Aptamerbasert måldeteksjon tilrettelagt av en 3-trinns G-quadruplex isotermisk eksponentiell amplifikasjonsreaksjon

Summary

Den nåværende protokollen demonstrerer bruken av en rask, 3-trinns, aptamerbasert eksponentiell amplifikasjonsanalyse for å oppdage mål. Prøvepreparering, signalforsterkning og fargeutvikling dekkes for å implementere dette systemet for å gjenkjenne tilstedeværelsen av teofyllin over koffein.

Abstract

Aptamerer er målgjenkjenningsmolekyler som binder seg med høy affinitet og spesifisitet. Disse egenskapene kan utnyttes til å kontrollere andre molekyler med signalgenereringsevne. For systemet beskrevet her, målgjenkjenning gjennom et aptamerisk domene, Stem II av et modifisert hammerhead ribozyme, aktiverer den selvspaltende ribozymet ved å stabilisere den opprinnelig ustrukturerte konstruksjonen. CIS-spaltende RNA virker ved krysset mellom Stem III og Stem I, og skaper to spaltningsprodukter. Det lengre spaltningsproduktet primer en isotermisk eksponentiell amplifikasjonsreaksjon (EXPAR) av de to lignende katalytisk aktive G-quadruplexene. De resulterende amplifikasjonsproduktene katalyserer peroksidasereduksjon, som er koblet til reduksjonen av et kolorimetrisk substrat med en utgang som det blotte øye kan oppdage. Det 3-delte systemet beskrevet i denne studien forbedrer deteksjonsmodaliteter som enzymbundne immunosorbentanalyser (ELISA) ved å produsere et visuelt detekterbart signal for å indikere tilstedeværelsen av så lavt som 0,5 μM teofyllin på så lite som 15 minutter.

Introduction

Aptamere er vanligvis enkeltstrenget DNA eller RNA valgt gjennom en evolusjonær prosess med høy bindingsaffinitet og spesifisitet til de ønskede målene¹. I tillegg til bindingsevne kan aptamere knyttes til og kontrollere motiver med signalutgangsfunksjoner^2,3, noe som forsterker signalet og forbedrer systemets følsomhet. G-quadruplex isotermisk eksponentiell amplifikasjonsreaksjon (GQ-EXPAR) -systemet er et tredelt system (figur 1) som utvikler et visuelt signal når suksessive komponenter legges til en enkelt reaksjonsbeholder for å produsere en visuell utgang⁴. Dette systemet gjør det mulig å oppdage et spesifikt mål, her teofyllin, i en gitt prøve innen 15 minutter ved hjelp av en strømlinjeformet arbeidsflyt for å muliggjøre rask, spesifikk påvisning av et mål av interesse. Denne metoden må vurderes for prøver der spesifikk kvantifisering av målkonsentrasjonen er en lavere bekymring enn høy spesifisitet av responsen på kort tid.

En allosterisk riboswitch, et strukturbyttende RNA-molekyl (ribozyme) som gjennomgår selvspaltning, produserer det første signalet. Denne konstruksjonen er basert på hammerhead ribozyme, med et aptamerisk domene introdusert i Stem II som en regulator av spaltningsaktivitet. Dens selvspaltningsfunksjon aktiveres når det aptameriske domenet stabiliseres ved binding til målet⁵. Ellers er bryteren inaktiv i sin opprinnelige tilstand.

Den påfølgende eksponentielle amplifikasjonsreaksjonen (EXPAR) bruker frigjøringen av den selvspaltede RNA-strengen fra første trinn for å prime en isotermisk amplifikasjonsreaksjon⁶. Forsterkningsproduktet til EXPAR har peroksidaseaktivitet⁷, som virker som grunnlag for den siste fasen av systemet. Når noen substrater oksideres i forbindelse med peroksidnedbrytning, produserer de en fluorescerende utgang som kan måles på forskjellige instrumenter. Andre vanlige substrater kan erstattes for å produsere et farget produkt for visuell deteksjon. EXPAR og peroksidaseaktiviteten til forsterkningsproduktene fungerer som en 2-trinns signalforsterker, og øker følsomheten for større nivåer sammenlignet med konvensjonelle strategier ^7,8.

Deteksjon av teofyllin versus koffein brukes som et eksempel på spesifisiteten til denne deteksjonsplattformen, da de bare avviker med en enkelt metylgruppe (figur 2). Denne demonstrasjonen av systemet produserer en kolorimetrisk utgang for visuell deteksjon av minst 500 nM teofyllin.

