Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Adressering av praktiske problemer i atomkraftmikroskopibasert mikroinnrykk på menneskelige leddbruskeksplanter

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64371
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

Summary

Vi presenterer en trinnvis tilnærming for å identifisere og løse de vanligste problemene knyttet til atomkraftmikroskopiske mikroinnrykk. Vi eksemplifiserer de nye problemene på innfødte menneskelige leddbruskeksplanter preget av ulike grader av slitasjegiktdrevet degenerasjon.

Abstract

Uten tvil er atomkraftmikroskopi (AFM) for tiden en av de kraftigste og mest nyttige teknikkene for å vurdere mikro- og til og med nano-signaler i det biologiske feltet. Men som med alle andre mikroskopiske tilnærminger kan det oppstå metodiske utfordringer. Spesielt kan egenskapene til prøven, prøvepreparering, type instrument og innrykkssonde føre til uønskede artefakter. I denne protokollen eksemplifiserer vi disse nye problemene på sunne så vel som osteoartrittiske leddbruskeksplanter. For dette formål viser vi først via en trinnvis tilnærming hvordan man genererer, graderer og visuelt klassifiserer ex vivo leddbruskskiver i henhold til forskjellige stadier av degenerasjon ved hjelp av stor 2D-mosaikkfluorescensavbildning av hele vevseksplanter. Den største styrken til ex vivo-modellen er at den består av eldre, innfødt, human brusk som gjør det mulig å undersøke slitasjegiktrelaterte endringer fra tidlig begynnelse til progresjon. I tillegg presenteres også vanlige fallgruver i vevspreparering, samt selve AFM-prosedyren sammen med den påfølgende dataanalysen. Vi viser hvordan grunnleggende, men avgjørende trinn som prøvepreparering og -behandling, topografiske prøveegenskaper forårsaket av avansert degenerasjon og interaksjon mellom prøver og spisser kan påvirke datainnsamlingen. Vi underkaster også gransking de vanligste problemene i AFM og beskriver, der det er mulig, hvordan vi kan overvinne dem. Kunnskap om disse begrensningene er av største betydning for riktig datainnsamling, tolkning og til slutt innlemming av funn i en bred vitenskapelig sammenheng.

Introduction

På grunn av den stadig krympende størrelsen på elektroniske enheter og systemer, har den raske utviklingen av mikro- og nanobasert teknologi og utstyr fått fart. En slik enhet er atomkraftmikroskopi (AFM), som kan skanne biologiske overflater og hente topografisk eller biomekanisk informasjon på både nano- og mikrometerskala 1,2. Blant de enorme funksjonene kan dette verktøyet betjenes som en mikro- så vel som en nano-indenter for å få informasjon om de mekaniske egenskapene til forskjellige biologiske systemer 3,4,5,6. Dataene samles inn ved fysisk kontakt med overflaten gjennom en mekanisk sonde, som kan være så liten som ca. 1 nm på spissen7. Den resulterende deformasjonen av prøven vises deretter basert på innrykksdybden til utkragingsspissen og kraften som påføres prøven8.

Slitasjegikt (OA) er en langvarig degenerativ kronisk sykdom preget av forverring av leddbrusk i leddene og omkringliggende vev, noe som kan føre til fullstendig eksponering av beinoverflatene. Byrden ved OA er betydelig; For tiden lider halvparten av alle kvinner og en tredjedel av alle menn i alderen 65 og over av OA9. Traumer, fedme og den resulterende endrede biomekanikken til leddet10 bestemmer leddbruskdegenerasjonen, som blir sett på som et vanlig sluttresultat. Den banebrytende studien av Ganz et al. antydet at de tidlige trinnene i OA-prosessen kan innebære de biomekaniske egenskapene til brusk11, og siden da har forskere bekreftet denne hypotesen12. På samme måte er det generelt akseptert at de biomekaniske egenskapene til vevet er funksjonelt orkestrert av den ultrastrukturelle organisasjonen, så vel som cellecelle- og cellematrisekrysstale. Eventuelle endringer kan dramatisk påvirke den generelle vevsbiomekaniske funksjonen13. Hittil er OA-diagnosen klinisk og er basert på vanlig filmradiografi14. Denne tilnærmingen er tosidig: For det første gjør mangelen på en definert degenerativ grenseverdi for å formulere diagnosen OA tilstanden vanskelig å kvantifisere, og for det andre mangler bildebehandlingsmetoder sensitivitet og standardisering og kan ikke oppdage lokaliserte bruskskader15,16,17. For dette formål har vurderingen av bruskens mekaniske egenskaper den avgjørende fordelen at den beskriver en parameter som endres i løpet av OA uavhengig av sykdommens etiologi og har en direkte innflytelse på vevsfunksjonalitet på et svært tidlig stadium. Innrykksinstrumenter måler kraften som vevet motstår innrykket med. Dette er faktisk ikke et nytt konsept; De tidligste studiene går tilbake til 1980- og 1990-tallet. I denne perioden antydet mange studier at innrykksinstrumenter designet for artroskopiske målinger av leddbrusk kunne være godt egnet til å oppdage degenerative forandringer i brusk. Selv for 30 år siden var noen studier i stand til å demonstrere at innrykksinstrumenter var i stand til å oppdage in vivo-endringer i bruskoverflaten under vevsdegenerasjon ved å utføre trykkstivhetsmålinger under artroskopi18,19,20.

AFM-innrykk (AFM-IT) av leddbrusk gir informasjon om en pivotal mekanisk egenskap av vevet, nemlig stivhet. Dette er en mekanisk parameter som beskriver forholdet mellom en påført, ikke-destruktiv belastning og den resulterende deformasjonen av det innrykkede vevsområdet21. AFM-IT har vist seg å være i stand til å kvantifisere aldersavhengige modifikasjoner i stivhet i makroskopisk upåvirkede kollagennettverk, og dermed skille mellom de patologiske endringene forbundet med OA-utbrudd (grad 0 på Outerbridge-skalaen i leddbrusk)22. Vi har tidligere vist at AFM-IT, på grunnlag av romlig kondrocyttorganisasjon som en bildebasert biomarkør for tidlig bruskdegenerasjon, tillater ikke bare kvantifisering, men også faktisk å identifisere de tidligste degenerative mekaniske endringene. Disse funnene er allerede bekreftet av andre23,24. Derfor fungerer AFM-IT som et interessant verktøy for å diagnostisere og identifisere tidlige degenerative endringer. Disse endringene kan allerede måles på cellenivå, og omforme forståelsen av OAs patofysiologiske prosess.

I denne protokollen demonstrerer vi en komplett histologisk og biomekanisk graderingsprosedyre for leddbruskeksplanter, fra innfødt bruskpreparering til AFM-datainnsamling og -behandling. Gjennom en trinnvis tilnærming viser vi hvordan man genererer, graderer og visuelt klassifiserer leddbruskvev i henhold til forskjellige stadier av degenerasjon ved hjelp av 2D stor mosaikkavbildning, etterfulgt av mikro-AFM-innrykk.

