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Bioengineering

मानव आर्टिकुलर कार्टिलेज खोजों पर परमाणु बल माइक्रोस्कोपी-आधारित माइक्रो-इंडेंटेशन में व्यावहारिक मुद्दों को संबोधित करना

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64371
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

Summary

हम परमाणु बल माइक्रोस्कोपी माइक्रो-इंडेंटेशन से जुड़ी सबसे आम समस्याओं की पहचान करने और उन्हें संबोधित करने के लिए एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। हम पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस-संचालित अध: पतन के विभिन्न डिग्री की विशेषता वाले देशी मानव आर्टिकुलर कार्टिलेज खोजों पर उभरती समस्याओं का उदाहरण देते हैं।

Abstract

बिना किसी संदेह के, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) वर्तमान में जैविक क्षेत्र में सूक्ष्म और यहां तक कि नैनो-संकेतों का आकलन करने के लिए सबसे शक्तिशाली और उपयोगी तकनीकों में से एक है। हालांकि, किसी भी अन्य सूक्ष्म दृष्टिकोण के साथ, पद्धति संबंधी चुनौतियां उत्पन्न हो सकती हैं। विशेष रूप से, नमूने की विशेषताओं, नमूना तैयारी, उपकरण के प्रकार और इंडेंटेशन जांच अवांछित कलाकृतियों को जन्म दे सकती है। इस प्रोटोकॉल में, हम स्वस्थ और साथ ही ऑस्टियोआर्थ्रिटिक आर्टिकुलर कार्टिलेज खोजों पर इन उभरते मुद्दों का उदाहरण देते हैं। इसके लिए, हम पहले एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण के माध्यम से दिखाते हैं कि पूरे ऊतक खोजों के बड़े 2 डी मोज़ेक फ्लोरेसेंस इमेजिंग के माध्यम से अपघटन के विभिन्न चरणों के अनुसार एक्स विवो आर्टिकुलर कार्टिलेज डिस्क को कैसे उत्पन्न, ग्रेड और नेत्रहीन रूप से वर्गीकृत किया जाए। एक्स विवो मॉडल की प्रमुख ताकत यह है कि इसमें वृद्ध, देशी, मानव उपास्थि शामिल हैं जो शुरुआती शुरुआत से प्रगति तक पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस से संबंधित परिवर्तनों की जांच की अनुमति देता है। इसके अलावा, ऊतक तैयारी में सामान्य नुकसान, साथ ही बाद के डेटा विश्लेषण के साथ वास्तविक एएफएम प्रक्रिया भी प्रस्तुत की जाती है। हम दिखाते हैं कि नमूना तैयारी और प्रसंस्करण, उन्नत अध: पतन के कारण स्थलाकृतिक नमूना विशेषताओं और नमूना-टिप इंटरैक्शन जैसे बुनियादी लेकिन महत्वपूर्ण कदम डेटा अधिग्रहण को कैसे प्रभावित कर सकते हैं। हम एएफएम में सबसे आम समस्याओं की जांच के अधीन भी हैं और वर्णन करते हैं, जहां संभव हो, उन्हें कैसे दूर किया जाए। इन सीमाओं का ज्ञान सही डेटा अधिग्रहण, व्याख्या और अंततः, निष्कर्षों को व्यापक वैज्ञानिक संदर्भ में एम्बेड करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है।

Introduction

इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों और प्रणालियों के लगातार सिकुड़ते आकार के कारण, सूक्ष्म और नैनो-आधारित प्रौद्योगिकी और उपकरणों के तेजी से विकास ने गति प्राप्त की है। ऐसा ही एक उपकरण परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) है, जो जैविक सतहों को स्कैन कर सकता है और नैनो- और माइक्रोमीटरस्केल 1,2 दोनों पर स्थलाकृतिक या बायोमैकेनिकल जानकारी प्राप्त कर सकता है। इसकी विशाल विशेषताओं के बीच, इस उपकरण को विभिन्न जैविक प्रणालियों 3,4,5,6 के यांत्रिक गुणों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए एक सूक्ष्म के साथ-साथ एक नैनो-इंडेंटर के रूप में संचालित किया जा सकता है। डेटा एक यांत्रिक जांच के माध्यम से सतह के साथ भौतिक संपर्क द्वारा एकत्र किया जाता है, जो इसकी टिप7 पर लगभग 1 एनएम जितना छोटा हो सकता है। नमूने के परिणामस्वरूप विरूपण तब कैंटिलीवर टिप की इंडेंटेशन गहराई और नमूना8 पर लागू बल के आधार पर प्रदर्शित किया जाता है।

ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) एक दीर्घकालिक अपक्षयी पुरानी बीमारी है जो जोड़ों और आसपास के ऊतकों में आर्टिकुलर कार्टिलेज की गिरावट की विशेषता है, जिससे हड्डी की सतहों का पूरा संपर्क हो सकता है। ओए का बोझ पर्याप्त है; वर्तमान में, सभी महिलाओं में से आधे और 65 वर्ष और उससे अधिक आयु के सभी पुरुषों में से एक तिहाई ओए9 से पीड़ित हैं। आघात, मोटापा, और संयुक्त10 के परिणामस्वरूप परिवर्तित बायोमैकेनिक्स आर्टिकुलर कार्टिलेज अपघटन को निर्धारित करते हैं, जिसे एक सामान्य अंतिम परिणाम के रूप में देखा जाता है। गैंज़ एट अल के अग्रणी अध्ययन ने माना कि ओए प्रक्रिया के शुरुआती चरणों में उपास्थि11 के बायोमैकेनिकल गुण शामिल हो सकते हैं, और तब से शोधकर्ताओं ने इस परिकल्पना12 की पुष्टि की है। इसी तरह, यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि ऊतक के बायोमैकेनिकल गुण कार्यात्मक रूप से अल्ट्रास्ट्रक्चरल संगठन के साथ-साथ सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स क्रॉसस्टॉक द्वारा व्यवस्थित होते हैं। कोई भी परिवर्तन नाटकीय रूप से समग्र ऊतक बायोमैकेनिकलकामकाज को प्रभावित कर सकता है। आज तक, ओए निदान नैदानिक है और सादे फिल्म रेडियोग्राफी14 पर आधारित है। यह दृष्टिकोण दो तरफा है: सबसे पहले, ओए के निदान को तैयार करने के लिए परिभाषित अपक्षयी कट-ऑफ सीमा की कमी से स्थिति को निर्धारित करना मुश्किल हो जाता है, और, दूसरी बात, इमेजिंग विधियों में संवेदनशीलता और मानकीकरण की कमी होती है और स्थानीयकृत उपास्थि क्षति15,16,17 का पता नहीं लगा सकते हैं। इसके लिए, उपास्थि के यांत्रिक गुणों के मूल्यांकन का निर्णायक लाभ है कि यह एक पैरामीटर का वर्णन करता है जो रोग के एटियलजि की परवाह किए बिना ओए के दौरान बदलता है और बहुत प्रारंभिक चरण में ऊतक कार्यक्षमता पर सीधा प्रभाव पड़ता है। इंडेंटेशन उपकरण उस बल को मापते हैं जिसके द्वारा ऊतक इंडेंटेशन का विरोध करता है। यह वास्तव में, एक नई अवधारणा नहीं है; सबसे शुरुआती अध्ययन 1980 और 1990 के दशक के हैं। इस अवधि में, कई अध्ययनों ने सुझाव दिया कि आर्टिकुलर कार्टिलेज के आर्थोस्कोपिक माप के लिए डिज़ाइन किए गए इंडेंटेशन उपकरण उपास्थि में अपक्षयी परिवर्तनों का पता लगाने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हो सकते हैं। यहां तक कि 30 साल पहले, कुछ अध्ययन यह प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि इंडेंटेशन उपकरण आर्थ्रोस्कोपी 18,19,20 के दौरान संपीड़ित कठोरता माप का संचालन करके ऊतक अध: पतन के दौरान उपास्थि की सतह में विवो परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम थे।

आर्टिकुलर कार्टिलेज का एएफएम इंडेंटेशन (एएफएम-आईटी) ऊतक की एक महत्वपूर्ण यांत्रिक संपत्ति, अर्थात् कठोरता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। यह एक यांत्रिक पैरामीटर है जो एक लागू, गैर-विनाशकारी भार और इंडेंटेड ऊतक क्षेत्र21 के परिणामी विरूपण के बीच संबंध का वर्णन करता है। एएफएम-आईटी को मैक्रोस्कोपिक रूप से अप्रभावित कोलेजन नेटवर्क में कठोरता में आयु-निर्भर संशोधनों को निर्धारित करने में सक्षम दिखाया गया है, इस प्रकार, ओए शुरुआत (आर्टिकुलर कार्टिलेज में आउटरब्रिज स्केल पर ग्रेड 0) से जुड़े पैथोलॉजिकल परिवर्तनों के बीच अंतर करना। हमने पहले दिखाया है कि एएफएम-आईटी, प्रारंभिक उपास्थि अध: पतन के लिए एक छवि-आधारित बायोमार्कर के रूप में स्थानिक चोंड्रोसाइट्स संगठन के आधार पर, न केवल मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देते हैं, बल्कि वास्तव में शुरुआती अपक्षयी यांत्रिक परिवर्तनों को भी इंगित करते हैं। इन निष्कर्षों की पुष्टि पहले हीअन्य 23,24 द्वारा की जा चुकी है। इसलिए, एएफएम-आईटी प्रारंभिक अपक्षयी परिवर्तनों का निदान और पहचान करने के लिए एक दिलचस्प उपकरण के रूप में कार्य करता है। इन परिवर्तनों को पहले से ही सेलुलर स्तर पर मापा जा सकता है, ओए पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रिया की समझ को फिर से आकार दिया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, हम मूल उपास्थि खोज तैयारी से लेकर एएफएम डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण तक, आर्टिकुलर कार्टिलेज खोजों की एक पूर्ण हिस्टोलॉजिकल और बायोमैकेनिकल ग्रेडिंग प्रक्रिया का प्रदर्शन करते हैं। एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण के माध्यम से, हम दिखाते हैं कि 2 डी बड़े मोज़ेक इमेजिंग के माध्यम से अध: पतन के विभिन्न चरणों के अनुसार आर्टिकुलर कार्टिलेज ऊतक को कैसे उत्पन्न, ग्रेड और नेत्रहीन रूप से वर्गीकृत किया जाए, इसके बाद माइक्रो-एएफएम इंडेंटेशन।

