基于适配体的靶标检测通过 3 级 G-四链体等温指数扩增反应进行

Summary

本协议演示了使用快速，3阶段，基于适体的指数扩增测定来检测目标。涵盖样品制备、信号放大和显色，以实现该系统，以识别茶碱的存在而不是咖啡因的存在。

Abstract

核酸适配体是以高亲和力和特异性结合的靶标识别分子。可以利用这些特性来控制具有信号产生能力的其他分子。对于本文描述的系统，通过适体结构域（改良的锤头核酶的Stem II）进行目标识别，通过稳定初始非结构化结构体来激活自裂解核酶。顺式切割RNA作用于茎III和茎I的连接处，产生两种切割产物。较长的裂解产物引发两种相似催化活性G-四链体的等温指数扩增反应（EXPAR）。这些产生的扩增产物催化过氧化物酶还原，这与具有肉眼可以检测到的输出的比色底物的还原相结合。本研究中描述的三部分系统通过产生视觉可检测的信号来改进检测方式，例如酶联免疫吸附测定（ELISA），以在短短15分钟内指示低至0.5μM茶碱的存在。

Introduction

核酸适配体通常是通过进化过程选择的单链DNA或RNA，与^所需靶标具有高结合亲和力和特异性1。除了结合能力外，核酸适配体还可以与具有信号输出功能²，³的基序连接和控制基序^，从而放大所述信号并提高系统的灵敏度。G-四链体等温指数扩增反应（GQ-EXPAR）系统是一个由三部分组成的系统（图1），当连续组分被添加到单个反应容器中以产生^{视觉输出时}，该系统会产生视觉信号4。该系统允许使用简化的工作流程在15分钟内检测给定样品中的特定靶标，本文中的茶碱，以允许快速，特异性地检测感兴趣的靶标。对于目标浓度的特异性定量比短时间内响应的高特异性更不关心的样品，必须考虑使用此方法。

变构核糖开关是一种经历自我切割的结构转换RNA分子（核酶），产生初始信号。该结构基于锤头核酶，在Stem II中引入了适体结构域作为裂解活性的调节剂。当其适体结构域稳定与其靶标⁵结合时，其自切割功能被激活。否则，交换机在其本机状态下处于非活动状态。

随后的指数扩增反应（EXPAR）使用自裂解RNA链从第一阶段释放到启动等温扩增反应⁶。EXPAR的扩增产物具有过氧化物酶活性⁷，作为系统最后阶段的基础。当某些基材与过氧化物击穿一起被氧化时，它们会产生荧光输出，可以在各种仪器上测量。可以替代其他常见的基材来生产用于视觉检测的有色产品。EXPAR及其扩增产物的过氧化物酶活性充当2级信号增强剂，^{与传统策略相比}，将灵敏度提高到更高的水平7^，8。

茶碱与咖啡因的检测被用作该检测平台特异性的一个例子，因为它们仅相差一个甲基（图2）。该系统的演示产生比色输出，用于至少500 nM茶碱的视觉检测。

Protocol

管制备见 补充表1 （反应设置表），包括反应组分的特定体积和浓度。此处演示的协议使用材料 表中描述的预组装检测平台套件。除非另有说明，否则所有组件必须保存在冰上。

1.核酶的制备

注意：主要检测成分是识别茶碱的变构（适体调节）核酶（见 补充表2）。

1. 在PCR管中收集5U的T4多核苷酸激酶（0.5μL，参见 材料表），该管将用于激活核酶切割产物。
   注意：首先添加此组分，以便用户可以看到酶的正确分配。
2. 向每个样品管（PCR管）中加入1 μL预先制备的5x核酶缓冲液（参见 材料表）。
3. 为了直观地展示特异性，向每个样品管中加入 1.5 μL 2 mM 茶碱（目标）或 2 mM 咖啡因（对照）（参见 材料表）作为测试样品。
   注意：为了建立标准曲线，建议从3.125 mM分析物开始，并测试五倍稀释度，直到0.001 mM。
4. 通过移液5-10次彻底混合每个样品管。
5. 向每个样品管中加入 2 μL 含有靶标特异性适体结构域的 600 nM RNA（参见 材料表），使 5 μL 测试溶液中的最终浓度为 240 nM，然后通过移液快速混合并置于冷块上以最小化背景信号。
   注意：重要的是最初准备不含核酶的所有反应，因为当核酶与核酶缓冲液结合时，自裂解反应将立即开始，并可能产生显着的背景。
6. 制备完所有反应管后，使用计时器在室温（23°C）下将每个样品（5μL）孵育3分钟。孵育后立即将样品管放回冰（4°C）中。