Protocol

Se tilleggstabell 1 (reaksjonsoppsetttabellen) for klargjøring av rør, inkludert spesifikke volumer og konsentrasjoner av reaksjonskomponentene. Protokollen som demonstreres her, bruker et forhåndsmontert deteksjonsplattformsett som beskrevet i materialfortegnelsen. Alle komponenter skal oppbevares på is med mindre annet er angitt.

1. Tilberedning av ribozyme

MERK: Den primære deteksjonskomponenten er et allosterisk (aptamerregulert) ribozym som gjenkjenner teofyllin (se tilleggstabell 2).

1. Samle 5 U T4 polynukleotidkinase (0,5 μL, se materialtabell) i et PCR-rør, som vil bli brukt til å aktivere ribozymspaltningsproduktene.
   MERK: Denne komponenten legges til først slik at brukeren kan se riktig dispensering av enzymet.
2. Tilsett 1 μL ferdig forberedt 5x ribozymebuffer (se materialfortegnelse) til hvert prøverør (PCR-rør).
3. For å visuelt demonstrere spesifisitet, tilsett 1,5 μL av 2 mM teofyllin (mål) eller 2 mM koffein (kontroll) (se materialfortegnelse) til hvert prøverør som testprøver.
   MERK: For å etablere en standardkurve anbefales det å starte på 3,125 mM analytt og teste fem ganger fortynninger til 0,001 mM.
4. Bland hver prøverør grundig ved å pipettere 5-10 ganger.
5. Tilsett 2 μL 600 nM RNA som inneholder et aptamerisk domene som er spesifikt for målet (se materialtabell) til hvert prøverør for å lage en endelig konsentrasjon på 240 nM i 5 μL testløsning, bland deretter raskt ved pipettering og legg på en kaldblokk for å minimere bakgrunnssignalet.
   MERK: Det er viktig å initialt tilberede alle reaksjonene uten ribozyme, da selvspaltningsreaksjonen vil starte umiddelbart når ribozyme kombineres med ribozymebuffer og kan gi betydelig bakgrunn.
6. Når alle reaksjonsrørene er klargjort, inkuber hver prøve (5 μL) ved romtemperatur (23 °C) i nøyaktig 3 minutter ved hjelp av en timer. Prøvebeholderne settes umiddelbart tilbake til is (4 °C) etter inkubering.

2. GQ-EXPAR

1. Tilsett 3,5 μL nikklase-polymerase enzymblanding (se materialtabell) til hvert prøverør og bland godt.
   MERK: De nødvendige enzymkonsentrasjonene avhenger av gjenkjennelsessekvensene, typer enzymer og reaksjonstemperaturer, hvis kombinasjon ble empirisk bestemt.
2. Tilsett 31,5 μL EXPAR reaksjonsblanding inneholdende template, nukleotider og reaksjonsbuffer (se Materialtabell) til hvert prøverør og pipet som skal blandes.
   MERK: Komponentkonsentrasjonene er optimalisert basert på enzymer og sekvenser av polymeraseproduktene.
3. Når alle prøvene er klargjort, inkuber hver fremstilte prøve (40 μL) ved 55 °C i nøyaktig 5 minutter ved hjelp av en timer. Hvis mulig, inkuber på en termosyklist, selv om et oppvarmet lokk er unødvendig.
4. Prøvebeholderne settes umiddelbart tilbake til is (4 °C) etter inkubasjonstrinnet.

3. Fargeutvikling

1. Tilsett 2 μL Hemin-oppløsning (25 uM, se materialfortegnelse) i hvert prøverør og bland godt.
2. Tilsett 58 mikrol av den kommersielt tilgjengelige TMB-oppløsningen (se materialfortegnelse) i hvert prøverør og bland godt.
3. Inkuber fargeutviklingsreaksjonen (100 μL) ved romtemperatur i minst 3 minutter og opptil 30 minutter.
   MERK: (Valgfritt) Fargeutvikling kan stoppes ved å tilsette 20 μL 2 M svovelsyre.
4. Les prøvene kvalitativt med øye, eller kvantifiser resultatene ved hjelp av en absorbansplateleser ved 450 nm hvis fargeutviklingsreaksjonene stoppes ved bruk av svovelsyre.