Selv om AFM-IT for tiden er et av de mest følsomme verktøyene for å måle biomekaniske endringer i brusk7, som enhver annen instrumentell teknikk, har den begrensninger og praktiske særegenheter25 som kan føre til feilaktig datainnsamling. For dette formål underkaster vi gransking de vanligste problemene som oppstår under AFM-målinger av bruskeksplantene og beskriver, der det er mulig, hvordan vi kan minimere eller overvinne dem. Disse inkluderer topografiske aspekter av prøvene og vanskelighetene med å stabilisere dem i et AFM-kompatibelt miljø, fysiske særegenheter av vevets overflate og de resulterende vanskelighetene med å utføre AFM-målinger på slike overflater. Eksempler på feilaktige kraftavstandskurver presenteres også, med vekt på forholdene som kan forårsake dem. Ytterligere begrensninger knyttet til geometrien til utkragingsspissen og bruken av Hertz-modellen for dataanalysen diskuteres også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Femoralkondyler samlet fra pasienter som gjennomgår total kneproteseplastikk ved Universitetssykehuset i Tübingen, Tyskland, ble brukt. Kun leddbruskprøver fra pasienter med degenerative og posttraumatiske leddpatologier ble inkludert i denne studien. Godkjenning fra avdelinger, institusjoner og lokale etiske komiteer ble innhentet før studiestart (prosjektnr.674/2016BO2). Det ble innhentet skriftlig informert samtykke fra alle pasientene før deltakelse.

MERK: Et flytskjema over eksperimenttrinnene i kronologisk rekkefølge er gitt i figur 1.

1. Vevsbehandling og generering av bruskskiver

  1. Vev forberedelse
    1. Etter postoperativ reseksjon, plasser bruskprøvene i en beholder fylt med Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) supplert med 5% (v / v) penicillin-streptomycin. Forsikre deg om at prøvene er helt nedsenket i mediet. Varigheten mellom kirurgisk reseksjon og videre behandling av brusk bør ikke overstige 24 timer. Forsikre deg om at prøvene er helt nedsenket i medier gjennom hele behandlingen for å unngå at prøven tørker.
    2. Klipp brusken vekk fra beinet ved hjelp av en skalpell.
  2. Generering av bruskskive
    1. Generer bruskskiver på 4 mm i diameter ved hjelp av en biopsistans.
      MERK: Det er viktig å velge og resektere områdene i kondylen der brusklagets tykkelse overstiger 1 mm. Dette kan være problematisk, spesielt rundt bærende soner, hvor brusklaget vanligvis mister tykkelsen på grunn av slitasjeprosesser eller degenerasjon.
    2. Plasser de tidligere genererte 4 mm bruskskivene på en skreddersydd skjæreanordning og fest og hold bruskskivene stabile ved hjelp av en slikkepott. Når du plasserer bruskskivene på skjæreapparatet, må du være forsiktig. Plasser prøvene slik at bruskens øverste lag (leddbruskens overfladiske sone) ikke vender mot bladet
    3. Klipp bruskskivene med et barberblad. Skiveformede bruskprøver på 4 mm x 1 mm genereres dermed. For å forhindre prøvetørking, utfør vevskjæring så raskt som mulig.
    4. Samle hver plate ved hjelp av en slikkepott og plasser de genererte bruskskivene i 1,5 ml rør inneholdende 1 ml DMEM supplert med 5% (v / v) penicillin-streptomycin. Plasser ca. 15 plater i ett rør.
  3. Kryotomsnitt av bruskskivene (for vinkelrette skiver)
    MERK: Dette trinnet er valgfritt, og det kan brukes hvis en sidevisningsvisualisering av den cellulære mønsterfordelingen i bruskskivene er ønsket. Den kan brukes som en verifikasjonsmetode da fordelingen av cellulært mønster er en 3D-funksjon av leddbrusk26. Optisk seksjonering og 3D-rekonstruksjoner av hele bruskskivene ved hjelp av et konfokalmikroskop kan også brukes, og fjerner dermed behovet for å seksjonere prøvene som beskrevet i protokollen.
    1. Dekk bruskskiven med vannløselig innebyggingsmedium og plasser den på kanten på kryotomknappen (med overflaten på skiven vinkelrett på overflaten på knappen). I kryotomanordningen fryser innebyggingsmediet ved lave temperaturer.
    2. Bruk en standard kryotom, seksjoner vevet sidelengs med en tykkelse på 60 μm til midten av skiven er nådd (dvs. når kryoseksjoner når en lengde på 4 mm) og samler skivene. Ved å snitte skiven vinkelrett, kan alle soner av brusk (overfladisk, midt og dyp) visualiseres.
    3. Samle seksjonene på et glassglass og fjern det vannløselige innebyggingsmediet ved å vaske tre ganger med fosfatbufret saltvann (PBS).

2. Bruskskivesortering som en funksjon av det cellulære romlige mønsteret

  1. Farging av skiveformede bruskprøver
    1. Plasser en bruskskive (seksjon 1.2) i hver brønn på en 96-brønnsplate og tilsett 130 μL cellepermeabelt fluorescensfargestoff ved en fortynning på 1: 1,000 til hver brønn.
    2. Inspiser visuelt hele platen og sørg for at bare en plate er plassert i hver brønn. Inkuber platen i 30 minutter i standard cellekulturinkubator ved 37 °C.
  2. Farging av de 60 μm bruskskivene
    1. Plasser bruskskiveseksjonene (pkt. 1.3) forsiktig på glassmikroskopglass ved hjelp av tang.
    2. Dekk bruskseksjonene med monteringsmedium som inneholder kjernefysisk DAPI-motfarging og plasser forsiktig dekkslips som er egnet for fluorescensmikroskopi.
    3. Forsegl kantene på hvert deksel med vanlig gjennomsiktig neglelakk og la tørke i 3 minutter.
  3. Topp-ned og side-view brusk sortering og avbildning
    MERK: Hver plate må undersøkes under et fluorescerende mikroskop. Målet med dette trinnet er å sortere platene basert på deres dominerende cellulære mønster (enkle strenger, doble strenger, små klynger, store klynger eller diffus).
    1. Plasser platen med 96 brønner på plateholderen til fluorescensmikroskopet.
    2. Velg passende fluorescensfilter på enten Em 495 nm / Ex 515 nm (for ovenfra og ned-avbildning av bruskskivene fremstilt i pkt. 2.1.) eller Em 358 nm / Ex 461 nm (for sidevisning av bruskseksjonene utarbeidet i avsnitt 2.2) og 10x-objektivet.
      MERK: Ved å bruke 10x-objektivet kan hele omkretsen av platen inspiseres, og prøver med inhomogen eller feil farging kan utelukkes. Imidlertid kan bruk av bare ovenfra og ned-visningen resultere i oppfatningen av endringer i cellulær organisasjon som et resultat av analyse av de dypere vevslagene som er synliggjort for ovenfra og ned-observasjon ved overfladisk erosjon. Som et eksempel kan en stigende streng som følger kollagenarkadene oppfattes som en enkelt celle eller spredte celler (diffust mønster)26. Som et resultat må begge sider av platene inspiseres for å sikre riktig valg av cellulært mønster.
    3. Bestem visuelt det cellulære mønsteret som vises i hver bruskskive. Det er usannsynlig at en plate bare vil ha en type cellulært mønster. For den delen av skiven der kondrocyttarrangementet ikke samsvarer med mønsteret av interesse, må du bare godta prøvene hvis det uønskede mønsteret er helt i periferien, hvor AFM-målinger ikke finner sted (dvs. opptil 0,5 mm fra skivegrensen), og sørg for at dette ikke overstiger 10% av skivens totale overflate27, 28.
  4. Bildeinnsamling av hele bruskskivene
    1. Velg mikroskopets 10x-mål og plasser det under den forhåndsvalgte brønnen som inneholder en individuell bruskskive. Fokuser på platen for å se det cellulære mønsteret.
    2. Velg Navigator-funksjonen for å få oversikt over hele brønnen. Bruk venstre museknapp og dra for å navigere til en annen sceneposisjon. Bruk musehjulet til å zoome inn og ut.
      MERK: På dette tidspunktet kan en forhåndsvisning av brønnen med hele prøven ses ved å dobbeltklikke på hvert interesseområde sekvensielt.
    3. Velg en firkant som omfatter interesseområdet som skal skannes; På dette tidspunktet vil alle enkeltfliser som komponerer mosaikken bli synlige.
    4. Juster eksponeringen/lysintensiteten slik at cellene kan visualiseres tydelig fra bakgrunnen. På dette tidspunktet er bildets lysstyrke/kontrast justert for alle flisene og kan ikke lenger tilpasses individuelt for hver flis.
      MERK: Siden cellene nær skivens kant ofte avgir et høyere fluorescenssignal enn cellene i midten, må innstillingene for eksponering/lysintensitet tilpasses.
      1. For å vurdere om eksponeringstiden passer for en bestemt kanal, undersøk fordelingen av signalet i histogrammet. Ved å bruke den automatiske eksponeringsmekanismen som er inkludert i mikroskopets bildeprogramvare, visualiserer du alle cellene som ligger i platen.
    5. Velg programvarens Focus Map Point-alternativ , og velg deretter hver enkelt flis ved å venstreklikke i midten av den.
    6. Velg alternativet Fokuskart. Et vindu vises med alle de tidligere valgte flisene. Dobbeltklikk på en flis i listen for å vise og bringe den i riktig fokus.
    7. Klikk på Sett Z for å lagre fokusplanen og gå videre til neste flis. Når du har justert fokusplanen for hver enkelt flis, begynner du bilderegistreringen ved å trykke på Start skanning.
      1. Hvis skanningen viser mørkere horisontale og/eller vertikale streker, kan dette skyldes feil og ujevn belysning av enkeltbildene. Løs dette ved å bruke alternativet Linked Shading som er innlemmet i programvaren før selve skanningen.
    8. Lagre, eksporter og kommenter bildene riktig.