हालांकि, वर्तमान में, एएफएम-आईटी कार्टिलेज7 में बायोमैकेनिकल परिवर्तनों को मापने के लिए सबसे संवेदनशील उपकरणों में से एक है, किसी भी अन्य वाद्य तकनीक की तरह, इसकी सीमाएं और व्यावहारिक विशिष्टताएं25 हैं जो गलत डेटा अधिग्रहण का कारण बन सकती हैं। इसके लिए, हम उपास्थि खोजों के एएफएम माप के दौरान उत्पन्न होने वाली सबसे आम समस्याओं की जांच के अधीन हैं और वर्णन करते हैं, जहां संभव हो, उन्हें कैसे कम या दूर किया जाए। इनमें नमूनों के स्थलाकृतिक पहलू और एएफएम-संगत वातावरण में उन्हें स्थिर करने में कठिनाइयां, ऊतक की सतह की भौतिक विशिष्टताएं और ऐसी सतहों पर एएफएम माप करने में परिणामी कठिनाइयां शामिल हैं। गलत बल-दूरी वक्रों के उदाहरण भी प्रस्तुत किए गए हैं, जो उन स्थितियों पर जोर देते हैं जो उनके कारण हो सकते हैं। कैंटिलीवर टिप की ज्यामिति में निहित अतिरिक्त सीमाओं और डेटा विश्लेषण के लिए हर्ट्ज मॉडल के उपयोग पर भी चर्चा की गई है।

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Protocol

जर्मनी के ट्यूबिंगन विश्वविद्यालय अस्पताल में कुल घुटने के आर्थ्रोप्लास्टी से गुजरने वाले रोगियों से एकत्र किए गए फेमोरल कोंडिल का उपयोग किया गया था। इस अध्ययन में अपक्षयी और पोस्टट्रामैटिक संयुक्त विकृति वाले रोगियों से केवल आर्टिकुलर कार्टिलेज नमूने शामिल किए गए थे। अध्ययन शुरू होने से पहले विभागीय, संस्थागत, साथ ही स्थानीय नैतिक समिति की मंजूरी प्राप्त की गई थी (परियोजना संख्या 674/2016बीओ 2)। भागीदारी से पहले सभी रोगियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

नोट: उनके कालानुक्रमिक क्रम में प्रयोग चरणों का एक फ़्लोचार्ट चित्र 1 में दिया गया है।

1. ऊतक प्रसंस्करण और उपास्थि डिस्क का उत्पादन

  1. ऊतक की तैयारी
    1. पोस्ट-ऑपरेटिव रिसेक्शन के बाद, उपास्थि के नमूनों को डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) से भरे कंटेनर में रखें, जो 5% (वी / वी) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है। सुनिश्चित करें कि नमूने माध्यम में पूरी तरह से डूबे हुए हैं। सर्जिकल रिसेक्शन और कार्टिलेज के आगे के प्रसंस्करण के बीच की अवधि 24 घंटे से अधिक नहीं होनी चाहिए। सुनिश्चित करें कि, पूरे प्रसंस्करण के दौरान, नमूने पूरी तरह से मीडिया में डूबे हुए हैं ताकि नमूना सुखाने से बचा जा सके।
    2. स्केलपेल का उपयोग करके उपास्थि को हड्डी से दूर करें।
  2. कार्टिलेज डिस्क जनरेशन
    1. बायोप्सी पंच का उपयोग करके व्यास में 4 मिमी की उपास्थि डिस्क उत्पन्न करें।
      नोट: कोंडिल के उन क्षेत्रों का चयन करना और उन्हें निकालना महत्वपूर्ण है जहां उपास्थि परत की मोटाई 1 मिमी से अधिक है। यह समस्याग्रस्त हो सकता है, विशेष रूप से भार वहन क्षेत्रों के आसपास, जहां उपास्थि परत आमतौर पर टूट-फूट प्रक्रियाओं या अध: पतन के कारण अपनी मोटाई खो देती है।
    2. पहले से उत्पन्न 4 मिमी उपास्थि डिस्क को कस्टम-निर्मित कटिंग डिवाइस पर रखें और एक स्पैटुला के माध्यम से उपास्थि डिस्क को ठीक करें और स्थिर रखें। कार्टिलेज डिस्क को काटने वाले उपकरण पर रखते समय, देखभाल की जानी चाहिए। नमूनों को इस तरह रखें कि उपास्थि की सबसे ऊपरी परत (आर्टिकुलर कार्टिलेज का सतही क्षेत्र) ब्लेड का सामना न करे।
    3. उपास्थि डिस्क को रेजर ब्लेड से काटें। इस प्रकार, 4 मिमी x 1 मिमी के डिस्क के आकार के उपास्थि के नमूने उत्पन्न होते हैं। नमूना सुखाने को रोकने के लिए, जितनी जल्दी हो सके ऊतक काटने का कार्य करें।
    4. स्पैटुला की मदद से प्रत्येक डिस्क को इकट्ठा करें और उत्पन्न उपास्थि डिस्क को 1.5 एमएल ट्यूबों में रखें जिसमें डीएमईएम के 1 एमएल 5% (वी / वी) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक हैं। एक ट्यूब में लगभग 15 डिस्क रखें।
  3. कार्टिलेज डिस्क का क्रायोटोम सेक्शनिंग (लंबवत स्लाइस के लिए)।
    नोट: यह चरण वैकल्पिक है, और इसे नियोजित किया जा सकता है यदि उपास्थि डिस्क के भीतर सेलुलर पैटर्न वितरण का साइड-व्यू विज़ुअलाइज़ेशन वांछित है। इसका उपयोग सत्यापन विधि के रूप में किया जा सकता है क्योंकि सेलुलर पैटर्न का वितरण आर्टिकुलर कार्टिलेज26 की एक 3 डी विशेषता है। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पूरे उपास्थि डिस्क के ऑप्टिकल सेक्शनिंग और 3 डी पुनर्निर्माण का भी उपयोग किया जा सकता है, इस प्रकार, प्रोटोकॉल में वर्णित नमूनों को विभाजित करने की आवश्यकता है।
    1. उपास्थि डिस्क को पानी में घुलनशील एम्बेडिंग माध्यम के साथ कवर करें और इसे क्रायोटोम नॉब (नॉब की सतह के लंबवत डिस्क की सतह के साथ) पर इसके किनारे पर रखें। क्रायोटोम डिवाइस में, एम्बेडिंग माध्यम कम तापमान पर जम जाता है।
    2. एक मानक क्रायोटोम का उपयोग करके, डिस्क के मध्य तक पहुंचने तक ऊतक को 60 μm मोटाई पर विभाजित करें (यानी, जब क्रायोसेक्शन 4 मिमी की लंबाई तक पहुंच जाते हैं) और स्लाइस एकत्र करें। डिस्क खोज को लंबवत रूप से विभाजित करके, उपास्थि के सभी क्षेत्रों (सतही, मध्य और गहरे) की कल्पना की जा सकती है।
    3. एक ग्लास स्लाइड पर अनुभागों को इकट्ठा करें और फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) से तीन बार धोकर पानी में घुलनशील एम्बेडिंग माध्यम को हटा दें।