Representative Results

Deteksjonsplattformen som er avbildet i figur 1 , konverterer aptamerisk målgjenkjenning til visuelt distinkte forskjeller mellom prøvepreparatene (mål vs. ikke-mål, figur 2) på kort tid. Et allosterisk ribozym identifisert av Soukup et ^al.5 tjente som utgangspunkt for å skape en mindre støyende sekvens med respons på målet over kontroll- og negative prøver. Den optimaliserte konstruksjonen var i stand til å gjenkjenne så lite som 500 nM teofyllin på 30 minutter (figur 3) - prøvepreparater utsatt for målet gir en blå farge i trinn 3, mens prøver som ikke inneholder noe mål forblir fargeløse. Om nødvendig kan disse resultatene kvantifiseres ved først å stoppe fargeutviklingsreaksjonen som beskrevet i trinn 3.4, og deretter lese absorbansen av det resulterende produktet ved 450 nm for å måle den opprinnelige konsentrasjonen av det nåværende målet. Typiske resultater av denne prosessen er presentert i tabell 1, som kan tilpasses en ikke-lineær regresjon for å estimere kvantitativt konsentrasjonen av målet i det opprinnelige utvalget (figur 4).

Figur 1: GQ-EXPAR-systemet. Mekanismer for deteksjons- og signalforsterkningssystemet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Aptamermål og motmål. Molekylær struktur av teofyllin (mål) og koffein (motmålskontroll) som en demonstrasjon av spesifisitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: GQ-EXPAR visuelle resultater. Representative resultater av systemet for å oppdage ulike konsentrasjoner av teofyllin etter 3 min og 30 min fargeutvikling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Representativ teofyllin standardkurve. Systemsignalets standardkurve målt ved A450 etter 30 min fargeutvikling. Rådata er presentert i tabell 1, N = 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

[Teofyllin] (mM)	Forsøk 1 (A450)	Prøve 2 (A450)	Prøve 3 (A450)	Gjennomsnitt (A450)
3.125	0.342	0.318	0.39	0,350 ± 0,0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0,314 ± 0,00772
0.125	0.263	0.264	0.287	0,271 ± 0,0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0,223 ± 0,00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0,173 ± 0,00779
0.001	0.134	0.115	0.138	0,129 ± 0,0100
0	0.107	0.104	0.117	0,109 ± 0,00556
Ingen Ribozyme	0.095	0.088	0.129	0,104 ± 0,0179

Tabell 1: Representative teofyllinkurve rådata. Resultater av systemet for å oppdage ulike konsentrasjoner av teofyllin etter 30 min fargeutvikling. Det ble også vurdert no-ribozyme-prøver, N = 3.

Tilleggstabell 1: GQ-EXPAR-oppsett. Sammendrag av GQ-EXPAR reagensvolumer og rekkefølge for tilsetning som beskrevet i protokollen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell 2: GQ-EXPAR oligonukleotidsekvenser. Sekvenser av DNA- og RNA-molekylene som brukes i deteksjonsreaksjonene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Metoden som presenteres her utnytter overgangen mellom en opprinnelig uordnet sekundær struktur i et allosterisk ribozyme og den ekstra stabiliteten som gis gjennom bindingen av målet til det aptameriske domenet for å aktivere cis-spaltende hammerhode ribozyme. Stabiliteten til ribozymet ble justert for å minimere katalytisk aktivitet i fravær av målet, samtidig som målbindingen ble tillatt for å gjenopprette den aktive strukturen. I tillegg må det tas hensyn til å balansere bufferne til de mange enzymene som kreves for å lette EXPAR og fargeutvikling. Til slutt, med tanke på at dette er et 3-trinns system, betydde kombinasjonen av inkubasjonstider og temperaturer sammen med konsentrasjonene av reaksjonskomponentene at maksimering av signalet samtidig som støy ble minimert, ikke var en liten utfordring.

