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Bioengineering

Abordaje de cuestiones prácticas en la microindentación basada en microscopía de fuerza atómica en explantes de cartílago articular humano

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64371
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

Summary

Presentamos un enfoque paso a paso para identificar y abordar los problemas más comunes asociados con las microindentaciones de microscopía de fuerza atómica. Ejemplificamos los problemas emergentes en los explantes nativos de cartílago articular humano caracterizados por varios grados de degeneración impulsada por la osteoartritis.

Abstract

Sin lugar a dudas, la microscopía de fuerza atómica (AFM) es actualmente una de las técnicas más potentes y útiles para evaluar micro e incluso nano-señales en el campo biológico. Sin embargo, al igual que con cualquier otro enfoque microscópico, pueden surgir desafíos metodológicos. En particular, las características de la muestra, la preparación de la muestra, el tipo de instrumento y la sonda de indentación pueden dar lugar a artefactos no deseados. En este protocolo, ejemplificamos estos problemas emergentes en explantes de cartílago articular sanos y osteoartríticos. Con este fin, primero mostramos a través de un enfoque paso a paso cómo generar, clasificar y clasificar visualmente discos de cartílago articular ex vivo de acuerdo con diferentes etapas de degeneración mediante imágenes de fluorescencia de mosaico 2D de gran tamaño de los explantes de tejido completo. La principal fortaleza del modelo ex vivo es que comprende cartílago humano nativo envejecido que permite la investigación de los cambios relacionados con la osteoartritis desde el inicio temprano hasta la progresión. Además, también se presentan los errores más comunes en la preparación de los tejidos, así como el procedimiento real de MFA junto con el posterior análisis de los datos. Mostramos cómo los pasos básicos pero cruciales, como la preparación y el procesamiento de la muestra, las características topográficas de la muestra causadas por la degeneración avanzada y la interacción muestra-punta, pueden afectar la adquisición de datos. También sometemos a escrutinio los problemas más comunes en la AFM y describimos, en la medida de lo posible, cómo superarlos. El conocimiento de estas limitaciones es de suma importancia para la correcta adquisición de datos, la interpretación y, en última instancia, la incorporación de los hallazgos en un contexto científico amplio.

Introduction

Debido al tamaño cada vez menor de los dispositivos y sistemas electrónicos, el rápido desarrollo de la tecnología y los equipos basados en micro y nano ha cobrado impulso. Uno de estos dispositivos es la microscopía de fuerza atómica (AFM, por sus siglas en inglés), que puede escanear superficies biológicas y recuperar información topográfica o biomecánica a escalas nanométricas y micrométricas 1,2. Entre sus vastas características, esta herramienta puede ser operada como micro y nano indentador para obtener información sobre las propiedades mecánicas de diversos sistemas biológicos 3,4,5,6. Los datos se recogen por contacto físico con la superficie a través de una sonda mecánica, que puede ser tan pequeña como aproximadamente 1 nm en su punta7. A continuación, se muestra la deformación resultante de la muestra en función de la profundidad de indentación de la punta en voladizo y la fuerza aplicada sobre la muestra8.

La osteoartritis (OA) es una enfermedad crónica degenerativa a largo plazo caracterizada por el deterioro del cartílago articular en las articulaciones y los tejidos circundantes, lo que puede conducir a la exposición completa de las superficies óseas. La carga de la OA es considerable; actualmente, la mitad de las mujeres y un tercio de los hombres de 65 años o más sufren de OA9. Los traumatismos, la obesidad y la consiguiente alteración de la biomecánica de la articulación10 determinan la degeneración del cartílago articular, que se considera un resultado final común. El estudio pionero de Ganz et al. postuló que los primeros pasos del proceso de artrosis pueden involucrar las propiedades biomecánicas del cartílago11, y desde entonces los investigadores han confirmado esta hipótesis12. Del mismo modo, es generalmente aceptado que las propiedades biomecánicas del tejido están orquestadas funcionalmente por la organización ultraestructural, así como por la diafonía célula-célula y célula-matriz. Cualquier alteración puede afectar drásticamente el funcionamiento biomecánico general de los tejidos13. Hasta la fecha, el diagnóstico de la artrosis es clínico y se basa en la radiografía simple14. Este enfoque tiene dos caras: en primer lugar, la falta de un umbral de corte degenerativo definido para formular el diagnóstico de OA hace que la afección sea difícil de cuantificar y, en segundo lugar, los métodos de imagen carecen de sensibilidad y estandarización y no pueden detectar daños localizados en el cartílago15,16,17. Para ello, la evaluación de las propiedades mecánicas del cartílago tiene la ventaja decisiva de que describe un parámetro que cambia durante el curso de la artrosis, independientemente de la etiología de la enfermedad, y que tiene una influencia directa en la funcionalidad tisular en una fase muy temprana. Los instrumentos de indentación miden la fuerza con la que el tejido resiste la indentación. De hecho, este no es un concepto nuevo; Los primeros estudios se remontan a las décadas de 1980 y 1990. En este período, numerosos estudios sugirieron que los instrumentos de indentación diseñados para las mediciones artroscópicas del cartílago articular podrían ser adecuados para detectar cambios degenerativos en el cartílago. Incluso hace 30 años, algunos estudios pudieron demostrar que los instrumentos de indentación eran capaces de detectar in vivo cambios en la superficie del cartílago durante la degeneración tisular mediante la realización de mediciones de rigidez compresiva durante la artroscopia18,19,20.

La indentación de AFM (AFM-IT) del cartílago articular proporciona información sobre una propiedad mecánica fundamental del tejido, a saber, la rigidez. Se trata de un parámetro mecánico que describe la relación entre una carga aplicada no destructiva y la deformación resultante del área tisular dentada21. Se ha demostrado que AFM-IT es capaz de cuantificar las modificaciones de la rigidez dependientes de la edad en redes de colágeno macroscópicamente no afectadas, diferenciando así entre los cambios patológicos asociados a la aparición de la artrosis (grado 0 en la escala de Outerbridge en cartílago articular)22. Hemos demostrado previamente que los AFM-IT, sobre la base de la organización espacial de los condrocitos como un biomarcador basado en imágenes para la degeneración temprana del cartílago, permiten no solo cuantificar, sino también identificar los cambios mecánicos degenerativos más tempranos. Estos hallazgos ya han sido confirmados por otros23,24. Por lo tanto, AFM-IT actúa como una herramienta interesante para diagnosticar e identificar cambios degenerativos tempranos. Estos cambios ya se pueden medir a nivel celular, remodelando la comprensión del proceso fisiopatológico de la artrosis.

En este protocolo, demostramos un procedimiento completo de clasificación histológica y biomecánica de explantes de cartílago articular, desde la preparación del explante de cartílago nativo hasta la adquisición y procesamiento de datos de AFM. A través de un enfoque paso a paso, mostramos cómo generar, clasificar y clasificar visualmente el tejido del cartílago articular de acuerdo con las diferentes etapas de degeneración mediante imágenes de mosaico grande en 2D, seguidas de indentaciones de micro-AFM.

A pesar de que, en la actualidad, la AFM-IT es una de las herramientas más sensibles para medir los cambios biomecánicos en el cartílago7, como cualquier otra técnica instrumental, tiene limitaciones y peculiaridades prácticas25 que pueden llevar a la adquisición errónea de datos. Con este fin, sometemos a escrutinio los problemas más comunes que surgen durante las mediciones de AFM de los explantes de cartílago y describimos, en la medida de lo posible, cómo minimizarlos o superarlos. Estos incluyen los aspectos topográficos de las muestras y las dificultades para estabilizarlas en un entorno compatible con AFM, las peculiaridades físicas de la superficie del tejido y las dificultades resultantes para realizar mediciones de AFM en dichas superficies. También se presentan ejemplos de curvas fuerza-distancia erróneas, haciendo hincapié en las condiciones que pueden causarlas. También se discuten las limitaciones adicionales inherentes a la geometría de la punta en voladizo y el uso del modelo Hertz para el análisis de datos.

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Protocol

Se utilizaron cóndilos femorales recogidos de pacientes sometidos a artroplastia total de rodilla en el Hospital Universitario de Tübingen, Alemania. Solo se incluyeron en este estudio muestras de cartílago articular de pacientes con patologías articulares degenerativas y postraumáticas. Antes del inicio del estudio se obtuvo la aprobación de los comités de ética departamentales, institucionales y locales (Proyecto n.º 674/2016BO2). Se recibió el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de participar.

NOTA: En la Figura 1 se presenta un diagrama de flujo de los pasos del experimento en su orden cronológico.

1. Procesamiento tisular y generación de discos cartilaginosos

  1. Preparación de tejidos
    1. Después de la resección postoperatoria, coloque las muestras de cartílago en un recipiente lleno de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con penicilina-estreptomicina al 5% (v/v). Asegúrese de que las muestras estén completamente sumergidas en el medio. El tiempo transcurrido entre la resección quirúrgica y el tratamiento posterior del cartílago no debe exceder las 24 h. Asegúrese de que, a lo largo de todo el proceso, las muestras estén completamente sumergidas en medios para evitar que se sequen.
    2. Corta el cartílago del hueso con un bisturí.
  2. Generación de discos de cartílago
    1. Generar discos de cartílago de 4 mm de diámetro utilizando un punzón de biopsia.
      NOTA: Es importante seleccionar y resecar las zonas del cóndilo donde el espesor de la capa de cartílago supere 1 mm. Esto puede ser problemático, especialmente alrededor de las zonas de carga, donde la capa de cartílago generalmente pierde su grosor debido a procesos de desgaste o degeneración.
    2. Coloque los discos de cartílago de 4 mm generados previamente en un dispositivo de corte hecho a medida y fije y mantenga estables los discos de cartílago mediante una espátula. Al colocar los discos de cartílago en el dispositivo de corte, se debe tener cuidado. Coloque las muestras de modo que la capa superior del cartílago (la zona superficial del cartílago articular) no quede frente a la cuchilla
    3. Corta los discos de cartílago con una cuchilla de afeitar. De este modo, se generan muestras de cartílago en forma de disco de 4 mm x 1 mm. Para evitar que la muestra se seque, realice el corte del tejido lo más rápido posible.
    4. Recoja cada disco con la ayuda de una espátula y coloque los discos de cartílago generados en tubos de 1,5 ml que contengan 1 ml de DMEM suplementado con penicilina-estreptomicina al 5% (v/v). Coloque aproximadamente 15 discos en un tubo.
  3. Corte criotomos de los discos de cartílago (para cortes perpendiculares)
    NOTA: Este paso es opcional y se puede emplear si se desea una visualización lateral de la distribución del patrón celular dentro de los discos cartilaginosos. Se puede utilizar como método de verificación, ya que la distribución del patrón celular es una característica 3D del cartílago articular26. También se puede utilizar el corte óptico y las reconstrucciones en 3D de los discos cartilaginosos completos utilizando un microscopio confocal, eliminando, por lo tanto, la necesidad de seccionar las muestras como se describe en el protocolo.
    1. Cubra el disco cartilaginoso con medio de inclusión soluble en agua y colóquelo en su borde en la perilla de criotomo (con la superficie del disco perpendicular a la superficie de la perilla). En el dispositivo criotomo, el medio de inclusión se congela a bajas temperaturas.
    2. Con un criotomo estándar, seccione el tejido lateralmente con un grosor de 60 μm hasta llegar a la mitad del disco (es decir, cuando las criosecciones alcancen una longitud de 4 mm) y recoja las rodajas. Al seccionar el explante discal perpendicularmente, se pueden visualizar todas las zonas del cartílago (superficial, medio y profundo).
    3. Recoja las secciones en un portaobjetos de vidrio y retire el medio de inclusión soluble en agua lavando tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).

