Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Att ta itu med praktiska frågor i atomkraftsmikroskopibaserad mikrointryckning på humant ledbroskexplantat

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64371
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

Summary

Vi presenterar ett steg-för-steg-tillvägagångssätt för att identifiera och ta itu med de vanligaste problemen i samband med mikrointryckningar i atomkraftsmikroskopi. Vi exemplifierar de framväxande problemen på naturliga mänskliga ledbroskexplantat som kännetecknas av olika grader av artrosdriven degeneration.

Abstract

Utan tvekan är atomkraftsmikroskopi (AFM) för närvarande en av de mest kraftfulla och användbara teknikerna för att bedöma mikro- och till och med nanosignaler inom det biologiska området. Men som med alla andra mikroskopiska metoder kan metodologiska utmaningar uppstå. I synnerhet kan egenskaperna hos provet, provberedningen, typen av instrument och intryckningssonden leda till oönskade artefakter. I detta protokoll exemplifierar vi dessa framväxande problem på friska såväl som osteoartritiska ledbroskexplantat. För detta ändamål visar vi först via en steg-för-steg-metod hur man genererar, graderar och visuellt klassificerar ex vivo ledbroskskivor enligt olika stadier av degeneration med hjälp av stor 2D-mosaikfluorescensavbildning av hela vävnadsexplantaten. Den största styrkan med ex vivo-modellen är att den består av åldrat, naturligt, humant brosk som gör det möjligt att undersöka artrosrelaterade förändringar från tidig debut till progression. Dessutom presenteras vanliga fallgropar vid vävnadspreparation, samt själva AFM-proceduren tillsammans med den efterföljande dataanalysen. Vi visar hur grundläggande men avgörande steg som provberedning och bearbetning, topografiska provegenskaper orsakade av avancerad degeneration och provspetsinteraktion kan påverka datainsamlingen. Vi granskar också de vanligaste problemen inom AFM och beskriver, där det är möjligt, hur man kan lösa dem. Kunskap om dessa begränsningar är av yttersta vikt för korrekt datainsamling, tolkning och i slutändan inbäddning av resultat i ett brett vetenskapligt sammanhang.

Introduction

På grund av den ständigt krympande storleken på elektroniska enheter och system har den snabba utvecklingen av mikro- och nanobaserad teknik och utrustning tagit fart. En sådan anordning är atomkraftsmikroskopi (AFM), som kan skanna biologiska ytor och hämta topografisk eller biomekanisk information på både nano- och mikrometerskala 1,2. Bland dess stora funktioner kan detta verktyg användas som en mikro- såväl som en nanoindenter för att få information om de mekaniska egenskaperna hos olika biologiska system 3,4,5,6. Data samlas in genom fysisk kontakt med ytan genom en mekanisk sond, som kan vara så liten som cirka 1 nm vid spetsen7. Den resulterande deformationen av provet visas sedan baserat på intryckningsdjupet för den utskjutande spetsen och kraften som appliceras på provet8.

Artros (OA) är en långvarig degenerativ kronisk sjukdom som kännetecknas av försämring av ledbrosket i lederna och omgivande vävnader, vilket kan leda till fullständig exponering av benytorna. Bördan av OA är betydande; Idag lider hälften av alla kvinnor och en tredjedel av alla män över 65 år av artros9. Trauman, fetma och den resulterande förändrade biomekaniken i leden10 bestämmer ledbroskdegenerationen, vilket ses som ett vanligt slutresultat. Den banbrytande studien av Ganz et al. antog att de tidiga stegen i OA-processen kan involvera de biomekaniska egenskaperna hos brosk11, och sedan dess har forskare bekräftat denna hypotes12. På samma sätt är det allmänt accepterat att vävnadens biomekaniska egenskaper är funktionellt orkestrerade av den ultrastrukturella organisationen såväl som cell-cell och cell-matris överhörning. Eventuella förändringar kan dramatiskt påverka vävnadens övergripande biomekaniska funktion13. Hittills är artrosdiagnosen klinisk och baseras på vanlig filmröntgen14. Detta tillvägagångssätt är dubbelsidigt: för det första gör avsaknaden av en definierad degenerativ gränsvärde för att formulera diagnosen OA tillståndet svårt att kvantifiera, och för det andra saknar avbildningsmetoder känslighet och standardisering och kan inte upptäcka lokaliserade broskskador15,16,17. För detta ändamål har bedömningen av broskets mekaniska egenskaper den avgörande fördelen att den beskriver en parameter som förändras under artrosförloppet oavsett sjukdomens etiologi och har en direkt inverkan på vävnadens funktionalitet i ett mycket tidigt skede. Intryckningsinstrument mäter den kraft med vilken vävnaden motstår intryckningen. Detta är i själva verket inget nytt koncept. De tidigaste studierna går tillbaka till 1980- och 1990-talen. Under denna period tyder många studier på att intryckningsinstrument utformade för artroskopiska mätningar av ledbrosk kan vara väl lämpade för att upptäcka degenerativa förändringar i brosket. Redan för 30 år sedan kunde vissa studier visa att intryckningsinstrument kunde detektera in vivo-förändringar i broskytan under vävnadsdegeneration genom att utföra tryckstyvhetsmätningar under artroskopi18,19,20.