3. Biomekanisk tilnærming av bruskeksplanter

  1. Prøveklargjøring for AFM-målinger
    1. Fest hver forhåndsvalgte bruskskive som inneholder et cellemønster (del 2) i petriskåler ved hjelp av biokompatibelt lim. Legg til tilstrekkelig prøvelim på toppen, bunnen, venstre og høyre side av platen.
    2. Dekk platene med 2,5 ml Leibovitz L-15 medium uten L-glutamin. Legg Leibowitz-mediet forsiktig på prøvene for å unngå prøveløsing fra overflaten på grunn av bølger skapt av mediet.
  2. Lasting av prøvene i AFM
    1. Plasser petriskålen i AFM-enhetens prøveholder og slå på petriskoppvaskvarmeren satt til 37 °C. La vevskulturskålen nå ønsket temperatur. Dette gjøres for å utelukke mulige artefakter forårsaket av temperaturvariasjon.
  3. AFM-utkraget kalibrering
    1. Initialiser programvareoppsettet som tidligere beskrevet av Danalache et al.29.
    2. Velg en passende utkragingsholder i glassblokk for væskemålinger og plasser den forsiktig på AFM-hodet. En låsemekanisme sikrer glassblokken i AFM-hodet. Forsikre deg om at glassblokkens reflekterende overflate er rett og parallell med AFM-holderen.
    3. Plasser utkrageren på overflaten av glassblokkens utkrageholder med forsiktighet. Selve utkragingen skal hvile på det polerte optiske planet, i midten av glassblokken.
    4. Legg forsiktig et silikonskjørt (silikonmembran) på undersiden av utkragholderen for å forhindre middels kondens i AFM-hodet.
    5. Senk utkragingen i trinn på 100 μm ved hjelp av trinnmotorfunksjonen til den er helt nedsenket i mediet.
    6. Kjør en skannertilnærming med tilnærmingsparametrene beskrevet av Danalache et al.29. Trekk utkragingen inn med 100 μm når bunnen av petriskålen er nådd.
    7. Kalibrer utkragingen ved hjelp av de nøyaktige trinnene og kjør parametrene beskrevet av Danalache et al.29. På slutten av kalibreringen lagres den vertikale avbøyningen og vises i newton (N) kraftenheter i stedet for volt (V) - enheten for den opprinnelige registreringen av fotodiodedetektoren. I forsøkene her resulterte et settpunkt på 4,47 nN etter kalibrering.
    8. Bruk trinnmotorfunksjonen til å trekke utkragingen til 1000 μm.
  4. Identifisering av ønsket bruskmålested under AFM
    MERK: På grunn av bruskskivenes tykkelse på 1 mm er ikke utkragingen synlig i synsfeltet under navigering over prøven.
    1. Bruk mikroskopets CCD-kamera for å identifisere utkragingen. AFM-utkrageren skal plasseres i et prøvefritt område av petriskålen.
    2. Start en skannertilnærming med utkrageren på et rent, prøvefritt område av petriskålen, ved å bruke de samme parametrene beskrevet av Danalache et al.29.
    3. Trekk utkrageren ytterligere 1,5 mm bort fra bunnen av platen med trinnmotorkontrollen. Dette trinnet er avgjørende for å unngå en direkte kollisjon mellom utkrageren og prøven.
    4. Bytt fra lysfelt til fluorescensvisning og identifiser toppen av platen visuelt.
    5. Flytt AFM-prøveholderen nøyaktig 2 mm mot midten av platen. Dette punktet anses å være sentrum av bruskskiven.
    6. Kjør en skannertilnærming, og når overflaten på bruskskiven er nådd, trekk utkragingen inn med 100 μm.
  5. Målinger av kraftavstandskurver
    1. Fokuser på cellene plassert på ønsket målested. Klikk på Kjør-knappen for å starte målingene og genereringen av kraftavstandskurver i målposisjonen.
    2. Skaff fem kraftavstandskurver på hvert målested. Trekk utkrageren inn med 500 μm og flytt utkragingen til neste målested.
      MERK: Tilbaketrekningen av utkragingen er et avgjørende trinn, da bruskskivens overflate ikke er homogen og har uregelmessigheter. En høy bakke på overflaten av prøven kan føre til en dramatisk kollisjon, noe som fører til uønsket utkragings-/prøveskade. Vi anbefaler å velge minimum fem forskjellige målesteder spredt over skivens overflate og anskaffe minst fem kraftavstandskurver på hvert sted.
    3. Inspiser kraftavstandskurvene og lagre dem.
  6. Estimering av Youngs moduler ved bruk av Hertz fit-modellen
    1. Åpne de genererte kraftavstandskurvene som skal analyseres (.jpk-fil) i dataanalyseprogramvaren ved hjelp av alternativet Åpne en gruppe spektroskopikurver .
    2. Velg Hertz-tilpasningsmodellen og velg deretter alternativet Elasticity fit .
      1. Alternativet Tilpassing av elastisitet utfører automatisk følgende beregninger på den valgte kraftavstandskurven: beregner grunnlinjen og trekker fra hele kurven for å fjerne grunnlinjeforskyvningen (grunnlinjen bringes tilbake til null på y-aksen); bestemmer kontaktpunktet ved å oppdage punktet der kraftavstandskurven krysser nullkraftlinjen (kontaktpunktet er satt til null på x-aksen); beregner spissprøveseparasjonen (høydesignalet til piezoen som står for bøyningen av utkrageren trekkes fra); og tilpasser kraftavstandskurven automatisk til den valgte modellen. Om ønskelig kan hvert av disse trinnene også utføres uavhengig.
    3. Tilpass ved hjelp av følgende tilpasningsparametere: Poisson-forhold på 0,5 og riktig utkragespissradius.
      MERK: Når du bruker en utkrager med en sfærisk utkragespiss, bør Hertz-passformmodellen brukes. Utkragingen som ble brukt i denne studien hadde en sfærisk spiss med en radius på 5 μm. Vi anbefaler at du monterer kraftavstandskurven til den maksimale påførte kraften er nådd (settpunkt).
    4. Kontroller visuelt kraftavstandskurven for å sikre korrekthet. Dette trinnet må utføres for hver av kraftavstandskurvene som analyseres.
  7. Bestemmelse av innrykksdybde
    MERK: Avhengig av dataanalyseverktøyet som brukes, kan denne prosessen variere. Eksperimentøren kan enkelt lese innrykksdybden ved å følge en rekke trinn som er inkludert i dataanalyseprogrammet.
    1. Åpne hver av de genererte kraftavstandskurvene i dataanalyseprogramvaren og velg Hertz-tilpasningsmodellen som analyseprosess.
    2. Bruk alternativet Trekk fra grunnlinjeforskyvning på null den loddrette nedbøyningsaksen (y-aksen), og velg funksjonen Forskyvning + vipping .
    3. Bruk funksjonen Finn kontaktpunkt til automatisk å identifisere kontaktpunktet, som automatisk bringes til en x-koordinat på null.
    4. Trekk avstandsregnskapet utelukkende for utkrageavbøyning fra den rå piezohøyden under innrykket ved hjelp av funksjonen Vertikal spissposisjon .
    5. Velg alternativet Tilpassing av elastisitet for å vise den behandlede kraftavstandskurven og velge området i diagrammet slik at det justeres med den mest negative verdien på x-aksen med loddrett spissposisjon .
    6. Les og dokumenter innrykket fra X Min-boksen i parameterfanen. Lagre og dokumenter resultatene.