2. सेलुलर स्थानिक पैटर्न के एक कार्य के रूप में कार्टिलेज डिस्क सॉर्टिंग।

  1. डिस्क के आकार के उपास्थि के नमूनों का धुंधला होना।
    1. 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक कार्टिलेज डिस्क (खंड 1.2) रखें और प्रत्येक कुएं में 1: 1,000 के कमजोर पड़ने पर सेल पारगम्य फ्लोरेसेंस डाई के 130 μL जोड़ें।
    2. पूरी प्लेट का नेत्रहीन निरीक्षण करें और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुएं में केवल एक डिस्क रखी गई है। 37 डिग्री सेल्सियस पर मानक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  2. 60 μm कार्टिलेज स्लाइस का धुंधला होना
    1. कार्टिलेज डिस्क सेक्शन (सेक्शन 1.3) को धीरे से ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड ्स पर फोर्सप्स की मदद से रखें।
    2. कार्टिलेज वर्गों को परमाणु डीएपीआई काउंटरस्टेनिंग युक्त बढ़ते माध्यम के साथ कवर करें और धीरे से कवरलिप्स रखें जो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त हैं।
    3. नियमित पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ प्रत्येक कवरस्लिप के किनारों को सील करें और 3 मिनट के लिए सूखने दें।
  3. ऊपर-नीचे और साइड-व्यू कार्टिलेज सॉर्टिंग और इमेजिंग।
    नोट: प्रत्येक डिस्क को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत जांच की जानी चाहिए। इस चरण का उद्देश्य डिस्क को उनके प्रमुख सेलुलर पैटर्न (एकल तार, डबल स्ट्रिंग्स, छोटे क्लस्टर, बड़े क्लस्टर, या डिफ्यूज) के आधार पर सॉर्ट करना है।
    1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के प्लेट धारक पर 96-वेल प्लेट रखें।
    2. ईएम 495 एनएम/एक्स 515 एनएम (सेक्शन 2.1 में तैयार कार्टिलेज डिस्क की टॉप-डाउन इमेजिंग के लिए) या ईएम 358 एनएम/एक्स 461 एनएम (सेक्शन 2.2 में तैयार किए गए कार्टिलेज सेक्शन के साइड-व्यू इमेजिंग के लिए) और 10एक्स ऑब्जेक्टिव के उपयुक्त फ्लोरेसेंस फिल्टर का चयन करें।
      नोट: 10x उद्देश्य का उपयोग करने से डिस्क की पूरी परिधि का निरीक्षण किया जा सकता है, और असंगत या अनुचित धुंधलापन वाले नमूने बाहर रखे जा सकते हैं। हालांकि, केवल टॉप-डाउन व्यू का उपयोग करने से सतही क्षरण द्वारा ऊपर-नीचे अवलोकन के लिए दृश्यमान गहरी ऊतक परतों के विश्लेषण के परिणामस्वरूप सेलुलर संगठन में परिवर्तन की धारणा हो सकती है। एक उदाहरण के रूप में, कोलेजन आर्केड के बाद एक आरोही स्ट्रिंग को एकल कोशिका या बिखरी हुई कोशिकाओं (डिफ्यूज पैटर्न) 26 के रूप में माना जा सकता है। नतीजतन, उचित सेलुलर पैटर्न चयन सुनिश्चित करने के लिए डिस्क के दोनों किनारों का निरीक्षण किया जाना चाहिए।
    3. प्रत्येक उपास्थि डिस्क में प्रदर्शित सेलुलर पैटर्न को नेत्रहीन रूप से निर्धारित करें। यह संभावना नहीं है कि एक डिस्क में केवल एक प्रकार का सेलुलर पैटर्न होगा। डिस्क के उस हिस्से के लिए जहां चोंड्रोसाइट्स व्यवस्था रुचि के पैटर्न से मेल नहीं खाती है, केवल तभी नमूने स्वीकार करें जब अवांछित पैटर्न बहुत परिधि पर हो, जहां एएफएम माप नहीं हो रहे हैं (यानी, डिस्क सीमा से 0.5 मिमी तक), और सुनिश्चित करें कि यह डिस्क27 की कुल सतह के 10% से अधिक न हो, 28.
  4. पूरे उपास्थि डिस्क का छवि अधिग्रहण
    1. माइक्रोस्कोप के 10x उद्देश्य का चयन करें और इसे एक व्यक्तिगत उपास्थि डिस्क वाले पूर्वचयनित कुएं के नीचे रखें। सेलुलर पैटर्न देखने के लिए डिस्क पर ध्यान केंद्रित करें।
    2. पूरे कुएं का अवलोकन प्राप्त करने के लिए नेविगेटर फ़ंक्शन का चयन करें। बाएं माउस बटन का उपयोग करें और किसी भिन्न चरण स्थिति में नेविगेट करने के लिए खींचें। माउस व्हील के साथ, ज़ूम इन और आउट करें।
      नोट: इस बिंदु पर, पूरे नमूने के साथ कुएं का पूर्वावलोकन क्रमिक रूप से रुचि के प्रत्येक क्षेत्र पर डबल-क्लिक करके देखा जा सकता है।
    3. एक वर्ग का चयन करें जिसमें स्कैन किए जाने वाले रुचि के क्षेत्र शामिल हैं; इस बिंदु पर, मोज़ेक की रचना करने वाली सभी एकल टाइलें दिखाई देंगी।
    4. प्रकाश तीव्रता को समायोजित करें ताकि कोशिकाओं को पृष्ठभूमि से स्पष्ट रूप से देखा जा सके। इस बिंदु पर, चित्र की चमक / कंट्रास्ट को सभी टाइलों के लिए समायोजित किया गया है और अब प्रत्येक टाइल के लिए व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित नहीं किया जा सकता है।
      नोट: चूंकि डिस्क के किनारे के पास की कोशिकाएं अक्सर केंद्र में कोशिकाओं की तुलना में उच्च प्रतिदीप्ति संकेत उत्सर्जित करती हैं, इसलिए एक्सपोज़र / प्रकाश तीव्रता सेटिंग्स को अनुकूलित किया जाना चाहिए।
      1. यह मूल्यांकन करने के लिए कि क्या एक्सपोज़र समय किसी विशेष चैनल के लिए उपयुक्त है, हिस्टोग्राम में सिग्नल के वितरण की जांच करें। माइक्रोस्कोप के छवि सॉफ्टवेयर में शामिल स्वचालित एक्सपोज़र तंत्र का उपयोग करके, डिस्क के भीतर रहने वाली सभी कोशिकाओं की कल्पना करें।
    5. सॉफ़्टवेयर के फ़ोकस मैप पॉइंट विकल्प का चयन करें, और फिर इसके केंद्र में बाएं-क्लिक करके प्रत्येक व्यक्तिगत टाइल का चयन करें।
    6. फ़ोकस मैप विकल्प का चयन करें. एक विंडो पहले से चयनित सभी टाइलों के साथ प्रदर्शित होती है। प्रदर्शित करने और इसे उचित फ़ोकस में लाने के लिए सूची में किसी टाइल पर डबल-क्लिक करें.
    7. फोकल प्लान को सहेजने के लिए Z सेट करें पर क्लिक करें और अगले टाइल पर आगे बढ़ें। प्रत्येक व्यक्तिगत टाइल के लिए फोकल प्लान को समायोजित करने के बाद, स्टार्ट स्कैन दबाकर छवि अधिग्रहण शुरू करें।
      1. यदि स्कैन गहरे क्षैतिज और / या ऊर्ध्वाधर सलाखों को प्रदर्शित कर रहा है, तो यह एकल फ्रेम की अनुचित और असमान रोशनी के कारण हो सकता है। वास्तविक स्कैन से पहले सॉफ़्टवेयर में शामिल लिंक्ड शेडिंग विकल्प का उपयोग करके इसे हल करें।
    8. छवियों को सहेजें, निर्यात करें, और सही ढंग से एनोटेट करें।

