Summary
Wir stellen einen Schritt-für-Schritt-Ansatz vor, um die häufigsten Probleme im Zusammenhang mit Mikroeindrücken in der Rasterkraftmikroskopie zu identifizieren und anzugehen. Wir veranschaulichen die aufkommenden Probleme an nativen menschlichen Gelenkknorpelexplantaten, die durch verschiedene Grade der Arthrose-bedingten Degeneration gekennzeichnet sind.
Abstract
Ohne Zweifel ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM) derzeit eine der leistungsfähigsten und nützlichsten Techniken zur Beurteilung von Mikro- und sogar Nanosignalen im biologischen Bereich. Wie bei jedem anderen mikroskopischen Ansatz können jedoch methodische Herausforderungen auftreten. Insbesondere die Eigenschaften der Probe, der Probenvorbereitung, des Gerätetyps und der Eindringsonde können zu unerwünschten Artefakten führen. In diesem Protokoll veranschaulichen wir diese aufkommenden Probleme sowohl an gesunden als auch an osteoarthritischen Gelenkknorpelexplantaten. Zu diesem Zweck zeigen wir zunächst Schritt für Schritt, wie ex vivo Gelenkknorpelscheiben nach verschiedenen Degenerationsstadien mittels großer 2D-Mosaikfluoreszenz-Bildgebung der gesamten Gewebeexplantate erzeugt, klassifiziert und visuell klassifiziert werden können. Die große Stärke des Ex-vivo-Modells besteht darin, dass es aus gealtertem, nativem, menschlichem Knorpel besteht, der es ermöglicht, arthrosebedingte Veränderungen vom frühen Beginn bis zur Progression zu untersuchen. Darüber hinaus werden auch häufige Fallstricke bei der Gewebepräparation sowie das eigentliche AFM-Verfahren zusammen mit der anschließenden Datenanalyse vorgestellt. Wir zeigen, wie sich grundlegende, aber entscheidende Schritte wie die Probenvorbereitung und -verarbeitung, topografische Probeneigenschaften, die durch fortgeschrittene Degeneration verursacht werden, und die Interaktion zwischen Probe und Spitze auf die Datenerfassung auswirken können. Wir nehmen auch die häufigsten Probleme in der AFM unter die Lupe und beschreiben, wo möglich, wie sie überwunden werden können. Die Kenntnis dieser Grenzen ist von größter Bedeutung für die korrekte Datenerfassung, Interpretation und letztlich die Einbettung der Ergebnisse in einen breiten wissenschaftlichen Kontext.
Introduction
Aufgrund der immer kleiner werdenden Größe elektronischer Geräte und Systeme hat die rasante Entwicklung von mikro- und nanobasierten Technologien und Geräten an Dynamik gewonnen. Ein solches Gerät ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM), die biologische Oberflächen scannen und topografische oder biomechanische Informationen sowohl im Nano- als auch im Mikrometerbereich abrufen kann 1,2. Zu seinen umfangreichen Funktionen gehört, dass dieses Werkzeug sowohl als Mikro- als auch als Nano-Eindringkörper betrieben werden kann, um Informationen über die mechanischen Eigenschaften verschiedener biologischer Systeme zu erhalten 3,4,5,6. Die Daten werden durch physischen Kontakt mit der Oberfläche durch eine mechanische Sonde gesammelt, die an ihrer Spitze7 nur etwa 1 nm betragen kann. Die resultierende Verformung der Probe wird dann basierend auf der Eindringtiefe der Cantilever-Spitze und der auf die Probe8 ausgeübten Kraft angezeigt.
Arthrose (OA) ist eine langfristige degenerative chronische Erkrankung, die durch eine Verschlechterung des Gelenkknorpels in den Gelenken und dem umliegenden Gewebe gekennzeichnet ist, was zu einer vollständigen Freilegung der Knochenoberflächen führen kann. Die Belastung durch Open Access ist erheblich; derzeit leidet die Hälfte aller Frauen und ein Drittel aller Männer ab 65 Jahren an OA9. Traumata, Fettleibigkeit und die daraus resultierende veränderte Biomechanik des Gelenks10 bestimmen die Degeneration des Gelenkknorpels, die als häufiges Endergebnis angesehen wird. Die bahnbrechende Studie von Ganz et al. postulierte, dass die frühen Schritte des OA-Prozesses die biomechanischen Eigenschaften des Knorpels beinhalten könnten11, und seitdem haben Forscher diese Hypothese bestätigt12. Ebenso ist es allgemein anerkannt, dass die biomechanischen Eigenschaften des Gewebes funktionell durch die ultrastrukturelle Organisation sowie durch Zell-Zell- und Zell-Matrix-Übersprechen orchestriert werden. Jede Veränderung kann sich dramatisch auf die gesamte biomechanische Funktion des Gewebes auswirken13. Bisher ist die Arthrose-Diagnose klinisch und basiert auf der Röntgenaufnahme14. Dieser Ansatz hat zwei Seiten: Erstens erschwert das Fehlen einer definierten degenerativen Cut-off-Schwelle zur Formulierung der Diagnose Arthrose die Quantifizierung der Erkrankung, und zweitens mangelt es den bildgebenden Verfahren an Sensitivität und Standardisierung und sie können lokalisierte Knorpelschäden nicht erkennen15,16,17. Dazu hat die Beurteilung der mechanischen Eigenschaften des Knorpels den entscheidenden Vorteil, dass sie einen Parameter beschreibt, der sich im Verlauf der Arthrose unabhängig von der Ätiologie der Erkrankung verändert und bereits in einem sehr frühen Stadium einen direkten Einfluss auf die Gewebefunktionalität hat. Eindringinstrumente messen die Kraft, mit der das Gewebe dem Einzug widersteht. Dies ist in der Tat kein neues Konzept; Die frühesten Studien stammen aus den 1980er und 1990er Jahren. In dieser Zeit deuteten zahlreiche Studien darauf hin, dass Eindringinstrumente, die für die arthroskopischen Messungen von Gelenkknorpel konzipiert sind, gut geeignet sein könnten, degenerative Veränderungen des Knorpels zu erkennen. Bereits vor 30 Jahren konnten einige Studien zeigen, dass Indentationsinstrumente in der Lage sind, in vivo Veränderungen der Knorpeloberfläche während der Gewebedegeneration durch Drucksteifigkeitsmessungen während der Arthroskopie zu erkennen18,19,20.
Die AFM-Einkerbung (AFM-IT) des Gelenkknorpels gibt Aufschluss über eine zentrale mechanische Eigenschaft des Gewebes, nämlich die Steifigkeit. Hierbei handelt es sich um einen mechanischen Parameter, der den Zusammenhang zwischen einer aufgebrachten, zerstörungsfreien Belastung und der daraus resultierenden Verformung des eingedrückten Gewebebereichs21 beschreibt. Es hat sich gezeigt, dass AFM-IT in der Lage ist, altersabhängige Veränderungen der Steifigkeit in makroskopisch nicht beeinflussten Kollagennetzwerken zu quantifizieren und somit zwischen den pathologischen Veränderungen zu unterscheiden, die mit dem Ausbruch von Arthrose verbunden sind (Grad 0 auf der Outerbridge-Skala im Gelenkknorpel)22. Wir haben bereits gezeigt, dass AFM-ITs auf der Grundlage der räumlichen Chondrozytenorganisation als bildbasierter Biomarker für die frühe Knorpeldegeneration es ermöglichen, die frühesten degenerativen mechanischen Veränderungen nicht nur zu quantifizieren, sondern auch tatsächlich zu lokalisieren. Diese Befunde wurden bereits von anderen bestätigt23,24. Daher ist AFM-IT ein interessantes Werkzeug, um frühe degenerative Veränderungen zu diagnostizieren und zu identifizieren. Diese Veränderungen können bereits auf zellulärer Ebene gemessen werden, was das Verständnis des pathophysiologischen Prozesses der Arthrose verändert.
In diesem Protokoll demonstrieren wir ein vollständiges histologisches und biomechanisches Grading-Verfahren von Gelenkknorpel-Explantaten, von der nativen Knorpel-Explantat-Präparation bis hin zur AFM-Datenerfassung und -verarbeitung. Anhand eines Schritt-für-Schritt-Ansatzes zeigen wir, wie Gelenkknorpelgewebe nach verschiedenen Stadien der Degeneration mit Hilfe von 2D-Bildgebung mit großem Mosaik, gefolgt von Mikro-AFM-Eindrücken, generiert, klassifiziert und visuell klassifiziert werden kann.
Auch wenn die AFM-IT derzeit eines der empfindlichsten Werkzeuge zur Messung biomechanischer Veränderungen im Knorpel ist7, wie jede andere instrumentelle Technik, hat sie Einschränkungen und praktische Besonderheiten25, die zu einer fehlerhaften Datenerfassung führen können. Zu diesem Zweck nehmen wir die häufigsten Probleme, die bei AFM-Messungen der Knorpelexplantate auftreten, unter die Lupe und beschreiben, wo möglich, wie diese minimiert oder überwunden werden können. Dazu gehören topographische Aspekte der Proben und die Schwierigkeiten, sie in einer AFM-kompatiblen Umgebung zu stabilisieren, physikalische Besonderheiten der Gewebeoberfläche und die daraus resultierenden Schwierigkeiten bei der Durchführung von AFM-Messungen auf solchen Oberflächen. Es werden auch Beispiele für fehlerhafte Kraft-Weg-Kurven vorgestellt, wobei die Bedingungen hervorgehoben werden, die sie verursachen können. Weitere Einschränkungen, die sich aus der Geometrie der Kragarmspitze und der Verwendung des Hertz-Modells für die Datenanalyse ergeben, werden ebenfalls diskutiert.
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Protocol
Es wurden Femurkondylen von Patienten verwendet, die sich am Universitätsklinikum Tübingen einer Knietotalendoprothetik unterzogen. In diese Studie wurden nur Gelenkknorpelproben von Patienten mit degenerativen und posttraumatischen Gelenkerkrankungen eingeschlossen. Vor Beginn der Studie wurde die Zustimmung der Abteilungs-, institutionellen und lokalen Ethikkommission eingeholt (Projekt Nr. 674/2016BO2). Vor der Teilnahme wurde von allen Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.
HINWEIS: Ein Flussdiagramm der Versuchsschritte in chronologischer Reihenfolge ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Gewebeaufbereitung und Generierung von Knorpelscheiben
- Präparation des Gewebes
- Nach der postoperativen Resektion werden die Knorpelproben in einen Behälter gegeben, der mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gefüllt ist, das mit 5% (v/v) Penicillin-Streptomycin angereichert ist. Stellen Sie sicher, dass die Proben vollständig in das Medium eingetaucht sind. Die Zeitspanne zwischen chirurgischer Resektion und Weiterverarbeitung des Knorpels sollte 24 h nicht überschreiten. Stellen Sie sicher, dass die Proben während der gesamten Verarbeitung vollständig in Medien eingetaucht sind, um ein Austrocknen der Proben zu vermeiden.
- Schneiden Sie den Knorpel mit einem Skalpell vom Knochen weg.
- Generierung von Knorpelscheiben
- Erzeugen Sie Knorpelscheiben mit einem Durchmesser von 4 mm mit einer Biopsiestanze.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Bereiche des Kondylus auszuwählen und zu resezieren, in denen die Knorpelschichtdicke 1 mm überschreitet. Dies kann vor allem in Belastungszonen problematisch sein, wo die Knorpelschicht typischerweise durch Verschleißprozesse oder Degeneration an Dicke verliert. - Legen Sie die zuvor erzeugten 4 mm Knorpelscheiben auf eine speziell angefertigte Schneidevorrichtung und fixieren und halten Sie die Knorpelscheiben mittels Spatel stabil. Beim Auflegen der Knorpelscheiben auf die Schneidvorrichtung ist Vorsicht geboten. Positionieren Sie die Proben so, dass die oberste Schicht des Knorpels (die oberflächliche Zone des Gelenkknorpels) nicht zur Klinge zeigt
- Schneiden Sie die Knorpelscheiben mit einer Rasierklinge ab. So werden scheibenförmige Knorpelproben von 4 mm x 1 mm erzeugt. Um ein Austrocknen der Probe zu verhindern, sollten Sie das Gewebe so schnell wie möglich schneiden.
- Sammeln Sie jede Scheibe mit Hilfe eines Spatels und legen Sie die erzeugten Knorpelscheiben in 1,5-ml-Röhrchen, die 1 ml DMEM enthalten, ergänzt mit 5% (v/v) Penicillin-Streptomycin. Legen Sie ca. 15 Scheiben in ein Röhrchen.
- Erzeugen Sie Knorpelscheiben mit einem Durchmesser von 4 mm mit einer Biopsiestanze.
- Kryotomschnitt der Knorpelscheiben (bei senkrechten Schichten)
ANMERKUNG: Dieser Schritt ist optional und kann verwendet werden, wenn eine seitliche Visualisierung der zellulären Musterverteilung innerhalb der Knorpelscheiben gewünscht wird. Es kann als Verifizierungsmethode verwendet werden, da die Verteilung des Zellmusters ein 3D-Merkmal des Gelenkknorpels26 ist. Optische Schnitte und 3D-Rekonstruktionen der gesamten Knorpelscheiben mit einem konfokalen Mikroskop können ebenfalls verwendet werden, so dass die Proben nicht mehr wie im Protokoll beschrieben geschnitten werden müssen.- Decken Sie die Knorpelscheibe mit wasserlöslichem Einbettmedium ab und legen Sie sie mit ihrem Rand auf den Kryotomknopf (wobei die Oberfläche der Scheibe senkrecht zur Oberfläche des Knopfes steht). Im Kryotomgerät gefriert das Einbettmedium bei niedrigen Temperaturen.
- Mit einem Standard-Kryotom wird das Gewebe mit einer Dicke von 60 μm seitlich durchtrennt, bis die Mitte der Scheibe erreicht ist (d. h. wenn Kryoschnitte eine Länge von 4 mm erreichen) und die Scheiben entnommen. Durch die senkrechte Sektion des Bandscheibenexplantats können alle Zonen des Knorpels (oberflächlich, mittig und tief) sichtbar gemacht werden.
- Sammeln Sie die Schnitte auf einem Objektträger und entfernen Sie das wasserlösliche Einbettmedium durch dreimaliges Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
2. Sortierung der Knorpelscheibe als Funktion des zellulären Raummusters
- Färbung der scheibenförmigen Knorpelproben
- Platzieren Sie eine Knorpelscheibe (Abschnitt 1.2) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und geben Sie 130 μl zellpermeablen Fluoreszenzfarbstoff in einer Verdünnung von 1:1.000 in jede Well.
- Prüfen Sie die gesamte Platte visuell und stellen Sie sicher, dass nur eine Scheibe in jede Vertiefung eingelegt wird. Inkubieren Sie die Platte für 30 Minuten im Standard-Zellkultur-Inkubator bei 37 °C.
- Färbung der 60 μm Knorpelschnitte
- Die Knorpelscheibenabschnitte (Abschnitt 1.3) werden vorsichtig mit Hilfe einer Pinzette auf Objektträger aus Glas gelegt.
- Decken Sie die Knorpelabschnitte mit Eindeckmedium ab, das die nukleare DAPI-Gegenfärbung enthält, und legen Sie vorsichtig Deckgläser an, die für die Fluoreszenzmikroskopie geeignet sind.
- Die Ränder jedes Deckglases mit normalem transparentem Nagellack versiegeln und 3 Minuten trocknen lassen.
- Knorpelsortierung und -bildgebung von oben nach unten und von der Seite
HINWEIS: Jede Scheibe muss unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht werden. Das Ziel dieses Schritts ist es, die Scheiben nach ihrem vorherrschenden Zellmuster (einzelne Saiten, Doppelsaiten, kleine Cluster, große Cluster oder diffuse) zu sortieren.- Legen Sie die 96-Well-Platte auf den Plattenhalter des Fluoreszenzmikroskops.
- Wählen Sie den geeigneten Fluoreszenzfilter von Em 495 nm/Ex 515 nm (für die Top-Down-Bildgebung der in Abschnitt 2.1 hergestellten Knorpelscheiben) oder Em 358 nm/Ex 461 nm (für die Seitenansicht der in Abschnitt 2.2 vorbereiteten Knorpelabschnitte) und das 10x-Objektiv.
HINWEIS: Mit dem 10x-Objektiv kann der gesamte Umfang der Scheibe inspiziert werden, und Proben mit inhomogener oder unsachgemäßer Färbung können ausgeschlossen werden. Die ausschließliche Verwendung der Top-Down-Ansicht kann jedoch dazu führen, dass Veränderungen in der zellulären Organisation als Ergebnis der Analyse der tieferen Gewebeschichten wahrgenommen werden, die durch oberflächliche Erosion für die Top-Down-Beobachtung sichtbar werden. Beispielsweise könnte ein aufsteigender Strang, der den Kollagenarkaden folgt, als einzelne Zelle oder als verstreute Zellen wahrgenommen werden (diffuses Muster)26. Daher müssen beide Seiten der Bandscheiben inspiziert werden, um die richtige Auswahl des Zellmusters zu gewährleisten. - Bestimmen Sie visuell das Zellmuster, das in jeder Knorpelscheibe angezeigt wird. Es ist unwahrscheinlich, dass eine Bandscheibe nur eine Art von Zellmuster aufweist. Nehmen Sie für den Teil der Scheibe, in dem die Chondrozytenanordnung nicht mit dem interessierenden Muster übereinstimmt, die Proben nur dann an, wenn sich das unerwünschte Muster an der äußersten Peripherie befindet, wo keine AFM-Messungen stattfinden (d. h. bis zu 0,5 mm vom Scheibenrand entfernt), und stellen Sie sicher, dass dies 10 % der Gesamtoberfläche der Scheibe27 nicht überschreitet. 28. S.
- Bildaufnahme der gesamten Knorpelscheiben
- Wählen Sie das 10x-Objektiv des Mikroskops aus und positionieren Sie es unter der vorgewählten Vertiefung, die eine einzelne Knorpelscheibe enthält. Fokussieren Sie sich auf die Scheibe, um das Zellmuster zu erkennen.
- Wählen Sie die Navigator-Funktion , um einen Überblick über das gesamte Well zu erhalten. Navigieren Sie mit der linken Maustaste und ziehen Sie zu einer anderen Bühnenposition. Vergrößern und verkleinern Sie mit dem Mausrad.
HINWEIS: An dieser Stelle können Sie eine Vorschau der Vertiefung mit der gesamten Probe sehen, indem Sie nacheinander auf jeden Interessenbereich doppelklicken. - Wählen Sie ein Quadrat aus, das den zu scannenden Interessenbereich umfasst. Zu diesem Zeitpunkt werden alle einzelnen Kacheln, aus denen sich das Mosaik zusammensetzt, sichtbar.
- Passen Sie die Belichtungs-/Lichtintensität so an, dass die Zellen vom Hintergrund aus deutlich sichtbar sind. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Helligkeit/der Kontrast des Bildes für alle Kacheln angepasst und kann nicht mehr für jede Kachel einzeln angepasst werden.
HINWEIS: Da die Zellen in der Nähe des Scheibenrandes oft ein höheres Fluoreszenzsignal aussenden als die Zellen in der Mitte, müssen die Einstellungen für Belichtung/Lichtintensität angepasst werden.- Um zu beurteilen, ob die Belichtungszeit für einen bestimmten Kanal geeignet ist, untersuchen Sie die Verteilung des Signals im Histogramm. Mit dem automatischen Belichtungsmechanismus, der in der Bildsoftware des Mikroskops enthalten ist, können Sie alle Zellen in der Scheibe visualisieren.
- Wählen Sie die Option Fokus-Map-Punkt der Software aus, und wählen Sie dann jede einzelne Kachel aus, indem Sie mit der linken Maustaste in die Mitte klicken.
- Wählen Sie die Option Fokus-Map. Es wird ein Fenster mit allen zuvor ausgewählten Kacheln angezeigt. Doppelklicken Sie auf eine Kachel in der Liste, um sie anzuzeigen und in den richtigen Fokus zu bringen.
- Klicken Sie auf Z festlegen , um den Fokusplan zu speichern und mit der nächsten Kachel fortzufahren. Nachdem Sie den Fokusplan für jede einzelne Kachel angepasst haben, starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie auf Scan starten drücken.
- Wenn der Scan dunklere horizontale und/oder vertikale Balken anzeigt, kann dies auf eine unsachgemäße und ungleichmäßige Ausleuchtung der einzelnen Bilder zurückzuführen sein. Beheben Sie dieses Problem, indem Sie vor dem eigentlichen Scan die in der Software enthaltene Option " Verknüpfte Schattierung" verwenden.
- Speichern, exportieren und kommentieren Sie die Bilder korrekt.
3. Biomechanischer Ansatz von Knorpelexplantaten
- Probenvorbereitung für AFM-Messungen
- Jede vorselektierte Knorpelscheibe, die ein Zellmuster (Abschnitt 2) enthält, wird in Petrischalen mit biokompatiblem Kleber fixiert. Füge ausreichend Probenkleber auf die obere, untere, linke und rechte Seite der Disc hinzu.
- Bedecken Sie die Scheiben mit 2,5 ml Leibovitz's L-15 Medium ohne L-Glutamin. Geben Sie das Leibowitz-Medium vorsichtig auf die Proben, um zu vermeiden, dass sich die Probe aufgrund der vom Medium erzeugten Wellen von der Oberfläche löst.
- Laden der Proben in das AFM
- Positionieren Sie die Petrischale im Probenhalter des AFM-Geräts und schalten Sie die auf 37 °C eingestellte Petrischale ein. Lassen Sie die Gewebekulturschale die gewünschte Temperatur erreichen. Dies geschieht, um mögliche Artefakte auszuschließen, die durch Temperaturschwankungen verursacht werden.
- AFM-Cantilever-Kalibrierung
- Initialisieren Sie das Software-Setup, wie zuvor von Danalache et al.29 beschrieben.
- Wählen Sie einen geeigneten Glasbaustein-Kragarmhalter für Flüssigkeitsmessungen aus und setzen Sie ihn vorsichtig auf den AFM-Kopf. Ein Verriegelungsmechanismus sichert den Glasbaustein im AFM-Kopf. Stellen Sie sicher, dass die reflektierende Oberfläche des Glassteins gerade und parallel zum AFM-Halter verläuft.
- Platzieren Sie den Ausleger vorsichtig auf der Oberfläche des Glasbaustein-Kragarmhalters. Der Ausleger selbst sollte auf der polierten optischen Ebene in der Mitte des Glasbausteins aufliegen.
- Legen Sie vorsichtig eine Silikonschürze (Silikonmembran) auf die Basis des Kragarmhalters, um eine mittlere Kondensation im AFM-Kopf zu verhindern.
- Senken Sie den Ausleger mit der Schrittmotorfunktion in 100-μm-Schritten ab, bis er vollständig in das Medium eingetaucht ist.
- Führen Sie einen Scanneranflug mit den von Danalache et al.29 beschriebenen Annäherungsparametern durch. Ziehen Sie den Ausleger um 100 μm zurück, sobald der Boden der Petrischale erreicht ist.
- Kalibrieren Sie den Ausleger anhand der exakten Schritte und führen Sie die von Danalache et al.29 beschriebenen Parameter aus. Am Ende der Kalibrierung wird die vertikale Auslenkung gespeichert und in Newton (N) Krafteinheiten und nicht in Volt (V) angezeigt - der Einheit der ursprünglichen Registrierung durch den Fotodiodendetektor. In den Experimenten ergab sich nach der Kalibrierung ein Sollwert von 4,47 nN.
- Mit der Schrittmotorfunktion den Ausleger auf 1.000 μm einfahren.
- Identifizierung der gewünschten Knorpelmessstelle unter dem AFM
HINWEIS: Aufgrund der 1 mm Dicke der Knorpelscheiben ist der Cantilever beim Navigieren über die Probe im Sichtfeld nicht sichtbar.- Verwenden Sie die CCD-Kamera des Mikroskops, um den Ausleger zu identifizieren. Der AFM-Ausleger sollte in einem probenfreien Bereich der Petrischale positioniert werden.
- Beginnen Sie einen Scanneransatz mit dem Cantilever auf einem sauberen, probenfreien Bereich der Petrischale unter Verwendung der gleichen Parameter, die von Danalache et al.29 beschrieben wurden.
- Ziehen Sie den Ausleger mit der Schrittmotorsteuerung 1,5 mm weiter vom Boden der Platte weg. Dieser Schritt ist entscheidend, um eine direkte Kollision zwischen Cantilever und Probe zu vermeiden.
- Wechseln Sie von der Hellfeld- zur Fluoreszenzansicht und identifizieren Sie visuell die Oberseite der Scheibe.
- Bewegen Sie den AFM-Probenhalter genau 2 mm in Richtung Mitte der Scheibe. Dieser Punkt gilt als Zentrum der Knorpelscheibe.
- Führen Sie einen Scanneranflug durch und ziehen Sie den Ausleger um 100 μm zurück, sobald die Oberfläche der Knorpelscheibe erreicht ist.
- Messungen der Kraft-Weg-Kurve
- Fokussieren Sie sich auf die Zellen, die an der gewünschten Messstelle positioniert sind. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Messungen und die Generierung von Kraft-Weg-Kurven an der Zielposition zu starten.
- Erfassen Sie fünf Kraft-Weg-Kurven an jeder Messstelle. Ziehen Sie den Ausleger um 500 μm zurück und fahren Sie den Ausleger zur nächsten Messstelle.
HINWEIS: Das Zurückziehen des Cantilevers ist ein entscheidender Schritt, da die Oberfläche der Knorpelscheibe nicht homogen ist und Unregelmäßigkeiten aufweist. Eine hohe Neigung auf der Oberfläche der Probe kann zu einer dramatischen Kollision führen, die zu einer unerwünschten Beschädigung der Cantilever-Spitze/Probe führt. Wir empfehlen, mindestens fünf verschiedene Messstellen auszuwählen, die über die Oberfläche der Scheibe verteilt sind, und an jeder Stelle mindestens fünf Kraft-Weg-Kurven zu erstellen. - Überprüfen Sie die Kraft-Weg-Kurven und speichern Sie sie.
- Schätzung der Elastizitätsmodule mit Hilfe des Hertz-Anpassungsmodells
- Öffnen Sie die generierten Kraft-Weg-Kurven (.jpk-Datei) in der Datenanalysesoftware mit der Option Stapel von Spektroskopiekurven öffnen .
- Wählen Sie das Hertz-Anpassungsmodell aus, und wählen Sie dann die Option Elastizitätsanpassung aus.
- Die Option Elastizitätsanpassung führt automatisch die folgenden Berechnungen für die ausgewählte Kraft-Weg-Kurve durch: berechnet die Basislinie und subtrahiert von der gesamten Kurve, um den Basislinienversatz zu entfernen (die Basislinie wird auf der y-Achse wieder auf Null gebracht); bestimmt den Kontaktpunkt, indem der Punkt erkannt wird, an dem die Kraft-Weg-Kurve die Kraftlinie Null schneidet (der Kontaktpunkt wird auf der x-Achse auf Null gesetzt); berechnet die Trennung zwischen Spitze und Probe (das Höhensignal des Piezos, das die Biegung des Auslegers berücksichtigt, wird subtrahiert); und passt die Kraft-Weg-Kurve automatisch an das ausgewählte Modell an. Auf Wunsch kann jeder dieser Schritte auch unabhängig voneinander durchgeführt werden.
- Passen Sie mit den folgenden Passungsparametern an: Poisson-Verhältnis von 0,5 und dem entsprechenden Auslegerspitzenradius.
HINWEIS: Bei Verwendung eines Auslegers mit kugelförmiger Auslegerspitze sollte das Hertz-Fit-Modell verwendet werden. Der in dieser Studie verwendete Cantilever hatte eine sphärische Spitze mit einem Radius von 5 μm. Wir empfehlen, die Kraft-Weg-Kurve so lange anzupassen, bis die maximal aufgebrachte Kraft erreicht ist (Sollwert). - Prüfen Sie visuell die Passung der Kraft-Weg-Kurve, um die Richtigkeit sicherzustellen. Dieser Schritt muss für jede der analysierten Kraft-Weg-Kurven durchgeführt werden.
- Bestimmung der Eindringtiefe
HINWEIS: Je nach verwendetem Datenanalyse-Tool kann dieser Prozess unterschiedlich sein. Der Experimentator kann die Eindringtiefe leicht ablesen, indem er eine Reihe von Schritten befolgt, die im Datenanalyseprogramm enthalten sind.- Öffnen Sie jede der generierten Kraft-Weg-Kurven in der Datenanalysesoftware und wählen Sie das Hertz-Anpassungsmodell als Analyseprozess aus.
- Wenden Sie die Option Basislinienversatz subtrahieren an, um die vertikale Durchbiegungsachse (y-Achse) auf Null zu setzen, und wählen Sie die Funktion Versatz + Neigung .
- Verwenden Sie die Funktion Kontaktpunkt suchen, um den Kontaktpunkt automatisch zu identifizieren, der automatisch auf eine x-Koordinate von Null gebracht wird.
- Subtrahieren Sie den Abstand, der ausschließlich die Auslenkung des Auslegers berücksichtigt, von der rohen Piezohöhe während des Eindrucks mit der Funktion Vertikale Spitzenposition .
- Wählen Sie die Option Elastizitätsanpassung aus, um die verarbeitete Kraft-Weg-Kurve anzuzeigen, und wählen Sie den Bereich des Diagramms so aus, dass er mit dem negativsten Wert auf der vertikalen Spitzenpositionsachse (x-Achse) ausgerichtet ist.
- Lesen und dokumentieren Sie die Einrückung aus dem Feld X Min auf der Registerkarte Parameter. Speichern und dokumentieren Sie die Ergebnisse.
4. Statistische Analyse
- Öffnen Sie die Statistiksoftware. Wählen Sie Neues Dataset aus dem Dropdown-Menü aus.
- Öffnen Sie die Registerkarte Variablenansicht , nachdem Sie die DataSet-Datei ausgewählt haben. Definieren Sie die numerischen Variablen für jede zelluläre Musterkategorie: einzelne Strings = SS, doppelte Strings = DS, kleine Cluster = SC, große Cluster = BC, diffuse und die Elastizitätsmodule.
- Geben Sie auf der Registerkarte "Datenansicht" die gemessenen Elastizitätsmoduldaten für jede der entsprechenden zellulären Musterkategorien ein. Analysieren Sie die Datenverteilung, indem Sie in der Menüleiste Analysieren und dann Explorative Datenanalyse auswählen.
- Wählen Sie Young's Moduli als abhängige Variable und Cellular Pattern als Faktorliste aus. Ein Boxplot, der für den Ergebnisabschnitt verwendet wird, wird unter den Ergebnissen in der Ausgabedatei angezeigt.
- Um eine statistische Analyse durchzuführen, wählen Sie Abhängige Stichproben im Abschnitt "Nicht parametrischer Test" auf der Registerkarte "Analysieren" in der Menüleiste. Wählen Sie Young's Moduli als Testfelder und Cellular Pattern als Gruppen auf der Registerkarte "Felder" aus. Drücken Sie auf Ausführen.
HINWEIS: Die Ergebnisse werden in der Ausgabedatei angezeigt. Für die statistische Auswertung wird ein Friedman-Test durchgeführt. - Integrieren Sie die p-Werte des nichtparametrischen Tests in den Boxplot, der in Schritt 4.4 erstellt wurde. Speichern Sie die Ergebnisse, indem Sie in der Menüleiste auf Datei klicken und Speichern auswählen.
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Representative Results
Mit Hilfe eines selbstgebauten Schneidegeräts konnten wir kleine (4 mm x 1 mm) Knorpelscheiben aus frischen menschlichen Kondylen explantieren und erzeugen, die ein einzelnes zelluläres Raummuster30 aus einzelnen Strängen (SS, Abbildung 2A), Doppelsträngen (DS), kleinen Clustern (SC), großen Clustern (BC; Abbildung 2A) und diffus (Abbildung 2B). Ein repräsentatives Knorpelexplantat ist in Abbildung 3A dargestellt. Die Auswahl der Scheiben, die nur einen Mustertyp zeigten, erfolgte mittels Top-Down-Fluoreszenzbildgebung (Abbildung 2). Die topographische Variation der Knorpeloberflächenscheibe wurde durch die seitliche Bildgebung von 60 μm dicken Schnitten, die aus den Knorpelscheiben erzeugt wurden, weiter veranschaulicht (Abbildung 2C). Auf der Oberfläche der explantierten osteoarthritischen Knorpelscheiben zeigten sich oberflächliches Flimmern und Matrixspalten (Abbildung 3B,C). Dies war besonders auffällig in den Bandscheiben, die für eine fortgeschrittene OA-Progression repräsentativ sind, die durch das Vorhandensein von BC repräsentiert wird (Abbildung 2A). Nach der Sortierung nach der Fluoreszenz wurde die Steifigkeit der Scheiben durch AFM-Mikroeindrücke beurteilt. Zu diesem Zweck wurden die erzeugten Knorpelscheiben erfolgreich in der AFM-Petrischale mittels biokompatiblem Kleber fixiert (Abbildung 3D), um ein Abdriften der Probe während der Messungen zu vermeiden (Abbildung 3E). Die Menge des verwendeten Klebers muss angepasst werden. Eine unzureichende Menge an Kleber führt zu einer Bandscheibeninstabilität, während die Zugabe von zu viel Kleber zu einer unerwünschten Verteilung des Klebers unter und/oder über die Knorpelscheibe führen kann. Letzteres führt zu Messartefakten und schlechter Identifizierung der Scheibe unter dem Fluoreszenzmikroskop. Unzureichender Klebstoffauftrag oder plötzliche Bewegungen der Probe während der Fixierung sind häufige Probleme, die dazu führen, dass sich das Gewebe von der Petrischale löst, und sollten vermieden werden.
Eine repräsentative allmähliche Steifigkeitsreduktion entlang der zellulären Musteranordnung ist in Abbildung 4A dargestellt. Die Steifigkeitswerte waren in den SS-haltigen Scheiben höher (Median von 2,6 kPa) - repräsentativ für nicht beeinträchtigte Knorpelbereiche. Mit Beginn und Progression der Arthrose zeigten die AFM-Messungen eine starke schrittweise Abnahme der Steifigkeit um 42 % bei DS (1,5 kPa), 77 % bei SC (0,6 kPa) und schließlich 88 % in fortgeschrittenen Stadien, dargestellt durch BC (0,3 kPa; Abbildung 4A). Die Scheiben, die ein diffuses Muster enthielten, zeigten eine erhöhte Elastizität mit einer signifikanten Variation der Einzelwerte des Elastizitätsmoduls. Für alle Knorpelscheiben mit zugeordneter vorherrschender zellulärer Musterorganisation wurde festgestellt, dass die mit dem verwendeten Sollwert assoziierte Eindringtiefe (4,477 nN) umgekehrt proportional zur Steifigkeit ist (Abbildung 4B). Eine repräsentativ erzeugte Kraft-Weg-Kurve ist in Abbildung 4C dargestellt, und eine Hertz-Anpassung sowie die Identifizierung des Kontaktpunktes sind in Abbildung 4D dargestellt.
Die richtige Passform hängt unter anderem von der korrekten Bestimmung der Baseline ab. Wenn die automatische Baseline-Erkennung fehlerhaft ist (z. B. aufgrund einer turbulenten Baseline), kann die Anpassung auch manuell bestimmt werden, und der Benutzer kann eine repräsentativere Baseline für die Messungen auswählen. Wenn die erzeugte Kraft-Weg-Kurve jedoch keine korrekte Anpassung zulässt, muss sie verworfen werden. Abbildung 5 zeigt Beispiele für fehlerhafte Kraft-Weg-Kurven. Die Erstellung geeigneter Kraft-Distanz-Kurven an osteoarthritischen Gelenkknorpelexplantaten kann aufgrund der unregelmäßigen Oberfläche des Gewebes (Beispiele sind in Abbildung 5A,B dargestellt) und der Instabilität der Probe, die durch unsachgemäße Probenfixierung verursacht wird (Beispiele in Abbildung 5C,D) schwierig sein. Artefakte können durch mehrere Kontaktpunkte zwischen Sonde und Probe (aufgrund der unebenen Oberfläche des degenerierten Knorpels) oder durch unerwünschte Gewebebewegungen (sichtbar durch Veränderungen in der Fokusebene) verursacht werden. Diese Artefakte sind in den generierten Kraft-Weg-Kurven zu sehen und deuten entweder auf einen suboptimalen Kontakt zwischen dem AFM-Cantilever und der Knorpeloberfläche oder auf eine unsachgemäße Fixierung der Probe an der Petrischale hin (siehe Abbildung 5A-D).
Abbildung 1: Flussdiagramm des Versuchsablaufs. Zusammenfassung der experimentellen Schritte in chronologischer Reihenfolge, beginnend mit intraoperativ resezierten Knorpelproben über die Generierung von 4 mm x 1 mm Knorpelscheiben, Fluoreszenzfärbung und Sortierung der Bandscheiben anhand der zellulären Musterorganisation mittels Top-Down- und Side-View-Bildgebung bis hin zur Elastizitätsbeurteilung mittels Rasterkraftmessungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Fluoreszenzbildgebung repräsentativer Knorpelscheiben . (A) Mosaik-2D-Bilder und ein gezoomtes Beispielfeld von Knorpelscheiben, die mit zellmembrandurchlässigem Farbstoff bei 100-facher Vergrößerung gefärbt wurden. Die obere Scheibe zeigt eine repräsentative einsaitige Scheibe, während die untere eine große Cluster-Scheibe darstellt (unten). (B) Mosaikbild einer diffus gemusterten Scheibe von der Oberfläche (oben) und derselben Scheibe von der Unterseite (unten). (C) Seitenansicht der Kernfärbung von 60 μm langen Knorpelscheibenscheiben. Der weiße Maßstabsbalken stellt 500 μm für die Mosaikbilder dar (größeres Sichtfeld, A [linkes Bild], B, C) und 100 μm für die vergrößerten, fokussierten Bilder (A[rechtes Bild]). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Explantierte Gelenkknorpelscheiben. (A) Repräsentatives Bild eines 4 mm x 1 mm großen Knorpelscheiben-Explantats aus frischem menschlichem Gelenkknorpel. Der weiß dargestellte Maßstabsbalken stellt 2 mm dar. (B) Repräsentatives Bild des nativen osteoarthritischen Knorpels, bei dem die Gewebeoberfläche makroskopisch sichtbares oberflächliches Flimmern und Spalten aufweist. Der weiß dargestellte Maßstabsbalken stellt 1.000 mm dar. (C) Schematische Darstellung der flimmernden Knorpeloberfläche. (D) Vor den AFM-Messungen wurde jedes der Knorpelscheiben-Explantate mit Hilfe von biokompatiblem Probenkleber ordnungsgemäß auf der Oberfläche der AFM-Petrischale fixiert, um Artefakte aufgrund von Probendrift während der eigentlichen Eindringmessungen zu vermeiden, wie in (E) gezeigt. Der weiße Maßstabsbalken stellt 4 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von Rasterkraftmikroskopie-Messungen von Gelenkknorpelscheiben, sortiert nach ihrer vorherrschenden zellulären Musterorganisation . (A) Boxplot mit dem Median des berechneten Elastizitätsmoduls von fünf Bandscheiben, eine für jedes Zellmuster, die von einem Patienten stammen. An jeder Scheibe wurden insgesamt 25 Messungen durchgeführt (fünf Messungen an fünf verschiedenen Messstellen). Die schwarze Linie innerhalb des Rechtecks stellt den Medianwert dar, die unteren und oberen Enden des Rechtecks stellen das erste bzw. dritte Quartil dar, und die Fehlerbalken stellen die niedrigsten und höchsten Werte für jede Gruppe dar. (B) Punktdiagramm mit Darstellung der 125 Eindringtiefenpunkte für jedes Zellmuster. (C) Beispielhafte Kraft-Weg-Kurven, die mit dem AFM mit einem berechneten Elastizitätsmodul von 0,4 kPa aufgenommen wurden. (D) Eine repräsentative Hertz-Passung und Kontaktpunktbestimmung für die in (C) dargestellte Kraft-Weg-Kurve. Die x-Achse zeigt die vertikale Spitzenposition an (d. h. die vom Piezo zurückgelegte Strecke, wobei die Länge für die Auslegerbiegung automatisch vom Kontaktteil der Kraft-Weg-Kurve abgezogen wird). *p < 0,05. Für die statistische Analyse wurde der Friedman-Test verwendet. Abkürzungen: SS = einzelne Saiten; DS = doppelte Saiten; SC = kleine Cluster; BC = große Cluster. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Beispiele für fehlerhafte Kraft-Weg-Kurven. (A) Die Kraft-Weg-Kurve zeigt eine massive Abweichung, gefolgt von einer Erholung in der Nähe des Basislinienniveaus, bevor eine kontinuierliche Vertiefung der Oberfläche beobachtet wird. Dieses Phänomen kann auf ein relativ großes Hindernis zurückgeführt werden (z. B. großflächige Spalten, die aus der obersten Knorpelschicht herausragen). (B) Die erweiterte Kraft-Weg-Kurve zeigt mehrere kleine Peaks. Es wird angenommen, dass diese Kurven durch mikroskalige Unregelmäßigkeiten auf der Knorpeloberfläche (z. B. Flimmern) verursacht werden. Sowohl (C) als auch (D) zeigen Kraft-Weg-Kurven mit zweiphasigen Verläufen. Beide Kraft-Weg-Kurven sind repräsentativ für eine schlechte Probenfixierung und Probendrift. In diesen Fällen kommt es auch häufig zu einer plötzlichen Veränderung der Fokusebene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Als fortschreitende und multifaktorielle Erkrankung löst Arthrose strukturelle und funktionelle Veränderungen im Gelenkknorpel aus. Im Verlauf der Arthrose gehen Beeinträchtigungen der mechanischen Eigenschaften mit strukturellen und biochemischen Veränderungen an der Oberfläche des Gelenkknorpels einher27,31. Die frühesten pathologischen Ereignisse, die bei OA auftreten, sind die Erschöpfung von Proteoglykanen in Verbindung mit einer Störung des Kollagennetzwerks32,33,34. Solche frühen subtilen Oberflächenveränderungen sind mit Massentests schwer zu lokalisieren und zu identifizieren, da das mechanische Verhalten über die gesamte Gewebetiefe gemittelt wird. Darüber hinaus ist eine noch unbearbeitete Frage, ob funktionelle Veränderungen auf Organ- und Gewebeebene mit mikro- oder nanoskaligen strukturellen und funktionellen Veränderungen zusammenhängen. Zu diesem Zweck gilt die AFM als eine der empfindlichsten Methoden, die in der Lage ist, die frühesten biomechanischen Veränderungen zu erkennen, die mit dem Auftreten von OA auftreten7. Es ermöglicht Steifigkeitsmessungen sowohl auf der Mikro- als auch auf der Nanometerskala in nativen Proben und liefert Informationen über die mechanischen Eigenschaften von Gelenkknorpel35,36. In diesem Protokoll haben wir mit Hilfe von Mikro-AFM-Einkerbungen die elastischen Eigenschaften von gesunden und osteoarthritischen Gelenkknorpel-Humanexplantaten gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Knorpelexplantaten sehr repräsentativ für frühe lokale OA-Ereignisse sind, mit einer bemerkenswerten allmählichen Abnahme der Steifigkeit, die bei musterspezifischen Knorpelexplantaten auftritt. Darüber hinaus stehen die Ergebnisse im Einklang mit früheren veröffentlichten Forschungsergebnissen, die eine deutliche Abnahme der Steifigkeit entlang der zellulären Musterorganisation zeigten23,24,27,37.
Bestätigte native Humanmodelle, die verschiedene Aspekte der OA-Pathogenese und -Progression nachahmen, werden derzeit benötigt, um die Defizite der translationalen Forschung und die Herausforderungen bei der Übertragung von In-vitro-Daten in ein klinisches Umfeld zu beheben. Bis heute kann kein Modell das komplexe native menschliche Knorpelkompartiment genau abbilden, geschweige denn das altersbedingte Gelenkgewebe, das als Reaktion auf krankheitsauslösende Reize zu Arthrose neigt38. Die bisher am häufigsten verwendeten explantären Modelle stammten von Rindern oder Rindern und verwendeten entweder eine stark inflammatorische Zytokinbehandlung oder eine mechanische Belastung 39,40,41. Dieses Protokoll hingegen zeigt, wie man kleine (4 mm x 1 mm) explantierte scheibenförmige menschliche Knorpelproben erzeugt, die auf die einzelnen Stadien bestimmter Arthroseereignisse hinweisen. Die Knorpelexplantate werden sortiert und unter Verwendung der zellulären räumlichen Organisation als bildbasierter Biomarker 30,42 dem Stadium zugeordnet. Da frühe Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften bereits identifiziert und quantifiziert werden können, sobald Doppelsträngeentstehen 23,27, in einem Stadium, in dem die Knorpeloberfläche noch makroskopisch intakt erscheint26, ermöglicht dieses Explantat-basierte Modell die Untersuchung eines lokalen nativen Knorpelkompartiments und kann aufschlussreiche Informationen über frühe Arthrose liefern. Darüber hinaus könnte dieses Knorpelmodell nützlich sein, um die Zell- und Matrixantwort auf mechanische und entzündliche Veränderungen in einem 3D-nativen lokalen Habitat zu untersuchen38,39. Da diese Knorpelexplantaten relativ einfach und leicht zu erzeugen sind, können sie auch zur Untersuchung der OA-Heterogenität verwendet werden, die ein limitierender Faktor bei der Entwicklung und Erprobung krankheitsmodifizierender OA-Medikamente ist43. Es muss auch beachtet werden, dass die Skalierbarkeit und die Abhängigkeit von Patienten, die sich einer Gelenkersatzoperation unterziehen, zwei der Mängel des Modells sind.
Es ist bekannt, dass Gelenkknorpel je nach getesteter Skalenstufe ein eigenartiges Verhalten aufweist. Wie von Loparic et al. angedeutet, verhält sich der Knorpel auf der Mikroskala wie ein unstrukturiertes und gleichmäßiges Material35, und ein solcher Ansatz ergibt eine Annäherung an die lokalisierte Gesamtknorpelsteifigkeit. In einer Studie von Stolz et al.44 aus dem Jahr 2004 wurden sowohl mikro- als auch nanoskalige Einkerbungen bei der Beurteilung der strukturmechanischen Eigenschaften von Gelenkknorpel verglichen. Die Autoren betonten, dass bei der mikroskaligen sphärischen Einkerbung des Gelenkknorpels die nanoskaligen feinen Strukturkomponenten (d. h. einzelne Kollagenfasern und Proteoglykane) gemeinsam die Aufgabe der Lasttragfähigkeit übernehmen. Dabei unterscheiden sich die mechanischen Eigenschaften der Aggregate deutlich von denen der einzelnen Nanokomponenten. Dieselben Autoren schlugen vor, dass eine Kombination von Mikro- und Nanovertiefungen verwendet werden könnte, um die allgemeinen lokalen Steifigkeitsprofile des Gelenkknorpels sowie die Steifigkeit im Zusammenhang mit den feinen Strukturkomponenten zu bewerten44.
In zahlreichen AFM-basierten Eindringexperimenten wurden scharfe pyramidenförmige Cantilever-Spitzen (Radius = 15-20 nm)22,36,44 zur Beurteilung der Knorpelmechanik verwendet. Obwohl die Nanoindentationen mit scharfen Cantilevern derzeit als besser geeignet für die Beurteilung feinster mechanischer Eigenschaften angesehen werden, liefern sphärische Cantilever-Spitzen Ergebnisse, die konsistenter und einfacher zu modellieren und zu interpretieren sind, wenn weiche biologische Proben getestet werden44,45. Darüber hinaus zeigten Stolz et al., dass AFM-Nano-Einkerbungen von enzymatisch (d. h. Elastase) abgebautem Gelenkknorpel nicht möglich sind, da das Gewebe so klebrig wird, dass die Adhäsion der Spitze der Probe die Kraft-Abstands-Kurven dominiert, was die Daten undurchführbar macht44.
Bei den vorliegenden AFM-Messungen wurde ein Cantilever mit einer sphärischen Cantilever-Spitze mit einem Radius von 5 μm verwendet. Die Wahl des Auslegers wurde durch die Absicht motiviert, die mechanischen Eigenschaften des Gewebes über eine ziemlich große Oberfläche zu mitteln und gleichzeitig die verursachten Schäden an der Knorpeloberfläche zu minimieren. Die Beziehung zwischen der auskragenden Kraft und dem resultierenden Probeneindruck wurde mit dem Hertz-Fit-Modell angepasst. Bei der Verwendung von sphärischen Eindringkörpern wird das Hertz-Passungsmodell empfohlen, wobei die Anziehungskräfte, die zwischen der Cantilever-Spitze und der Probenoberfläche wirken, vernachlässigt werden46. Die Gleichungen für das Hertzsche Modell sind in Gleichung 1 und Gleichung 2 dargestellt.
Gl.1
Gl.2
Wobei F = Kraft; E = Elastizitätsmodul; v = Poisson-Verhältnis; δ = Einrückung; a = Radius des Kontaktkreises; und Rs = Radius der Kugel.
Das Modell berechnet schließlich die Zell-/Gewebeelastizität47, die formal als Elastizitätsmodul (E) ausgedrückt wird. Das Hertz-Anpassungsmodell berücksichtigt mehrere Merkmale wie die Form und Größe der Spitze, den Eindruck und die Verformbarkeit der Probe. Wenn diese Anforderungen nicht ideal erfüllt sind, kann das Modell eine ungenaue Schätzung des Elastizitätsmoduls46 liefern.
Das Hertz-Anpassungsmodell geht davon aus, dass die Dehnung und die elastische Spannung linear vom Elastizitätsmodul abhängen, was bedeutet, dass der Eindruck in der Probe viel kleiner bleibt als die Probendickeselbst 46. Diese Annahme wurde in diesem Aufbau, in dem die Knorpelexplantaten eine Dicke von 1 mm im Vergleich zu Einkerbungen von wenigen Mikrometern aufwiesen, leicht erfüllt.
Gelenkknorpel kann als poröses viskoelastisches Materialmodelliert werden 48,49. Das viskoelastische Verhalten resultiert aus der Reibung zwischen den intrazellulären/zytoplasmatischen oder Matrixbestandteilen wie Molekülen, Organellen und dem Kollagen-Proteoglykan-Netzwerk50,51. Wie der Name schon sagt, vereinen viskoelastische Materialien zwei unterschiedliche Eigenschaften: viskos - das Material verformt sich langsam, wenn es einer äußeren Belastung ausgesetzt wird - und elastisch - das Material kehrt in seine ursprüngliche Konfiguration zurück, sobald die aufgebrachte Last entfernt wird52,53. Das viskoelastische Verhalten manifestiert sich als Hysterese zwischen der Annäherungs- (verlängert) und der Retraktionskurve in den Kraft-Weg-Kurven 46,52, ähnlich denen, die in dieser Studie erhalten wurden (Abbildung 4C). Darüber hinaus ist ein Merkmal viskoelastischer Werkstoffe, dass ihre mechanischen Eigenschaften von der Verformungsgeschwindigkeit abhängen, wobei die Steifigkeit des Materials mit der Geschwindigkeit der Belastung (Eindringgeschwindigkeit) zunimmt54. Somit wird durch Auswahl unterschiedlicher Belastungsgeschwindigkeiten eine Familie von Kraft-Weg-Kurven erzeugt, von denen jede die mechanischen Eigenschaften der getesteten Probe bei jeder Belastungsrate52 darstellt. Wenn Sie also versuchen, die Ergebnisse verschiedener Arbeiten zu vergleichen, ist es wichtig, alle Einrückungsparameter zu berücksichtigen. Insgesamt verhält sich Gelenkknorpel bei Messungen auf der Mikrometerskala (wie in dieser Studie mit einer 5 μm sphärischen Cantilever-Spitze) als unstrukturiertes und gleichmäßiges Material und erzeugt einen kumulativen Elastizitätsmodul, der aufgrund der poroviskoelastischen Natur des Gewebes sowohl elastische als auch viskose Beiträge zur Steifigkeit enthält35.
Eine weitere Annahme des Hertzschen Modells ist, dass die Eindringtiefe kleiner ist als der Radius der sphärischen Kragarmspitze55. Die Eindringtiefe stellt die maximale Verschiebung der Cantilever-Spitze nach dem ersten Kontakt mit der Probe dar. Bei maximaler Belastung ist die maximale Eindringtiefe die Gesamtverschiebung der Probe und der Cantilever-Spitze. Die Bückle-Richtlinie gibt eine maximale Eindringtiefe von 10 % der Gesamtdicke einer Probe mit gleicher Strukturüber 56 an, ansonsten variieren die Ergebnisse je nach Tiefe-Dicke-Verhältnis. Bei einem Cantilever-Spitzenradius von 5 μm waren die Knorpelexplantaten in dieser Studie im Mittel 1,1 μm eingerückt, mit einigen wenigen Spitzen von 3 μm, insbesondere bei den stark degenerierten Knorpelexplantaten. In diesem Fall wurde ein Kompromiss gesucht, da in der Versuchsumgebung relativ hohe Kräfte erforderlich sind, die mit großen Vertiefungen verbunden sind, um die Oberflächenunregelmäßigkeiten des degenerierten Knorpels zu neutralisieren. Eine mildere Einkerbung würde zur Untersuchung von oberflächlichem Flimmern und Kollagenrissen führen, beides häufige Merkmale von stark degeneriertem Knorpel57.
Entscheidend für das Hertz-Fit-Modell ist auch die korrekte Identifizierung des Punktes, an dem die Cantilever-Spitze in direkten Kontakt mit der Probe kommt, der allgemein als Kontaktpunkt bezeichnet wird. Dies kann sich jedoch als problematisch erweisen, wenn zu klebrige oder zu weiche Proben eingedrückt werden, da dies zu mehreren Sonden-Proben-Kontaktpunktenführen kann 58,59. In der Tat, wie A-Hassan et al. sehr schön betont haben, ist die genaue Bestimmung des Kontaktpunktes für biologische Weichgewebe eines der ärgerlichsten Probleme60. Dieser Effekt wurde auch bei den nativen osteoarthritischen Knorpelexplantaten beobachtet, da die Gewebeoberfläche je nach Degenerationsstadium ihre natürlichen mechanischen Eigenschaften verliert und oft uneben ist, was zu oberflächlichem Flimmern und Spalten führt (Abbildung 3B,C). Dieses Phänomen wurde besonders bei den Knorpelexplantaten beobachtet, bei denen das dominante Zellmuster große Cluster waren (Abbildung 2C). Diese Inhomogenitäten in der Knorpeloberfläche können zu mehreren Kontaktpunkten zwischen Sonde und Probe und damit zu fehlerhaften Ergebnissen führen. In einigen Fällen wurden enorme Auslenkungen beobachtet, gefolgt von einer raschen Erholung der Basislinie vor dem letzten Abschnitt der Kraft-Weg-Kurve (Abbildung 5A). Dies könnte auf ein großes Hindernis auf dem Weg der Cantilever-Spitze zurückgeführt werden (z. B. fortgeschrittene Fibrillationsbereiche mit ausfransendem und spaltendem Knorpel). In anderen Fällen war die endgültige Steigung der Kraft-Weg-Kurve mit kleineren Unregelmäßigkeiten gestreut (Abbildung 5B), was auf einen Kontakt mit sukzessive kleineren Hindernissen (z. B. Mikroflimmern des Gewebes) hindeutet. In solchen Fällen muss die Messstelle neu vermessen oder sogar verändert werden, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Daten zu gewährleisten. Zu diesem Zweck ist es auch wichtig, die Kraft-Weg-Kurvenausgabe des AFM sorgfältig zu überprüfen, um die Kontaktstelle korrekt zu identifizieren. Dies ist ein entscheidender Punkt, dessen man sich bewusst sein sollte, da sich gezeigt hat, dass eine falsche Identifizierung des Kontaktpunktes durch 50 nm zu einer falschen Schätzung des Wertes von E um eine Größenordnung von61 führt. Mehrere Studien haben damit begonnen, automatisierte Ansätze zur Bestimmung des Kontaktpunkts von Kraft-Weg-Kurven zu verwenden, mit dem Ziel, subjektive Benutzereingaben bei der Schätzung des Kontaktpunkts durch visuelle Inspektion zu umgehen und die Genauigkeit zu verbessern. Dies wird umso wichtiger, wenn es sich um eine große Anzahl von Kraft-Weg-Kurven handelt, wie sie z.B. in zellmechanischen Messungen47,62 erzeugt werden. Obwohl mehrere Strategien vorgeschlagen wurden, um die Kontaktpunktbestimmung47, 63, 64, 65 zu automatisieren, hängt die optimale Strategie in hohem Maße von experimentellen Bedingungen und Faktoren ab, wie z. B. dem Modell, das zur Analyse der Daten verwendet wird, der Form der Sonde, der (nicht-)adhäsiven mechanischen Wechselwirkung zwischen der Cantilever-Spitze und der Probe sowie dem (nicht-)Hertz'schen Verhalten der Probe 63.
Probendrift ist ein weiteres häufiges Problem, das zu Artefakten und einer fehlerhaften Kontaktpunktbestimmung führen kann (Abbildung 3E). Dies bedeutet im Grunde, dass die Probe nicht richtig im Probenhalter (Petrischale) montiert ist und sich die Probe während der AFM-Messungen bewegt. Besonders ausgeprägt ist der Effekt, wenn der AFM-Ausleger an einen neuen Messort verlegt wird. Dieser Aspekt kann während der eigentlichen Messungen durch eine plötzliche Änderung der Fokusebene leicht beobachtet werden. Die resultierenden Kraft-Weg-Kurven weisen typischerweise eine zweiphasig verlängerte Steigung auf, mit einem leichten Anstieg zu Beginn, der der Verengung des leeren Raums zwischen dem Boden der Scheibe und der Petrischale entspricht, wenn die Scheibe durch den Ausleger nach unten gedrückt wird (siehe Abbildung 3E), gefolgt von einer festeren Neigung im zweiten Abschnitt der Steigung. Dies deutet darauf hin, dass die Scheibe weiter eingedrückt wird, da sie jetzt in direktem Kontakt mit dem Boden der Petrischale steht (Abbildung 5C,D). Um die Verzerrungen zu überwinden, kann man versuchen, die Proben besser zu fixieren, indem man einen geeigneten Probenklebstoff verwendet (Abbildung 3D), die Temperatur konstant hält, indem man externe Wärmequellen (Lichter) ausschaltet, um thermische Drift zu vermeiden, und schnelle Scanning-Messungen durchführt. In den Experimenten hier beobachteten wir eine Cantilever-Ablenkungsdrift, die innerhalb der ersten 15 Minuten nach dem Eintauchen des Cantilevers in Medien auftrat (aufgrund plötzlicher Temperaturänderungen). Nach diesem Zeitablauf ist die Drift in der Regel vernachlässigbar. Daher raten wir dem Versuchsleiter, die Basislinie nach dem Cantilever-Eintauchen sorgfältig zu untersuchen und mit der Messung zu beginnen, sobald sie sich stabilisiert hat. Die Dauer dieses Prozesses kann je nach verwendetem Ausleger stark variieren.
Ein weiterer kritischer Parameter für jede AFM-Messung ist der Sollwert, der vereinfacht gesagt ein Maß für die Kraft ist, die der Ausleger auf die Probe ausübt. Für den Kontaktmodus (wie er in dieser Studie verwendet wird) stellt der Sollwert eine bestimmte Auslenkung des Auslegers dar. Bei der Durchführung mehrerer Scans oder mehrerer Wiederholungen an der Stelle, wie im Protokoll hier, kann die Cantilever-Spitze Partikel von der Probenoberfläche adsorbieren, so dass es manchmal notwendig ist, den Cantilever zu entfernen, ihn ordnungsgemäß zu reinigen66 und dann neu zu kalibrieren, bevor mit den Messungen fortgefahren wird.
Während AFM-Mikroeinkerbungen neue und interessante Möglichkeiten der Datenerhebung bieten, insbesondere im Zusammenhang mit osteoarthritischem Knorpel, hängen die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der erzeugten Daten stark von mehreren Parametern ab, wie oben beschrieben. Bei der Verwendung dieses Ansatzes zur Beurteilung der mechanischen Veränderungen, die durch die Degeneration von Knorpelgewebe verursacht werden, müssen zunächst einige Pilotmessungen an verschiedenen räumlichen Mustern durchgeführt werden, um die Ergebnisse auf das spezifische Versuchsdesign hochzuskalieren. Pilot-AFM-Messungen sollten mit dem am besten standardisierbaren Verfahren durchgeführt werden, bei dem genügend Proben (z. B. fünf Scheiben) desselben Musters entnommen werden, um einen Hinweis auf das Ausmaß der Datenvariabilität zu erhalten. Dies ist besonders wichtig, wenn versucht wird, die frühesten relevanten OA-Steifigkeitsänderungen zu quantifizieren und zu bewerten (d. h. zwischen Einzel- und Doppelsaiten, Abbildung 4A). Tatsächlich haben wir in einer früheren Studie mit einem ähnlichen Ansatz gezeigt, dass eine Stichprobengröße von 30 menschlichen Proben erforderlich ist, um biomechanische Veränderungen in der Matrix als Funktion der räumlichen Organisation der Zellen zu beurteilen37.
Darüber hinaus sind viele der in diesem Protokoll vorgestellten Schritte anfällig für menschliche Fehler und hängen stark von der Erfahrung des Bedieners ab. Angesichts aller Faktoren, die die tatsächlichen AFM-Ergebnisse beeinflussen können, sind die absoluten E-Werte, die in dieser Studie berichtet werden, nicht verallgemeinerbar und eher spezifisch für diesen Versuchsaufbau. Die hier dargestellte Beziehung zwischen den verschiedenen Elastizitätsmodulen und den zellulären Knorpelexplantaten (je pathologischer das räumliche Muster, desto niedriger der Elastizitätsmodul [EM] des Knorpels) ist jedoch unbeeinflusst, da die Ergebnisse mit früheren Studien übereinstimmen, die Steifigkeitsänderungen als Funktion der zellulären Musterorganisation zeigen23,37.
Insgesamt demonstriert dieses Schritt-zu-Schritt-Protokoll die Funktionalität standardisierter 3D-nativer Gelenkknorpelexplantate, die nicht nur repräsentativ für OA-gesteuerte zelluläre Reorganisationsereignisse sind, die vom Beginn bis zur fortgeschrittenen Progression reichen, sondern auch mit einer allmählichen Abnahme der Steifigkeit verbunden sind. Die Explantate könnten ein zuverlässiges biomimetisches Modell für die Untersuchung des Beginns und der Progression von OA widerspiegeln, das die Erprobung und Entwicklung verschiedener Behandlungsmodalitäten ex vivo ermöglicht. Die Verwendung eines solchen humanen Explantatmodells in Kombination mit einer AFM-basierten biomechanischen Bewertung könnte zu einem Paradigmenwechsel für die biomedizinische Forschung und die pharmazeutische Industrie führen und den Weg für neue Wege ebnen, um dringend benötigte wirksame OA-Medikamente zu identifizieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken den orthopädischen Chirurgen der Klinik für Orthopädische Chirurgie des Universitätsklinikums Tübingen für die Bereitstellung der Gewebeproben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1397-89-3 | |
| Atomic force microscop (AFM) head | CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | H000033 | |
| Calcein AM | Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA | 14948 | Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging |
| Cantilever | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SAA-SPH-5UM | Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm, geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius |
| Cartilage ctting device | Self-made | n/a | Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm |
| CDD camera integrated in the AFM | The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany | DFK 31BF03 | |
| CDD camera integrated in the fluorescence microscope | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DFC3000G | |
| Cryotome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | CM3050S | |
| Data Processing Software for the AFM | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Version 5.0.86, can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Fluorescence Microscope (Leica DMi8) | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | 11889113 | |
| Glass block cantiliver holder | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SP-90-05 | Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker). |
| Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F1315 | |
| Microscope glass slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS294775X50 | |
| Mounting medium With DAPI | ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany | 50011 | Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs side view imaging |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather Medical Products, Osaka, Japan | 2023-01 | |
| Silicone Skirt | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent medium condensation in the AFM head. |
| Statistical program - SPSS | IBM, Armonk, New York, USA | SPSS Statistics 22 | Vesion 280.0.0.0 (190) |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 | Water-soluble embedding medium |
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