4. Statistisk analyse

  1. Åpne statistikkprogramvaren. Velg Nytt datasett fra rullegardinmenyen.
  2. Åpne kategorien Variabelvisning etter at du har valgt datasettfilen . Definer de numeriske variablene for hver cellemønsterkategori: enkeltstrenger = SS, doble strenger = DS, små klynger = SC, store klynger = BC, diffuse og Youngs moduli.
  3. I datavisningsfanen skriver du inn de målte Youngs moduli-data for hver av de tilsvarende mobilmønsterkategoriene. Analyser datadistribusjonen ved å velge Analyser fra menylinjen og deretter Utforskende dataanalyse.
  4. Velg Youngs moduli som avhengig variabel og cellulært mønster som faktorliste. Et boksplott som brukes til resultatdelen, vises blant resultatene i utdatafilen.
  5. Hvis du vil utføre en statistisk analyse, velger du Avhengige prøver i delen for ikke-parametrisk test i menylinjefanen for analyse. Velg Youngs moduler som testfelt og mobilmønster som grupper under feltfanen. Trykk på Kjør.
    MERK: Resultatene vises i utdatafilen. For statistisk analyse utføres en Friedman-test.
  6. Bygg inn p-verdiene for den ikke-parametriske testen i bokstegningen som ble opprettet i trinn 4.4. Lagre resultatene ved å klikke på Fil i menylinjen og velge Lagre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av et selvfremstillet skjæreapparat kunne vi eksplantere og generere små (4 mm x 1 mm) bruskskiver fra ferske menneskelige kondyler som inneholder et enkelt cellulært romlig mønster30 enkeltstrenger (SS, figur 2A), doble strenger (DS), små klynger (SC), store klynger (BC; figur 2A), og diffus (figur 2B). En representativ bruskeksplante er avbildet i figur 3A. Valget av skiver som bare viste én type mønster ble gjort ved hjelp av ovenfra og ned fluorescensavbildning (figur 2). Den topografiske variasjonen i bruskskiven ble ytterligere illustrert ved avbildning av 60 μm tykke snitt generert fra bruskskivene (figur 2C). På overflaten av de eksplanterte osteoartrittiske bruskskivene var det overfladisk flimmer og matriksspaltning (figur 3B,C). Dette var spesielt merkbart i skivene som var representative for avansert OA-progresjon - representert ved tilstedeværelsen av BC (figur 2A). Etter sortering etter fluorescens ble skivenes stivhet vurdert av AFM-mikrofordypninger. Til dette formål ble de genererte bruskskivene vellykket festet i AFM Petri-parabolen ved hjelp av biokompatibelt lim (figur 3D) for å unngå prøvedrift under målingene (figur 3E). Mengden lim som brukes må justeres. Utilstrekkelig mengde lim vil føre til ustabilitet i skiven, mens tilsetning av for mye lim kan føre til uønsket spredning av limet enten under og/eller over bruskskiven. Sistnevnte fører til måleartefakter og dårlig identifisering av platen under fluorescensmikroskopet. Utilstrekkelig limpåføring eller plutselige bevegelser av prøven under fiksering er hyppige problemer som får vevet til å løsne fra petriskålen og bør unngås.

En representativ gradvis stivhetsreduksjon ved siden av cellemønsterarrangementet er vist i figur 4A. Stivhetsverdiene var høyere i skivene med SS (median på 2,6 kPa) – representativt for kompromissløse områder med lyngbrusk. Med OA-utbrudd og progresjon viste AFM-målingene en sterk trinnvis reduksjon i stivhet på 42 % i DS (1,5 kPa), 77 % i SC (0,6 kPa) og til slutt 88 % i avanserte stadier representert ved BC (0,3 kPa; Figur 4A). Skivene som inneholdt et diffust mønster viste en forhøyet elastisitet med en viktig variasjon av Youngs modul enkeltverdier. For alle bruskskivene med tildelt dominerende cellulær mønsterorganisasjon ble innrykksdybden assosiert med det anvendte settpunktet (4.477 nN) funnet å være omvendt proporsjonal med stivhet (figur 4B). En representativ generert kraftavstandskurve er vist i figur 4C, og en Hertz-tilpasning samt identifisering av kontaktpunktet er vist i figur 4D.

Riktig tilpasning avhenger blant annet av riktig bestemmelse av grunnlinjen. Hvis den automatiske grunnlinjedeteksjonen er feil (for eksempel på grunn av en turbulent grunnlinje), kan tilpasningen også bestemmes manuelt, og den lar brukeren velge en mer representativ grunnlinje for målingene. Men hvis den genererte kraftavstandskurven ikke tillater riktig passform, må den kastes. Figur 5 viser eksempler på feil kraft-avstandskurver. Generering av egnede kraftavstandskurver på osteoartrittiske leddbruskeksplanter kan være vanskelig på grunn av vevets uregelmessige overflate på den ene siden (eksempler er vist i figur 5A, B), og prøvens ustabilitet forårsaket av feil prøvefiksering (eksempler vist i figur 5C, D). Artefakter kan være forårsaket av flere sondeprøvekontaktpunkter (på grunn av den ujevne overflaten av degenerert brusk) eller uønsket vevsbevegelse (synlig gjennom endringer i fokalplanet). Disse artefaktene kan sees i de genererte kraftavstandskurvene og indikerer enten en suboptimal kontakt mellom AFM-utkrageren og bruskoverflaten eller feil prøvefiksering til petriskålen (se figur 5A-D).