3. कार्टिलेज खोजों का बायोमैकेनिकल दृष्टिकोण।

  1. एएफएम माप के लिए नमूना तैयारी।
    1. बायोकम्पैटिबल गोंद के माध्यम से पेट्री व्यंजनों में एक सेलुलर पैटर्न (खंड 2) युक्त प्रत्येक पूर्वचयनित उपास्थि डिस्क को ठीक करें। डिस्क के शीर्ष, नीचे, बाएं और दाएं किनारों पर पर्याप्त नमूना गोंद जोड़ें।
    2. एल-ग्लूटामाइन के बिना लीबोविट्ज़ के एल -15 माध्यम के 2.5 एमएल के साथ डिस्क को कवर करें। माध्यम द्वारा बनाई गई तरंगों के कारण सतह से नमूना अलगाव से बचने के लिए नमूने पर धीरे से लीबोविट्ज़ माध्यम जोड़ें।
  2. एएफएम में नमूने लोड करना
    1. एएफएम डिवाइस के नमूना धारक में पेट्री डिश रखें और पेट्री डिश हीटर सेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर चालू करें। ऊतक संवर्धन पकवान को वांछित तापमान तक पहुंचने दें। यह तापमान भिन्नता के कारण संभावित कलाकृतियों को बाहर करने के लिए किया जाता है।
  3. एएफएम-कैंटिलीवर अंशांकन
    1. सॉफ़्टवेयर सेटअप को प्रारंभ करें जैसा कि पहले Danalache et al.29 द्वारा वर्णित किया गया था।
    2. तरल माप के लिए एक उपयुक्त ग्लास ब्लॉक कैंटिलीवर धारक का चयन करें और इसे एएफएम सिर पर ध्यान से रखें। एक लॉकिंग तंत्र एएफएम हेड में ग्लास ब्लॉक को सुरक्षित करता है। सुनिश्चित करें कि ग्लास ब्लॉक की परावर्तक सतह एएफएम धारक के सीधे और समानांतर है।
    3. कैंटिलीवर को ग्लास ब्लॉक कैंटिलीवर धारक की सतह पर देखभाल के साथ रखें। कैंटिलीवर को ग्लास ब्लॉक के केंद्र में, पॉलिश किए गए ऑप्टिकल प्लेन पर आराम करना चाहिए।
    4. एएफएम सिर में मध्यम संघनन को रोकने के लिए कैंटिलीवर धारक के आधार पर एक सिलिकॉन स्कर्ट (सिलिकॉन झिल्ली) को ध्यान से रखें।
    5. स्टेपर मोटर फ़ंक्शन का उपयोग करके कैंटिलीवर को 100 μm चरणों में कम करें जब तक कि यह माध्यम में पूरी तरह से जलमग्न न हो जाए।
    6. Danalache et al.29 द्वारा वर्णित दृष्टिकोण मापदंडों के साथ एक स्कैनर दृष्टिकोण चलाएँ। पेट्री डिश के तल तक पहुंचने के बाद कैंटिलीवर को 100 μm से वापस ले लें।
    7. सटीक चरणों का उपयोग करके कैंटिलीवर को कैलिब्रेट करें और दनालाचे एट अल .29 द्वारा वर्णित मापदंडों को चलाएं। अंशांकन के अंत में, ऊर्ध्वाधर विक्षेपण को सहेजा जाता है और वोल्ट (वी) के बजाय न्यूटन (एन) बल की इकाइयों में प्रदर्शित किया जाता है - फोटोडायोड डिटेक्टर द्वारा मूल पंजीकरण की इकाई। यहां प्रयोगों में, अंशांकन के बाद 4.47 एनएन का एक निर्धारित बिंदु हुआ।
    8. स्टेपर मोटर फ़ंक्शन का उपयोग करके, कैंटिलीवर को 1,000 μm पर वापस ले लें।
  4. एएफएम के तहत वांछित उपास्थि माप स्थल की पहचान करना
    नोट: कार्टिलेज डिस्क की 1 मिमी मोटाई के कारण, नमूने पर नेविगेट करते समय कैंटिलीवर दृश्य के क्षेत्र में दिखाई नहीं देता है।
    1. कैंटिलीवर की पहचान करने के लिए माइक्रोस्कोप के सीसीडी कैमरे का उपयोग करें। एएफएम कैंटिलीवर को पेट्री डिश के नमूना-मुक्त क्षेत्र में तैनात किया जाना चाहिए।
    2. दनालाचे एट अल .29 द्वारा वर्णित समान मापदंडों का उपयोग करके, पेट्री डिश के एक स्वच्छ, नमूना-मुक्त क्षेत्र पर कैंटिलीवर के साथ एक स्कैनर दृष्टिकोण शुरू करें।
    3. आगे स्टेपर मोटर नियंत्रण के साथ प्लेट के नीचे से कैंटिलीवर को 1.5 मिमी दूर वापस ले लें। कैंटिलीवर और नमूने के बीच सीधी टक्कर से बचने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है।
    4. ब्राइटफील्ड से फ्लोरेसेंस व्यू पर स्विच करें और डिस्क के शीर्ष को नेत्रहीन रूप से पहचानें।
    5. एएफएम नमूना धारक को डिस्क के बीच की ओर ठीक 2 मिमी ले जाएं। इस बिंदु को कार्टिलेज डिस्क का केंद्र माना जाता है।
    6. एक स्कैनर दृष्टिकोण चलाएं और, एक बार उपास्थि डिस्क की सतह तक पहुंचने के बाद, कैंटिलीवर को 100 μm से वापस ले लें।
  5. बल-दूरी वक्र माप
    1. वांछित माप साइट में स्थित कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें। माप और लक्षित स्थिति में बल-दूरी वक्रों की पीढ़ी शुरू करने के लिए रन बटन पर क्लिक करें।
    2. प्रत्येक माप स्थल पर पांच बल-दूरी वक्र प्राप्त करें। कैंटिलीवर को 500 μm से वापस लें और कैंटिलीवर को अगले मापने वाले स्थान पर ले जाएं।
      नोट: कैंटिलीवर की वापसी एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि उपास्थि डिस्क की सतह समरूप नहीं है और इसमें अनियमितताएं हैं। नमूने की सतह पर एक ऊंची पहाड़ी के परिणामस्वरूप एक नाटकीय टक्कर हो सकती है, जिससे अवांछित कैंटिलीवर टिप / नमूना क्षति हो सकती है। हम डिस्क की सतह पर फैले न्यूनतम पांच अलग-अलग माप स्थलों का चयन करने और प्रत्येक साइट पर न्यूनतम पांच बल-दूरी वक्र प्राप्त करने की सलाह देते हैं।
    3. बल-दूरी मोड़ों का निरीक्षण करें और उन्हें सहेजें।
  6. हर्ट्ज फिट मॉडल का उपयोग करके यंग के मोडुलिन का अनुमान
    1. स्पेक्ट्रोस्कोपी कर्व्स के एक बैच को खोलें विकल्प का उपयोग करके डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण किए जाने के लिए जेनरेट किए गए बल-दूरी वक्र (.jpk फ़ाइल) खोलें।
    2. हर्ट्ज फिट मॉडल का चयन करें और फिर लोच फिट विकल्प का चयन करें।
      1. लोच फिट विकल्प स्वचालित रूप से चयनित बल-दूरी वक्र पर निम्नलिखित गणना करता है: बेसलाइन की गणना करता है और बेसलाइन ऑफसेट को हटाने के लिए पूरे वक्र से घटाता है (बेसलाइन को वाई-अक्ष पर शून्य पर वापस लाया जाता है); उस बिंदु का पता लगाकर संपर्क बिंदु निर्धारित करता है जहां बल-दूरी वक्र शून्य बल-रेखा को पार करता है (संपर्क बिंदु एक्स-अक्ष पर शून्य पर सेट है); टिप-नमूना पृथक्करण की गणना करता है (कैंटिलीवर के झुकने के लिए पीजो की ऊंचाई संकेत घटाया जाता है); और चयनित मॉडल के साथ स्वचालित रूप से बल-दूरी वक्र फिट बैठता है। यदि वांछित हो, तो इनमें से प्रत्येक चरण स्वतंत्र रूप से भी किया जा सकता है।
    3. निम्नलिखित फिट मापदंडों का उपयोग करके अनुकूलन करें: 0.5 का पॉइसन अनुपात और उपयुक्त कैंटिलीवर टिप त्रिज्या।
      नोट: गोलाकार कैंटिलीवर टिप के साथ कैंटिलीवर का उपयोग करते समय, हर्ट्ज फिट मॉडल का उपयोग किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले कैंटिलीवर में 5 μm की त्रिज्या के साथ एक गोलाकार नोक थी। हम बल-दूरी वक्र को तब तक फिट करने की सलाह देते हैं जब तक कि अधिकतम लागू बल (सेटपॉइंट) तक नहीं पहुंच जाता।
    4. शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए बल-दूरी वक्र फिट को नेत्रहीन रूप से जांचें। यह चरण विश्लेषण किए गए बल-दूरी वक्रों में से प्रत्येक के लिए किया जाना है।
  7. इंडेंटेशन गहराई निर्धारण
    नोट: उपयोग किए जा रहे डेटा विश्लेषण उपकरण के आधार पर, यह प्रक्रिया भिन्न हो सकती है। प्रयोगकर्ता डेटा विश्लेषण कार्यक्रम में शामिल चरणों की एक श्रृंखला का पालन करके आसानी से इंडेंटेशन गहराई को पढ़ सकता है।
    1. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में उत्पन्न बल-दूरी वक्रों में से प्रत्येक को खोलें और विश्लेषण प्रक्रिया के रूप में हर्ट्ज फिट मॉडल का चयन करें।
    2. ऊर्ध्वाधर विक्षेपण अक्ष (वाई-अक्ष) को शून्य करने के लिए बेसलाइन ऑफसेट घटाना विकल्प लागू करें और ऑफसेट + टिल्ट फ़ंक्शन का चयन करें।
    3. संपर्क बिंदु को स्वचालित रूप से पहचानने के लिए संपर्क बिंदु खोजें फ़ंक्शन का उपयोग करें, जिसे स्वचालित रूप से शून्य के x-समन्वय पर लाया जाता है।
    4. ऊर्ध्वाधर टिप पोजिशन फ़ंक्शन का उपयोग करके इंडेंटेशन के दौरान कच्चे पीजो ऊंचाई से कैंटिलीवर विक्षेपण के लिए पूरी तरह से दूरी घटाएं।
    5. संसाधित बल-दूरी वक्र प्रदर्शित करने के लिए लोच फिट विकल्प का चयन करें और ग्राफ़ के क्षेत्र का चयन करें ताकि यह ऊर्ध्वाधर टिप स्थिति अक्ष (एक्स-अक्ष) पर सबसे अधिक नकारात्मक मान के साथ पंक्तिबद्ध हो।
    6. पैरामीटर टैब में X Min बॉक्स से इंडेंटेशन पढ़ें और दस्तावेज़ करें. परिणामों को सहेजें और दस्तावेज़ करें.

4. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर खोलें। ड्रॉप-डाउन मेनू से नया डेटासेट चुनें.
  2. DataSet फ़ाइल का चयन करने के बाद चर दृश्य टैब खोलें। प्रत्येक सेलुलर पैटर्न श्रेणी के लिए संख्यात्मक चर को परिभाषित करें: एकल स्ट्रिंग = एसएस, डबल स्ट्रिंग्स = डीएस, छोटे क्लस्टर = एससी, बड़े क्लस्टर = बीसी, डिफ्यूज और यंग का मोडुलिन।
  3. डेटा दृश्य टैब में, संबंधित सेलुलर पैटर्न श्रेणियों में से प्रत्येक के लिए मापा गया यंग का मोडुलिन डेटा दर्ज करें। मेनू पट्टी से विश्लेषण करें का चयन करके डेटा वितरण का विश्लेषण करें, और फिर खोजपूर्ण डेटा विश्लेषण.
  4. निर्भर चर के रूप में यंग के मोडुलिन और कारक सूची के रूप में सेलुलर पैटर्न का चयन करें। परिणाम अनुभाग के लिए उपयोग किया जाने वाला बॉक्स प्लॉट आउटपुट फ़ाइल में परिणामों के बीच प्रदर्शित होता है.
  5. सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए, विश्लेषण मेनू बार टैब के गैर-पैरामीट्रिक परीक्षण अनुभाग में निर्भर नमूने चुनें। फ़ील्ड टैब के तहत टेस्ट फ़ील्ड के रूप में यंग के मोडुलिन और समूहों के रूप में सेलुलर पैटर्न का चयन करें।
    नोट:: परिणाम आउटपुट फ़ाइल में प्रदर्शित होते हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, एक फ्रीडमैन परीक्षण किया जाता है।
  6. चरण 4.4 में बनाए गए बॉक्स प्लॉट में गैर-पैरामीट्रिक परीक्षण के पी-मानों को शामिल करें। मेनू बार में फ़ाइल क्लिक करके और सहेजें का चयन करके परिणाम सहेजें.