AFM-indrag (AFM-IT) av ledbrosket ger information om en central mekanisk egenskap hos vävnaden, nämligen styvhet. Detta är en mekanisk parameter som beskriver förhållandet mellan en applicerad, icke-destruktiv belastning och den resulterande deformationen av det indragna vävnadsområdet21. AFM-IT har visat sig kunna kvantifiera åldersberoende förändringar i styvhet i makroskopiskt opåverkade kollagennätverk, och därmed skilja mellan de patologiska förändringar som är förknippade med debut av artros (grad 0 på Outerbridge-skalan i ledbrosk)22. Vi har tidigare visat att AFM-ITs, på grundval av spatial kondrocytorganisation som en bildbaserad biomarkör för tidig broskdegeneration, inte bara möjliggör kvantifiering utan också faktiskt lokalisering av de tidigaste degenerativa mekaniska förändringarna. Dessa resultat har redan bekräftats av andra23,24. Därför fungerar AFM-IT som ett intressant verktyg för att diagnostisera och identifiera tidiga degenerativa förändringar. Dessa förändringar kan redan mätas på cellnivå, vilket omformar förståelsen av den patofysiologiska processen för artros.

I detta protokoll demonstrerar vi en komplett histologisk och biomekanisk graderingsprocedur för ledbroskexplantat, från naturlig broskexplantation till AFM-datainsamling och bearbetning. Genom ett steg-för-steg-tillvägagångssätt visar vi hur man genererar, graderar och visuellt klassificerar ledbroskvävnad enligt olika stadier av degeneration med hjälp av 2D stor mosaikavbildning, följt av mikro-AFM-intryck.

Även om AFM-IT för närvarande är ett av de känsligaste verktygen för att mäta biomekaniska förändringar i brosk7, har det, precis som alla andra instrumentella tekniker, begränsningar och praktiska egenheter25 som kan leda till felaktig datainsamling. För detta ändamål granskar vi de vanligaste problemen som uppstår vid AFM-mätningar av broskexplantat och beskriver, där det är möjligt, hur man kan minimera eller övervinna dem. Dessa inkluderar topografiska aspekter av proverna och svårigheterna att stabilisera dem i en AFM-kompatibel miljö, fysiska särdrag hos vävnadens yta och de resulterande svårigheterna att utföra AFM-mätningar på sådana ytor. Exempel på felaktiga kraft-avståndskurvor presenteras också, med betoning på de förhållanden som kan orsaka dem. Ytterligare begränsningar som är inneboende i geometrin hos den fribärande spetsen och användningen av Hertz-modellen för dataanalys diskuteras också.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Lårbenskondyler som samlats in från patienter som genomgick total knäprotesplastik vid universitetssjukhuset i Tübingen, Tyskland, användes. Endast ledbroskprover från patienter med degenerativa och posttraumatiska ledpatologier inkluderades i denna studie. Godkännande från avdelnings-, institutions- och lokaletiska kommittéer erhölls innan studien påbörjades (projekt nr 674/2016BO2). Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter före deltagandet.

OBS: Ett flödesschema över experimentstegen i kronologisk ordning ges i figur 1.

1. Vävnadsbearbetning och generering av broskskivor

  1. Beredning av vävnad
    1. Efter postoperativ resektion placeras broskproverna i en behållare fylld med Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) kompletterat med 5 % (v/v) penicillin-streptomycin. Se till att proverna är helt nedsänkta i mediet. Tiden mellan kirurgisk resektion och vidare bearbetning av brosket bör inte överstiga 24 timmar. Se till att proverna under hela bearbetningen är helt nedsänkta i medier för att undvika att proverna torkar.
    2. Skär bort brosket från benet med en skalpell.
  2. Generering av broskskivor
    1. Generera broskskivor med en diameter på 4 mm med hjälp av en biopsistans.
      OBS: Det är viktigt att välja och avlägsna de områden i leden där broskskiktets tjocklek överstiger 1 mm. Detta kan vara problematiskt, särskilt runt bärande zoner, där broskskiktet vanligtvis förlorar sin tjocklek på grund av slitageprocesser eller degeneration.
    2. Placera de tidigare genererade 4 mm broskskivorna på en specialtillverkad skäranordning och fixera och håll broskskivorna stabila med hjälp av en spatel. När du placerar broskskivorna på skäranordningen måste du vara försiktig. Placera proverna så att broskets översta lager (ledbroskets ytliga zon) inte är vänt mot bladet
    3. Skär av broskskivorna med ett rakblad. På så sätt genereras skivformade broskprover på 4 mm x 1 mm. För att förhindra sample torkning, utför vävnadsskärning så snabbt som möjligt.
    4. Samla upp varje disk med hjälp av en spatel och placera de genererade broskskivorna i 1,5 ml rör som innehåller 1 ml DMEM kompletterat med 5% (v/v) penicillin-streptomycin. Placera cirka 15 skivor i ett rör.
  3. Kryotomsnitt av broskskivorna (för vinkelräta skivor)
    OBS: Detta steg är valfritt, och det kan användas om en sidovyvisualisering av den cellulära mönsterfördelningen i broskskivorna önskas. Det kan användas som en verifieringsmetod eftersom fördelningen av cellulärt mönster är en 3D-funktion hos ledbrosk26. Optisk snittning och 3D-rekonstruktioner av hela broskskivorna med hjälp av ett konfokalmikroskop kan också användas, vilket tar bort behovet av att snitta proverna enligt beskrivningen i protokollet.
    1. Täck broskskivan med vattenlösligt inbäddningsmedium och placera den på sin kant på kryotomknoppen (med skivans yta vinkelrät mot knoppens yta). I kryotomanordningen fryser inbäddningsmediet vid låga temperaturer.
    2. Använd en vanlig kryotom, snitta vävnaden i sidled med en tjocklek på 60 μm tills mitten av skivan nås (dvs. när kryosektioner når en längd av 4 mm) och samla upp skivorna. Genom att snitta diskexplantationen vinkelrätt kan alla zoner i brosket (ytliga, mellersta och djupa) visualiseras.
    3. Samla sektionerna på ett glasglas och ta bort det vattenlösliga inbäddningsmediet genom att tvätta tre gånger med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).

2. Sortering av broskskivor som en funktion av det cellulära rumsliga mönstret

  1. Färgning av de skivformade broskproverna
    1. Placera en broskskiva (avsnitt 1.2) i varje brunn på en platta med 96 brunnar och tillsätt 130 μl cellpermeabelt fluorescensfärgämne i en spädning av 1:1 000 till varje brunn.
    2. Inspektera hela plattan visuellt och se till att endast en skiva placeras i varje brunn. Inkubera plattan i 30 minuter i standardinkubatorn för cellodling vid 37 °C.
  2. Färgning av 60 μm broskskivor
    1. Placera försiktigt broskskivans sektioner (avsnitt 1.3) på glasmikroskopglas med hjälp av en pincett.
    2. Täck brosksektionerna med monteringsmedium som innehåller nukleär DAPI-motfärgning och placera försiktigt täckglas som är lämpliga för fluorescensmikroskopi.
    3. Försegla kanterna på varje täckglas med vanligt genomskinligt nagellack och låt torka i 3 min.
  3. Sortering och avbildning av brosk uppifrån och ner och från sidan
    OBS: Varje skiva måste undersökas i ett fluorescerande mikroskop. Syftet med detta steg är att sortera skivorna baserat på deras dominerande cellulära mönster (enkla strängar, dubbla strängar, små kluster, stora kluster eller diffusa).
    1. Placera 96-brunnsplattan på platthållaren på fluorescensmikroskopet.
    2. Välj lämpligt fluorescensfilter för antingen Em 495 nm/Ex 515 nm (för avbildning uppifrån och ned av broskskivorna som förberetts i avsnitt 2.1) eller Em 358 nm/Ex 461 nm (för avbildning från sidan av brosksektionerna som förberetts i avsnitt 2.2) och 10x-objektivet.
      OBS: Genom att använda 10x-objektivet kan skivans hela omkrets inspekteras, och prover med inhomogen eller felaktig färgning kan uteslutas. Att endast använda top-down-vyn kan dock resultera i uppfattningen av förändringar i cellulär organisation som ett resultat av analys av de djupare vävnadslagren som gjorts synliga för top-down-observation genom ytlig erosion. Som ett exempel kan en stigande sträng som följer kollagenarkaderna uppfattas som en enda cell eller spridda celler (diffust mönster)26. Som ett resultat måste båda sidor av skivorna inspekteras för att säkerställa korrekt val av cellmönster.
    3. Bestäm visuellt det cellulära mönstret som visas i varje broskskiva. Det är osannolikt att en skiva bara har en typ av cellulärt mönster. För den del av skivan där kondrocytarrangemanget inte stämmer överens med mönstret av intresse, acceptera endast proverna om det oönskade mönstret är i själva periferin, där AFM-mätningar inte äger rum (dvs. upp till 0.5 mm från diskkanten), och se till att detta inte överstiger 10 % av den totala ytan på skivan27, 28. veckor
  4. Bildinsamling av hela broskskivorna
    1. Välj mikroskopets 10x objektiv och placera det under den förvalda brunnen som innehåller en individuell broskskiva. Fokusera på skivan för att se det cellulära mönstret.
    2. Välj funktionen Navigatör för att få en översikt över hela brunnen. Använd vänster musknapp och dra för att navigera till en annan scenposition. Zooma in och ut med mushjulet.
      OBS: Vid denna tidpunkt kan en preview av brunnen med hela sample kan ses genom att dubbelklicka på varje intresseområde sekventiellt.
    3. Välj en ruta som omfattar det intresseområde som ska skannas. Vid denna tidpunkt kommer alla enskilda brickor som utgör mosaiken att bli synliga.
    4. Justera exponeringen/ljusintensiteten så att cellerna tydligt kan visualiseras från bakgrunden. Vid det här laget har bildens ljusstyrka/kontrast justerats för alla brickor och kan inte längre anpassas individuellt för varje bricka.
      OBS: Eftersom cellerna nära skivans kant ofta avger en högre fluorescenssignal än cellerna i mitten, måste inställningarna för exponering/ljusintensitet anpassas.
      1. För att utvärdera om exponeringstiden är lämplig för en viss kanal, undersök fördelningen av signalen i histogrammet. Genom att använda den automatiska exponeringsmekanismen som ingår i mikroskopets bildprogramvara kan du visualisera alla celler som finns i skivan.
    5. Välj alternativet Focus Map Point i programvaran och välj sedan varje enskild ruta genom att vänsterklicka i mitten av den.
    6. Välj alternativet Fokuskarta. Ett fönster visas med alla tidigare markerade rutor. Dubbelklicka på en bricka i listan för att visa och få den i rätt fokus.
    7. Klicka på Ställ in Z för att spara fokusplanen och gå vidare till nästa panel. När du har justerat fokusplanen för varje enskild ruta börjar du ta bilder genom att trycka på Starta skanning.
      1. Om skanningen visar mörkare horisontella och/eller vertikala streck kan detta bero på felaktig och ojämn belysning av de enskilda bildrutorna. Lös detta genom att använda alternativet Länkad skuggning som är inbyggt i programvaran före den faktiska skanningen.
    8. Spara, exportera och kommentera bilderna korrekt.