Figure 1
Figur 1: Flytskjema over eksperimentell prosedyre. Sammendrag av de eksperimentelle trinnene i kronologisk rekkefølge, fra intraoperativt resekterte bruskprøver til generering av 4 mm x 1 mm bruskskiver, fluorescensfarging og sortering av skivene på grunnlag av den cellulære mønsterorganisasjonen ved hjelp av top-down og side-view imaging, og til slutt elastisitetsvurdering ved hjelp av atomkraftmålinger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fluorescensavbildning av representative bruskskiver . (A) Mosaikk 2D-bilder og et zoomet eksemplarisk felt av bruskskiver farget med cellemembranpermeabelt fargestoff ved 100x forstørrelse. Den øverste platen viser en representativ enkeltstrengsplate, mens den nedre er representativ for en stor klyngeplate (nederst). (B) Mosaikkbilde av en diffus mønsterskive sett fra overflaten (øverst), og den samme skiven avbildet fra undersiden (nederst). (C) Sidevisning av kjernefysisk farging av 60 μm skiver bruskskiver. Hvitskalalinjen representerer 500 μm for mosaikkbildene (større synsfelt, A [venstre panel], B, C) og 100 μm for de innzoomede, fokuserte bildene (A [høyre panel]). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Eksplanterte leddbruskskiver. (A) Representativt bilde av en generert 4mm x 1mm bruskskive explant fra fersk menneskelig leddbrusk. Skalalinjen avbildet i hvitt representerer 2 mm. (B) Representativt bilde av naturlig osteoartrittisk brusk der vevsoverflaten presenterer makroskopisk synlig overfladisk flimmer og spalting. Skalalinjen avbildet i hvitt representerer 1000 mm. (C) Skjematisk avbildning av den fibrillerte bruskoverflaten. (D) Før AFM-målingene ble hver av bruskskiveeksplantene riktig festet ved hjelp av biokompatibelt prøvelim til overflaten av AFM Petri-parabolen for å unngå artefakter på grunn av prøvedrift under de faktiske innrykksmålingene som vist i (E). Den hvite skalalinjen representerer 4 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative resultater fra atomkraftmikroskopimålinger av leddbruskskiver sortert på grunnlag av deres dominerende cellulære mønsterorganisasjon . (A) Boxplot som viser medianen til den beregnede Youngs moduli av fem plater, en for hvert cellemønster, som stammer fra en pasient. Totalt 25 målinger ble utført på hver skive (fem målinger for fem forskjellige målesteder). Den svarte linjen inne i rektangelet representerer medianverdien, nedre og øvre ekstremiteter av rektangelet representerer henholdsvis første og tredje kvartil, og feilfeltene representerer de laveste og høyeste verdiene for hver gruppe. (B) Punktplott som viser de 125 dybdepunktene for hvert cellemønster. (C) Eksempler på kraftavstandskurver oppnådd med AFM med en beregnet Youngs modul på 0,4 kPa. (D) En representativ Hertz-tilpasning og kontaktpunktbestemmelse for kraftavstandskurven vist i (C). X-aksen viser den vertikale spissposisjonen (som er avstanden krysset av piezoen, der lengden som tar hensyn til utkragingsbøyningen automatisk trekkes fra kontaktdelen av kraftavstandskurven). *p < 0,05. For statistisk analyse ble Friedman-testen brukt. Forkortelser: SS = enkeltstrenger; DS = doble strenger; SC = små klynger; BC = store klynger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Eksempler på feilaktige kraftavstandskurver . (A) Kraftavstandskurven viser et massivt avvik etterfulgt av restitusjon nær grunnlinjenivået før en kontinuerlig innrykk av overflaten observeres. Dette fenomenet kan tilskrives en relativt stor hindring (f.eks. store overflatespalter som stikker ut fra det øverste laget av brusk). (B) Den utvidede kraftavstandskurven viser flere små topper. Disse kurvene antas å være forårsaket av uregelmessigheter på mikroskala på bruskoverflaten (f.eks. Fibrillering). Både (C) og (D) viser kraftavstandskurver med bifasiske kurs. Begge kraftavstandskurvene er representative for dårlig prøvefiksering og prøvedrift. Det er også ganske vanlig i disse tilfellene å se en plutselig endring i fokalplanet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som en progressiv og multifaktoriell sykdom utløser OA strukturelle og funksjonelle endringer i leddbrusk. I løpet av OA ledsages svekkelser i mekaniske egenskaper av strukturelle og biokjemiske endringer på overflaten av leddbrusk27,31. De tidligste patologiske hendelsene som forekommer i OA er proteoglykanuttømming kombinert med kollagennettverksforstyrrelser32,33,34. Slike tidlige subtile overflateendringer er vanskelige å fastslå og identifisere med bulktesting, fordi den mekaniske oppførselen er gjennomsnittet over hele vevsdybden. I tillegg er et fortsatt uadressert spørsmål om funksjonelle endringer på organ- og vevsnivå er relatert til strukturelle og funksjonelle endringer i mikro- eller nanoskala. For dette formål anses AFM å være en av de mest følsomme metodene, som er i stand til å oppdage de tidligste biomekaniske endringene som forekommer med OA-utbrudd7. Det tillater stivhetsmålinger på både mikro- og nanometerskalaer i innfødte prøver, og gir informasjon om de mekaniske egenskapene til leddbrusk35,36. I denne protokollen, ved hjelp av mikro-AFM-innrykk, målte vi de elastiske egenskapene til sunne og osteoartrittiske leddbrusk menneskelige eksplanter. Resultatene viste at bruskeksplantene er svært representative for tidlige lokale OA-hendelser med en merkbar gradvis reduksjon i stivhet som forekommer i mønsterspesifikke bruskeksplanter. Videre er resultatene i tråd med tidligere publisert forskning som viste en bemerkelsesverdig stivhetsreduksjon sammen med den cellulære mønsterorganisasjonen23,24,27,37.

Bekreftede innfødte menneskelige modeller som etterligner ulike aspekter av OA-patogenese og progresjon er for tiden nødvendig for å løse manglene i translasjonsforskning og utfordringene ved å oversette in vitro-data til en klinisk setting. Til dags dato kan ingen modell nøyaktig representere det komplekse innfødte menneskelige bruskrommet, enn si det aldersrelaterte leddvevet som er utsatt for OA som respons på sykdomsinitierende stimuli38. De mest brukte explant-baserte modellene hittil var av storfe eller storfe opprinnelse og anvendt enten en sterk inflammatorisk cytokinbehandling eller mekanisk belastning 39,40,41. Denne protokollen, på den andre siden, demonstrerer hvordan man genererer små (4 mm x 1 mm) eksplanterte skiveformede menneskelige bruskprøver, som er indikative for de individuelle stadiene av spesifikke OA-hendelser. Bruskeksplantene sorteres og scenetildeles ved hjelp av den cellulære romlige organisasjonen som en bildebasert biomarkør 30,42. Siden tidlige endringer i biomekaniske egenskaper allerede kan identifiseres og kvantifiseres så snart doble strenger begynner å oppstå23,27, på et stadium hvor bruskoverflaten fortsatt vises makroskopisk intakt26, tillater denne eksplantbaserte modellen undersøkelsen av et lokalt innfødt bruskrom og kan gi innsiktsfull informasjon om tidlig OA. Videre kan denne bruskmodellen være nyttig for å undersøke cellene og matriseresponsen på mekaniske og inflammatoriske endringer i et 3D-innfødt lokalt habitat38,39. Siden disse bruskplantene er relativt enkle og enkle å generere, kan de også brukes til å studere OA-heterogenitet, noe som er en begrensende faktor for å utvikle og teste sykdomsmodifiserende OA-legemidler43. Det må også bemerkes at skalerbarhet og avhengighet av pasienter som gjennomgår leddprotesekirurgi er to av modellens mangler.

Det er velkjent at leddbrusk presenterer en merkelig oppførsel avhengig av skalanivået som testes. Som indikert av Loparic et al., på mikroskala, oppfører brusken seg som et ikke-strukturert og ensartet materiale35, og en slik tilnærming gir en tilnærming til lokalisert total bruskstivhet. Med hensyn til om mikro- eller nanofordypninger er bedre egnet, sammenlignet en studie fra 2004 av Stolz et al.44 både mikro- og nanoskalainnrykk ved vurdering av strukturmekaniske egenskaper til leddbrusk. Forfatterne understreket at for mikroskala sfærisk innrykk av leddbrusk, deler nanoskala fine strukturelle komponenter (dvs. individuelle kollagenfibre og proteoglykaner) vanligvis oppgaven med bæring. I slike er de samlede mekaniske egenskapene forskjellig markant fra de enkelte nanokomponentene. De samme forfatterne foreslo at en kombinasjon av mikro- og nanofordypninger kunne brukes til å vurdere de generelle lokale stivhetsprofilene til leddbrusk, samt stivheten knyttet til de fine strukturelle komponentene44.