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Representative Results

एक स्व-निर्मित कटिंग डिवाइस का उपयोग करके, हम ताजा मानव कोंडिल से छोटे (4 मिमी x 1 मिमी) उपास्थि डिस्क को खोजने और उत्पन्न करने में सक्षम थे, जिसमें एकल स्ट्रिंग (एसएस, चित्रा 2 ए), डबल स्ट्रिंग्स (डीएस), छोटे क्लस्टर (एससी), बड़े क्लस्टर (बीसी) के एकल सेलुलर स्थानिक पैटर्न30 शामिल थे। चित्रा 2 ए), और फैलाव (चित्रा 2 बी)। एक प्रतिनिधि उपास्थि खोज को चित्र 3 ए में दर्शाया गया है। केवल एक प्रकार के पैटर्न को प्रदर्शित करने वाली डिस्क का चयन टॉप-डाउन फ्लोरेसेंस इमेजिंग (चित्रा 2) का उपयोग करके किया गया था। कार्टिलेज सतह डिस्क की स्थलाकृतिक भिन्नता को उपास्थि डिस्क (चित्रा 2 सी) से उत्पन्न 60 μm मोटे वर्गों के साइड-व्यू इमेजिंग द्वारा चित्रित किया गया था। खोजी गई ओस्टियोआर्थ्रिटिक कार्टिलेज डिस्क की सतह पर, सतही फाइब्रिलेशन और मैट्रिक्स क्लेफ्टिंग मौजूद थे (चित्रा 3 बी, सी)। यह बीसी (चित्रा 2 ए) की उपस्थिति द्वारा दर्शाए गए उन्नत ओए प्रगति के डिस्क प्रतिनिधि में विशेष रूप से उल्लेखनीय था। पोस्ट-फ्लोरेसेंस सॉर्टिंग के बाद, एएफएम माइक्रो-इंडेंटेशन द्वारा डिस्क की कठोरता का आकलन किया गया था। इसके लिए, उत्पन्न उपास्थि डिस्क को माप के दौरान नमूना बहने से बचने के लिए बायोकंपैटिबल गोंद (चित्रा 3 डी) के माध्यम से एएफएम पेट्री डिश में सफलतापूर्वक तय किया गया था (चित्रा 3 ई)। उपयोग किए गए गोंद की मात्रा को समायोजित किया जाना चाहिए। गोंद की अपर्याप्त मात्रा के परिणामस्वरूप डिस्क अस्थिरता होगी, जबकि बहुत अधिक गोंद जोड़ने से कार्टिलेज डिस्क के नीचे और / या उसके ऊपर गोंद का अवांछित प्रसार हो सकता है। उत्तरार्द्ध प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत माप कलाकृतियों और डिस्क की खराब पहचान की ओर जाता है। निर्धारण के दौरान नमूने के अपर्याप्त गोंद आवेदन या अचानक आंदोलन अक्सर मुद्दे होते हैं जो ऊतक को पेट्री डिश से अलग करने का कारण बनते हैं और इससे बचा जाना चाहिए।

सेलुलर पैटर्न व्यवस्था के साथ एक प्रतिनिधि क्रमिक कठोरता में कमी चित्रा 4 ए में प्रदर्शित की गई है। एसएस (2.6 केपीए का औसत) युक्त डिस्क में कठोरता मान अधिक थे - जो बिना समझौता किए हुए स्वस्थ उपास्थि क्षेत्रों का प्रतिनिधि था। ओए की शुरुआत और प्रगति के साथ, एएफएम माप ने डीएस (1.5 केपीए) में 42%, एससी (0.6 केपीए) में 77% की कठोरता में एक मजबूत चरणबद्ध कमी दिखाई, और अंततः, बीसी (0.3 केपीए) द्वारा दर्शाए गए उन्नत चरणों में 88%; चित्रा 4 ए)। एक डिफ्यूज पैटर्न वाले डिस्क ने यंग के मापांक एकल मूल्यों की एक महत्वपूर्ण भिन्नता के साथ एक ऊंचा लोच प्रदर्शित किया। निर्दिष्ट प्रमुख सेलुलर पैटर्न संगठन के साथ सभी उपास्थि डिस्क के लिए, नियोजित सेटपॉइंट (4.477 एनएन) से जुड़ी इंडेंटेशन गहराई कठोरता के व्युत्क्रमानुपाती पाई गई (चित्रा 4 बी)। एक प्रतिनिधि उत्पन्न बल-दूरी वक्र चित्रा 4 सी में दिखाया गया है, और एक हर्ट्ज फिट के साथ-साथ संपर्क बिंदु की पहचान चित्रा 4 डी में दिखाई गई है।

सही फिट, अन्य कारकों के बीच, बेसलाइन के सही निर्धारण पर निर्भर करता है। यदि स्वचालित बेसलाइन डिटेक्शन गलत है (उदाहरण के लिए, एक अशांत आधार रेखा के कारण), फिट को मैन्युअल रूप से भी निर्धारित किया जा सकता है, और यह उपयोगकर्ता को माप के लिए अधिक प्रतिनिधि आधार रेखा का चयन करने की अनुमति देता है। हालांकि, यदि उत्पन्न बल-दूरी वक्र उचित फिट की अनुमति नहीं देता है, तो इसे त्यागना होगा। चित्र 5 गलत बल-दूरी वक्रों के उदाहरण दिखाता है। ओस्टियोआर्थ्रिटिक आर्टिकुलर कार्टिलेज एक्सप्लेंट पर उपयुक्त बल-दूरी वक्र उत्पन्न करना एक तरफ ऊतक की अनियमित सतह के कारण मुश्किल हो सकता है (उदाहरण चित्रा 5 ए, बी में दिखाए गए हैं), और अनुचित नमूना निर्धारण के कारण नमूने की अस्थिरता (उदाहरण चित्रा 5 सी, डी में प्रदर्शित)। कलाकृतियां कई जांच-नमूना संपर्क बिंदुओं (विघटित उपास्थि की असमान सतह के कारण) या अवांछित ऊतक आंदोलन (फोकल प्लेन में परिवर्तन के माध्यम से दिखाई देने के कारण) के कारण हो सकती हैं। इन कलाकृतियों को उत्पन्न बल-दूरी वक्रों में देखा जा सकता है और या तो एएफएम कैंटिलीवर और उपास्थि की सतह के बीच एक उप-मानक संपर्क या पेट्री डिश के लिए अनुचित नमूना निर्धारण का संकेत है (चित्रा 5 ए-डी देखें)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट। कालानुक्रमिक क्रम में प्रयोगात्मक चरणों का सारांश, इंट्राऑपरेटिव रूप से निकाले गए उपास्थि नमूनों से शुरू होकर 4 मिमी x 1 मिमी उपास्थि डिस्क की पीढ़ी तक, फ्लोरेसेंस धुंधला होना और टॉप-डाउन और साइड-व्यू इमेजिंग के माध्यम से सेलुलर पैटर्न संगठन के आधार पर डिस्क की छंटाई, और अंततः, परमाणु बल माप के माध्यम से लोच मूल्यांकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि उपास्थि डिस्क की प्रतिदीप्ति इमेजिंग। (ए) मोज़ेक 2 डी छवियां और 100 x आवर्धन पर कोशिका झिल्ली पारगम्य डाई से सना हुआ उपास्थि डिस्क का एक ज़ूम अनुकरणीय क्षेत्र। शीर्ष डिस्क एक प्रतिनिधि एकल स्ट्रिंग डिस्क प्रदर्शित करती है, जबकि निचली एक बड़ी क्लस्टर डिस्क (नीचे) का प्रतिनिधि है। (बी) सतह (ऊपर) से देखी गई एक डिफ्यूजपैटर्न डिस्क की मोज़ेक तस्वीर, और नीचे (नीचे) से चित्रित एक ही डिस्क। (सी) कार्टिलेज डिस्क के 60 μm स्लाइस के परमाणु धुंधलापन का साइड व्यू। सफेद स्केल बार मोज़ेक चित्रों के लिए 500 μm का प्रतिनिधित्व करता है (देखने का बड़ा क्षेत्र, A [बाएं पैनल], B, C) और ज़ूम इन, केंद्रित चित्रों (A[दाएं पैनल]) के लिए 100 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: कृत्रिम उपास्थि डिस्क का पता लगाया। (ए) ताजा मानव आर्टिकुलर कार्टिलेज से उत्पन्न 4 मिमी x 1 मिमी उपास्थि डिस्क खोज की प्रतिनिधि छवि। (बी) देशी ऑस्टियोआर्थ्रिटिक उपास्थि की प्रतिनिधि छवि जहां ऊतक की सतह मैक्रोस्कोपिक रूप से दिखाई देने वाले सतही फाइब्रिलेशन और क्लेफ्टिंग प्रस्तुत करती है। सफेद रंग में चित्रित स्केल बार 1,000 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) एएफएम माप ों से पहले, प्रत्येक कार्टिलेज डिस्क एक्सप्लेंट को एएफएम पेट्री डिश की सतह पर जैव-संगत नमूना गोंद के माध्यम से ठीक से तय किया गया था ताकि वास्तविक इंडेंटेशन माप के दौरान नमूना बहने के कारण कलाकृतियों से बचा जा सके जैसा कि (ई) में दिखाया गया है। सफेद स्केल बार 4 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: आर्टिकुलर कार्टिलेज डिस्क के परमाणु बल माइक्रोस्कोपी माप के प्रतिनिधि परिणाम उनके प्रमुख सेलुलर पैटर्न संगठन के आधार पर क्रमबद्ध हैं। (ए) बॉक्सप्लॉट पांच डिस्क के गणना किए गए यंग के मोडुलिन के औसत को प्रदर्शित करता है, प्रत्येक सेलुलर पैटर्न के लिए एक, जो एक रोगी से उत्पन्न होता है। प्रत्येक डिस्क पर कुल 25 माप किए गए (पांच अलग-अलग माप साइटों के लिए पांच माप)। आयत के अंदर काली रेखा औसत मान का प्रतिनिधित्व करती है, आयत के निचले और ऊपरी छोर क्रमशः पहले और तीसरे चतुर्थक का प्रतिनिधित्व करते हैं, और त्रुटि पट्टियाँ प्रत्येक समूह के लिए सबसे कम और उच्चतम मूल्यों का प्रतिनिधित्व करती हैं। (बी) प्रत्येक सेलुलर पैटर्न के लिए 125 इंडेंटेशन गहराई बिंदुओं को दर्शाने वाला पॉइंट-प्लॉट। (ग) एएफएम के साथ प्राप्त अनुकरणीय बल-दूरी वक्र ों की गणना यंग के मापांक 0.4 केपीए के साथ की जाती है। (डी) (सी) में दिखाए गए बल-दूरी वक्र के लिए एक प्रतिनिधि हर्ट्ज फिट और संपर्क बिंदु निर्धारण। एक्स-अक्ष ऊर्ध्वाधर टिप स्थिति प्रदर्शित करता है (जो कि पीजो द्वारा पार की गई दूरी है, जिसमें कैंटिलीवर झुकने के लिए लंबाई बल-दूरी वक्र के संपर्क भाग से स्वचालित रूप से घटाया जाता है)। * पी < 0.05. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, फ्रीडमैन परीक्षण का उपयोग किया गया था। संक्षेप: एसएस = एकल तार; डीएस = डबल स्ट्रिंग्स; एससी = छोटे समूह; बीसी = बड़े समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: त्रुटिपूर्ण बल-दूरी वक्रों के उदाहरण । (ए) बल-दूरी वक्र सतह के निरंतर इंडेंटेशन से पहले बेसलाइन स्तर के पास वसूली के बाद एक बड़े विचलन को दर्शाता है। इस घटना को अपेक्षाकृत बड़ी बाधा के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है (उदाहरण के लिए, उपास्थि की सबसे ऊपरी परत से बड़ी सतह की फांकें उभरी हुई हैं)। (बी) विस्तारित बल-दूरी वक्र कई छोटी चोटियों को दर्शाता है। इन वक्रों को उपास्थि की सतह (जैसे, फाइब्रिलेशन) पर सूक्ष्म पैमाने पर अनियमितताओं के कारण माना जाता है। दोनों (सी) और (डी) द्विध्रुवीय पाठ्यक्रमों के साथ बल-दूरी वक्र प्रदर्शित करते हैं। दोनों बल-दूरी वक्र खराब नमूना निर्धारण और नमूना बहाव के प्रतिनिधि हैं। इन मामलों में फोकल प्लेन में अचानक बदलाव देखना भी काफी आम है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एक प्रगतिशील और बहुक्रियात्मक बीमारी के रूप में, ओए आर्टिकुलर कार्टिलेज में संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों को ट्रिगर करता है। ओए के दौरान, यांत्रिक विशेषताओं में हानि आर्टिकुलर कार्टिलेज27,31 की सतह पर संरचनात्मक और जैव रासायनिक परिवर्तनों के साथ होती है। ओए में होने वाली शुरुआती पैथोलॉजिकल घटनाएं कोलेजन नेटवर्क व्यवधान32,33,34 के साथ युग्मित प्रोटिओग्लाइकन की कमी हैं। इस तरह के शुरुआती सूक्ष्म सतह परिवर्तनों को थोक परीक्षण के साथ इंगित करना और पहचानना मुश्किल है, क्योंकि यांत्रिक व्यवहार पूरे ऊतक की गहराई पर औसत है। इसके अतिरिक्त, अभी भी एक अनसुलझा सवाल यह है कि क्या अंग और ऊतक स्तरों पर कार्यात्मक परिवर्तन सूक्ष्म या नैनो-स्केल संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों से संबंधित हैं। इसके लिए, एएफएम को सबसे संवेदनशील तरीकों में से एक माना जाता है, जो ओए ऑनसेट7 के साथ होने वाले शुरुआती बायोमेकेनिकल परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम है। यह देशी नमूनों में सूक्ष्म और नैनोमीटर दोनों तराजू पर कठोरता माप की अनुमति देता है, जो आर्टिकुलर कार्टिलेज35,36 के यांत्रिक गुणों पर जानकारी प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में, माइक्रो-एएफएम इंडेंटेशन का उपयोग करके, हमने स्वस्थ और ऑस्टियोआर्थ्रिटिक आर्टिकुलर कार्टिलेज मानव खोजों के लोचदार गुणों को मापा। परिणामों से पता चला है कि कार्टिलेज एक्सप्लेंट प्रारंभिक स्थानीय ओए घटनाओं का अत्यधिक प्रतिनिधि हैं, जिसमें पैटर्न-विशिष्ट उपास्थि खोजों में होने वाली कठोरता में उल्लेखनीय क्रमिक कमी आई है। इसके अलावा, परिणाम पिछले प्रकाशित शोध के अनुरूप हैं जो सेलुलर पैटर्न संगठन23,24,27,37 के साथ उल्लेखनीय कठोरता में कमी दिखाते हैं।