Under forberedelsen av ribozymet (trinn 1) stabiliserer målbindingen til det aptameriske domenet strukturen til det selvspaltende ribozymet. Til tross for dette vil ribozymet være i stand til å spalte en gang introdusert til ribozymebufferen, selv i fravær av et mål. For å minimere bakgrunnssignalet er det derfor viktig å holde reaksjonene på is til de er klare for den definerte inkubasjonen. Den vellykkede bindingen av målet til det aptameriske domenet og den resulterende spaltningshendelsen produserer to spaltningsprodukter, som vist i figur 1, trinn 1: et kort segment av stamme I og et nylig eksponert segment av stamme III med et terminalt syklisk fosfat⁸. T4-polynukleotidkinasen som er tilstede i prøveblandingen, fjerner det sykliske fosfatet fra Stem III-spaltningsproduktet, som fungerer som en primer for amplifikasjonsreaksjonen i trinn 2. Konsentrasjonene og volumene av reagensene som ble brukt i dette systemet ble optimalisert basert på eksperimenter for å evaluere bakgrunnssignalet mot spesifikk respons⁴ og må optimaliseres fra hvilket punkt endringer gjøres. I tillegg anbefales 3.125 mM teofyllin som den høyeste konsentrasjonen for å etablere en standardkurve, da fargeutviklingen som følge av denne prøven er nær maksimal absorpsjon mulig ved 450 nm (figur 4). En ikke-lineær regresjon av vanlige minste kvadraters brukes til å bestemme standardkurven for denne utarbeidelsen av GQ-EXPAR-systemet.

GQ-EXPAR, utført i trinn 2, bruker to DNA-maler: en som er primet av Stem III-spaltningsproduktet og produserer G-quadruplex, og en som er primet av G-quadruplex og produserer G-quadruplex. Den tidligere reaksjonen er viktigere enn sistnevnte, da oversettelse av Stem III-spaltningsproduktet til G-quadruplexes er nødvendig for å produsere en kolorimetrisk utgang, mens G-quadruplex selvforsterkning øker signalet som allerede er tilstede. Bst 2.0 DNA-polymerase utfører isotermisk amplifikasjon og har strengforskyvningsaktivitet, mens Nt. BstNBI nickase spalter før G-quadruplex-sekvensen for å tillate Bst 2.0 å forskyve det tidligere genererte produktet og produsere mer G-quadruplex amplicon. Bufferen leverer også K⁺, som gjør at forsterkningsproduktet kan brettes inn i den aktive G-quadruplex-formen. Ulike nickaser har forskjellige gjenkjenningssekvenser for binding og skjæring, og spesifikke enzymer vil ha forskjellige skjæreeffektiviteter; Endring av sekvensen i gjenkjenning / nicking området vil kreve en endring i nickase og reoptimizing trinn 2.

I trinn 3 kan G-kvadruplexer fungere som DNAzymes med peroksidaseaktivitet, spesielt når de er assosiert med hemin⁷. Reduksjonen av peroksid er kombinert med oksidasjon av substratet som TMB for å produsere et detekterbart signal for visualisering eller kvantifisering.

Hovedbegrensningen i dette systemet er støyen som den allosteriske ribozymen kan generere. Selv om den aktive, selvspaltende strukturen ikke er stabil i fravær av målet (i dette tilfellet teofyllin), har RNA muligheten til å prøve forskjellige konfigurasjoner og kan utilsiktet få tilgang til den aktive konfigurasjonen⁴. Dette, kombinert med forsterkningen av signalet som finnes i trinn 2 og trinn 3, kan generere et falskt positivt signal. Det er derfor viktig å redusere systemets aktivitet så mye som mulig gjennom optimalisering av RNA-, buffer- og enzymmengder, samt minimere inkubasjonstider og temperaturer for å begrense produksjonen av RNA-spaltningshendelser som ikke er målmedierte.

Til tross for vanskeligheten med å optimalisere en GQ-EXPAR-arbeidsflyt, kan systemet være ganske allsidig når det først er etablert. Ulike aptamerkontrollerte allosteriske ribozymer er allerede identifisert⁹ og kan optimaliseres for ønsket funksjonalitet⁵. Det er også gjort fremskritt i utviklingen av allosteriske DNAzymes modulert av aptamers¹⁰, som utvider kjemien som kan integreres i denne plattformen. Disse alternativene for å endre målgjenkjenningen av systemet har ikke blitt evaluert og vil være fokus for fremtidige studier. I tillegg kan nøkkelkomponenter i systemet byttes ut med ekvivalente materialer med forskjellige aktivitetskrav, for eksempel lavere inkubasjonstemperaturer for polymerasen eller forskjellige gjenkjenningssekvenser for nikklasen. Fleksibiliteten og modulariteten til dette systemet gjør det mulig å tilpasse seg et bredt spekter av innganger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.