Tallrike AFM-baserte innrykkseksperimenter har brukt skarpe pyramidale utkragingsspisser (radius = 15-20 nm)22,36,44 for å vurdere bruskmekanikk. Selv om nanoindentasjonene med skarpe utkrager for tiden anses å være mer egnet til å vurdere de fineste mekaniske egenskapene, gir sfæriske utkragingsspisser resultater som er mer konsistente og lettere å modellere og tolke ved testing av myke biologiske prøver44,45. Videre viste Stolz et al. at AFM nano-innrykk av enzymatisk (dvs. elastase) nedbrutt leddbrusk ikke er mulig fordi vevet blir så klebrig at spissprøveadhesjon dominerer kraftavstandskurvene, noe som gjør dataene umulige44.

I de nåværende AFM-målingene ble det brukt en utkrager med en sfærisk utkragespiss på 5 μm radius. Utkragingsvalget var motivert av intensjonen om å gjennomsnittlig de mekaniske egenskapene til vevet over en ganske stor overflate samtidig som den påførte skaden på bruskoverflaten minimeres. Forholdet mellom den utkragede kraften og den resulterende prøvefordypningen ble utstyrt med Hertz-passformmodellen. Ved bruk av sfæriske innrykk anbefales Hertz-passformmodellen, med de attraktive kreftene som virker mellom utkragingsspissen og prøveflaten blir neglisjert46. Ligningene for Hertzian-modellen er vist i Eq.1 og Eq.2.

Equation 1LIGNING 1

Equation 2Eq.2

Hvor F = kraft; E = Youngs modul; v = Poissons forhold; δ = innrykk; a = radius av kontaktsirkelen; og Rs = radius av sfære.

Modellen beregner til slutt cellulær/vevselastisiteten47, formelt uttrykt som Youngs modul (E). Hertz-passformmodellen tar hensyn til flere egenskaper som spissens form og størrelse, innrykk og prøvedeformerbarhet. Hvis disse kravene ikke er ideelt oppfylt, kan modellen gi et unøyaktig estimat av Youngs modul46.

Hertz-tilpasningsmodellen antar at belastningen og den elastiske spenningen avhenger lineært av den elastiske modulen, noe som innebærer at innrykket i prøven forblir mye mindre enn selve prøvetykkelsen46. Denne antagelsen ble lett oppfylt i dette oppsettet, hvor bruskeksplantene hadde en tykkelse på 1 mm sammenlignet med fordypninger på få mikrometer.

Leddbrusk kan modelleres som et porøst viskoelastisk materiale48,49. Den viskoelastiske oppførselen skyldes friksjon mellom de intracellulære / cytoplasmatiske eller matriksbestanddelene som molekyler, organeller og kollagen-proteoglykannettverket50,51. Som navnet antyder, kombinerer viskoelastiske materialer to forskjellige egenskaper: viskøs - materialet deformeres sakte når det utsettes for en ekstern belastning - og elastisk - materialet går tilbake til sin opprinnelige konfigurasjon når den påførte belastningen er fjernet52,53. Den viskoelastiske oppførselen manifesteres som en hysterese mellom tilnærmingen (utvidet) og tilbaketrekningskurvene i kraftavstandskurvene 46,52, lik de som ble oppnådd i denne studien (figur 4C). Videre er et kjennetegn ved viskoelastiske materialer at deres mekaniske egenskaper avhenger av deformasjonshastigheten, og materialets stivhet øker med hastigheten som belastningen påføres (innrykkshastighet)54. Ved å velge forskjellige belastningshastigheter genereres således en familie av kraftavstandskurver, som hver representerer de mekaniske egenskapene til den testede prøven ved hver lasthastighet52. Så når du prøver å sammenligne resultatene av ulike verk, er det viktig å ta hensyn til alle innrykksparametrene. Samlet sett, ved måling på mikrometerskala (som i denne studien med en 5 μm sfærisk utkragingsspiss), oppfører leddbrusk seg som et ikke-strukturert og ensartet materiale, og genererer en kumulativ elastisk modul som inkluderer både elastiske og viskøse bidrag til stivhet på grunn av vevets poroviskoelastiske natur35.

En annen antagelse i Hertzian-modellen er at innrykksdybden er lavere enn radiusen til den sfæriske utkragingsspissen55. Innrykksdybden representerer maksimal forskyvning av utkragingsspissen etter første kontakt med prøven. Ved maksimal belastning er den maksimale innrykksdybden den totale forskyvningen av prøven og utkragespissen. Bueckle's retningslinje angir en maksimal innrykksdybde på 10% av den totale tykkelsen på en prøve med samme struktur gjennom56, ellers varierer resultatene i henhold til dybde-til-tykkelse-forholdet. For en utkragingsradius på 5 μm ble bruskeksplantene i denne studien i gjennomsnitt rykket inn ved 1,1 μm, med noen få topper på 3 μm i noen få tilfeller, spesielt for de sterkt degenererte bruskeksplantene. I dette tilfellet ble det søkt et kompromiss, da det i eksperimentell setting kreves relativt høye krefter forbundet med store innrykk for å nøytralisereoverflate uregelmessigheter av degenerert brusk. En mildere fordypning vil resultere i undersøkelse av overfladisk flimmer og kollagenfissurering, som begge er vanlige trekk ved sterkt degenerert brusk57.

Avgjørende for Hertz fit-modellen er også den korrekte identifiseringen av punktet der utkragingsspissen kommer i direkte kontakt med prøven, generelt kalt kontaktpunktet. Dette kan imidlertid vise seg å være problematisk ved innrykk av for klebrige eller for myke prøver, da det kan resultere i flere sondeprøvekontaktpunkter58,59. Faktisk, som pent understreket av A-Hassan et al., for myke biologiske vev, er nøyaktig bestemmelse av kontaktpunktet et av de mest plagsomme problemene60. Denne effekten ble også observert i de opprinnelige osteoartrittiske bruskeksplantene, da vevsoverflaten mister sine opprinnelige mekaniske egenskaper og ofte er ujevn, og presenterer overfladisk flimmer og spalting (figur 3B,C). Dette fenomenet ble spesielt lagt merke til i bruskeksplantene der det dominerende cellemønsteret var store klynger (figur 2C). Disse inhomogenitetene i bruskoverflaten kan føre til flere sondeprøvekontaktpunkter og dermed feilaktige resultater. Store avbøyninger ble observert i noen tilfeller, etterfulgt av en rask gjenoppretting av grunnlinjen før den siste strekningen av kraftavstandskurven (figur 5A). Dette kan tilskrives en stor hindring i utkragingsspissens vei (f.eks. avanserte fibrilleringsområder med frynsete og splittende brusk). I andre tilfeller var den siste helningen av kraftavstandskurven spredt med mindre uregelmessigheter (figur 5B), noe som indikerer kontakt med suksessivt mindre hindringer (f.eks. mikrofibrillering av vevet). I slike tilfeller må målestedet måles på nytt eller til og med endres for å sikre datapålitelighet og reproduserbarhet. For dette formål er det også viktig å nøye inspisere AFMs kraftavstandskurveutgang for riktig identifisering av kontaktpunktet. Dette er et viktig punkt å være klar over, da det har vist seg at feil identifisering av kontaktpunktet med 50 nm resulterer i en feil estimering av verdien av E med en størrelsesorden61. Flere studier har begynt å bruke automatiserte tilnærminger for å bestemme kontaktpunktet til kraftavstandskurver, med mål om å omgå subjektiv brukerinngang når man estimerer kontaktpunktet ved visuell inspeksjon og forbedrer nøyaktigheten. Dette blir enda mer avgjørende når det gjelder et stort antall kraftforskyvningskurver, som de som genereres i cellemekanikkmålinger47,62. Selv om flere strategier har blitt foreslått for å automatisere kontaktpunktbestemmelsen 47,63,64,65, er den optimale strategien svært avhengig av eksperimentelle forhold og faktorer som modellen som brukes til å analysere dataene, sondens form, den (ikke-) klebende mekaniske interaksjonen mellom utkragingsspissen og prøven, samt (ikke-) Hertzian oppførselen til prøven 63.