ओए रोगजनन और प्रगति के विभिन्न पहलुओं की नकल करने वाले मूल मानव मॉडल की पुष्टि वर्तमान में ट्रांसलेशनल अनुसंधान की कमी और नैदानिक सेटिंग में इन विट्रो डेटा का अनुवाद करने की चुनौतियों को संबोधित करने के लिए आवश्यक है। आज तक, कोई भी मॉडल जटिल देशी मानव उपास्थि डिब्बे का सटीक रूप से प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है, उम्र से संबंधित संयुक्त ऊतकों की बात तो छोड़ ही दें, जो रोग शुरू करने वाली उत्तेजनाओं के जवाब में ओए से ग्रस्तहैं। अब तक सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले खोज-आधारित मॉडल गोजातीय या मवेशी मूल के थे और या तो एक मजबूत भड़काऊ साइटोकिन उपचार या यांत्रिक लोडिंग 39,40,41 लागू करते थे। दूसरी ओर, यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि छोटे (4 मिमी x 1 मिमी) खोजे गए डिस्क के आकार के मानव उपास्थि के नमूने कैसे उत्पन्न किए जाएं, जो विशिष्ट ओए घटनाओं के व्यक्तिगत चरणों का संकेत हैं। कार्टिलेज खोजों को क्रमबद्ध किया जाता है और सेलुलर स्थानिक संगठन का उपयोग करके छवि-आधारित बायोमार्कर30,42 के रूप में चरण सौंपा जाता है। चूंकि बायोमेकेनिकल गुणों में शुरुआती परिवर्तनों को पहले से ही पहचाना और परिमाणित किया जा सकता है जैसे ही डबल स्ट्रिंग्स23,27 उत्पन्न होने लगते हैं, एक ऐसे चरण में जहां उपास्थि की सतह अभी भी मैक्रोस्कोपिक रूप से बरकरार दिखाई देती है, यह खोज-आधारित मॉडल एक स्थानीय देशी उपास्थि डिब्बे की जांच की अनुमति देता है और प्रारंभिक ओए पर व्यावहारिक जानकारी प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, यह उपास्थि मॉडल38,39 में यांत्रिक और भड़काऊ परिवर्तनों के लिए कोशिकाओं और मैट्रिक्स प्रतिक्रिया की जांच में उपयोगी हो सकता है। अपेक्षाकृत सरल और उत्पन्न करने में आसान होने के कारण, इन उपास्थि खोजों का उपयोग ओए विषमता का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है, जो रोग-संशोधित ओए दवाओंके विकास और परीक्षण में एक सीमित कारक है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि संयुक्त प्रतिस्थापन सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों पर स्केलेबिलिटी और निर्भरता मॉडल की दो कमियां हैं।

यह सर्वविदित है कि आर्टिकुलर कार्टिलेज परीक्षण किए गए पैमाने के स्तर के आधार पर एक अजीब व्यवहार प्रस्तुत करता है। जैसा कि लोपरिक एट अल द्वारा इंगित किया गया है, सूक्ष्म पैमाने पर, उपास्थि एक गैर-संरचित और समान सामग्री35 के रूप में व्यवहार करती है, और इस तरह के दृष्टिकोण से स्थानीयकृत समग्र उपास्थि कठोरता का अनुमान मिलता है। माइक्रो- या नैनो-इंडेंटेशन बेहतर अनुकूल हैं या नहीं, इसके संबंध में, स्टोल्ज़ एट अल .44 द्वारा 2004 के एक अध्ययन ने आर्टिकुलर कार्टिलेज की संरचना-यांत्रिक गुणों का आकलन करने में सूक्ष्म और नैनो-स्केल इंडेंटेशन दोनों की तुलना की। लेखकों ने जोर दिया कि आर्टिकुलर कार्टिलेज के माइक्रो-स्केल गोलाकार इंडेंटेशन के लिए, नैनो-स्केल फाइन स्ट्रक्चरल घटक (यानी, व्यक्तिगत कोलेजन फाइबर और प्रोटिओग्लाइकेन्स) आमतौर पर लोड असर के कार्य को साझा करते हैं। इस प्रकार, कुल यांत्रिक गुण व्यक्तिगत नैनोघटकों से स्पष्ट रूप से भिन्न होते हैं। उन्हीं लेखकों ने प्रस्तावित किया कि सूक्ष्म और नैनो-इंडेंटेशन के संयोजन का उपयोग आर्टिकुलर कार्टिलेज के समग्र स्थानीय कठोरता प्रोफाइल का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, साथ ही साथ ठीक संरचनात्मक घटकों से संबंधित कठोरता44।

कई एएफएम-आधारित इंडेंटेशन प्रयोगों ने उपास्थि यांत्रिकी का आकलन करने के लिए तेज पिरामिड कैंटिलीवर युक्तियों (त्रिज्या = 15-20 एनएम) 22,36,44 का उपयोग किया है। यद्यपि तेज कैंटिलीवर के साथ नैनोइंडेंटेशन को वर्तमान में बेहतरीन यांत्रिक गुणों का आकलन करने के लिए अधिक उपयुक्त माना जाता है, गोलाकार कैंटिलीवर युक्तियां ऐसे परिणाम उत्पन्न करती हैं जो नरम जैविक नमूनोंका परीक्षण करते समय मॉडल और व्याख्या करने के लिए अधिक सुसंगत और आसान होते हैं। इसके अलावा, स्टोल्ज़ एट अल ने प्रदर्शित किया कि एंजाइमेटिक रूप से (यानी, इलास्टेस) अवक्रमित आर्टिकुलर कार्टिलेज के एएफएम नैनो-इंडेंटेशन संभव नहीं हैं क्योंकि ऊतक इतना चिपचिपा हो जाता है कि टिप-नमूना आसंजन बल-दूरी वक्रों पर हावी हो जाता है, जिससे डेटा अव्यवहार्यहो जाता है।

वर्तमान एएफएम माप में, 5 μm त्रिज्या के गोलाकार कैंटिलीवर टिप के साथ एक कैंटिलीवर का उपयोग किया गया था। कैंटिलीवर विकल्प उपास्थि की सतह पर लगाए गए नुकसान को कम करते हुए काफी बड़ी सतह पर ऊतक के यांत्रिक गुणों को औसत करने के इरादे से प्रेरित था। कैंटिलीवर-लागू बल और परिणामस्वरूप नमूना इंडेंटेशन के बीच संबंध हर्ट्ज फिट मॉडल के साथ फिट किया गया था। गोलाकार इंडेंटर्स का उपयोग करते समय, हर्ट्ज फिट मॉडल की सिफारिश की जाती है, जिसमें कैंटिलीवर टिप और नमूना सतह के बीच काम करने वाले आकर्षक बलों कीउपेक्षा की जाती है। हर्ट्ज़ियन मॉडल के समीकरण Eq.1 और Eq.2 में दिखाए गए हैं।

Equation 1Eq.1

Equation 2Eq.2

जहां एफ = बल; ई = यंग का मापांक; v = पॉइसन का अनुपात; δ = इंडेंटेशन; ए = संपर्क सर्कल की त्रिज्या; और Rs = गोले की त्रिज्या।

मॉडल अंततः सेलुलर / ऊतक लोच47 की गणना करता है, जिसे औपचारिक रूप से यंग के मापांक (ई) के रूप में व्यक्त किया जाता है। हर्ट्ज फिट मॉडल कई विशेषताओं को ध्यान में रखता है जैसे कि टिप आकार और आकार, इंडेंटेशन और नमूना विकृति। यदि इन आवश्यकताओं को आदर्श रूप से पूरा नहीं किया जाता है, तो मॉडल यंग के मापांक46 का गलत अनुमान प्रदान कर सकता है।

हर्ट्ज फिट मॉडल मानता है कि तनाव और लोचदार तनाव लोचदार मापांक पर रैखिक रूप से निर्भर करता है, जिसका अर्थ है कि नमूने में इंडेंटेशन नमूना मोटाई46 की तुलना में बहुत छोटा रहता है। इस धारणा को इस सेटअप में आसानी से पूरा किया गया था, जहां कुछ माइक्रोमीटर के इंडेंटेशन की तुलना में कार्टिलेज एक्सप्लेंट की मोटाई 1 मिमी थी।

आर्टिकुलर कार्टिलेज को एक छिद्रपूर्ण विस्कोस्टिक सामग्री48,49 के रूप में मॉडलिंग किया जा सकता है। साइटोप्लाज्मिक या मैट्रिक्स घटकों जैसे अणुओं, ऑर्गेनेल और कोलेजन-प्रोटिओग्लाइकन नेटवर्क50,51 के बीच घर्षण के परिणामस्वरूप विस्कोस्टिक व्यवहार होता है। जैसा कि नाम से ही स्पष्ट है, विस्कोस्टिक सामग्री दो अलग-अलग गुणों को जोड़ती है: चिपचिपा-बाहरी भार के अधीन होने पर सामग्री धीरे-धीरे विकृत हो जाती है- और लोचदार- लागू भारको हटाने के बाद सामग्री अपने प्रारंभिक विन्यास में वापस आ जाती है। विस्कोस्टिक व्यवहार इस अध्ययन में प्राप्त किए गए लोगों के समान,बल-दूरी वक्रों 46,52 में दृष्टिकोण (विस्तारित) और वापसी वक्रों के बीच एक हिस्टैरिसीस के रूप में प्रकट होता है (चित्रा 4 सी)। इसके अलावा, विस्कोस्टिक सामग्री की एक विशेषता यह है कि उनके यांत्रिक गुण विरूपण दर पर निर्भर करते हैं, सामग्री की कठोरता उस दर के साथ बढ़ती है जिस पर लोडिंग लागू होती है (इंडेंटेशन गति)54। इस प्रकार, विभिन्न लोडिंग दरों का चयन करके, बल-दूरी वक्रों का एक परिवार उत्पन्न होता है, जिनमें से प्रत्येक प्रत्येक लोडिंग दर52 पर परीक्षण किए गए नमूने के यांत्रिक गुणों का प्रतिनिधित्व करता है। इसलिए, विभिन्न कार्यों के परिणामों की तुलना करने का प्रयास करते समय, सभी इंडेंटेशन मापदंडों को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है। कुल मिलाकर, माइक्रोमीटर पैमाने पर मापने पर (जैसा कि इस अध्ययन में 5 μm गोलाकार कैंटिलीवर टिप के साथ), आर्टिकुलर कार्टिलेज एक गैर-संरचित और समान सामग्री के रूप में व्यवहार करता है, जिससे एक संचयी लोचदार मापांक उत्पन्न होता है जिसमें ऊतक35 की पोरोविस्कोस्टिक प्रकृति के कारण कठोरता के लिए लोचदार और चिपचिपा योगदान दोनों शामिल होते हैं।

हर्ट्ज़ियन मॉडल की एक और धारणा यह है कि इंडेंटेशन गहराई गोलाकार कैंटिलीवर टिप55 की त्रिज्या से कम है। इंडेंटेशन गहराई नमूने के साथ पहले संपर्क के बाद कैंटिलीवर टिप के अधिकतम विस्थापन का प्रतिनिधित्व करती है। अधिकतम भार पर, अधिकतम इंडेंटेशन गहराई नमूना और कैंटिलीवर टिप का समग्र विस्थापन है। ब्यूकल के दिशानिर्देश मेंपूरे 56 में एक ही संरचना के साथ एक नमूने की समग्र मोटाई के 10% की अधिकतम इंडेंटेशन गहराई बताई गई है, अन्यथा, परिणाम गहराई-से-मोटाई अनुपात के अनुसार भिन्न होते हैं। 5 μm के कैंटिलीवर टिप त्रिज्या के लिए, इस अध्ययन में कार्टिलेज एक्सप्लेंट को औसतन 1.1 μm पर इंडेंटेड किया गया था, जिसमें कुछ उदाहरणों में 3 μm की कुछ चोटियां थीं, विशेष रूप से अत्यधिक विघटित उपास्थि खोजों के लिए। इस मामले में, एक समझौता मांगा गया था, क्योंकि, प्रयोगात्मक सेटिंग में, बड़े इंडेंटेशन से जुड़े अपेक्षाकृत उच्च बलों को विघटित उपास्थि की सतह अनियमितताओं को बेअसर करने की आवश्यकता होती है। एक हल्के इंडेंटेशन के परिणामस्वरूप सतही फाइब्रिलेशन और कोलेजन फिसरिंग की परीक्षा होगी, जो दोनों अत्यधिक विघटित उपास्थि57 की सामान्य विशेषताएं हैं।

हर्ट्ज फिट मॉडल के लिए महत्वपूर्ण उस बिंदु की सही पहचान भी है जिस पर कैंटिलीवर टिप नमूने के साथ सीधे संपर्क में आता है, जिसे सामान्य रूप से संपर्क बिंदु कहा जाता है। हालांकि, यह बहुत चिपचिपे या बहुत नरम नमूनों की मांग करते समय समस्याग्रस्त हो सकता है, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप कई जांच-नमूना संपर्क बिंदु58,59 हो सकते हैं। वास्तव में, जैसा कि ए-हसन एट अल द्वारा अच्छी तरह से जोर दिया गया है, नरम जैविक ऊतकों के लिए, संपर्क के बिंदु का सटीक निर्धारण सबसेपरेशान समस्याओं में से एक है। यह प्रभाव देशी ओस्टियोआर्थ्रिटिक कार्टिलेज खोजों में भी देखा गया था, क्योंकि, अध: पतन के चरण के आधार पर, ऊतक की सतह अपनी मूल यांत्रिक विशेषताओं को खो देती है और अक्सर असमान होती है, सतही फाइब्रिलेशन और क्लेफ्टिंग पेश करती है (चित्रा 3 बी, सी)। इस घटना को विशेष रूप से उपास्थि खोजों में नोट किया गया था जहां प्रमुख सेलुलर पैटर्न बड़े क्लस्टर थे (चित्रा 2 सी)। उपास्थि की सतह में ये असमानताएं कई जांच-नमूना संपर्क बिंदुओं को जन्म दे सकती हैं और इस प्रकार, गलत परिणाम हो सकते हैं। कुछ मामलों में विशाल विक्षेपण देखा गया, इसके बाद बल-दूरी वक्र के अंतिम खिंचाव से पहले बेसलाइन की तेजी से वसूली हुई (चित्रा 5 ए)। इसे कैंटिलीवर टिप के मार्ग में एक बड़ी बाधा के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है (उदाहरण के लिए, उपास्थि और विभाजन उपास्थि के साथ उन्नत फाइब्रिलेशन क्षेत्र)। अन्य उदाहरणों में, बल-दूरी वक्र का अंतिम ढलान छोटी अनियमितताओं (चित्रा 5 बी) के साथ बिखरा हुआ था, जो क्रमिक रूप से छोटी बाधाओं (जैसे, ऊतक के माइक्रो-फाइब्रिलेशन) के संपर्क का संकेत देता है। ऐसे मामलों में, डेटा विश्वसनीयता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए माप साइट को फिर से मापा जाना चाहिए या यहां तक कि बदला जाना चाहिए। इसके लिए, संपर्क बिंदु की सही पहचान के लिए एएफएम के बल-दूरी वक्र आउटपुट का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करना भी महत्वपूर्ण है। यह एक महत्वपूर्ण बिंदु है, क्योंकि यह दिखाया गया है कि 50 एनएम द्वारा संपर्क बिंदु की गलत पहचान के परिणामस्वरूप61 परिमाण के क्रम से ई के मूल्य का गलत अनुमान लगाया जाता है। कई अध्ययनों ने बल-दूरी वक्रों के संपर्क बिंदु को निर्धारित करने के लिए स्वचालित दृष्टिकोण का उपयोग करना शुरू कर दिया है, जिसमें दृश्य निरीक्षण द्वारा संपर्क बिंदु का अनुमान लगाते समय व्यक्तिपरक उपयोगकर्ता इनपुट को दरकिनार करने और सटीकता में सुधार करने का लक्ष्य है। यह तब और भी महत्वपूर्ण हो जाता है जब बड़ी संख्या में बल-विस्थापन वक्रों से निपटते हैं, जैसे कि सेल यांत्रिकी47,62 में उत्पन्न। यद्यपि संपर्क बिंदु निर्धारण 47,63,64,65 को स्वचालित करने के लिए कई रणनीतियों का प्रस्ताव किया गया है, इष्टतम रणनीति प्रयोगात्मक स्थितियों और कारकों पर अत्यधिक निर्भर है जैसे कि डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाने वाला मॉडल, जांच का आकार, कैंटिलीवर टिप और नमूने के बीच (गैर-) चिपकने वाला यांत्रिक बातचीत, साथ ही नमूना 63 का (गैर-) हर्ट्ज़ियन व्यवहार।

