Summary
원자력 현미경 미세 압입과 관련된 가장 일반적인 문제를 식별하고 해결하기 위한 단계별 접근 방식을 제시합니다. 우리는 다양한 정도의 골관절염 유발 퇴행을 특징으로 하는 토착 인간 관절 연골 외식에 대한 새로운 문제를 예시합니다.
Abstract
의심할 여지 없이 원자력 현미경(AFM)은 현재 생물학 분야에서 마이크로 및 나노 신호를 평가하는 가장 강력하고 유용한 기술 중 하나입니다. 그러나 다른 미시적 접근 방식과 마찬가지로 방법론적 문제가 발생할 수 있습니다. 특히, 시료의 특성, 시료 전처리, 기기 유형 및 압흔 프로브로 인해 원치 않는 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 건강한 관절염 관절 연골 외식에 대한 이러한 새로운 문제를 예시합니다. 이를 위해 먼저 전체 조직 이식물의 대형 2D 모자이크 형광 이미징을 통해 다양한 변성 단계에 따라 생체 외 관절 연골 디스크를 생성, 등급 지정 및 시각적으로 분류하는 방법을 단계별 접근 방식으로 보여줍니다. ex vivo 모델의 가장 큰 강점은 골관절염 초기 발병부터 진행까지 골관절염 관련 변화를 조사할 수 있는 노화된 천연 인간 연골로 구성되어 있다는 것입니다. 또한 조직 준비의 일반적인 함정과 후속 데이터 분석과 함께 실제 AFM 절차도 제시됩니다. 시료 전처리 및 처리, 고급 변성으로 인한 지형학적 시료 특성, 시료-팁 상호 작용과 같은 기본적이지만 중요한 단계가 데이터 수집에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 보여줍니다. 또한 AFM에서 가장 일반적인 문제를 면밀히 조사하고 가능한 경우 이를 극복하는 방법을 설명합니다. 이러한 한계에 대한 지식은 올바른 데이터 수집, 해석 및 궁극적으로 광범위한 과학적 맥락에 결과를 포함시키는 데 가장 중요합니다.
Introduction
전자 장치 및 시스템의 크기가 계속 줄어들면서 마이크로 및 나노 기반 기술 및 장비의 급속한 발전이 탄력을 받았습니다. 그러한 장치 중 하나는 원자력 현미경 (AFM)으로, 생물학적 표면을 스캔하고 나노 및 마이크로 미터 규모 1,2에서 지형 또는 생체 역학 정보를 검색 할 수 있습니다. 그것의 광대한 특징 중에서, 이 공구는 각종 생물학 체계 3,4,5,6의 기계적 성질에 관하여 정보를 얻기 위하여 마이크로 뿐 아니라 nano indenter로 운영될 수 있다. 데이터는 기계적 프로브를 통해 표면과의 물리적 접촉에 의해 수집되며, 이는 팁7에서 약 1nm만큼 작을 수 있습니다. 샘플의 결과 변형은 캔틸레버 팁의 압흔 깊이와 샘플8에 가해지는 힘을 기반으로 표시됩니다.
골관절염(OA)은 관절과 주변 조직의 관절 연골이 악화되어 뼈 표면이 완전히 노출될 수 있는 장기적인 퇴행성 만성 질환입니다. OA의 부담은 상당합니다. 현재 65세 이상 여성의 절반과 남성의 1/3이 골관절염9을 앓고 있습니다. 외상, 비만, 그리고 그로 인한 관절(10)의 변형된 생체역학이 관절 연골 퇴행을 결정하며, 이는 일반적인 최종 결과로 간주된다. Ganz et al.의 선구적인 연구는 OA 과정의 초기 단계가 연골11의 생체역학적 특성과 관련이 있을 수 있다고 가정했으며, 그 이후로 연구자들은 이 가설을 확인했습니다 12. 마찬가지로, 조직의 생체역학적 특성은 세포-세포 및 세포-기질 누화뿐만 아니라 초구조적 조직에 의해 기능적으로 조정된다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있습니다. 모든 변화는 전체 조직의 생체역학적 기능에 극적인 영향을 미칠 수 있다13. 현재까지 OA 진단은 임상적이며 일반 필름 방사선 촬영을 기반으로 한다14. 이 접근법은 양면성을 가지고 있다: 첫째, 골관절염의 진단을 공식화하기 위한 정의된 퇴행성 컷오프 역치가 없기 때문에 상태를 정량화하기 어렵고, 둘째, 영상 기법은 감도와 표준화가 부족하고 국소 연골 손상을 감지할 수 없다15,16,17. 이를 위해 연골의 기계적 성질 평가는 골관절염의 병인과 무관하게 골관절염 진행 과정에서 변하는 파라미터를 설명하고, 매우 초기 단계에서 조직 기능에 직접적인 영향을 미친다는 결정적인 장점이 있습니다. 압흔 기구는 조직이 압흔에 저항하는 힘을 측정합니다. 사실 이것은 새로운 개념이 아닙니다. 가장 초기의 연구는 1980년대와 1990년대로 거슬러 올라간다. 이 기간 동안 수많은 연구에서 관절 연골의 관절경 측정을 위해 설계된 압흔 기구가 연골의 퇴행성 변화를 감지하는 데 적합할 수 있음을 시사했습니다. 30년 전에도 일부 연구에서는 압흔 기구가 관절경 검사 중 압축 강성 측정을 수행하여 조직 퇴화 중 연골 표면의 생체 내 변화를 감지할 수 있음을 입증할 수 있었습니다18,19,20.
관절 연골의 AFM 압흔(AFM-IT)은 조직의 중추적인 기계적 특성, 즉 강성에 대한 정보를 제공합니다. 이것은 인가된 비파괴 하중과 압입된 조직 영역(21)의 결과적인 변형 사이의 관계를 기술하는 기계적 파라미터이다. AFM-IT는 거시적으로 영향을 받지 않는 콜라겐 네트워크에서 연령에 따른 강성 변화를 정량화할 수 있는 것으로 나타났으며, 따라서 골관절염 발병과 관련된 병리학적 변화(관절 연골의 Outerbridge 척도에서 0등급)를 구별할 수 있습니다22. 우리는 이전에 AFM-IT가 초기 연골 퇴행에 대한 이미지 기반 바이오마커로서 공간 연골 세포 조직을 기반으로 정량화할 뿐만 아니라 실제로 초기 퇴행성 기계적 변화를 정확히 찾아낼 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 발견은 이미 다른 사람들에 의해 확인되었다23,24. 따라서 AFM-IT는 초기 퇴행성 변화를 진단하고 식별하는 흥미로운 도구 역할을 합니다. 이러한 변화는 이미 세포 수준에서 측정될 수 있으며, OA 병태생리학적 과정에 대한 이해를 재구성할 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 천연 연골 외식물 준비부터 AFM 데이터 수집 및 처리에 이르기까지 관절 연골 외식의 완전한 조직학적 및 생체역학적 등급 지정 절차를 보여줍니다. 단계별 접근 방식을 통해 2D 대형 모자이크 이미징 및 마이크로 AFM 압흔을 통해 다양한 퇴행 단계에 따라 관절 연골 조직을 생성, 등급 지정 및 시각적으로 분류하는 방법을 보여줍니다.
현재 AFM-IT는 연골의 생체역학적 변화를 측정하는 가장 민감한 도구 중 하나이지만7 다른 도구 기법과 마찬가지로 잘못된 데이터 수집으로 이어질 수 있는 한계와 실용적인 특성25이 있다. 이를 위해 연골 외출부의 심방세동 측정 중에 발생하는 가장 일반적인 문제를 면밀히 조사하고 가능한 경우 이를 최소화하거나 극복하는 방법을 설명합니다. 여기에는 샘플의 지형적 측면과 AFM 호환 환경에서 안정화하기 어려운 점, 조직 표면의 물리적 특성, 이러한 표면에서 AFM 측정을 수행하는 데 따른 어려움이 포함됩니다. 잘못된 힘-거리 곡선의 예도 제시되어 이를 유발할 수 있는 조건을 강조합니다. 캔틸레버 팁의 형상에 내재된 추가 제한 사항과 데이터 분석을 위한 Hertz 모델 사용도 논의됩니다.
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Protocol
독일 튀빙겐 대학병원에서 무릎 인공관절 전치환술을 받은 환자로부터 채취한 대퇴골 과두를 사용했다. 이 연구에는 퇴행성 및 외상 후 관절 병리가 있는 환자의 관절 연골 샘플만 포함되었습니다. 연구 시작 전에 부서, 기관 및 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(프로젝트 번호 674/2016BO2). 참여하기 전에 모든 환자로부터 서면 동의서를 받았습니다.
참고: 실험 단계의 시간순 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 조직 처리 및 연골 디스크 생성
- 조직 준비
- 수술 후 절제 후 연골 샘플을 5%(v/v)의 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)으로 채워진 용기에 넣습니다. 샘플이 매체에 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 외과적 절제와 연골의 추가 처리 사이의 시간은 24시간을 초과해서는 안 됩니다. 전체 공정에서 샘플이 건조되지 않도록 미디어에 완전히 잠기도록 합니다.
- 메스를 사용하여 뼈에서 연골을 잘라냅니다.
- 연골 디스크 생성
- 생검 펀치를 사용하여 직경 4mm의 연골 디스크를 생성합니다.
참고: 연골층 두께가 1mm를 초과하는 과두 부위를 선택하여 절제하는 것이 중요합니다. 이는 특히 연골층이 마모 과정이나 변성으로 인해 일반적으로 두께를 잃는 하중 지지 영역 주변에서 문제가 될 수 있습니다. - 기존에 생성된 4mm 연골 디스크를 맞춤형 절단 장치에 놓고 주걱으로 연골 디스크를 고정하고 안정적으로 고정합니다. 절단 장치에 연골 디스크를 놓을 때 주의를 기울여야 합니다. 연골의 최상층(관절 연골의 표피 영역)이 칼날을 향하지 않도록 샘플을 배치합니다
- 면도날로 연골 디스크를 자릅니다. 따라서 4mm x 1mm의 디스크 모양의 연골 샘플이 생성됩니다. 샘플 건조를 방지하려면 가능한 한 빨리 조직 절단을 수행하십시오.
- 주걱을 사용하여 각 디스크를 수집하고 생성된 연골 디스크를 5%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 1mL의 DMEM이 들어 있는 1.5mL 튜브에 넣습니다. 하나의 튜브에 약 15개의 디스크를 넣습니다.
- 생검 펀치를 사용하여 직경 4mm의 연골 디스크를 생성합니다.
- 연골 디스크의 극저온 절편(수직 절편용)
참고: 이 단계는 선택 사항이며 연골 디스크 내 세포 패턴 분포의 측면 시각화가 필요한 경우 사용할 수 있습니다. 세포 패턴의 분포는 관절 연골26의 3D 특징이므로 검증 방법으로 사용할 수 있습니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 전체 연골 디스크의 광학 절편 및 3D 재구성도 사용할 수 있으므로 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 절편할 필요가 없습니다.- 연골 디스크를 수용성 임베딩 배지로 덮고 냉동 절개 손잡이의 가장자리에 놓습니다(디스크 표면이 손잡이 표면에 수직이 되도록). cryotome 장치에서 매립 매체는 저온에서 동결됩니다.
- 표준 빙정 토메를 사용하여 디스크 중간에 도달할 때까지(즉, 동결 절편이 4mm 길이에 도달할 때까지) 60μm 두께로 조직을 옆으로 절편하고 슬라이스를 수집합니다. 디스크 외피물을 수직으로 절편하여 연골의 모든 영역(표재, 중간, 심부)을 시각화할 수 있습니다.
- 유리 슬라이드에서 섹션을 수집하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 세척하여 수용성 임베딩 매체를 제거합니다.
2. 세포 공간 패턴의 함수로서의 연골 디스크 분류
- 원반 모양의 연골 샘플의 염색
- 96웰 플레이트의 각 웰에 연골 디스크(섹션 1.2) 1개를 놓고 각 웰에 1:1,000으로 희석하여 130μL의 세포 투과성 형광 염료를 추가합니다.
- 전체 플레이트를 육안으로 검사하고 각 웰에 하나의 디스크만 배치되었는지 확인합니다. 37°C의 표준 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 30분 동안 배양합니다.
- 60μm 연골 절편의 염색
- 연골 디스크 섹션(섹션 1.3)을 겸자를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 부드럽게 놓습니다.
- 핵 DAPI 대조염색이 포함된 장착 배지로 연골 부분을 덮고 형광 현미경 검사에 적합한 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다.
- 각 커버슬립의 가장자리를 일반 투명 매니큐어로 밀봉하고 3분 동안 건조시킵니다.
- 하향식(top-down) 및 측면(side-view) 연골 분류 및 이미징
알림: 각 디스크는 형광 현미경으로 검사해야 합니다. 이 단계의 목적은 주요 셀룰러 패턴(단일 스트링, 이중 스트링, 작은 클러스터, 큰 클러스터 또는 확산)을 기반으로 디스크를 정렬하는 것입니다.- 형광 현미경의 플레이트 홀더에 96웰 플레이트를 놓습니다.
- Em 495 nm/Ex 515 nm(섹션 2.1에서 준비한 연골 디스크의 하향식 이미징용) 또는 Em 358 nm/Ex 461nm(섹션 2.2에서 준비한 연골 절편의 측면 이미징용)와 10x 대물렌즈의 적절한 형광 필터를 선택합니다.
참고: 10x 대물렌즈를 사용하면 디스크의 전체 둘레를 검사할 수 있으며 불균일하거나 부적절한 염색이 있는 샘플을 제외할 수 있습니다. 그러나, 하향식 관점만을 사용하는 것은 표면 침식에 의해 하향식 관찰에 가시화된 더 깊은 조직층의 분석 결과로서 세포 조직의 변화를 인식하는 결과를 초래할 수 있습니다. 예를 들어, 콜라겐 아케이드를 따르는 오름차순 문자열은 단일 세포 또는 흩어진 세포(확산 패턴)로 인식될 수 있습니다(확산 패턴)26. 결과적으로, 적절한 세포 패턴 선택을 보장하기 위해 디스크의 양면을 검사해야 합니다. - 각 연골 디스크에 표시되는 세포 패턴을 시각적으로 확인합니다. 디스크에 한 가지 유형의 셀룰러 패턴만 있을 가능성은 거의 없습니다. 연골세포 배열이 관심있는 패턴과 일치하지 않는 디스크 부분의 경우, 원하지 않는 패턴이 AFM 측정이 일어나지 않는 바로 주변부에 있는 경우(즉, 디스크 경계로부터 최대 0.5mm), 이것이 디스크(27)의 전체 표면의 10%를 초과하지 않도록 하고, 28입니다.
- 전체 연골 디스크의 이미지 획득
- 현미경의 10x 대물렌즈를 선택하고 개별 연골 디스크가 포함된 미리 선택된 웰 아래에 배치합니다. 디스크에 초점을 맞추면 세포 패턴을 볼 수 있습니다.
- 탐색기 기능을 선택하여 전체 우물에 대한 개요를 확인합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 사용하고 드래그하여 다른 스테이지 위치로 이동합니다. 마우스 휠을 사용하여 확대 및 축소합니다.
참고: 이 시점에서, 전체 샘플이 있는 웰의 미리보기는 각 관심 영역을 순차적으로 두 번 클릭하여 볼 수 있습니다. - 스캔할 관심 영역을 포함하는 사각형을 선택합니다. 이 시점에서 모자이크를 구성하는 모든 단일 타일이 표시됩니다.
- 배경에서 세포를 명확하게 시각화할 수 있도록 노출/조명 강도를 조정합니다. 이 시점에서 그림의 밝기/대비는 모든 타일에 대해 조정되었으며 더 이상 각 타일에 대해 개별적으로 사용자 지정할 수 없습니다.
알림: 디스크 가장자리 근처의 셀은 중앙의 셀보다 더 높은 형광 신호를 방출하는 경우가 많으므로 노출/광도 설정을 조정해야 합니다.- 노출 시간이 특정 채널에 적합한지 평가하려면 히스토그램에서 신호의 분포를 검토하십시오. 현미경의 이미지 소프트웨어에 포함된 자동 노출 메커니즘을 사용하여 디스크 내에 있는 모든 세포를 시각화합니다.
- 소프트웨어의 포커스 맵 포인트 옵션을 선택한 다음 중앙을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 각 개별 타일을 선택합니다.
- 포커스 맵 옵션을 선택합니다. 이전에 선택한 모든 타일이 있는 창이 표시됩니다. 목록에서 타일을 두 번 클릭하여 표시하고 적절한 초점을 맞춥니다.
- Z 설정을 클릭하여 초점 계획을 저장하고 다음 타일로 진행합니다. 각 개별 타일에 대한 초점 평면도를 조정한 후 스캔 시작을 눌러 이미지 획득을 시작합니다.
- 스캔에 더 어두운 수평 및/또는 수직 막대가 표시되는 경우 이는 단일 프레임의 부적절하고 고르지 않은 조명 때문일 수 있습니다. 실제 스캔 전에 소프트웨어에 통합된 Linked Shading 옵션을 사용하여 이 문제를 해결하십시오.
- 이미지를 저장하고, 내보내고, 올바르게 주석을 달 수 있습니다.
3. 연골 외식의 생체역학적 접근
- AFM 측정을 위한 시료 전처리
- 생체 적합성 접착제를 사용하여 페트리 접시에 세포 패턴(섹션 2)이 포함된 미리 선택된 각 연골 디스크를 고정합니다. 디스크의 위쪽, 아래쪽, 왼쪽 및 오른쪽에 충분한 샘플 접착제를 추가합니다.
- L-글루타민이 없는 Leibovitz의 L-15 배지 2.5mL로 디스크를 덮습니다. Leibowitz 배지를 샘플에 부드럽게 추가하여 샘플이 매체에 의해 생성된 파동으로 인해 표면에서 분리되는 것을 방지합니다.
- AFM에 샘플 로드
- AFM 장치의 샘플 홀더에 페트리 접시를 놓고 37°C로 설정된 페트리 식기 히터를 켭니다. 조직 배양 접시가 원하는 온도에 도달하도록 합니다. 이는 온도 변화로 인해 발생할 수 있는 아티팩트를 배제하기 위해 수행됩니다.
- AFM-캔틸레버 캘리브레이션
- 이전에 Danalache et al.29에서 설명한 대로 소프트웨어 설정을 초기화합니다.
- 액체 측정에 적합한 유리 블록 캔틸레버 홀더를 선택하고 AFM 헤드에 조심스럽게 놓습니다. 잠금 장치가 유리 블록을 AFM 헤드에 고정합니다. 유리 블록의 반사면이 AFM 홀더와 직선이고 평행한지 확인하십시오.
- 캔틸레버를 유리 블록 캔틸레버 홀더 표면에 조심스럽게 놓습니다. 캔틸레버 자체는 유리 블록의 중앙에 있는 광택 처리된 광학 평면에 있어야 합니다.
- AFM 헤드에 중간 응결을 방지하기 위해 캔틸레버 홀더 바닥에 실리콘 스커트(실리콘 멤브레인)를 조심스럽게 놓습니다.
- 캔틸레버가 매체에 완전히 잠길 때까지 스테퍼 모터 기능을 사용하여 캔틸레버를 100μm 단위로 내립니다.
- Danalache et al.29에서 설명한 접근 매개변수를 사용하여 스캐너 접근 방식을 실행합니다. 페트리 접시의 바닥에 도달하면 캔틸레버를 100μm 후퇴시킵니다.
- 정확한 단계를 사용하여 캔틸레버를 보정하고 Danalache et al.29에서 설명한 매개변수를 실행합니다. 교정이 끝나면 수직 편향이 저장되고 광 다이오드 검출기에 의한 원래 등록 단위인 볼트(V)가 아닌 뉴턴(N) 힘 단위로 표시됩니다. 여기의 실험에서 보정 후 4.47nN의 설정점이 발생했습니다.
- 스테퍼 모터 기능을 사용하여 캔틸레버를 1,000μm로 후퇴시킵니다.
- AFM에서 원하는 연골 측정 부위 확인
참고: 연골 디스크의 두께가 1mm이기 때문에 캔틸레버는 샘플을 탐색하는 동안 시야에서 보이지 않습니다.- 현미경의 CCD 카메라를 사용하여 캔틸레버를 식별합니다. AFM 캔틸레버는 샘플이 없는 페트리 접시 영역에 위치해야 합니다.
- Danalache et al.29에서 설명한 것과 동일한 매개변수를 사용하여 페트리 접시의 깨끗하고 샘플이 없는 영역에서 캔틸레버로 스캐너 접근 방식을 시작합니다.
- 스테퍼 모터 제어를 사용하여 캔틸레버를 플레이트 바닥에서 1.5mm 더 후퇴시킵니다. 이 단계는 캔틸레버와 샘플 사이의 직접적인 충돌을 피하기 위해 매우 중요합니다.
- 명시야(brightfield) 보기에서 형광 보기(fluorescence view)로 전환하고 디스크 상단을 시각적으로 식별할 수 있습니다.
- AFM s를 이동합니다.amp디스크 중앙을 향해 정확히 2mm 홀더를 놓습니다. 이 지점은 연골 디스크의 중심으로 간주됩니다.
- 스캐너 접근 방식을 실행하고 연골 디스크의 표면에 도달하면 캔틸레버를 100μm 후퇴시킵니다.
- 힘-거리 곡선 측정
- 원하는 측정 부위에 위치한 세포에 초점을 맞춥니다. Run 버튼을 클릭하여 측정 및 목표 위치에서 힘-거리 곡선 생성을 시작합니다.
- 각 측정 사이트에서 5개의 힘-거리 곡선을 수집합니다. 캔틸레버를 500μm 후퇴시키고 캔틸레버를 다음 측정 장소로 이동합니다.
알림: 캔틸레버의 수축은 연골 디스크 표면이 균일하지 않고 불규칙성이 있기 때문에 중요한 단계입니다. 시료 표면의 높은 경사면은 급격한 충돌을 일으켜 원치 않는 캔틸레버 팁/시료 손상으로 이어질 수 있습니다. 디스크 표면에 분산된 최소 5개의 서로 다른 측정 부위를 선택하고 각 부위에서 최소 5개의 힘-거리 곡선을 획득하는 것이 좋습니다. - 힘-거리 곡선을 검사하고 저장합니다.
- Hertz 피팅 모델을 사용한 영률 추정
- Open a Batch of Spectroscopy Curves 옵션을 사용하여 데이터 분석 소프트웨어에서 분석할 생성된 힘-거리 곡선(.jpk 파일)을 엽니다.
- Hertz 피팅 모델을 선택한 다음 탄성 피팅 옵션을 선택합니다.
- 탄성 맞춤 옵션은 선택한 힘-거리 곡선에 대해 다음 계산을 자동으로 수행합니다: 기준선을 계산하고 전체 곡선에서 빼서 기준선 오프셋을 제거합니다(기준선은 y축에서 0으로 되돌려짐). 힘-거리 곡선이 0 힘-선과 교차하는 지점을 감지하여 접촉점을 결정합니다(접촉점은 x축에서 0으로 설정됨). 팁-샘플 분리를 계산합니다(캔틸레버의 굽힘을 설명하는 피에조의 높이 신호를 뺍니다). 힘-거리 곡선을 선택한 모델에 자동으로 맞춥니다. 원하는 경우 이러한 각 단계를 독립적으로 수행할 수도 있습니다.
- 다음 피팅 파라미터(포아송 비율 0.5 및 적절한 캔틸레버 팁 반경)를 사용하여 조정합니다.
알림: 구형 캔틸레버 팁이 있는 캔틸레버를 사용할 때는 Hertz 핏 모델을 사용해야 합니다. 이 연구에 사용된 캔틸레버는 반경이 5μm인 구형 팁을 가지고 있었습니다. 적용된 최대 힘(설정값)에 도달할 때까지 힘-거리 곡선을 맞추는 것이 좋습니다. - 힘-거리 곡선 맞춤을 육안으로 확인하여 정확성을 확인합니다. 이 단계는 분석된 각 힘-거리 곡선에 대해 수행해야 합니다.
- 압흔 깊이 측정
참고: 사용 중인 데이터 분석 도구에 따라 이 프로세스가 다를 수 있습니다. 실험자는 데이터 분석 프로그램에 포함된 일련의 단계에 따라 압입 깊이를 쉽게 읽을 수 있습니다.- 데이터 분석 소프트웨어에서 생성된 각 힘-거리 곡선을 열고 해석 프로세스로 Hertz 적합 모델을 선택합니다.
- 기준선 오프셋 빼기 옵션을 적용하여 수직 처짐 축(y축)을 0으로 만들고 오프셋 + 기울기 기능을 선택합니다.
- 접점 찾기 기능을 사용하여 접점을 자동으로 식별하면 자동으로 x 좌표가 0이 됩니다.
- Vertical Tip Position 기능을 사용하여 압입 중 원시 피에조 높이에서 캔틸레버 처짐만을 고려한 거리를 뺍니다.
- 탄성 맞춤(Elasticity Fit) 옵션을 선택하여 처리된 힘-거리 곡선을 표시하고 수직 팁 위치 축(x축)에서 가장 음의 값과 정렬되도록 그래프 영역을 선택합니다.
- 매개 변수 탭의 X Min 상자에서 들여쓰기를 읽고 문서화합니다. 결과를 저장하고 문서화합니다.
4. 통계 분석
- 통계 소프트웨어를 엽니다. 드롭다운 메뉴에서 새 데이터 세트를 선택합니다.
- 데이터 세트 파일을 선택한 후 변수 보기 탭을 엽니다. 각 세포 패턴 범주에 대한 수치 변수를 정의합니다: 단일 문자열 = SS, 이중 문자열 = DS, 작은 클러스터 = SC, 큰 클러스터 = BC, 확산 및 영 계수.
- 데이터 보기 탭에서 해당 세포 패턴 범주 각각에 대해 측정된 영률 데이터를 입력합니다. 메뉴 모음에서 분석을 선택한 다음 예비 데이터 분석을 선택하여 데이터 분포를 분석합니다.
- 영률(Young's Moduli)을 종속 변수로, 세포 패턴(Cellular Pattern)을 요인 목록으로 선택합니다. 결과 섹션에 사용된 상자 그림이 출력 파일의 결과 사이에 표시됩니다.
- 통계 분석을 수행하려면 분석 메뉴 모음 탭의 비모수 검정 섹션에서 종속 표본 을 선택합니다. fields(필드) 탭에서 Young's Moduli(영 계수 )를 Test Fields(테스트 필드 )로, Cellular Pattern(셀룰러 패턴 )을 Groups(그룹 )로 선택합니다. Run(실행)을 누릅니다.
참고: 결과는 출력 파일에 표시됩니다. 통계 분석을 위해 Friedman 검정이 수행됩니다. - 비모수 검정의 p-값을 4.4단계에서 만든 상자 그림에 통합합니다. 메뉴 모음에서 File( 파일 )을 클릭하고 Save(저장)를 선택하여 결과를 저장합니다.
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Representative Results
자체 제작한 절단 장치를 사용하여 단일 스트링(SS, 그림 2A), 이중 스트링(DS), 작은 클러스터(SC), 큰 클러스터(BC; 그림 2A) 및 확산(그림 2B). 대표적인 연골 이식은 그림 3A에 묘사되어 있습니다. 한 가지 유형의 패턴만 표시하는 디스크 선택은 하향식 형광 이미징을 사용하여 수행되었습니다(그림 2). 연골 표면 디스크의 지형적 변화는 연골 디스크에서 생성된 60μm 두께의 단면을 측면 영상으로 촬영하여 추가로 설명되었습니다(그림 2C). 이식된 골관절염 연골 디스크의 표면에는 표재성 세동과 기질 갈라짐이 있었습니다(그림 3B,C). 이는 BC의 존재로 대표되는 진행성 OA 진행을 나타내는 디스크에서 특히 두드러졌습니다(그림 2A). 형광 후 분류 후 디스크의 강성은 AFM 미세 압흔으로 평가되었습니다. 이를 위해 생성된 연골 디스크는 생체 적합성 접착제(그림 3D)를 사용하여 AFM 페트리 접시에 성공적으로 고정되어 측정 중 샘플 표류를 방지했습니다(그림 3E). 사용되는 접착제의 양을 조정해야 합니다. 접착제의 양이 충분하지 않으면 디스크가 불안정해지고, 접착제를 너무 많이 넣으면 접착제가 연골 디스크 아래 및/또는 위로 원치 않게 퍼질 수 있습니다. 후자는 측정 아티팩트와 형광 현미경 하에서 디스크를 제대로 식별하지 못하게 합니다. 부적절한 접착제 도포 또는 고정 중 샘플의 갑작스러운 움직임은 조직이 페트리 접시에서 분리되는 빈번한 문제이므로 피해야 합니다.
세포 패턴 배열과 함께 대표적인 점진적인 강성 감소가 그림 4A에 표시되어 있습니다. 경직 값은 SS(중앙값 2.6kPa)를 포함하는 디스크에서 더 높았으며, 이는 손상되지 않은 건강한 연골 영역을 나타냅니다. 골관절염 발병 및 진행에 따라 AFM 측정은 DS(1.5kPa)에서 42%, SC(0.6kPa)에서 77%, 궁극적으로 BC(0.3kPa)로 표시되는 고급 단계에서 88%의 강성이 단계적으로 크게 감소했음을 보여주었습니다. 그림 4A). 확산 패턴을 포함하는 디스크는 Young's modulus 단일 값의 중요한 변화로 상승된 탄성을 나타냈습니다. 우세한 세포 패턴 조직이 할당된 모든 연골 디스크의 경우, 사용된 설정값(4.477nN)과 관련된 압흔 깊이는 강성에 반비례하는 것으로 나타났습니다(그림 4B). 대표적으로 생성된 힘-거리 곡선은 그림 4C에 나와 있으며, 헤르츠 피팅과 접점 식별은 그림 4D에 나와 있습니다.
올바른 피팅은 다른 요인 중에서 기준선의 올바른 결정에 따라 달라집니다. 자동 기준선 감지가 잘못된 경우(예: 난류 기준선으로 인해) 맞춤을 수동으로 결정할 수도 있으며 이를 통해 사용자는 측정에 대해 보다 대표적인 기준선을 선택할 수 있습니다. 그러나 생성된 힘-거리 곡선이 적절한 맞춤을 허용하지 않으면 버려야 합니다. 그림 5는 잘못된 힘-거리 곡선의 예를 보여줍니다. 골관절염 관절 연골 외피에서 적절한 힘-거리 곡선을 생성하는 것은 한편으로는 조직의 불규칙한 표면(그림 5A, B 참조)과 부적절한 샘플 고정으로 인한 샘플의 불안정성(그림 5C, D 참조)으로 인해 어려울 수 있습니다. 아티팩트는 여러 프로브-샘플 접촉점(퇴행성 연골의 고르지 않은 표면으로 인해) 또는 원치 않는 조직 이동(초점면의 변화를 통해 볼 수 있음)으로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 아티팩트는 생성된 힘-거리 곡선에서 볼 수 있으며 AFM 캔틸레버와 연골 표면 사이의 최적이 아닌 접촉 또는 페트리 접시에 대한 부적절한 샘플 고정을 나타냅니다(그림 5A-D 참조).
그림 1: 실험 절차의 순서도. 수술 중 절제된 연골 샘플에서 시작하여 4mm x 1mm 연골 디스크 생성, 하향식 및 측면 이미징을 통한 세포 패턴 조직을 기반으로 한 형광 염색 및 디스크 분류, 궁극적으로 원자력 측정을 통한 탄성 평가에 이르기까지 실험 단계를 시간순으로 요약합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 대표적인 연골 디스크의 형광 이미징. (A) 모자이크 2D 이미지 및 100배 배율로 세포막 투과성 염료로 염색된 연골 디스크의 확대된 예시 필드. 위쪽 디스크에는 대표적인 단일 스트링 디스크가 표시되고, 아래쪽 디스크에는 큰 클러스터 디스크(아래쪽)가 표시됩니다. (B) 표면(위)에서 본 확산 패턴 원반의 모자이크 그림과 밑면(아래)에서 본 동일한 원반. (C) 60μm 연골 디스크 절편의 핵 염색 측면도. 흰색 눈금 막대는 모자이크 사진(더 큰 시야, A[왼쪽 패널], B, C)의 경우 500μm, 확대된 초점이 맞춰진 사진(A[오른쪽 패널])의 경우 100μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이식된 관절 연골 디스크. (A) 신선한 인간 관절 연골에서 생성된 4mm x 1mm 연골 디스크 이식물의 대표 이미지. 흰색으로 표시된 눈금 막대는 2mm를 나타냅니다. (B) 조직 표면이 거시적으로 보이는 표재성 세동 및 구순구개열을 나타내는 천연 골관절염 연골의 대표 이미지. 흰색으로 표시된 눈금 막대는 1,000mm를 나타냅니다. (C) 세동이 발생한 연골 표면의 개략적 묘사. (D) AFM 측정 이전에, (E)에 표시된 바와 같이 실제 압흔 측정 중 샘플 표류로 인한 아티팩트를 방지하기 위해 각 연골 디스크 외피는 생체 적합성 샘플 접착제를 사용하여 AFM 페트리 접시의 표면에 적절하게 고정되었습니다. 흰색 눈금 막대는 4mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 관절 연골 디스크의 우세한 세포 패턴 조직을 기준으로 정렬된 원자력 현미경 측정의 대표적인 결과. (A) 한 환자로부터 유래한 각 세포 패턴에 대해 하나씩 5개의 디스크에 대해 계산된 영률(Young's moduli)의 중앙값을 표시하는 상자 그림. 각 디스크에서 총 25개의 측정이 수행되었습니다(5개의 개별 측정 부위에 대해 5개의 측정). 사각형 안의 검은색 선은 중앙값을 나타내고, 사각형의 아래쪽 끝과 위쪽 끝은 각각 첫 번째 사분위수와 세 번째 사분위수를 나타내며, 오차 막대는 각 그룹의 가장 낮은 값과 가장 높은 값을 나타냅니다. (B) 각 세포 패턴에 대한 125개의 압흔 깊이 지점을 나타내는 점 플롯. (C) 0.4kPa의 영률(Young's modulus)을 계산하여 AFM으로 획득한 예시적인 힘-거리 곡선. (D) (C)에 표시된 힘-거리 곡선에 대한 대표적인 Hertz 적합 및 접점 결정. x축은 수직 팁 위치(피에조가 교차하는 거리이며, 캔틸레버 굽힘을 고려한 길이는 힘-거리 곡선의 접촉 부분에서 자동으로 차감됨)를 표시합니다. *p < 0.05. 통계 분석에는 Friedman 검정이 사용되었습니다. 약어: SS = 단일 문자열; DS = 이중 문자열; SC = 작은 클러스터; BC = 큰 성단. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 잘못된 힘-거리 곡선의 예. (A) 힘-거리 곡선은 표면의 지속적인 압흔이 관찰되기 전에 기준선 수준 근처에서 회복된 후 엄청난 편차를 보여줍니다. 이 현상은 상대적으로 큰 장애물(예: 연골의 최상층에서 튀어나온 큰 표면 틈)에 기인할 수 있습니다. (B) 확장된 힘-거리 곡선은 여러 개의 작은 피크를 보여줍니다. 이러한 만곡은 연골 표면의 미세한 불규칙성(예: 세동)으로 인해 발생하는 것으로 생각됩니다. (C)와 (D)는 모두 이위상 코스가 있는 힘-거리 곡선을 표시합니다. 두 힘-거리 곡선 모두 불량한 샘플 고정 및 샘플 드리프트를 나타냅니다. 이러한 경우 초점면의 급격한 변화를 보는 것도 매우 일반적입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
진행성 다인성 질환인 골관절염은 관절 연골의 구조적, 기능적 변화를 유발합니다. 골관절염이 진행되는 동안, 기계적 특징의 손상은 관절 연골 표면의 구조적 및 생화학적 변화를 동반한다27,31. 골관절염에서 발생하는 가장 초기의 병리학적 사건은 프로테오글리칸 고갈과 콜라겐 네트워크 붕괴이다32,33,34. 이러한 초기의 미묘한 표면 변화는 기계적 거동이 전체 조직 깊이에 걸쳐 평균화되기 때문에 벌크 테스트로 정확히 찾아내고 식별하기가 어렵습니다. 또한 장기 및 조직 수준의 기능적 변화가 마이크로 또는 나노 규모의 구조적 및 기능적 변화와 관련이 있는지 여부는 아직 해결되지 않은 질문입니다. 이를 위해 AFM은 OA 발병과 함께 발생하는 가장 초기의 생체역학적 변화를 감지할 수 있는 가장 민감한 방법 중 하나로 간주됩니다7. 이를 통해 천연 샘플에서 마이크로 및 나노 미터 규모의 강성을 측정 할 수 있으며, 관절 연골35,36의 기계적 특성에 대한 정보를 제공합니다. 이 프로토콜에서는 마이크로 AFM 압흔을 사용하여 건강한 골관절염 관절 연골 인간 외출부의 탄성 특성을 측정했습니다. 그 결과, 연골 외측은 초기 국소 골관절염 현상을 매우 잘 나타내며, 패턴 특이적 연골 외식에서 발생하는 경직도의 점진적인 감소가 눈에 띄게 감소하는 것으로 나타났습니다. 또한, 결과는 세포 패턴 조직23,24,27,37과 함께 현저한 강성 감소를 보여준 이전에 발표된 연구와 일치합니다.
골관절염 발병 및 진행의 다양한 측면을 모방하는 확증된 네이티브 인간 모델은 현재 중개 연구의 부족과 in vitro 데이터를 임상 환경으로 번역하는 문제를 해결하는 데 필요합니다. 현재까지, 어떤 모델도 복잡한 인간 연골 구획을 정확하게 표현할 수 없으며, 질병을 유발하는 자극에 반응하여 골관절염이 발생하기 쉬운 노화 관련 관절 조직도 말할 수 없다38. 지금까지 가장 일반적으로 사용된 외식물 기반 모델은 소 또는 소 기원이었고 강력한 염증성 사이토카인 처리 또는 기계적 로딩을 적용했습니다 39,40,41. 한편, 이 프로토콜은 특정 골관절염 사건의 개별 단계를 나타내는 작은(4mm x 1mm) 이식된 디스크 모양의 인간 연골 샘플을 생성하는 방법을 보여줍니다. 연골 외피는 이미지 기반 바이오마커(30,42)로서 세포 공간 조직을 사용하여 분류되고 병기가 할당됩니다. 생체역학적 특성의 초기 변화는 이중 끈이 발생하기 시작하자마자 이미 확인되고 정량화될 수 있기 때문에23,27, 연골 표면이 여전히 거시적으로 온전한 상태로 나타나는 단계에서26, 이 외식-기반 모델은 국소적인 토착 연골 구획의 조사를 가능하게 하고 초기 골관절염에 대한 통찰력 있는 정보를 제공할 수 있다. 또한, 이 연골 모델은 3D 토착 지역 서식지(38,39)에서 기계적 및 염증성 변화에 대한 세포 및 기질 반응을 조사하는 데 유용할 수 있다. 비교적 간단하고 생성하기 쉽기 때문에, 이들 연골 외식은 또한 질병 변형 OA 약물의 개발 및 시험에 있어 제한 요인인 골관절염 이질성을 연구하는데 사용될 수 있다43. 또한 관절 치환 수술을 받는 환자에 대한 확장성과 의존성이 이 모델의 두 가지 단점이라는 점에 유의해야 합니다.
관절 연골이 검사하는 스케일 수준에 따라 특이한 행동을 나타낸다는 것은 잘 알려져 있습니다. Loparic et al.에 의해 지적된 바와 같이, 미시적 스케일에서, 연골은 비구조화되고 균일한 물질(35)로서 행동하며, 이러한 접근법은 국부적인 전체 연골 강성의 근사치를 제공한다. 2004년 Stolz et al.44의 연구에서는 관절 연골의 구조적-기계적 특성을 평가할 때 마이크로 또는 나노 압흔을 마이크로 또는 나노 압흔이 더 적합한지 여부와 관련하여 비교했습니다. 저자들은 관절 연골의 미세한 구형 압흔의 경우 나노 크기의 미세한 구조 구성 요소(즉, 개별 콜라겐 섬유 및 프로테오글리칸)가 일반적으로 하중 지지 작업을 공유한다고 강조했습니다. 이러한 경우, 응집체의 기계적 특성은 개별 나노 성분의 기계적 특성과 현저하게 다릅니다. 동일한 저자들은 미세 및 나노 압흔의 조합이 관절 연골의 전반적인 국소 강성 프로파일뿐만 아니라 미세한 구조 구성 요소와 관련된 강성을 평가하기 위해 사용될 수 있다고 제안했습니다44.
수많은 AFM 기반 압흔 실험에서 연골 역학을 평가하기 위해 날카로운 피라미드 캔틸레버 팁(반경 = 15-20nm)22,36,44을 사용했습니다. 날카로운 캔틸레버가 있는 나노인덴테이션은 현재 가장 미세한 기계적 특성을 평가하는 데 더 적합한 것으로 간주되지만 구형 캔틸레버 팁은 부드러운 생물학적 샘플을 테스트할 때 보다 일관되고 모델링 및 해석하기 쉬운 결과를 생성합니다(44,45). 또한, Stolz et al.은 효소적으로(즉, 엘라스타제) 분해된 관절 연골의 AFM 나노 압흔은 조직이 너무 끈적거리기 때문에 팁-샘플 접착이 힘-거리 곡선을 지배하여 데이터를 실현 불가능하게 만들기 때문에 가능하지 않다는 것을 입증했습니다44.
본 AFM 측정에서는 반경 5μm의 구형 캔틸레버 팁을 갖는 캔틸레버를 사용하였다. 캔틸레버 선택은 연골 표면에 가해지는 손상을 최소화하면서 상당히 큰 표면에 걸쳐 조직의 기계적 특성을 평균화하려는 의도에서 비롯되었습니다. 캔틸레버에 가해진 힘과 결과 샘플 압흔 사이의 관계는 Hertz 적합 모델에 적합했습니다. 구형 압자를 사용할 때, 캔틸레버 팁과 샘플 표면 사이에 작용하는 인력이 무시되는 Hertz 적합 모델이 권장됩니다46. 헤르츠 모델에 대한 방정식은 식1과 식2에 나와 있습니다.
식 1
식 2
여기서 F = 힘; E = 영률(Young's modulus); v = 푸아송 비; δ = 들여쓰기; a = 접촉 원의 반경; Rs = 구의 반지름.
이 모델은 궁극적으로 세포/조직 탄성(47)을 계산하며, 공식적으로는 영률(Young's modulus, E)로 표현된다. Hertz 피팅 모델은 팁 모양과 크기, 압흔, 샘플 변형성과 같은 여러 특성을 고려합니다. 이러한 요건들이 이상적으로 충족되지 않으면, 모델은 영률(46)의 부정확한 추정치를 제공할 수 있다.
헤르츠 적합 모델은 변형률과 탄성 응력이 탄성 계수에 선형적으로 의존한다고 가정하는데, 이는 시료의 압흔이 시료 두께 자체(46)보다 훨씬 작게 유지됨을 의미한다. 이 가정은 연골 외피의 두께가 수 마이크로미터의 움푹 들어간 곳과 비교하여 1mm인 이 설정에서 쉽게 충족되었습니다.
관절 연골은 다공성 점탄성 물질(48,49)로서 모델링될 수 있다. 점탄성 거동은 분자, 세포 소기관 및 콜라겐-프로테오글리칸 네트워크(50,51)와 같은 세포내/세포질 또는 매트릭스 성분 사이의 마찰에 의해 발생한다. 이름에서 알 수 있듯이 점탄성 재료는 두 가지 별개의 특성을 결합합니다 : 점성 - 외부 하중을받을 때 재료가 천천히 변형되고 탄성 - 적용된 하중이 제거되면 재료가 초기 구성으로 돌아갑니다52,53. 점탄성 거동은 힘-거리 곡선 46,52에서 접근(확장)과 후퇴 곡선 사이의 히스테리시스로 나타나며, 이 연구에서 얻은 것과 유사합니다(그림 4C). 또한, 점탄성 재료의 특징은 기계적 특성이 변형 속도에 따라 달라지며, 재료의 강성은 하중이 가해지는 속도(압흔 속도)에 따라 증가한다는 것입니다(54). 따라서, 상이한 하중 속도를 선택함으로써, 힘-거리 곡선의 패밀리가 생성되고, 이들 각각은 각각의 하중 속도(52)에서 시험된 샘플의 기계적 특성을 나타낸다. 따라서 다양한 작업의 결과를 비교할 때 모든 들여쓰기 매개변수를 고려하는 것이 중요합니다. 전반적으로, 마이크로미터 규모로 측정할 때(본 연구에서 5μm 구형 캔틸레버 팁을 사용한 경우와 같이), 관절 연골은 비구조적이고 균일한 물질로서 거동하며, 조직(35)의 다공성 탄성 성질로 인한 강성에 대한 탄성 및 점성 기여를 모두 포함하는 누적 탄성 계수를 생성한다.
헤르쯔 모델의 또 다른 가정은 압흔 깊이가 구형 캔틸레버 선단(55)의 반경보다 낮다는 것이다. 압흔 깊이는 샘플과 처음 접촉한 후 캔틸레버 팁의 최대 변위를 나타냅니다. 최대 하중에서 최대 압흔 깊이는 샘플과 캔틸레버 팁의 전체 변위입니다. Bueckle의 지침서에 따르면 최대 압흔 깊이는56 전체에 걸쳐 동일한 구조를 가진 샘플의 전체 두께의 10 %이며, 그렇지 않으면 결과는 깊이 대 두께 비율에 따라 달라집니다. 캔틸레버 팁 반경이 5μm인 경우 이 연구의 연골 외피는 평균 1.1μm로 압입되었으며, 특히 심하게 퇴행된 연골 외피의 경우 일부 사례에서 3μm의 피크가 발생했습니다. 이 경우, 실험 설정에서 퇴화 된 연골의 표면 불규칙성을 중화하기 위해 큰 움푹 들어간 곳과 관련된 상대적으로 높은 힘이 필요하기 때문에 타협점을 찾았습니다. 더 가벼운 움푹 들어간 곳은 표재성 세동과 콜라겐 균열을 검사하는 결과를 낳을 것인데, 이 두 가지 모두 고도로 퇴행된 연골의 일반적인 특징이다57.
Hertz 피팅 모델에서 중요한 것은 캔틸레버 팁이 샘플과 직접 접촉하는 지점(일반적으로 접촉점이라고 함)을 정확하게 식별하는 것입니다. 그러나, 이것은 너무 끈적거리거나 너무 부드러운 샘플을 압입할 때 문제가 될 수 있는데, 이는 다수의 프로브-샘플 접점(58,59)을 초래할 수 있기 때문이다. 사실, A-Hassan et al.에 의해 잘 강조된 바와 같이, 연질 생체 조직의 경우, 접촉점의 정확한 결정은 가장 성가신 문제 중 하나이다60. 이러한 효과는 본래의 골관절염 연골 외식물에서도 관찰되었는데, 퇴행 단계에 따라 조직 표면이 본래의 기계적 특성을 잃고 종종 고르지 않아 표재성 세동과 갈라짐이 나타나기 때문입니다(그림 3B,C). 이 현상은 특히 연골 외식에서 두드러졌는데, 이 연골 외식에서는 지배적인 세포 패턴이 큰 무리를 이루고 있었습니다(그림 2C). 연골 표면의 이러한 불균일성은 여러 프로브-샘플 접촉점으로 이어질 수 있으며, 따라서 잘못된 결과를 초래할 수 있습니다. 어떤 경우에는 엄청난 편향이 관찰되었고, 힘-거리 곡선의 최종 스트레칭 전에 기준선이 빠르게 회복되었습니다(그림 5A). 이는 캔틸레버 팁의 경로에 있는 큰 장애물(예: 연골이 닳고 갈라지는 진행성 세동 영역)에 기인할 수 있습니다. 다른 경우에는 힘-거리 곡선의 최종 기울기가 더 작은 불규칙성으로 흩어져 있었는데(그림 5B), 이는 연속적으로 더 작은 장애(예: 조직의 미세 세동)와의 접촉을 나타냅니다. 이러한 경우 데이터 신뢰성과 재현성을 보장하기 위해 측정 부위를 다시 측정하거나 변경해야 합니다. 이를 위해 접점을 올바르게 식별하기 위해 AFM의 힘-거리 곡선 출력을 주의 깊게 검사하는 것도 중요합니다. 50nm로 접점을 잘못 식별하면 E 값이크기 61 차만큼 잘못 추정되는 것으로 나타났기 때문에 이것은 알아야 할 중요한 포인트입니다. 여러 연구에서 육안 검사로 접촉점을 추정할 때 주관적인 사용자 입력을 우회하고 정확도를 향상시키는 것을 목표로 힘-거리 곡선의 접촉점을 결정하기 위해 자동화된 접근 방식을 사용하기 시작했습니다. 이것은 셀 역학 측정에서 생성된 것과 같은 많은 수의 힘-변위 곡선을 다룰 때 훨씬 더 중요합니다47,62. 접촉점 결정(47,63,64,65)을 자동화하기 위해 몇 가지 전략이 제안되었지만, 최적의 전략은 데이터를 분석하는데 사용되는 모델, 프로브의 형상, 캔틸레버 팁과 샘플 사이의 (비)접착성 기계적 상호 작용, 샘플(63)의(비)헤르쯔 거동과 같은 실험 조건 및 요인에 크게 의존한다.
시료 드리프트는 아티팩트 및 잘못된 접점 결정을 유발할 수 있는 또 다른 일반적인 문제입니다(그림 3E). 이는 기본적으로 샘플이 샘플 홀더(페트리 접시)에 제대로 장착되지 않았고 AFM 측정 중에 샘플이 움직인다는 것을 의미합니다. 이 효과는 AFM 캔틸레버를 새로운 측정 장소로 옮길 때 특히 두드러집니다. 이 측면은 초점면의 급격한 변화로 실제 측정 중에 쉽게 관찰할 수 있습니다. 결과적인 힘-거리 곡선은 전형적으로 원판이 캔틸레버에 의해 아래로 밀려날 때 원판의 바닥과 페트리 접시 사이의 빈 공간이 좁아지는 것에 해당하는 처음에는 완만한 상승과 함께 이위상 확장 경사를 가지며(그림 3E 참조), 경사의 두 번째 섹션에서 더 단단한 경사가 뒤따른다. 디스크가 페트리 접시의 바닥과 직접 접촉하고 있으므로 디스크가 더 움푹 들어가고 있음을 나타냅니다(그림 5C,D). 왜곡을 극복하기 위해 적절한 샘플 접착제(그림 3D)를 사용하고, 열 드리프트를 방지하기 위해 외부 열원(조명)을 꺼서 온도를 일정하게 유지하고, 빠른 스캐닝 측정을 수행하여 샘플을 더 잘 고정할 수 있습니다. 여기의 실험에서 우리는 캔틸레버가 매체에 잠긴 후 처음 15분 이내에 발생하는 캔틸레버 편향 드리프트를 관찰했습니다(급격한 온도 변화로 인해). 이 시간이 경과한 후에는 드리프트가 일반적으로 무시할 수 있습니다. 결과적으로 실험자는 캔틸레버를 담근 후 기준선을 주의 깊게 검사하고 안정화되면 측정을 시작하는 것이 좋습니다. 이 과정의 지속 시간은 사용되는 캔틸레버에 따라 크게 다를 수 있습니다.
AFM 측정의 또 다른 중요한 파라미터는 설정점으로, 간단히 말해서 캔틸레버가 샘플에 가하는 힘의 척도입니다. 접촉 모드(이 연구에서 사용됨)의 경우 설정점은 캔틸레버의 특정 처짐을 나타냅니다. 여기 프로토콜에서와 같이 여러 스캔 또는 여러 사이트 반복을 수행할 때 캔틸레버 팁은 샘플 표면으로부터 입자를 흡착할 수 있으므로 캔틸레버를 제거하고 적절하게 청소한 다음(66) 측정을 진행하기 전에 재교정해야 하는 경우가 있습니다.
AFM 마이크로 인덴테이션은 특히 골관절염 연골과 관련하여 새롭고 흥미로운 데이터 수집 기회를 제공하지만, 생성된 데이터의 일관성과 재현성은 위에서 설명한 바와 같이 여러 매개변수에 크게 의존합니다. 이 접근법을 사용하여 연골 조직 퇴화로 인한 기계적 변화를 평가할 때 결과를 특정 실험 설계로 확장하기 위해 다양한 공간 패턴에 대한 일부 파일럿 측정을 먼저 수행해야 합니다. 파일럿 AFM 측정은 데이터 변동성의 정도를 나타내기 위해 동일한 패턴의 충분한 샘플(예: 디스크 5개)을 채취하는 가장 표준화 가능한 절차로 수행해야 합니다. 이는 가장 초기의 관련 OA 강성 변화(즉, 단일 스트링과 이중 스트링 사이, 그림 4A)를 정량화하고 평가하려고 할 때 특히 중요합니다. 실제로, 이전 연구에서, 유사한 접근법을 사용하여, 우리는 세포의 공간 조직의 함수로서 매트릭스의 생체역학적 변화를 평가하기 위해 30개의 인간 표본의 표본 크기가 필요하다는 것을 보여주었다37.
또한 이 프로토콜에 제시된 많은 단계는 인적 오류에 취약하며 운영자의 경험에 크게 의존합니다. 실제 AFM 결과에 영향을 미칠 수 있는 모든 요인을 감안할 때 이 연구에서 보고된 절대 E 값은 일반화할 수 없으며 이 실험 설정에 따라 다릅니다. 그러나, 여기에 제시된 다양한 영 계수와 세포 패턴 기반 연골 외식물(공간 패턴이 병리학적일수록 연골의 탄성 계수[EM]이 낮음) 사이의 관계는 영향을 받지 않으며, 그 결과는 세포 패턴 조직의 기능으로서 강성 변화를 보여주는 이전 연구와 일치하기 때문입니다23,37.
전반적으로, 이 단계별 프로토콜은 표준화된 3D 천연 관절 연골 외식의 기능을 보여주며, 이는 시작에서 진행에 이르는 OA 기반 세포 재구성 이벤트를 대표할 뿐만 아니라 경직의 점진적인 감소와도 관련이 있습니다. 외식은 골관절염 발병 및 진행을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 생체 모방 모델을 반영할 수 있으며, 이를 통해 다양한 치료 방식을 생체 외에서 테스트하고 개발할 수 있습니다. AFM 기반 생체역학적 평가와 함께 이러한 인간 이식 모델을 사용하면 생물의학 연구 및 제약 산업의 패러다임 전환을 가져올 수 있으며, 매우 필요한 효과적인 골관절염 약물을 식별하는 새로운 방법을 열 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
조직 샘플을 제공해 주신 튀빙겐 대학병원 정형외과의 정형외과 의사들에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1397-89-3 | |
| Atomic force microscop (AFM) head | CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | H000033 | |
| Calcein AM | Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA | 14948 | Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging |
| Cantilever | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SAA-SPH-5UM | Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm, geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius |
| Cartilage ctting device | Self-made | n/a | Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm |
| CDD camera integrated in the AFM | The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany | DFK 31BF03 | |
| CDD camera integrated in the fluorescence microscope | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DFC3000G | |
| Cryotome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | CM3050S | |
| Data Processing Software for the AFM | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Version 5.0.86, can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Fluorescence Microscope (Leica DMi8) | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | 11889113 | |
| Glass block cantiliver holder | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SP-90-05 | Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker). |
| Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F1315 | |
| Microscope glass slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS294775X50 | |
| Mounting medium With DAPI | ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany | 50011 | Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs side view imaging |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather Medical Products, Osaka, Japan | 2023-01 | |
| Silicone Skirt | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent medium condensation in the AFM head. |
| Statistical program - SPSS | IBM, Armonk, New York, USA | SPSS Statistics 22 | Vesion 280.0.0.0 (190) |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 | Water-soluble embedding medium |
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