Prøvedrift er et annet vanlig problem som kan forårsake artefakter og feilaktig bestemmelse av kontaktpunkt (figur 3E). Det betyr i utgangspunktet at prøven ikke er riktig montert i prøveholderen (petriskål) og prøven beveger seg under AFM-målingene. Effekten er spesielt uttalt når du flytter AFM-utkragingen til et nytt målested. Dette aspektet kan lett observeres under de faktiske målingene ved en plutselig endring i fokalplanet. De resulterende kraftavstandskurvene har vanligvis en bifasisk utvidet skråning, med en mild stigning i begynnelsen, tilsvarende innsnevringen av det tomme rommet mellom bunnen av skiven og petriskålen når skiven skyves ned av utkragingen (se figur 3E), etterfulgt av en fastere helning i den andre delen av skråningen, indikerer at platen rykkes ytterligere inn nå som den er i direkte kontakt med bunnen av petriskålen (figur 5C,D). For å overvinne forvrengningene kan man prøve å fikse prøvene bedre ved å bruke et tilstrekkelig prøvelim (figur 3D), holde temperaturen konstant ved å slå av eksterne varmekilder (lys) for å unngå termisk drifting og gjennomføre raske skanningsmålinger. I forsøkene her observerte vi en utkragende avbøyningsdrift som skjedde i løpet av de første 15 minuttene av utkragingens nedsenkning i media (på grunn av plutselige temperaturendringer). Etter denne tidsforløpet er driften vanligvis ubetydelig. Som et resultat anbefaler vi eksperimentøren å nøye undersøke grunnlinjen etter nedsenking av utkrager og begynne å måle når den har stabilisert seg. Varigheten av denne prosessen kan variere sterkt avhengig av utkrageren som brukes.

En annen kritisk parameter for enhver AFM-måling er settpunktet, som forenklet er et mål på kraften som utkrageren påfører prøven. For kontaktmodus (som brukt i denne studien) representerer settpunktet en viss avbøyning av utkragingen. Når du utfører flere skanninger eller flere repetisjoner, som i protokollen her, kan utkragingsspissen adsorbere partikler fra prøveoverflaten, noe som gjør det noen ganger nødvendig å fjerne utkragingen, rengjøre den ordentlig66 og deretter kalibrere på nytt før du fortsetter med målingene.

Mens AFM-mikroinnrykk gir nye og interessante datainnsamlingsmuligheter, spesielt i sammenheng med osteoartrittisk brusk, er konsistensen og reproduserbarheten av de produserte dataene sterkt avhengig av flere parametere, som skissert ovenfor. Når du bruker denne tilnærmingen for å vurdere de mekaniske endringene forårsaket av bruskvevsdegenerasjon, må noen pilotmålinger på ulike romlige mønstre først utføres for å skalere opp resultatene til den spesifikke eksperimentelle designen. Pilot AFM-målinger bør utføres med den mest standardiserbare prosedyren som tar nok prøver (f.eks. fem plater) av samme mønster for å gi en indikasjon på omfanget av datavariabilitet. Dette er spesielt viktig når man forsøker å kvantifisere og vurdere de tidligste relevante OA-stivhetsendringene (dvs. mellom enkeltstrenger og doble strenger, figur 4A). Faktisk, i en tidligere studie, ved hjelp av en lignende tilnærming, viste vi at en prøvestørrelse på 30 menneskelige prøver var nødvendig for å vurdere biomekaniske endringer i matrisen som en funksjon av den romlige organisasjonen av cellene37.

Videre er mange av trinnene som presenteres i denne protokollen utsatt for menneskelige feil og stoler sterkt på operatørens erfaring. Gitt alle faktorene som kan påvirke de faktiske AFM-resultatene, er de absolutte E-verdiene rapportert i denne studien ikke generaliserbare og er ganske spesifikke for dette eksperimentelle oppsettet. Imidlertid er forholdet som presenteres her mellom de forskjellige Youngs moduli og de cellulære mønsterbaserte bruskeksplantene (jo mer patologisk det romlige mønsteret er, desto lavere er bruskens elastiske modul [EM]) upåvirket, da funnene stemmer overens med tidligere studier som viser stivhetsendringer som en funksjon av cellulær mønsterorganisasjon23,37.