नमूना बहाव एक और आम मुद्दा है जो कलाकृतियों और गलत संपर्क बिंदु निर्धारण (चित्रा 3 ई) का कारण बन सकता है। इसका मूल रूप से मतलब है कि नमूना नमूना धारक (पेट्री डिश) में ठीक से नहीं लगाया गया है और नमूना एएफएम माप के दौरान आगे बढ़ रहा है। एएफएम कैंटिलीवर को एक नए माप स्थल पर ले जाने पर प्रभाव विशेष रूप से स्पष्ट होता है। फोकल प्लेन में अचानक परिवर्तन द्वारा वास्तविक माप के दौरान इस पहलू को आसानी से देखा जा सकता है। परिणामी बल-दूरी वक्रों में आम तौर पर एक द्विध्रुवीय विस्तारित ढलान होता है, जिसमें पहली बार में हल्की वृद्धि होती है, जो डिस्क के तल और पेट्री डिश के बीच खाली स्थान के संकीर्ण होने के अनुरूप होती है क्योंकि डिस्क को कैंटिलीवर द्वारा नीचे धकेल दिया जाता है ( चित्र 3 ई देखें), इसके बाद ढलान के दूसरे खंड में एक दृढ़ झुकाव होता है, यह दर्शाता है कि डिस्क को अब और अधिक इंडेंटेड किया जा रहा है क्योंकि यह पेट्री डिश (चित्रा 5 सी, डी) के निचले हिस्से के साथ सीधे संपर्क में है। विकृतियों को दूर करने के लिए, कोई पर्याप्त नमूना चिपकने वाला (चित्रा 3 डी) का उपयोग करके नमूनों को बेहतर ढंग से ठीक करने की कोशिश कर सकता है, थर्मल बहाव से बचने के लिए गर्मी (रोशनी) के बाहरी स्रोतों को बंद करके तापमान स्थिर रख सकता है, और तेजी से स्कैनिंग माप आयोजित कर सकता है। यहां प्रयोगों में, हमने एक कैंटिलीवर विक्षेपण बहाव देखा जो मीडिया में कैंटिलीवर के विसर्जन के पहले 15 मिनट के भीतर हुआ (तापमान में अचानक परिवर्तन के कारण)। इस समय अंतराल के बाद, बहाव आमतौर पर नगण्य होता है। नतीजतन, हम प्रयोगकर्ता को कैंटिलीवर विसर्जन के बाद बेसलाइन की सावधानीपूर्वक जांच करने और स्थिर होने के बाद मापने के लिए सलाह देते हैं। इस प्रक्रिया की अवधि उपयोग किए जाने वाले कैंटिलीवर के आधार पर बहुत भिन्न हो सकती है।

किसी भी एएफएम माप के लिए एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर सेट पॉइंट है, जो सरल रूप से, कैंटिलीवर द्वारा नमूने पर लागू बल का एक उपाय है। संपर्क मोड के लिए (जैसा कि इस अध्ययन में उपयोग किया गया है), सेट बिंदु कैंटिलीवर के एक निश्चित विक्षेपण का प्रतिनिधित्व करता है। कई स्कैन या कई साइट दोहराव करते समय, जैसे कि यहां प्रोटोकॉल में, कैंटिलीवर टिप नमूना सतह से कणों को सोख सकता है, इस प्रकार कभी-कभी कैंटिलीवर को हटाना, इसे ठीक से साफ करना और फिर माप के साथ आगे बढ़ने से पहले रीकैलिब्रेट करना आवश्यक हो जाता है।

जबकि एएफएम माइक्रो-इंडेंटेशन नए और दिलचस्प डेटा संग्रह के अवसर प्रदान करते हैं, विशेष रूप से ऑस्टियोआर्थ्रिटिक कार्टिलेज के संदर्भ में, उत्पादित डेटा की स्थिरता और प्रजनन क्षमता कई मापदंडों पर बहुत अधिक निर्भर है, जैसा कि ऊपर उल्लिखित है। उपास्थि ऊतक अध: पतन के कारण यांत्रिक परिवर्तनों का आकलन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करते समय, विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन के परिणामों को स्केल करने के लिए विभिन्न स्थानिक पैटर्न पर कुछ पायलट माप पहले किए जाने चाहिए। पायलट एएफएम माप को डेटा परिवर्तनशीलता की सीमा का संकेत प्रदान करने के लिए एक ही पैटर्न के पर्याप्त नमूने (जैसे, पांच डिस्क) लेने वाली सबसे मानक प्रक्रिया के साथ किया जाना चाहिए। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब शुरुआती प्रासंगिक ओए कठोरता परिवर्तनों (यानी, एकल स्ट्रिंग और डबल स्ट्रिंग के बीच, चित्रा 4 ए) को मापने और आकलन करने का प्रयास किया जाता है। वास्तव में, पिछले अध्ययन में, एक समान दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने दिखायाकि कोशिकाओं के स्थानिक संगठन के कार्य के रूप में मैट्रिक्स में बायोमैकेनिकल परिवर्तनों का आकलन करने के लिए 30 मानव नमूनों के नमूना आकार की आवश्यकता थी।

इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत कई कदम मानव त्रुटि के लिए अतिसंवेदनशील हैं और ऑपरेटर के अनुभव पर बहुत अधिक निर्भर करते हैं। वास्तविक एएफएम परिणामों को प्रभावित करने वाले सभी कारकों को देखते हुए, इस अध्ययन में रिपोर्ट किए गए पूर्ण ई मान सामान्य नहीं हैं और इस प्रयोगात्मक सेटअप के लिए विशिष्ट हैं। हालांकि, यहां प्रस्तुत विभिन्न यंग के मोडुलिन और सेलुलर पैटर्न-आधारित उपास्थि खोजों (जितना अधिक पैथोलॉजिकल स्थानिक पैटर्न, उपास्थि का लोचदार मापांक [ईएम] कम होता है) के बीच संबंध अप्रभावित है, क्योंकि निष्कर्ष पिछले अध्ययनों के अनुरूप हैं जो सेलुलर पैटर्न संगठन23,37 के कार्य के रूप में कठोरता परिवर्तन दिखाते हैं।

कुल मिलाकर, यह चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल मानकीकृत 3 डी देशी आर्टिकुलर कार्टिलेज खोजों की कार्यक्षमता को प्रदर्शित करता है, जो न केवल शुरुआत से उन्नत प्रगति तक ओए-संचालित सेलुलर पुनर्गठन घटनाओं का प्रतिनिधि है, बल्कि कठोरता में क्रमिक कमी के साथ भी जुड़ा हुआ है। खोज ओए की शुरुआत और प्रगति का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय बायोमिमेटिक मॉडल को प्रतिबिंबित कर सकती है, जिससे विवो में विभिन्न उपचार विधियों के परीक्षण और विकास की अनुमति मिलती है। एएफएम-आधारित बायोमैकेनिकल मूल्यांकन के साथ संयोजन में इस तरह के मानव खोज मॉडल के उपयोग से बायोमेडिकल अनुसंधान और दवा उद्योग के लिए एक प्रतिमान बदलाव हो सकता है, जिससे बहुत आवश्यक प्रभावी ओए दवाओं की पहचान करने के नए तरीकों का मार्ग प्रशस्त हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम ऊतक के नमूने प्रदान करने के लिए तुएबिंगन विश्वविद्यालय अस्पताल के आर्थोपेडिक सर्जरी विभाग के आर्थोपेडिक सर्जनों को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head  CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany JPK00518
Biocompatible sample glue  Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany H000033
Calcein AM Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA 14948 Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SAA-SPH-5UM Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device  Self-made  n/a Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope Leica Biosystems, Wetzlar, Germany DFC3000G
Cryotome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany CM3050S 
Data Processing Software for the AFM Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)  Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany 41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) Leica Biosystems, Wetzlar, Germany 11889113
Glass block cantiliver holder Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SP-90-05 Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine  Merck KGaA, Darmstadt, Germany F1315
Microscope glass slides Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS294775X50
Mounting medium With DAPI ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany 50011 Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany T-05-0117
Scalpel Feather Medical Products, Osaka, Japan 2023-01
Silicone Skirt Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSS IBM, Armonk, New York, USA SPSS Statistics 22 Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes  TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands SA6255012 Water-soluble embedding medium 

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