2. Clasificación del disco cartilaginoso en función del patrón espacial celular

  1. Tinción de las muestras de cartílago en forma de disco
    1. Colocar un disco de cartílago (sección 1.2) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y añadir 130 μL de colorante de fluorescencia permeable a la célula a una dilución de 1:1.000 en cada pocillo.
    2. Inspeccione visualmente toda la placa y asegúrese de que solo se coloque un disco en cada pocillo. Incubar la placa durante 30 min en la incubadora de cultivo celular estándar a 37 °C.
  2. Tinción de las rodajas de cartílago de 60 μm
    1. Coloque suavemente las secciones del disco de cartílago (sección 1.3) sobre portaobjetos de microscopio de vidrio con la ayuda de fórceps.
    2. Cubra las secciones de cartílago con un medio de montaje que contenga contratinción nuclear DAPI y coloque suavemente cubreobjetos que sean adecuados para microscopía de fluorescencia.
    3. Sella los bordes de cada cubreobjetos con esmalte de uñas transparente normal y déjalo secar durante 3 minutos.
  3. Clasificación e imágenes del cartílago de arriba hacia abajo y de lado
    NOTA: Cada disco debe examinarse bajo un microscopio fluorescente. El objetivo de este paso es clasificar los discos en función de su patrón celular predominante (cuerdas simples, cuerdas dobles, grupos pequeños, grupos grandes o difusos).
    1. Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de la placa del microscopio de fluorescencia.
    2. Seleccione el filtro de fluorescencia adecuado de Em 495 nm/Ex 515 nm (para la obtención de imágenes de arriba hacia abajo de los discos de cartílago preparado en la sección 2.1.) o Em 358 nm/Ex 461 nm (para la obtención de imágenes de visión lateral de las secciones de cartílago preparadas en la sección 2.2) y el objetivo 10x.
      NOTA: El uso del objetivo 10x permite inspeccionar toda la circunferencia del disco y se pueden excluir las muestras con tinción no homogénea o inadecuada. Sin embargo, el uso de solo la vista de arriba hacia abajo puede resultar en la percepción de cambios en la organización celular como resultado del análisis de las capas de tejido más profundas que se hacen visibles a la observación de arriba hacia abajo por la erosión superficial. A modo de ejemplo, una cadena ascendente que sigue las arcadas de colágeno podría percibirse como una sola célula o como células dispersas (patrón difuso)26. Como resultado, ambos lados de los discos deben inspeccionarse para garantizar la selección adecuada del patrón celular.
    3. Determinar visualmente el patrón celular que se muestra en cada disco cartilaginoso. Es poco probable que un disco tenga un solo tipo de patrón celular. Para la parte del disco en la que la disposición de los condrocitos no coincide con el patrón de interés, acepte las muestras solo si el patrón no deseado se encuentra en la periferia, donde no se están realizando mediciones de AFM (es decir, hasta 0,5 mm del borde del disco), y asegúrese de que esto no exceda el 10% de la superficie total del disco27, Artículo 28.
  4. Adquisición de imágenes de todos los discos cartilaginosos
    1. Seleccione el objetivo 10x del microscopio y colóquelo debajo del pocillo preseleccionado que contiene un disco de cartílago individual. Concéntrese en el disco para ver el patrón celular.
    2. Seleccione la función Navegador para obtener una visión general de todo el pozo. Utilice el botón izquierdo del ratón y arrastre para desplazarse a una posición diferente del escenario. Con la rueda del ratón, acérquese y aléjese.
      NOTA: En este punto, se puede ver una vista previa del pozo con toda la muestra haciendo doble clic en cada área de interés secuencialmente.
    3. Seleccione un cuadrado que abarque el área de interés que se va a escanear; En este punto, todas las baldosas individuales que componen el mosaico se volverán visibles.
    4. Ajuste la exposición/intensidad de la luz para que las celdas se puedan visualizar claramente desde el fondo. En este punto, el brillo/contraste de la imagen se ha ajustado para todos los mosaicos y ya no se puede personalizar individualmente para cada mosaico.
      NOTA: Como las celdas cercanas al borde del disco a menudo emiten una señal de fluorescencia más alta que las celdas en el centro, se deben adaptar los ajustes de exposición/intensidad de luz.
      1. Para evaluar si el tiempo de exposición es apropiado para un canal en particular, examine la distribución de la señal en el histograma. Mediante el uso del mecanismo de exposición automática incluido en el software de imagen del microscopio, visualice todas las células que residen dentro del disco.
    5. Seleccione la opción Punto de mapa de enfoque del software y, a continuación, seleccione cada mosaico individual haciendo clic con el botón izquierdo en el centro del mismo.
    6. Seleccione la opción Mapa de enfoque. Se muestra una ventana con todos los mosaicos seleccionados anteriormente. Haga doble clic en un mosaico de la lista para mostrarlo y enfocarlo correctamente.
    7. Haga clic en Establecer Z para guardar el plano focal y pasar al siguiente mosaico. Después de ajustar el plan focal para cada mosaico individual, comience la adquisición de imágenes pulsando Iniciar escaneo.
      1. Si el escaneo muestra barras horizontales y/o verticales más oscuras, esto puede deberse a una iluminación inadecuada y desigual de los fotogramas individuales. Resuelva esto utilizando la opción Sombreado vinculado incorporada en el software antes del escaneo real.
    8. Guarde, exporte y anote correctamente las imágenes.

3. Abordaje biomecánico de los explantes de cartílago

  1. Preparación de muestras para mediciones de AFM
    1. Fijar cada disco cartilaginoso preseleccionado que contenga un patrón celular (sección 2) en placas de Petri mediante pegamento biocompatible. Agregue suficiente pegamento de muestra en los lados superior, inferior, izquierdo y derecho del disco.
    2. Cubra los discos con 2,5 ml de medio L-15 de Leibovitz sin L-glutamina. Agregue el medio Leibowitz suavemente sobre las muestras para evitar que la muestra se desprenda de la superficie debido a las ondas creadas por el medio.
  2. Carga de las muestras en el AFM
    1. Coloque la placa de Petri en el portamuestras del dispositivo AFM y encienda el calentador de placa de Petri ajustado a 37 °C. Deje que la placa de cultivo de tejidos alcance la temperatura deseada. Esto se hace para excluir posibles artefactos causados por la variación de temperatura.
  3. Calibración AFM-voladizo
    1. Inicialice la configuración del software como lo describieron anteriormente Danalache et al.29.
    2. Seleccione un soporte en voladizo de bloque de vidrio adecuado para las mediciones de líquidos y colóquelo con cuidado en el cabezal AFM. Un mecanismo de bloqueo asegura el bloque de vidrio en el cabezal AFM. Asegúrese de que la superficie reflectante del bloque de vidrio esté recta y paralela al soporte AFM.
    3. Coloque el voladizo en la superficie del soporte del voladizo de bloque de vidrio con cuidado. El voladizo en sí debe descansar en el plano óptico pulido, en el centro del bloque de vidrio.
    4. Coloque con cuidado un faldón de silicona (membrana de silicona) en la base del soporte en voladizo para evitar la condensación del medio en el cabezal AFM.
    5. Baje el voladizo en pasos de 100 μm utilizando la función de motor paso a paso hasta que esté completamente sumergido en el medio.
    6. Ejecute un enfoque de escáner con los parámetros de aproximación descritos por Danalache et al.29. Retraiga el voladizo 100 μm una vez que se alcance el fondo de la placa de Petri.
    7. Calibrar el voladizo siguiendo los pasos exactos y ejecutar los parámetros descritos por Danalache et al.29. Al final de la calibración, la deflexión vertical se guarda y se muestra en newton (N) unidades de fuerza en lugar de voltios (V), la unidad del registro original por el detector de fotodiodos. En los experimentos aquí, se obtuvo un punto de ajuste de 4,47 nN después de la calibración.
    8. Utilizando la función de motor paso a paso, retraiga el voladizo a 1.000 μm.
  4. Identificación del sitio de medición de cartílago deseado bajo el AFM
    NOTA: Debido al grosor de 1 mm de los discos de cartílago, el voladizo no es visible en el campo de visión mientras se navega sobre la muestra.
    1. Utilice la cámara CCD del microscopio para identificar el voladizo. El voladizo AFM debe colocarse en un área libre de muestras de la placa de Petri.
    2. Inicie un enfoque de escáner con el voladizo en un área limpia y libre de muestras de la placa de Petri, utilizando los mismos parámetros descritos por Danalache et al.29.
    3. Retraiga aún más el voladizo a 1,5 mm de distancia de la parte inferior de la placa con el control del motor paso a paso. Este paso es crucial para evitar una colisión directa entre el voladizo y la muestra.
    4. Cambie de la vista de campo claro a la de fluorescencia e identifique visualmente la parte superior del disco.
    5. Mueva el portamuestras AFM exactamente 2 mm hacia el centro del disco. Este punto se considera el centro del disco cartilaginoso.
    6. Ejecute un enfoque de escáner y, una vez alcanzada la superficie del disco cartilaginoso, retraiga el voladizo 100 μm.
  5. Mediciones de la curva fuerza-distancia
    1. Detalle de las celdas colocadas en el lugar de medición deseado. Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar las mediciones y la generación de curvas fuerza-distancia en la posición de destino.
    2. Adquiera cinco curvas de fuerza-distancia en cada sitio de medición. Retraiga el voladizo 500 μm y muévalo al siguiente sitio de medición.
      NOTA: La retracción del voladizo es un paso crucial, ya que la superficie del disco cartilaginoso no es homogénea y tiene irregularidades. Un montículo alto en la superficie de la muestra puede provocar una colisión dramática, lo que provocará daños no deseados en la punta del voladizo/muestra. Recomendamos seleccionar un mínimo de cinco sitios de medición diferentes dispersos por la superficie del disco y adquirir un mínimo de cinco curvas de fuerza-distancia en cada sitio.
    3. Inspeccione las curvas fuerza-distancia y guárdelas.
  6. Estimación de los módulos de Young mediante el modelo de ajuste de Hertz
    1. Abra las curvas de fuerza-distancia generadas que se van a analizar (archivo .jpk) en el software de análisis de datos utilizando la opción Abrir un lote de curvas de espectroscopia .
    2. Seleccione el modelo de ajuste Hertz y, a continuación, seleccione la opción Ajuste de elasticidad .
      1. La opción de ajuste de elasticidad realiza automáticamente los siguientes cálculos en la curva fuerza-distancia seleccionada: calcula la línea base y resta de toda la curva para eliminar el desplazamiento de la línea base (la línea base vuelve a cero en el eje y); determina el punto de contacto detectando el punto en el que la curva fuerza-distancia cruza la línea de fuerza cero (el punto de contacto se establece en cero en el eje x); calcula la separación entre la punta y la muestra (se resta la señal de altura del piezoeléctrico que tiene en cuenta la flexión del voladizo); y ajusta la curva fuerza-distancia automáticamente con el modelo seleccionado. Si se desea, cada uno de estos pasos también se puede llevar a cabo de forma independiente.
    3. Adáptese utilizando los siguientes parámetros de ajuste: relación de Poisson de 0,5 y el radio de punta en voladizo adecuado.
      NOTA: Cuando se utiliza un voladizo con una punta esférica en voladizo, se debe utilizar el modelo de ajuste Hertz. El voladizo utilizado en este estudio tenía una punta esférica con un radio de 5 μm. Recomendamos ajustar la curva fuerza-distancia hasta que se alcance la fuerza máxima aplicada (punto de ajuste).
    4. Compruebe visualmente el ajuste de la curva fuerza-distancia para garantizar su corrección. Este paso debe realizarse para cada una de las curvas fuerza-distancia analizadas.
  7. Determinación de la profundidad de indentación
    NOTA: Dependiendo de la herramienta de análisis de datos que se utilice, este proceso puede diferir. El experimentador puede leer fácilmente la profundidad de indentación siguiendo una serie de pasos que se incluyen en el programa de análisis de datos.
    1. Abra cada una de las curvas de fuerza-distancia generadas en el software de análisis de datos y seleccione el modelo de ajuste de hercios como proceso de análisis.
    2. Aplique la opción Restar desplazamiento de línea base para poner a cero el eje de deflexión vertical (eje Y) y seleccione la función Desplazamiento + Inclinación .
    3. Utilice la función Buscar punto de contacto para identificar automáticamente el punto de contacto , que se lleva automáticamente a una coordenada x de cero.
    4. Reste la distancia teniendo en cuenta únicamente la deflexión en voladizo de la altura piezoeléctrica bruta durante la indentación utilizando la función Posición vertical de la punta .
    5. Seleccione la opción Ajuste de elasticidad para mostrar la curva fuerza-distancia procesada y seleccione el área del gráfico para que se alinee con el valor más negativo en el eje de posición vertical de la punta (eje x).
    6. Lea y documente la sangría desde el cuadro X Min en la pestaña de parámetros. Guarde y documente los resultados.

4. Análisis estadístico

  1. Abra el software estadístico. Seleccione Nuevo conjunto de datos en el menú desplegable.
  2. Abra la pestaña Vista de variables después de seleccionar el archivo DataSet . Defina las variables numéricas para cada categoría de patrón celular: cadenas simples = SS, cadenas dobles = DS, grupos pequeños = SC, grupos grandes = BC, difusos y módulos de Young.
  3. En la pestaña de vista de datos, introduzca los datos de los módulos de Young medidos para cada una de las categorías de patrones celulares correspondientes. Analice la distribución de datos seleccionando Analizar en la barra de menús y, a continuación, Análisis exploratorio de datos.
  4. Seleccione los módulos de Young como variable dependiente y el patrón celular como lista de factores. Un diagrama de caja utilizado para la sección de resultados se muestra entre los resultados del archivo de salida.
  5. Para realizar un análisis estadístico, elija Muestras dependientes en la sección de prueba no paramétrica de la pestaña de la barra de menús Analizar. Seleccione Módulos de Young como Campos de Prueba y Patrón Celular como Grupos en la pestaña de campos.
    NOTA: Los resultados se muestran en el archivo de salida. Para el análisis estadístico se realiza una prueba de Friedman.
  6. Incorpore los valores p de la prueba no paramétrica en el diagrama de caja que se creó en el paso 4.4. Guarde los resultados haciendo clic en Archivo en la barra de menús y seleccionando Guardar.

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Representative Results

Utilizando un dispositivo de corte de fabricación propia, pudimos explantar y generar pequeños discos de cartílago (4 mm x 1 mm) a partir de cóndilos humanos frescos que contenían un patrón espacial celularúnico 30 de cuerdas simples (SS, Figura 2A), cuerdas dobles (DS), grupos pequeños (SC), grupos grandes (BC; Figura 2A) y difusa (Figura 2B). En la Figura 3A se muestra un explante de cartílago representativo. La selección de los discos que mostraban un solo tipo de patrón se realizó mediante imágenes de fluorescencia de arriba hacia abajo (Figura 2). La variación topográfica del disco de la superficie del cartílago se ilustró aún más mediante imágenes de vista lateral de secciones de 60 μm de espesor generadas a partir de los discos de cartílago (Figura 2C). En la superficie de los discos de cartílago osteoartrítico explantados había fibrilación superficial y hendidura de la matriz (Figura 3B,C). Esto fue particularmente notable en los discos representativos de la progresión avanzada de la OA, representada por la presencia de BC (Figura 2A). Después de la clasificación posterior a la fluorescencia, se evaluó la rigidez de los discos mediante microindentaciones AFM. Para ello, los discos de cartílago generados se fijaron con éxito en la placa de Petri AFM mediante pegamento biocompatible (Figura 3D) para evitar la deriva de la muestra durante las mediciones (Figura 3E). Hay que ajustar la cantidad de pegamento utilizado. Una cantidad insuficiente de pegamento provocará inestabilidad en el disco, mientras que añadir demasiado pegamento puede provocar una dispersión no deseada del pegamento por debajo y/o sobre el disco de cartílago. Esto último conduce a artefactos de medición y a una mala identificación del disco bajo el microscopio de fluorescencia. La aplicación inadecuada de pegamento o los movimientos bruscos de la muestra durante la fijación son problemas frecuentes que hacen que el tejido se desprenda de la placa de Petri y deben evitarse.

En la Figura 4A se muestra una reducción gradual representativa de la rigidez junto con la disposición del patrón celular. Los valores de rigidez fueron mayores en los discos que contenían SS (mediana de 2,6 kPa), representativos de áreas de cartílago sano no comprometidas. Con el inicio y la progresión de la artrosis, las mediciones de AFM mostraron una fuerte disminución escalonada de la rigidez del 42% en DS (1,5 kPa), del 77% en SC (0,6 kPa) y, en última instancia, del 88% en estadios avanzados representados por BC (0,3 kPa; Figura 4A). Los discos que contenían un patrón difuso mostraban una elasticidad elevada con una variación importante de los valores individuales del módulo de Young. Para todos los discos cartilaginosos con una organización de patrón celular predominante asignada, se encontró que la profundidad de indentación asociada con el punto de ajuste empleado (4.477 nN) era inversamente proporcional a la rigidez (Figura 4B). En la Figura 4C se muestra una curva representativa de fuerza-distancia generada, y en la Figura 4D se muestra un ajuste en hercios, así como la identificación del punto de contacto.

El ajuste correcto depende, entre otros factores, de la correcta determinación de la línea de base. Si la detección automática de la línea de base es errónea (por ejemplo, debido a una línea de base turbulenta), el ajuste también se puede determinar manualmente y permite al usuario seleccionar una línea de base más representativa para las mediciones. Sin embargo, si la curva fuerza-distancia generada no permite un ajuste adecuado, debe descartarse. La Figura 5 muestra ejemplos de curvas fuerza-distancia incorrectas. La generación de curvas de fuerza-distancia adecuadas en los explantes de cartílago articular osteoartrítico puede ser difícil debido a la superficie irregular del tejido, por un lado (los ejemplos se muestran en la Figura 5A, B), y la inestabilidad de la muestra causada por una fijación inadecuada de la muestra (ejemplos mostrados en la Figura 5C, D). Los artefactos pueden ser causados por múltiples puntos de contacto entre la sonda y la muestra (debido a la superficie irregular del cartílago degenerado) o por el movimiento no deseado del tejido (visible a través de cambios en el plano focal). Estos artefactos se pueden ver en las curvas de fuerza-distancia generadas y son indicativos de un contacto subóptimo entre el voladizo AFM y la superficie del cartílago o de una fijación incorrecta de la muestra a la placa de Petri (ver Figura 5A-D).

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo del procedimiento experimental. Resumen de los pasos experimentales en orden cronológico, desde las muestras de cartílago resecadas intraoperatoriamente hasta la generación de discos de cartílago de 4 mm x 1 mm, la tinción de fluorescencia y la clasificación de los discos en función de la organización del patrón celular mediante imágenes de arriba hacia abajo y de vista lateral y, en última instancia, la evaluación de la elasticidad mediante mediciones de fuerza atómica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes de fluorescencia de discos de cartílago representativos. (A) Imágenes en mosaico en 2D y un campo ejemplar ampliado de discos de cartílago teñidos con colorante permeable a la membrana celular con un aumento de 100x. El disco superior muestra un disco representativo de una sola cuerda, mientras que el inferior es representativo de un disco de racimo grande (inferior). (B) Imagen de mosaico de un disco de patrón difuso visto desde la superficie (arriba), y el mismo disco fotografiado desde la parte inferior (abajo). (C) Vista lateral de la tinción nuclear de cortes de 60 μm de discos de cartílago. La barra de escala blanca representa 500 μm para las imágenes de mosaico (campo de visión más grande, A [panel izquierdo], B, C) y 100 μm para las imágenes ampliadas y enfocadas (A [panel derecho]). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Discos de cartílago articular explantados. (A) Imagen representativa de un explante de disco de cartílago de 4 mm x 1 mm generado a partir de cartílago articular humano fresco. La barra de escala representada en blanco representa 2 mm. (B) Imagen representativa del cartílago osteoartrítico nativo donde la superficie del tejido presenta fibrilación superficial y hendidura macroscópicamente visibles. La barra de escala representada en blanco representa 1.000 mm. (C) Representación esquemática de la superficie del cartílago fibrilado. (D) Antes de las mediciones de AFM, cada uno de los explantes de disco de cartílago se fijó correctamente por medio de pegamento de muestra biocompatible a la superficie de la placa de Petri de AFM para evitar artefactos debido a la deriva de la muestra durante las mediciones de indentación reales como se muestra en (E). La barra de escala blanca representa 4 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados representativos de las mediciones de microscopía de fuerza atómica de los discos de cartílago articular ordenados en función de la organización de su patrón celular predominante. (A) Diagrama de caja que muestra la mediana de los módulos de Young calculados de cinco discos, uno para cada patrón celular, que se originan en un paciente. Se realizaron un total de 25 mediciones en cada disco (cinco mediciones para cinco sitios de medición distintos). La línea negra dentro del rectángulo representa el valor de la mediana, las extremidades inferior y superior del rectángulo representan el primer y tercer cuartil, respectivamente, y las barras de error representan los valores más bajos y más altos de cada grupo. (B) Diagrama de puntos que representa los 125 puntos de profundidad de indentación para cada patrón celular. (C) Curvas de fuerza-distancia ejemplares adquiridas con el AFM con un módulo de Young calculado de 0,4 kPa. (D) Un ajuste representativo de hercios y determinación del punto de contacto para la curva fuerza-distancia que se muestra en (C). El eje x muestra la posición vertical de la punta (que es la distancia recorrida por el piezoeléctrico, y la longitud que representa la flexión en voladizo se resta automáticamente de la parte de contacto de la curva fuerza-distancia). *p < 0,05. Para el análisis estadístico se utilizó la prueba de Friedman. Abreviaturas: SS = cadenas simples; DS = cadenas dobles; SC = conglomerados pequeños; BC = grandes racimos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Ejemplos de curvas fuerza-distancia erróneas . (A) La curva fuerza-distancia muestra una desviación masiva seguida de una recuperación cerca del nivel de referencia antes de que se observe una hendidura continua de la superficie. Este fenómeno se puede atribuir a un obstáculo relativamente grande (por ejemplo, grandes hendiduras superficiales que sobresalen de la capa superior del cartílago). (B) La curva de fuerza-distancia extendida muestra múltiples picos pequeños. Se cree que estas curvas son causadas por irregularidades a microescala en la superficie del cartílago (por ejemplo, fibrilación). Tanto (C) como (D) muestran curvas fuerza-distancia con cursos bifásicos. Ambas curvas de fuerza-distancia son representativas de una mala fijación de la muestra y de una deriva de la muestra. También es bastante común en estos casos ver un cambio brusco en el plano focal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Al ser una enfermedad progresiva y multifactorial, la artrosis desencadena cambios estructurales y funcionales en el cartílago articular. A lo largo del curso de la artrosis, las alteraciones en las características mecánicas se acompañan de cambios estructurales y bioquímicos en la superficie del cartílago articular27,31. Los eventos patológicos más tempranos que ocurren en la OA son la depleción de proteoglicanos junto con la disrupción de la red de colágeno32,33,34. Estos cambios sutiles tempranos en la superficie son difíciles de identificar con pruebas masivas, porque el comportamiento mecánico se promedia en toda la profundidad del tejido. Además, una cuestión aún no abordada es si los cambios funcionales a nivel de órganos y tejidos se relacionan con cambios estructurales y funcionales a micro o nanoescala. Con este fin, la MFA se considera uno de los métodos más sensibles, capaz de detectar los cambios biomecánicos más tempranos que ocurren con el inicio de la OA7. Permite realizar mediciones de rigidez tanto a escala micro como nanométrica en muestras nativas, proporcionando información sobre las propiedades mecánicas del cartílago articular35,36. En este protocolo, utilizando indentaciones de micro-AFM, medimos las propiedades elásticas de explantes humanos de cartílago articular sano y osteoartrítico. Los resultados mostraron que los explantes de cartílago son altamente representativos de los eventos locales tempranos de OA, con una notable disminución gradual de la rigidez que se produce en los explantes de cartílago específicos del patrón. Además, los resultados están en línea con investigaciones publicadas previamente que mostraron una notable disminución de la rigidez junto con la organización del patrón celular23,24,27,37.

Actualmente se necesitan modelos humanos nativos corroborados que imiten varios aspectos de la patogénesis y progresión de la OA para abordar las deficiencias de la investigación traslacional y los desafíos de traducir los datos in vitro a un entorno clínico. Hasta la fecha, ningún modelo puede representar con precisión el complejo compartimento del cartílago humano nativo, y mucho menos los tejidos articulares relacionados con la edad que son propensos a la artrosis en respuesta a los estímulos iniciadores de la enfermedad38. Los modelos basados en explantes más utilizados hasta el momento fueron de origen bovino o bovino y aplicaron un tratamiento con citoquinas inflamatorias fuertes o carga mecánica 39,40,41. Este protocolo, por otro lado, demuestra cómo generar pequeñas muestras de cartílago humano en forma de disco explantadas (4 mm x 1 mm), que son indicativas de las etapas individuales de eventos específicos de OA. Los explantes de cartílago se clasifican y se asignan por estadios utilizando la organización espacial celular como biomarcador basado en imágenes30,42. Dado que los cambios tempranos en las propiedades biomecánicas ya pueden ser identificados y cuantificados tan pronto como comienzan a surgir las cuerdas dobles23,27, en una etapa en la que la superficie del cartílago todavía aparece macroscópicamente intacta26, este modelo basado en explantes permite la investigación de un compartimento de cartílago nativo local y puede proporcionar información perspicaz sobre la artrosis temprana. Además, este modelo de cartílago podría ser útil para investigar la respuesta de las células y la matriz a las alteraciones mecánicas e inflamatorias en un hábitat local nativo en3D 38,39. Al ser relativamente simples y fáciles de generar, estos explantes de cartílago también se pueden utilizar para estudiar la heterogeneidad de la artrosis, que es un factor limitante en el desarrollo y prueba de fármacos modificadores de la enfermedad para la artrosis43. También hay que tener en cuenta que la escalabilidad y la dependencia de los pacientes que se someten a una cirugía de reemplazo articular son dos de las deficiencias del modelo.

Es bien sabido que el cartílago articular presenta un comportamiento peculiar dependiendo del nivel de escala que se evalúe. Como indican Loparic et al., a microescala, el cartílago se comporta como un material no estructurado y uniforme35, y este enfoque da una aproximación de la rigidez global localizada del cartílago. Con respecto a si las micro o nano hendiduras son más adecuadas, un estudio de 2004 de Stolz et al.44 comparó las indentaciones a micro y nanoescala para evaluar las propiedades estructurales y mecánicas del cartílago articular. Los autores enfatizaron que para la hendidura esférica a microescala del cartílago articular, los componentes estructurales finos a escala nanométrica (es decir, fibras de colágeno individuales y proteoglicanos) comúnmente comparten la tarea de soportar la carga. En este sentido, las propiedades mecánicas de los agregados difieren notablemente de las de los nanocomponentes individuales. Los mismos autores propusieron que se podría utilizar una combinación de micro y nanohendiduras para evaluar los perfiles de rigidez local general del cartílago articular, así como la rigidez relacionada con los componentes estructurales finos44.

Numerosos experimentos de indentación basados en AFM han utilizado puntas en voladizo piramidales afiladas (radio = 15-20 nm)22,36,44 para evaluar la mecánica del cartílago. Aunque actualmente se considera que las nanohendiduras con voladizos afilados son más adecuadas para evaluar las propiedades mecánicas más finas, las puntas esféricas en voladizo producen resultados más consistentes y fáciles de modelar e interpretar cuando se analizan muestras biológicas blandas44,45. Además, Stolz et al. demostraron que las nano-hendiduras de AFM del cartílago articular degradado enzimáticamente (es decir, elastasa) no son posibles porque el tejido se vuelve tan pegajoso que la adhesión de la punta de la muestra domina las curvas fuerza-distancia, lo que hace que los datos sean inviables44.

En las mediciones actuales de AFM, se utilizó un voladizo con una punta esférica en voladizo de 5 μm de radio. La elección del voladizo fue motivada por la intención de promediar las propiedades mecánicas del tejido en una superficie bastante grande y minimizar el daño infligido en la superficie del cartílago. La relación entre la fuerza aplicada en voladizo y la indentación de la muestra resultante se ajustó con el modelo de ajuste de Hertz. Cuando se utilizan indentadores esféricos, se recomienda el modelo de ajuste de Hertz, descuidando las fuerzas de atracción que actúan entre la punta del voladizo y la superficie de la muestra46. Las ecuaciones para el modelo hertziano se muestran en las Ec.1 y Eq.2.

Equation 1Ec.1

Equation 2Ec.2

Donde F = fuerza; E = módulo de Young; v = Razón de Poisson; δ = sangría; a = radio del círculo de contacto; y Rs = radio de la esfera.

En última instancia, el modelo calcula la elasticidad celular/tisular47, expresada formalmente como el módulo de Young (E). El modelo de ajuste de Hertz tiene en cuenta varias características, como la forma y el tamaño de la punta, la hendidura y la deformabilidad de la muestra. Si estos requisitos no se cumplen idealmente, el modelo puede proporcionar una estimación inexacta del módulode Young 46.

El modelo de ajuste de Hertz asume que la deformación y la tensión elástica dependen linealmente del módulo elástico, lo que implica que la indentación en la muestra sigue siendo mucho menor que el espesor de la muestra en sí46. Esta suposición se cumplió fácilmente en esta configuración, donde los explantes de cartílago tenían un espesor de 1 mm en comparación con las hendiduras de unos pocos micrómetros.

El cartílago articular se puede modelar como un material viscoelástico poroso48,49. El comportamiento viscoelástico resulta de la fricción entre los constituyentes intracelulares/citoplasmáticos o de la matriz, como moléculas, orgánulos y la red colágeno-proteoglicano50,51. Como su nombre lo indica, los materiales viscoelásticos combinan dos propiedades distintas: viscoso -el material se deforma lentamente cuando se somete a una carga externa- y elástico -el material vuelve a su configuración inicial una vez que se elimina la carga aplicada- 52,53. El comportamiento viscoelástico se manifiesta como una histéresis entre las curvas de aproximación (extendida) y retracción en las curvas fuerza-distancia 46,52, similar a las obtenidas en este estudio (Figura 4C). Además, una característica de los materiales viscoelásticos es que sus propiedades mecánicas dependen de la velocidad de deformación, aumentando la rigidez del material con la velocidad a la que se aplica la carga (velocidad de indentación)54. Así, mediante la selección de diferentes velocidades de carga, se genera una familia de curvas fuerza-distancia, cada una de las cuales representa las propiedades mecánicas de la muestra ensayada a cada velocidad de carga52. Por lo tanto, al intentar comparar los resultados de varios trabajos, es fundamental tener en cuenta todos los parámetros de sangría. En general, cuando se mide a escala micrométrica (como en este estudio con una punta esférica en voladizo de 5 μm), el cartílago articular se comporta como un material no estructurado y uniforme, generando un módulo elástico acumulativo que incluye contribuciones tanto elásticas como viscosas a la rigidez debido a la naturaleza poroviscoelástica del tejido35.

Otra suposición del modelo hertziano es que la profundidad de la indentación es menor que el radio de la punta esférica en voladizo55. La profundidad de indentación representa el desplazamiento máximo de la punta en voladizo después del primer contacto con la muestra. A la carga máxima, la profundidad máxima de indentación es el desplazamiento total de la muestra y la punta en voladizo. La directriz de Bueckle establece una profundidad máxima de indentación del 10% del espesor total de una muestra con la misma estructura a lo largo de56, de lo contrario, los resultados varían según la relación profundidad-espesor. Para un radio de punta en voladizo de 5 μm, los explantes de cartílago en este estudio se indentaron en 1,1 μm en promedio, con algunos picos de 3 μm en algunos casos, particularmente para los explantes de cartílago altamente degenerados. En este caso, se buscó un compromiso, ya que, en el entorno experimental, se requieren fuerzas relativamente altas asociadas con grandes hendiduras para neutralizar las irregularidades superficiales del cartílago degenerado. Una hendidura más leve daría lugar al examen de la fibrilación superficial y la fisuración del colágeno, que son características comunes del cartílago altamente degenerado57.

Crucial para el modelo de ajuste de Hertz es también la correcta identificación del punto en el que la punta en voladizo entra en contacto directo con la muestra, denominado genéricamente punto de contacto. Sin embargo, esto puede resultar problemático cuando se indentan muestras demasiado pegajosas o demasiado blandas, ya que puede dar lugar a múltiples puntos de contacto sonda-muestra58,59. De hecho, como bien subrayan A-Hassan et al., en el caso de los tejidos biológicos blandos, la determinación precisa del punto de contacto es uno de los problemas más molestos60. Este efecto también se observó en los explantes nativos de cartílago osteoartrítico, ya que, dependiendo de la etapa de degeneración, la superficie del tejido pierde sus características mecánicas nativas y a menudo es irregular, presentando fibrilación superficial y hendidura (Figura 3B,C). Este fenómeno se observó particularmente en los explantes de cartílago, donde el patrón celular dominante eran grandes grupos (Figura 2C). Estas inhomogeneidades en la superficie del cartílago pueden dar lugar a múltiples puntos de contacto entre la sonda y la muestra y, por lo tanto, a resultados erróneos. En algunos casos se observaron grandes desviaciones, seguidas de una rápida recuperación de la línea de base antes del tramo final de la curva fuerza-distancia (Figura 5A). Esto podría atribuirse a un gran obstáculo en el camino de la punta en voladizo (p. ej., áreas de fibrilación avanzada con cartílago deshilachado y partido). En otros casos, la pendiente final de la curva fuerza-distancia estaba dispersa con irregularidades más pequeñas (Figura 5B), lo que indica contacto con obstáculos sucesivamente más pequeños (p. ej., microfibrilación del tejido). En tales casos, el sitio de medición debe volver a medirse o incluso cambiarse para garantizar la fiabilidad y la reproducibilidad de los datos. Con este fin, también es importante inspeccionar cuidadosamente la salida de la curva fuerza-distancia del AFM para la correcta identificación del punto de contacto. Este es un punto crucial a tener en cuenta, ya que se ha demostrado que una identificación incorrecta del punto de contacto por 50 nm da como resultado una estimación incorrecta del valor de E en un orden de magnitud61. Varios estudios han comenzado a utilizar enfoques automatizados para determinar el punto de contacto de las curvas de fuerza-distancia, con el objetivo de evitar la entrada subjetiva del usuario al estimar el punto de contacto mediante inspección visual y mejorar la precisión. Esto se vuelve aún más crucial cuando se trata de un gran número de curvas de fuerza-desplazamiento, como las generadas en las mediciones de mecánica celular47,62. Aunque se han propuesto varias estrategias para automatizar la determinación del punto de contacto 47,63,64,65, la estrategia óptima depende en gran medida de las condiciones experimentales y de factores como el modelo utilizado para analizar los datos, la forma de la sonda, la interacción mecánica (no) adhesiva entre la punta en voladizo y la muestra, así como el comportamiento (no) hertziano de la muestra 63.

La deriva de la muestra es otro problema común que puede causar artefactos y determinación errónea del punto de contacto (Figura 3E). Básicamente, significa que la muestra no está montada correctamente en el portamuestras (placa de Petri) y la muestra se mueve durante las mediciones de AFM. El efecto es particularmente pronunciado cuando se traslada el voladizo AFM a un nuevo sitio de medición. Este aspecto se puede observar fácilmente durante las mediciones reales por un cambio repentino en el plano focal. Las curvas fuerza-distancia resultantes suelen tener una pendiente extendida bifásica, con un leve aumento al principio, que corresponde al estrechamiento del espacio vacío entre la parte inferior del disco y la placa de Petri a medida que el disco es empujado hacia abajo por el voladizo (véase la Figura 3E), seguido de una inclinación más firme en la segunda sección de la pendiente, lo que indica que el disco está siendo más indentado ahora que está en contacto directo con el fondo de la placa de Petri (Figura 5C, D). Para superar las distorsiones, se puede intentar fijar mejor las muestras utilizando un adhesivo de muestra adecuado (Figura 3D), manteniendo la temperatura constante apagando las fuentes externas de calor (luces) para evitar la deriva térmica y realizando mediciones de escaneo rápidas. En los experimentos aquí, observamos una deriva de deflexión en voladizo que ocurrió dentro de los primeros 15 minutos de la inmersión del voladizo en el medio (debido a cambios repentinos de temperatura). Después de este lapso de tiempo, la deriva suele ser insignificante. Como resultado, aconsejamos al experimentador que examine cuidadosamente la línea de base después de la inmersión en voladizo y que comience a medir una vez que se haya estabilizado. La duración de este proceso puede variar mucho dependiendo del voladizo utilizado.

Otro parámetro crítico para cualquier medición de AFM es el punto de ajuste, que es, de manera simplista, una medida de la fuerza aplicada por el voladizo a la muestra. Para el modo de contacto (como se utiliza en este estudio), el punto de ajuste representa una cierta deflexión del voladizo. Cuando se realizan varios escaneos o varias repeticiones de sitio, como en el protocolo aquí, la punta en voladizo puede adsorber partículas de la superficie de la muestra, por lo que a veces es necesario quitar el voladizo,limpiarlo adecuadamente y luego recalibrarlo antes de continuar con las mediciones.

Si bien las microindentaciones de AFM ofrecen nuevas e interesantes oportunidades de recopilación de datos, en particular en el contexto del cartílago osteoartrítico, la consistencia y la reproducibilidad de los datos producidos dependen en gran medida de varios parámetros, como se ha descrito anteriormente. Cuando se utiliza este enfoque para evaluar los cambios mecánicos causados por la degeneración del tejido cartilaginoso, primero se deben realizar algunas mediciones piloto en varios patrones espaciales para ampliar los resultados al diseño experimental específico. Las mediciones piloto de AFM deben realizarse con el procedimiento más normalizable, tomando suficientes muestras (por ejemplo, cinco discos) del mismo patrón para proporcionar una indicación del alcance de la variabilidad de los datos. Esto es particularmente importante cuando se intenta cuantificar y evaluar los primeros cambios relevantes de rigidez de OA (es decir, entre cuerdas simples y cuerdas dobles, Figura 4A). De hecho, en un estudio anterior, utilizando un enfoque similar, demostramos que se requería un tamaño de muestra de 30 especímenes humanos para evaluar los cambios biomecánicos en la matriz en función de la organización espacial de las células37.

Además, muchos de los pasos presentados en este protocolo son susceptibles de error humano y dependen en gran medida de la experiencia del operador. Teniendo en cuenta todos los factores que pueden influir en los resultados reales de la MFA, los valores absolutos de E informados en este estudio no son generalizables y son más bien específicos de esta configuración experimental. Sin embargo, la relación aquí presentada entre los diversos módulos de Young y los explantes de cartílago basados en patrones celulares (cuanto más patológico es el patrón espacial, menor es el módulo elástico [EM] del cartílago) no se ve afectada, ya que los hallazgos son consistentes con estudios previos que muestran cambios en la rigidez en función de la organización del patrón celular23,37.

En general, este protocolo paso a paso demuestra la funcionalidad de los explantes de cartílago articular nativo 3D estandarizados, que no solo son representativos de los eventos de reorganización celular impulsados por la artrosis que van desde el inicio hasta la progresión avanzada, sino que también se asocian con una disminución gradual de la rigidez. Los explantes pueden reflejar un modelo biomimético fiable para estudiar el inicio y la progresión de la artrosis, lo que permite probar y desarrollar diferentes modalidades de tratamiento ex vivo. El uso de un modelo de explante humano de este tipo en combinación con la evaluación biomecánica basada en AFM podría dar lugar a un cambio de paradigma para la investigación biomédica y la industria farmacéutica, allanando el camino para nuevas formas de identificar fármacos eficaces para la artrosis que tanto se necesitan.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a los cirujanos ortopédicos del Departamento de Cirugía Ortopédica del Hospital Universitario de Tubinga por proporcionar las muestras de tejido.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head  CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany JPK00518
Biocompatible sample glue  Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany H000033
Calcein AM Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA 14948 Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SAA-SPH-5UM Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device  Self-made  n/a Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope Leica Biosystems, Wetzlar, Germany DFC3000G
Cryotome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany CM3050S 
Data Processing Software for the AFM Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)  Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany 41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) Leica Biosystems, Wetzlar, Germany 11889113
Glass block cantiliver holder Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SP-90-05 Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine  Merck KGaA, Darmstadt, Germany F1315
Microscope glass slides Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS294775X50
Mounting medium With DAPI ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany 50011 Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany T-05-0117
Scalpel Feather Medical Products, Osaka, Japan 2023-01
Silicone Skirt Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSS IBM, Armonk, New York, USA SPSS Statistics 22 Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes  TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands SA6255012 Water-soluble embedding medium 

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Abordaje de cuestiones prácticas en la microindentación basada en microscopía de fuerza atómica en explantes de cartílago articular humano
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