2. GQ-EXPAR

1. 向每个样品管中加入 3.5 μL 切口酶-聚合酶混合物（参见 材料表）并充分混合。
   注意：所需的酶浓度取决于识别序列、酶类型和反应温度，其组合是根据经验确定的。
2. 向每个样品管和移液管中加入 31.5 μL 含有模板、核苷酸和反应缓冲液（参见 材料表）的 EXPAR 反应混合物进行混合。
   注意：组分浓度根据聚合酶产物的酶和序列进行优化。
3. 制备完所有样品后，使用计时器将每个制备的样品（40μL）在55°C下孵育5分钟。如果可能，在热循环仪上孵育，尽管不需要加热盖子。
4. 孵育步骤后立即将样品管放回冰（4°C）中。

3. 显色

1. 向每个样品管中加入 2 μL 血红素溶液（25 uM，参见 材料表）并充分混合。
2. 向每个样品管中加入 58 μL 市售 TMB 溶液（参见 材料表）并充分混合。
3. 在室温下孵育显色反应（100μL）至少3分钟至30分钟。
   注意：（可选）可以通过添加 20 μL 2 M 硫酸来停止显色。
4. 用肉眼定性读取样品，如果使用硫酸停止显色反应，则使用450nm处的吸光度板读数器定量结果。

Representative Results

图1所示的检测平台可在短时间内将适体靶标识别转换为样品制备（靶标与非靶标，图2）之间的视觉差异。Soukup等人5鉴定的变构核酶作为创建噪声较小的序列的起点，该序列在对照和阴性样品上响应目标。优化后的构建体能够在30分钟内识别低至500 nM茶碱（图3）-暴露于靶标的样品制备物在步骤3中产生蓝色，而不含靶标的样品保持无色。如有必要，可以通过首先停止步骤3.4中所述的显色反应，然后在450nm处读取所得产物的吸光度以测量存在的靶标的初始浓度来量化这些结果。该过程的典型结果如表1所示，可以拟合到非线性回归中，以定量估计初始样品中存在的靶标浓度（图4）。

图 1：GQ-EXPAR 系统。 检测和信号放大系统的机制。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：适配体靶标和反靶标。 茶碱（靶标）和咖啡因（反靶标对照）的分子结构作为特异性的证明。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：GQ-EXPAR 视觉结果。 用于检测颜色显影3分钟和30分钟后各种浓度茶碱的系统的代表结果。 请点击此处查看此图的大图。

图4：代表性茶碱标准曲线。 显色 30 分钟后在 A450 处测量的系统信号的标准曲线。原始数据如 表1所示，N = 3。 请点击此处查看此图的大图。

[茶碱]（月米）	试用 1 （A450）	试用 2 （A450）	试用 3 （A450）	平均 （A450）
3.125	0.342	0.318	0.39	0.350 ± 0.0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0.314 ± 0.00772
0.125	0.263	0.264	0.287	0.271 ± 0.0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0.223 ± 0.00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0.173 ± 0.00779
0.001	0.134	0.115	0.138	0.129 ± 0.0100
0	0.107	0.104	0.117	0.109 ± 0.00556
无核酶	0.095	0.088	0.129	0.104 ± 0.0179

表1：具有代表性的茶碱标准曲线原始数据。 颜色显影30分钟后检测各种浓度茶碱的系统的结果。还评估了无核酶样品，N = 3。

补充表1：GQ-EXPAR设置。 GQ-EXPAR试剂体积和添加顺序摘要，如实验方案中所述。 请点击此处下载此文件。

补充表2：GQ-EXPAR寡核苷酸序列。 检测反应中使用的DNA和RNA分子序列。 请点击此处下载此文件。

Discussion

这里介绍的方法利用了变构核酶中最初无序的二级结构与通过靶标与适体结构域结合以激活顺式裂解锤头核酶而赋予的额外稳定性之间的过渡。调整核酶的稳定性，以在无靶标的情况下最小化催化活性，同时允许靶标结合恢复活性结构。此外，必须注意平衡促进EXPAR和显色所需的多种酶的缓冲液。最后，考虑到这是一个三级系统，孵育时间和温度以及反应组分浓度的组合意味着在最大化信号的同时最小化噪声是一项不小的挑战。

在核酶的制备过程中（步骤1），与适体结构域的靶标结合稳定了自裂解核酶的结构。尽管如此，即使没有靶标，核酶一旦引入核酶缓冲液，也能够裂解。因此，为了尽量减少背景信号，至关重要的是将反应保持在冰上，直到它们准备好进行规定的孵育。靶标与适体结构域的成功结合以及由此产生的裂解事件产生两种裂解产物，如图1，阶段 1所示：一小段茎I和新暴露的茎III段，末端环磷酸盐⁸。样品混合物中存在的 T4 多核苷酸激酶从 Stem III 裂解产物中去除环磷酸盐，该产物可作为第 2 阶段扩增反应的引物。该系统中使用的试剂的浓度和体积基于实验进行了优化，以评估背景信号与特定响应⁴ ，并且需要从进行的任何点更改开始进行优化。此外，建议将3.125 mM茶碱作为建立标准曲线的最高浓度，因为该样品产生的显色接近450 nm处可能的最大吸收（图4）。采用常最小二乘法的非线性回归来确定该制备GQ-EXPAR系统的标准曲线。

在步骤2中进行的GQ-EXPAR使用两个DNA模板：一个由Stem III切割产物引发并产生G-四链体，另一个由G-四链体引发并产生G-四链体。前者的反应比后者更重要，因为将Stem III裂解产物转换为G-四链体是产生比色输出所必需的，而G-四链体自放大会增加已经存在的信号。Bst 2.0 DNA聚合酶进行等温扩增并具有链置换活性，而Nt. BstNBI切口酶在G-四链体序列之前切割，使Bst 2.0取代先前生成的产物并产生更多的G-四链体扩增子。缓冲液还提供K⁺，允许扩增产物折叠成活性G-四链体形式。不同的切口酶具有不同的结合和切割识别序列，特定的酶将具有不同的切割效率;更改识别/切口位点中的序列将需要更改切口酶并重新优化步骤 2。

在步骤3中，G-四链体可以作为具有过氧化物酶活性的DNA酶发挥作用，特别是当与血红素⁷相关时。过氧化物的还原与底物（如TMB）的氧化相结合，以产生可检测的信号以进行可视化或定量。

该系统的主要限制是变构核酶可能产生的噪声。尽管活性的自裂解结构在没有靶标（在本例中为茶碱）的情况下不稳定，但RNA有机会对不同的构型进行采样，并且可以无意中访问活性构型⁴。这与第 2 阶段和第 3 阶段发现的信号放大相结合，可能会产生假阳性信号。因此，通过优化RNA、缓冲液和酶量以及最小化孵育时间和温度以限制非靶向介导的RNA切割事件的产生，尽可能降低系统的活性至关重要。

尽管优化GQ-EXPAR工作流程存在困难，但该系统一旦建立就可以非常通用。已经鉴定出各种适体控制的变构核酶⁹ ，并且可以针对^{所需的功能进行}优化5。在开发由适配体¹⁰调节的变构DNA酶方面也取得了进展，扩展了可以集成到该平台中的化学物质。这些改变系统目标识别的选项尚未得到评估，将成为未来研究的重点。此外，系统的关键组分可以交换为具有不同活性要求的等效材料，例如聚合酶的较低孵育温度或切口酶的不同识别序列。该系统的灵活性和模块化使其能够适应广泛的输入。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.