Samlet sett demonstrerer denne trinnvise protokollen funksjonaliteten til standardiserte 3D-innfødte leddbruskeksplanter, som ikke bare er representative for OA-drevne cellulære reorganiseringshendelser som spenner fra begynnelse til avansert progresjon, men også er forbundet med en gradvis reduksjon i stivhet. Eksplantene kan gjenspeile en pålitelig biomimetikkmodell for å studere utbrudd og progresjon av OA, slik at testing og utvikling av ulike behandlingsmodaliteter ex vivo. Bruken av en slik human explant-modell i kombinasjon med AFM-basert biomekanisk vurdering kan resultere i et paradigmeskifte for biomedisinsk forskning og farmasøytisk industri, og bane vei for nye måter å identifisere sterkt tiltrengte effektive OA-legemidler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker ortopedene fra Ortopedisk avdeling ved Universitetssykehuset i Tuebingen for å ha levert vevsprøvene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head  CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany JPK00518
Biocompatible sample glue  Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany H000033
Calcein AM Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA 14948 Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SAA-SPH-5UM Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device  Self-made  n/a Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope Leica Biosystems, Wetzlar, Germany DFC3000G
Cryotome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany CM3050S 
Data Processing Software for the AFM Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)  Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany 41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) Leica Biosystems, Wetzlar, Germany 11889113
Glass block cantiliver holder Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SP-90-05 Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine  Merck KGaA, Darmstadt, Germany F1315
Microscope glass slides Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS294775X50
Mounting medium With DAPI ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany 50011 Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany T-05-0117
Scalpel Feather Medical Products, Osaka, Japan 2023-01
Silicone Skirt Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSS IBM, Armonk, New York, USA SPSS Statistics 22 Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes  TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands SA6255012 Water-soluble embedding medium 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application of atomic force microscopy in cancer research. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 102 (2018).
  3. Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  4. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  5. Rabinovich, Y., et al. Atomic force microscopy measurement of the elastic properties of the kidney epithelial cells. Journal of Colloid and Interface Science. 285 (1), 125-135 (2005).
  6. Dufrêne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces. Nature Reviews Microbiology. 2 (6), 451-460 (2004).
  7. Cykowska, A., Danalache, M., Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Hofmann, U. K. Detecting early osteoarthritis through changes in biomechanical properties - A review of recent advances in indentation technologies in a clinical arthroscopic setup. Journal of Biomechanics. 132, 110955 (2022).
  8. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  9. Fuchs, J., Kuhnert, R., Scheidt-Nave, C. 12-Monats-Prävalenz von Arthrose in Deutschland. Journal of Health Monitoring. 2, 55-60 (2017).
  10. Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
  11. Ganz, R., Leunig, M., Leunig-Ganz, K., Harris, W. H. The etiology of osteoarthritis of the hip. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (2), 264-272 (2008).
  12. Saxby, D. J., Lloyd, D. G. Osteoarthritis year in review 2016: Mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (2), 190-198 (2017).
  13. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instructional Course Lectures. 47, 487-504 (1998).
  14. Braun, H. J., Gold, G. E. Diagnosis of osteoarthritis: Imaging. Bone. 51 (2), 278-288 (2012).
  15. Guermazi, A., Roemer, F. W., Burstein, D., Hayashi, D. Why radiography should no longer be considered a surrogate outcome measure for longitudinal assessment of cartilage in knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), 247 (2011).
  16. Guermazi, A., et al. Different thresholds for detecting osteophytes and joint space narrowing exist between the site investigators and the centralized reader in a multicenter knee osteoarthritis study--Data from the Osteoarthritis Initiative. Skeletal Radiology. 41 (2), 179-186 (2012).
  17. Bedson, J., Croft, P. R. The discordance between clinical and radiographic knee osteoarthritis: A systematic search and summary of the literature. BMC Musculoskeletal Disorders. 9 (1), 116 (2008).
  18. Dashefsky, J. H. Arthroscopic measurement of chondromalacia of patella cartilage using a microminiature pressure transducer. Arthroscopy. 3 (2), 80-85 (1987).
  19. Berkenblit, S. I., Frank, E. H., Salant, E. P., Grodzinsky, A. J. Nondestructive detection of cartilage degeneration using electromechanical surface spectroscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 116 (4), 384-392 (1994).
  20. Appleyard, R. C., Swain, M. V., Khanna, S., Murrell, G. A. The accuracy and reliability of a novel handheld dynamic indentation probe for analysing articular cartilage. Physics in Medicine and Biology. 46 (2), 541-550 (2001).
  21. Hsieh, C. H., et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (4), 480-488 (2008).
  22. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 4 (3), 186-192 (2009).
  23. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  24. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomaterialia. 126, 315-325 (2021).
  25. Eaton, P., Batziou, K. Artifacts and Practical Issues in Atomic Force Microscopy. Atomic Force Microscopy: Methods and Protocols. Santos, N. C., Carvalho, F. A. , Springer. New York, NY. 3-28 (2019).
  26. Danalache, M., et al. Exploration of changes in spatial chondrocyte organisation in human osteoarthritic cartilage by means of 3D imaging. Scientific Reports. 11, 9783 (2021).
  27. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  28. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  29. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
  30. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  31. Wilusz, R. E., DeFrate, L. E., Guilak, F. Immunofluorescence-guided atomic force microscopy to measure the micromechanical properties of the pericellular matrix of porcine articular cartilage. Journal of The Royal Society Interface. 9 (76), 2997-3007 (2012).
  32. Guilak, F., Ratcliffe, A., Lane, N., Rosenwasser, M. P., Mow, V. C. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 12 (4), 474-484 (1994).
  33. Billinghurst, R. C., et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. The Journal of Clinical Investigation. 99 (7), 1534-1545 (1997).
  34. Wu, P. J., et al. Detection of proteoglycan loss from articular cartilage using Brillouin microscopy, with applications to osteoarthritis. Biomedical Optics Express. 10 (5), 2457-2466 (2019).
  35. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: Validation with a gel-microfiber composite. Biophysical Journal. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  36. Moshtagh, P. R., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. The elastic modulus of articular cartilage at nano-scale and micro-scale measured using indentation type atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 22, 359-360 (2014).
  37. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 19, 109409 (2019).
  38. Houtman, E., et al. Human osteochondral explants: Reliable biomimetic models to investigate disease mechanisms and develop personalized treatments for osteoarthritis. Rheumatology and Therapy. 8 (1), 499-515 (2021).
  39. Anderson, J. R., Phelan, M. M., Foddy, L., Clegg, P. D., Peffers, M. J. Ex vivo equine cartilage explant osteoarthritis model: A metabolomics and proteomics study. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3652-3667 (2020).
  40. Chen, C. T., Torzilli, P. A. In vitro cartilage explant injury models. Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. Olson, S. A., Gauilak, F. , Springer. New York, NY. 29-40 (2015).
  41. Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. -C. An ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants. Journal of Visualized Experiments. (153), e59467 (2019).
  42. Rolauffs, B., Williams, J., Grodzinsky, A., E Kuettner, K., Cole, A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  43. Deveza, L. A., Loeser, R. F. Is osteoarthritis one disease or a collection of many. Rheumatology. 57, 34-42 (2018).
  44. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  45. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  46. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  47. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267 (2016).
  48. Mow, V. C., Kuei, S. C., Lai, W. M., Armstrong, C. G. Biphasic creep and stress relaxation of articular cartilage in compression? Theory and experiments. Journal of Biomechanical Engineering. 102 (1), 73-84 (1980).
  49. Armstrong, C. G., Lai, W. M., Mow, V. C. An analysis of the unconfined compression of articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 106 (2), 165-173 (1984).
  50. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5 (8), 636-640 (2006).
  51. Fischer-Friedrich, E., et al. Rheology of the active cell cortex in mitosis. Biophysical Journal. 111 (3), 589-600 (2016).
  52. Gould, T. E., Jesunathadas, M., Nazarenko, S., Piland, S. G. Chapter 6 - Mouth Protection in Sports. Materials in Sports Equipment (Second Edition). Subic, A. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 199-231 (2019).
  53. Kontomaris, S. V., Malamou, A. Hertz model or Oliver & Pharr analysis? Tutorial regarding AFM nanoindentation experiments on biological samples. Materials Research Express. 7 (3), 033001 (2020).
  54. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  55. Wu, C. -E., Lin, K. -H., Juang, J. -Y. Hertzian load-displacement relation holds for spherical indentation on soft elastic solids undergoing large deformations. Tribology International. 97, 71-76 (2016).
  56. Westbrook, J. H., Conrad, H. The Science of Hardness Testing and its Research Applications. , American Society for Metal. Metals Park, Ohio. (1973).
  57. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  58. Stylianou, A., Kontomaris, S. V., Grant, C., Alexandratou, E. Atomic force microscopy on biological materials related to pathological conditions. Scanning. 2019, 8452851 (2019).
  59. Sokolov, I. Atomic force microscopy in cancer cell research. Cancer Nanotechnology. 1, 1-17 (2007).
  60. Emad, A., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
  61. Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: Importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
  62. Shoelson, B., Dimitriadis, E. K., Cai, H., Kachar, B., Chadwick, R. S. Evidence and implications of inhomogeneity in tectorial membrane elasticity. Biophysical Journal. 87 (4), 2768-2777 (2004).
  63. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  64. Rudoy, D., Yuen, S. G., Howe, R. D., Wolfe, P. J. Bayesian change-point analysis for atomic force microscopy and soft material indentation. Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). 59 (4), 573-593 (2010).
  65. Benítez, R., Moreno-Flores, S., Bolós, V. J., Toca-Herrera, J. L. A new automatic contact point detection algorithm for AFM force curves. Microscopy Research and Technique. 76 (8), 870-876 (2013).
  66. Timashev, P. S., et al. Cleaning of cantilevers for atomic force microscopy in supercritical carbon dioxide. Russian Journal of Physical Chemistry B. 8 (8), 1081-1086 (2014).

Tags

Retraksjon utgave 188 Leddbruskeksplanter atomkraftmikroskopi elastisk moduli ex vivo-modell Hertz-modellinnrykk vevspreparering
Adressering av praktiske problemer i atomkraftmikroskopibasert mikroinnrykk på menneskelige leddbruskeksplanter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daniel, C., Alexander, D., Umrath,… More

Daniel, C., Alexander, D., Umrath, F., Danalache, M. Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (188), e64371, doi:10.3791/64371 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter