Aptamer-baseret måldetektion lettet af en 3-trins G-quadruplex isotermisk eksponentiel forstærkningsreaktion

Summary

Denne protokol demonstrerer brugen af et hurtigt, 3-trins, aptamerbaseret eksponentielt forstærkningsassay til at detektere mål. Prøveforberedelse, signalforstærkning og farveudvikling er dækket for at implementere dette system for at genkende tilstedeværelsen af theophyllin over koffein.

Abstract

Aptamers er målgenkendelsesmolekyler, der binder med høj affinitet og specificitet. Disse egenskaber kan udnyttes til at styre andre molekyler med signalgenereringsevne. For det system, der er beskrevet heri, aktiverer målgenkendelse gennem et aptamerisk domæne, stamme II af et modificeret hammerhovedribozym, det selvspaltende ribozym ved at stabilisere den oprindeligt ustrukturerede konstruktion. Det cis-spaltende RNA virker ved krydset mellem stamme III og stamme I, hvilket skaber to spaltningsprodukter. Det længere spaltningsprodukt primer en isotermisk eksponentiel amplifikationsreaktion (EXPAR) af de to lignende katalytisk aktive G-quadruplexer. Disse resulterende forstærkningsprodukter katalyserer peroxidasereduktion, som er koblet til reduktionen af et kolorimetrisk substrat med et output, som det blotte øje kan detektere. Det 3-delte system, der er beskrevet i denne undersøgelse, forbedrer detektionsmetoder såsom enzymbundne immunosorbentassays (ELISA'er) ved at producere et visuelt detekterbart signal til indikation af tilstedeværelsen af så lavt som 0,5 μM theophyllin på så lidt som 15 min.

Introduction

Aptamerer er typisk enkeltstrenget DNA eller RNA udvalgt gennem en evolutionær proces med høj bindingsaffinitet og specificitet til de ønskede mål¹. Ud over bindingsevne kan aptamerer forbindes til og styre motiver med signaludgangsfunktioner^2,3, hvilket forstærker signalet og forbedrer systemets følsomhed. G-quadruplex isotermisk eksponentiel forstærkningsreaktion (GQ-EXPAR) system er et tredelt system (figur 1), der udvikler et visuelt signal, når successive komponenter føjes til en enkelt reaktionsbeholder for at producere et visuelt output⁴. Dette system giver mulighed for detektion af et specifikt mål, heri theophyllin, i en given prøve inden for 15 minutter ved hjælp af en strømlinet arbejdsgang for at muliggøre hurtig, specifik detektion af et mål af interesse. Denne metode skal overvejes for prøver, hvor specifik kvantificering af målkoncentrationen er mindre problematisk end en høj grad af responsspecificitet på kort tid.

En allosterisk riboswitch, et strukturomskiftende RNA-molekyle (ribozym), der gennemgår selvspaltning, producerer det indledende signal. Denne konstruktion er baseret på hammerhead ribozym, med et aptamerisk domæne introduceret i Stem II som regulator af spaltningsaktivitet. Dens selvspaltningsfunktion aktiveres, når dens aptameriske domæne stabiliseres ved binding til sit mål⁵. Ellers er kontakten inaktiv i sin oprindelige tilstand.

Den efterfølgende eksponentielle amplifikationsreaktion (EXPAR) bruger frigivelsen af den selvspaltede RNA-streng fra det første trin til at prime en isotermisk amplifikationsreaktion⁶. Forstærkningsproduktet af EXPAR har peroxidaseaktivitet⁷, der fungerer som grundlag for systemets sidste trin. Når nogle substrater oxideres i forbindelse med peroxidnedbrydning, producerer de et fluorescerende output, der kan måles på forskellige instrumenter. Andre almindelige substrater kan erstattes for at producere et farvet produkt til visuel detektion. EXPAR og peroxidaseaktiviteten af dets amplifikationsprodukter fungerer som en 2-trins signalforstærker, der øger følsomheden over for større niveauer sammenlignet med konventionelle strategier ^7,8.

Påvisning af theophyllin versus koffein anvendes som et eksempel på specificiteten af denne detektionsplatform, da de kun adskiller sig med en enkelt methylgruppe (figur 2). Denne demonstration af systemet frembringer et kolorimetrisk output til visuel detektion af mindst 500 nM theophyllin.

Protocol

Se supplerende tabel 1 (reaktionsopstillingstabellen) for rørforberedelse, herunder reaktionskomponenternes specifikke volumener og koncentrationer. Den protokol, der demonstreres her, bruger et færdigmonteret detektionsplatformssæt som beskrevet i materialetabellen. Alle komponenter skal opbevares på is, medmindre andet er angivet.

1. Fremstilling af ribozym

BEMÆRK: Den primære detektionskomponent er et allosterisk (aptamerreguleret) ribozym, der genkender theophyllin (se supplerende tabel 2).

1. Der opsamles 5 U T4 polynukleotidkinase (0,5 μL, se materialetabel) i et PCR-rør, som skal bruges til at aktivere ribozymspaltningsprodukterne.
   BEMÆRK: Denne komponent tilføjes først, så brugeren kan se den korrekte dispensering af enzymet.
2. Der tilsættes 1 μL forberedt 5x ribozymbuffer (se materialetabel) til hvert prøveglas (PCR-reagensglas).
3. For visuelt at påvise specificitet tilsættes 1,5 μL 2 mM theophyllin (mål) eller 2 mM koffein (kontrol) (se materialetabel) til hvert prøveglas som analyseprøver.
   BEMÆRK: Til etablering af en standardkurve anbefales det at starte ved 3,125 mM analysand og teste femfoldsfortyndinger indtil 0,001 mM.
4. Hvert prøveglas blandes grundigt ved pipettering 5-10 gange.
5. Der tilsættes 2 μL 600 nM RNA indeholdende et aptamerisk domæne, der er specifikt for målet (se materialetabellen) til hvert prøveglas for at opnå en slutkoncentration på 240 nM i 5 μL testopløsning, bland derefter hurtigt ved pipettering og læg det på en kold blok for at minimere baggrundssignalet.
   BEMÆRK: Det er vigtigt indledningsvis at forberede alle reaktioner uden ribozym, da selvspaltningsreaktionen begynder straks, når ribozym kombineres med ribozymbuffer og kan give signifikant baggrund.
6. Når alle reaktionsglassene er klargjort, inkuberes hver prøve (5 μL) ved stuetemperatur (23 °C) i nøjagtig 3 minutter ved hjælp af en timer. Prøveglassene sættes straks tilbage til is (4 °C) efter inkubation.

2. GQ-EXPAR

1. Der tilsættes 3,5 μL nickase-polymeraseenzymblanding (se materialetabel) til hvert prøveglas og blandes godt.
   BEMÆRK: De krævede enzymkoncentrationer afhænger af genkendelsessekvenserne, enzymtyperne og reaktionstemperaturerne, hvis kombination blev empirisk bestemt.
2. Der tilsættes 31,5 μL EXPAR-reaktionsblanding indeholdende skabelon, nukleotider og reaktionsbuffer (se materialetabel) til hvert prøveglas og pipet for at blande.
   BEMÆRK: Komponentkoncentrationerne optimeres baseret på enzymerne og sekvenserne af polymeraseprodukterne.
3. Når alle prøverne er forberedt, inkuberes hver forberedt prøve (40 μL) ved 55 °C i nøjagtig 5 minutter ved hjælp af en timer. Hvis det er muligt, inkuberes på en termocykler, selvom et opvarmet låg er unødvendigt.
4. Prøveglassene sættes straks tilbage i is (4 °C) efter inkubationstrinnet.

3. Farveudvikling

1. Der tilsættes 2 μL Hemin-opløsning (25 uM, se materialetabellen) til hvert prøveglas og blandes godt.
2. Der tilsættes 58 μL af den kommercielt tilgængelige TMB-opløsning (se materialetabellen) til hvert prøveglas og blandes godt.
3. Inkuber farveudviklingsreaktionen (100 μL) ved stuetemperatur i mindst 3 min og op til 30 min.
   BEMÆRK: (Valgfrit) Farveudvikling kan stoppes ved tilsætning af 20 μL 2 M svovlsyre.
4. Prøverne aflæses kvalitativt med øjet, eller resultaterne kvantificeres ved hjælp af en absorbanspladelæser ved 450 nm, hvis farveudviklingsreaktionerne stoppes ved hjælp af svovlsyre.

Representative Results

Detektionsplatformen vist i figur 1 konverterer aptamerisk målgenkendelse til visuelt forskellige forskelle mellem prøvepræparaterne (mål vs. ikke-mål, figur 2) på kort tid. Et allosterisk ribozym identificeret af Soukup et ^al.5 tjente som udgangspunkt for at skabe en mindre støjende sekvens med respons på målet over kontrol- og negative prøver. Den optimerede konstruktion var i stand til at genkende så lidt som 500 nM theophyllin på 30 min (figur 3) - prøvepræparater udsat for målet producerer en blå farve i trin 3, mens prøver, der ikke indeholder noget mål, forbliver farveløse. Om nødvendigt kan disse resultater kvantificeres ved først at standse farveudviklingsreaktionen som beskrevet i trin 3.4 og derefter aflæse absorbansen af det resulterende produkt ved 450 nm for at måle den oprindelige koncentration af det tilstedeværende mål. Typiske resultater af denne proces er vist i tabel 1, som kan tilpasses en ikke-lineær regression for kvantitativt at estimere koncentrationen af målet, der er til stede i den oprindelige prøve (figur 4).

Figur 1: GQ-EXPAR-systemet. Mekanismer i detekterings- og signalforstærkningssystemet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Aptamer mål og modmål. Molekylstruktur af theophyllin (mål) og koffein (modmålkontrol) som en demonstration af specificitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: GQ-EXPAR visuelle resultater. Repræsentative resultater af systemet til påvisning af forskellige koncentrationer af theophyllin efter 3 min og 30 min farveudvikling. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Repræsentativ theophyllinstandardkurve. Systemsignalets standardkurve målt ved A450 efter 30 minutters farveudvikling. Rådata er præsenteret i tabel 1, N = 3. Klik her for at se en større version af denne figur.

[Theophyllin] (mM)	Forsøg 1 (A450)	Forsøg 2 (A450)	Forsøg 3 (A450)	Gennemsnit (A450)
3.125	0.342	0.318	0.39	0,350 ± 0,0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0,314 ± 0,00772
0.125	0.263	0.264	0.287	0,271 ± 0,0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0,223 ± 0,00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0,173 ± 0,00779
0.001	0.134	0.115	0.138	0,129 ± 0,0100
0	0.107	0.104	0.117	0,109 ± 0,00556
Ingen ribozym	0.095	0.088	0.129	0,104 ± 0,0179

Tabel 1: Repræsentative theophyllinstandardkurve rådata. Resultater af systemet til påvisning af forskellige koncentrationer af theophyllin efter 30 minutters farveudvikling. Der blev også vurderet no-ribozymprøver, N = 3.

Supplerende tabel 1: GQ-EXPAR-opsætning. Resumé af GQ-EXPAR-reagensvolumener og tilsætningsrækkefølge som beskrevet i protokollen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 2: GQ-EXPAR oligonukleotidsekvenser. Sekvenser af DNA- og RNA-molekylerne, der anvendes i detektionsreaktionerne. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Metoden, der præsenteres her, udnytter overgangen mellem en oprindeligt uordnet sekundær struktur i et allosterisk ribozym og den yderligere stabilitet, der opnås ved binding af målet til det aptameriske domæne for at aktivere cis-spaltende hammerhovedribozym. Stabiliteten af ribozymet blev justeret for at minimere katalytisk aktivitet i fravær af målet, samtidig med at målbindingen kunne genoprette den aktive struktur. Derudover skal man sørge for at afbalancere bufferne af de mange enzymer, der kræves for at lette EXPAR og farveudvikling. Endelig, i betragtning af at dette er et 3-trins system, betød kombinationen af inkubationstider og temperaturer sammen med koncentrationerne af reaktionskomponenterne, at maksimering af signalet og samtidig minimering af støj ikke var nogen lille udfordring.

Under fremstillingen af ribozymet (trin 1) stabiliserer målbindingen til det aptameriske domæne strukturen af det selvspaltende ribozym. På trods af dette vil ribozymet være i stand til at spalte, når det først er introduceret til ribozymbufferen, selv i mangel af et mål. For at minimere baggrundssignalet er det derfor vigtigt at holde reaktionerne på is, indtil de er klar til den definerede inkubation. Den vellykkede binding af målet til det aptameriske domæne og den resulterende spaltningsbegivenhed producerer to spaltningsprodukter, som vist i figur 1, trin 1: et kort segment af stamme I og et nyligt eksponeret segment af stam III med et terminalt cyklisk phosphat⁸. T4-polynukleotidkinasen, der er til stede i prøveblandingen, fjerner det cykliske phosphat fra stam III-spaltningsproduktet, som fungerer som en primer for amplifikationsreaktionen i trin 2. Koncentrationerne og volumenerne af de reagenser, der anvendes i dette system, blev optimeret baseret på eksperimenter for at evaluere baggrundssignalet versus specifikt respons⁴ og skal optimeres fra det tidspunkt, hvor ændringerne foretages. Derudover anbefales 3,125 mM theophyllin som den højeste koncentration til etablering af en standardkurve, da farveudviklingen som følge af denne prøve er tæt på den maksimale absorption, der er mulig ved 450 nm (figur 4). En ikke-lineær regression med almindelige mindste kvadrater anvendes til at bestemme standardkurven for denne fremstilling af GQ-EXPAR-systemet.

GQ-EXPAR, udført i trin 2, bruger to DNA-skabeloner: en, der er primet af Stem III-spaltningsproduktet og producerer G-quadruplex, og en, der er primet af G-quadruplex og producerer G-quadruplex. Den førstnævnte reaktion er vigtigere end sidstnævnte, da oversættelse af Stem III-spaltningsproduktet til G-quadruplexes er nødvendig for at producere et kolorimetrisk output, mens G-quadruplex selvforstærkning øger det signal, der allerede er til stede. Bst 2.0 DNA-polymerase udfører den isotermiske amplifikation og har strengforskydningsaktivitet, mens Nt. BstNBI nickase spalter før G-quadruplex-sekvensen for at tillade Bst 2.0 at fortrænge det tidligere genererede produkt og producere mere G-quadruplex amplicon. Bufferen leverer også K⁺, hvilket gør det muligt for forstærkningsproduktet at folde ind i den aktive G-quadruplex-form. Forskellige nickaser har forskellige genkendelsessekvenser til binding og skæring, og specifikke enzymer vil have forskellige skæreeffektiviteter; Ændring af sekvensen på genkendelses-/nicking-webstedet kræver en ændring i nickasen og genoptimering af trin 2.

I trin 3 kan G-quadruplexer fungere som DNAzymer med peroxidaseaktivitet, især når de er forbundet med hæmin⁷. Reduktionen af peroxid kobles med oxidation af substratet, såsom TMB, for at producere et detekterbart signal til visualisering eller kvantificering.

Den vigtigste begrænsning i dette system er den støj, som det allosteriske ribozym kan generere. Selvom den aktive, selvspaltende struktur ikke er stabil i fravær af målet (i dette tilfælde theophyllin), har RNA'et mulighed for at prøve forskellige konfigurationer og kan utilsigtet få adgang til den aktive konfiguration⁴. Dette kombineret med forstærkningen af signalet, der findes i trin 2 og trin 3, kan generere et falsk positivt signal. Det er derfor afgørende at reducere systemets aktivitet så meget som muligt gennem optimering af RNA-, buffer- og enzymmængderne samt minimere inkubationstider og temperaturer for at begrænse produktionen af RNA-spaltningshændelser, der ikke er målmedierede.

På trods af vanskeligheden ved at optimere en GQ-EXPAR-arbejdsgang kan systemet være ret alsidigt, når det først er etableret. Forskellige aptamerstyrede allosteriske ribozymer er allerede identificeret⁹ og kan optimeres til den ønskede funktionalitet⁵. Der er også gjort fremskridt med at udvikle allosteriske DNAzymer moduleret af aptamerer¹⁰, hvilket udvider kemierne, der kan integreres i denne platform. Disse muligheder for at ændre målgenkendelsen af systemet er ikke blevet evalueret og vil være fokus for fremtidige undersøgelser. Derudover kan nøglekomponenter i systemet udskiftes med ækvivalente materialer med forskellige aktivitetskrav, såsom lavere inkubationstemperaturer for polymerasen eller forskellige genkendelsessekvenser for nickasen. Fleksibiliteten og modulariteten i dette system gør det muligt at tilpasse sig en bred vifte af input.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.