3. Biomekanisk metod för broskexplantation

  1. Provberedning för AFM-mätningar
    1. Fäst varje förvald broskskiva som innehåller ett cellmönster (avsnitt 2) i petriskålar med hjälp av biokompatibelt lim. Tillsätt tillräckligt med provlim på skivans ovansida, botten, vänster och höger sida.
    2. Täck skivorna med 2,5 ml Leibovitz L-15 medium utan L-glutamin. Tillsätt Leibowitz-mediet försiktigt på proverna för att undvika att provet lossnar från ytan på grund av vågor som skapas av mediet.
  2. Lastning av proverna i AFM
    1. Placera petriskålen i AFM-enhetens provhållare och slå på petriskålvärmaren inställd på 37 °C. Låt vävnadsodlingsskålen nå önskad temperatur. Detta görs för att utesluta eventuella artefakter som orsakas av temperaturvariationer.
  3. Kalibrering av AFM-konsoler
    1. Initiera programvaruinstallationen som tidigare beskrivits av Danalache et al.29.
    2. Välj en lämplig konsolhållare för vätskemätningar och placera den försiktigt på AFM-huvudet. En låsmekanism säkrar glasblocket i AFM-huvudet. Se till att glasblockets reflekterande yta är rak och parallell med AFM-hållaren.
    3. Placera konsolen försiktigt på ytan av glasblockets konsolhållare. Själva utskjutaren ska vila på det polerade optiska planet, i mitten av glasblocket.
    4. Placera försiktigt en silikonkjol (silikonmembran) på basen av konsolhållaren för att förhindra medelhög kondens i AFM-huvudet.
    5. Sänk konsolen i steg om 100 μm med hjälp av stegmotorfunktionen tills den är helt nedsänkt i mediet.
    6. Kör en skannermetod med de inflygningsparametrar som beskrivs av Danalache et al.29. Dra tillbaka utskjutaren 100 μm när petriskålens botten har nåtts.
    7. Kalibrera konsolen med de exakta stegen och kör parametrarna som beskrivs av Danalache et al.29. I slutet av kalibreringen sparas den vertikala avböjningen och visas i newton (N) kraftenheter snarare än volt (V) - enheten för den ursprungliga registreringen av fotodioddetektorn. I experimenten här erhölls ett börvärde på 4,47 nN efter kalibrering.
    8. Använd stegmotorfunktionen för att dra tillbaka utskjutaren till 1 000 μm.
  4. Identifiering av önskat mätställe för brosk under AFM
    OBS: På grund av broskskivornas tjocklek på 1 mm är konsolen inte synlig i synfältet när du navigerar över provet.
    1. Använd mikroskopets CCD-kamera för att identifiera konsolen. AFM-konsolen ska placeras i ett provfritt område av petriskålen.
    2. Starta en skannermetod med utskjutaren på ett rent, provfritt område av petriskålen, med samma parametrar som beskrivs av Danalache et al.29.
    3. Dra in konsolen ytterligare 1,5 mm från plattans botten med stegmotorstyrningen. Detta steg är avgörande för att undvika en direkt kollision mellan utskjutaren och provet.
    4. Växla från ljusfält till fluorescensvy och identifiera skivans ovansida visuellt.
    5. Flytta AFM-provhållaren exakt 2 mm mot mitten av skivan. Denna punkt anses vara centrum av broskskivan.
    6. Kör en skannermetod och, när broskskivans yta har nåtts, dra tillbaka konsolen med 100 μm.
  5. Mätning av kraft-avståndskurvan
    1. Fokusera på cellerna som är placerade på önskad mätplats. Klicka på knappen Kör för att starta mätningarna och genereringen av kraft-avståndskurvor i målpositionen.
    2. Skaffa fem kraft-avståndskurvor på varje mätplats. Dra tillbaka konsolen 500 μm och flytta den till nästa mätplats.
      OBS: Indragningen av konsolen är ett avgörande steg, eftersom broskskivans yta inte är homogen och har ojämnheter. En hög kulle på provets yta kan resultera i en dramatisk kollision, vilket leder till oönskade skador på utskjutande spets/prov. Vi rekommenderar att du väljer minst fem olika mätpunkter utspridda över skivans yta och skaffar minst fem kraftavståndskurvor på varje plats.
    3. Inspektera kraft-avståndskurvorna och spara dem.
  6. Uppskattning av Youngs moduli med hjälp av Hertz fit-modellen
    1. Öppna de genererade kraft-avståndskurvorna som ska analyseras (.jpk-fil) i dataanalysprogrammet med alternativet Öppna en batch med spektroskopikurvor .
    2. Välj Hertz passformsmodell och välj sedan alternativet Elasticitetspassning .
      1. Alternativet elasticitetsanpassning utför automatiskt följande beräkningar på den valda kraft-avståndskurvan: beräknar baslinjen och subtraherar från hela kurvan för att ta bort baslinjeförskjutningen (baslinjen återställs till noll på y-axeln); bestämmer kontaktpunkten genom att detektera den punkt där kraft-avståndskurvan korsar nollkraftlinjen (kontaktpunkten är inställd på noll på x-axeln), beräknar avståndet mellan spets och prov (höjdsignalen för piezo som står för böjningen av konsolen subtraheras); och anpassar kraft-avståndskurvan automatiskt till den valda modellen. Om så önskas kan vart och ett av dessa steg också utföras oberoende av varandra.
    3. Anpassa med hjälp av följande passningsparametrar: Poisson-förhållande på 0,5 och lämplig utskjutande spetsradie.
      OBS: När du använder en konsol med en sfärisk utskjutande spets bör Hertz fit-modellen användas. Den fribärande som användes i denna studie hade en sfärisk spets med en radie på 5 μm. Vi rekommenderar att du monterar kraft-avståndskurvan tills den maximala applicerade kraften uppnås (börvärde).
    4. Kontrollera visuellt kraft-avståndskurvans passform för att säkerställa korrekthet. Detta steg måste göras för var och en av de analyserade kraft-avståndskurvorna.
  7. Bestämning av intryckningsdjup
    OBS: Beroende på vilket dataanalysverktyg som används kan denna process skilja sig åt. Experimentatorn kan enkelt läsa indragsdjupet genom att följa en serie steg som ingår i dataanalysprogrammet.
    1. Öppna var och en av de genererade kraft-avståndskurvorna i dataanalysprogrammet och välj Hertz-anpassningsmodellen som analysprocess.
    2. Använd alternativet Subtrahera baslinjeförskjutning för att nollställa den vertikala avböjningsaxeln (y-axeln) och välj funktionen Förskjutning + lutning .
    3. Använd funktionen Sök kontaktpunkt för att automatiskt identifiera kontaktpunkten, som automatiskt får en x-koordinat på noll.
    4. Subtrahera avståndet och ta endast hänsyn till fribärande avböjning från den råa piezohöjden under fördjupningen med hjälp av funktionen Vertical Tip Position .
    5. Välj alternativet Elasticity Fit för att visa den bearbetade kraft-avståndskurvan och välj området i diagrammet så att det ligger i linje med det mest negativa värdet på den vertikala spetspositionsaxeln (x-axeln).
    6. Läs och dokumentera indraget från rutan X Min på parameterfliken. Spara och dokumentera resultaten.

4. Statistisk analys

  1. Öppna statistikprogrammet. Välj Ny datauppsättning i den nedrullningsbara menyn.
  2. Öppna fliken Variabelvy när du har valt DataSet-filen . Definiera de numeriska variablerna för varje cellulär mönsterkategori: enkla strängar = SS, dubbla strängar = DS, små kluster = SC, stora kluster = BC, diffusa och Youngs moduler.
  3. På fliken datavy anger du Youngs uppmätta modulidata för var och en av motsvarande cellulära mönsterkategorier. Analysera datadistributionen genom att välja Analysera på menyraden och sedan Utforskande dataanalys.
  4. Välj Youngs modul som beroende variabel och cellulärt mönster som faktorlista. Ett lådagram som används för resultatavsnittet visas bland resultaten i utdatafilen.
  5. Om du vill utföra en statistisk analys väljer du Beroende exempel i avsnittet icke-parametriskt test på menyradsfliken Analysera. Välj Young's Moduli som Testfält och Cellulärt mönster som Grupper under fliken Fält. Tryck på Kör.
    OBS: Resultaten visas i utdatafilen. För den statistiska analysen utförs ett Friedman-test.
  6. Införliva det icke-parametriska testets p-värden i lådagrammet som skapades i steg 4.4. Spara resultaten genom att klicka på Arkiv i menyraden och välja Spara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av en egentillverkad skäranordning kunde vi explantera och generera små (4 mm x 1 mm) broskskivor från färska mänskliga kondyler som innehåller ett enda cellulärt rumsligt mönster30 av enkla strängar (SS, figur 2A), dubbla strängar (DS), små kluster (SC), stora kluster (BC; (figur 2A) och diffus (figur 2B). En representativ broskexplantering visas i figur 3A. Urvalet av skivor som endast visar en typ av mönster gjordes med hjälp av fluorescensavbildning uppifrån och ned (figur 2). Den topografiska variationen av broskskivan illustrerades ytterligare genom sidobild av 60 μm tjocka snitt som genererats från broskskivorna (Figur 2C). På ytan av de explanterade osteoartritiska broskskivorna förekom ytligt flimmer och matrisklyvning (Figur 3B,C). Detta var särskilt anmärkningsvärt i diskarna som representerar avancerad OA-progression - representerad av närvaron av BC (Figur 2A). Efter efterfluorescenssortering bedömdes diskarnas styvhet med hjälp av AFM-mikrointryck. För detta ändamål fixerades de genererade broskskivorna framgångsrikt i AFM-petriskålen med hjälp av biokompatibelt lim (figur 3D) för att undvika att proverna avfyrades under mätningarna (figur 3E). Mängden lim som används måste justeras. En otillräcklig mängd lim kommer att resultera i skivinstabilitet, medan tillsats av för mycket lim kan leda till en oönskad spridning av limmet antingen under och/eller över broskskivan. Det senare leder till mätartefakter och dålig identifiering av skivan under fluorescensmikroskopet. Otillräcklig applicering av lim eller plötsliga rörelser av provet under fixering är vanliga problem som gör att vävnaden lossnar från petriskålen och bör undvikas.

En representativ gradvis minskning av styvheten tillsammans med det cellulära mönsterarrangemanget visas i figur 4A. Styvhetsvärdena var högre i diskarna som innehöll SS (median 2,6 kPa) - representativt för oskadade hedbroskområden. Med debut och progression av artros visade AFM-mätningarna en stark stegvis minskning av styvheten med 42 % i DS (1,5 kPa), 77 % i SC (0,6 kPa) och slutligen 88 % i avancerade stadier som representeras av BC (0,3 kPa; Figur 4A). Skivorna som innehöll ett diffust mönster uppvisade en förhöjd elasticitet med en viktig variation av Youngs modul singelvärden. För alla broskskivor med tilldelad dominerande cellulär mönsterorganisation visade sig intryckningsdjupet associerat med det använda börvärdet (4,477 nN) vara omvänt proportionellt mot styvheten (Figur 4B). En representativt genererad kraft-avståndskurva visas i figur 4C, och en Hertz-passning samt identifiering av kontaktpunkten visas i figur 4D.

Rätt passform beror bland annat på korrekt bestämning av baslinjen. Om den automatiska baslinjeidentifieringen är felaktig (till exempel på grund av en turbulent baslinje) kan anpassningen också bestämmas manuellt och det gör att användaren kan välja en mer representativ baslinje för mätningarna. Men om den genererade kraft-avståndskurvan inte tillåter en korrekt passning måste den kasseras. Figur 5 visar exempel på felaktiga kraft-avståndskurvor. Att generera lämpliga kraft-avståndskurvor på osteoartritiska ledbroskexplantat kan vara svårt på grund av vävnadens oregelbundna yta, å ena sidan (exempel visas i figur 5A,B) och provets instabilitet orsakad av felaktig provfixering (exempel visas i figur 5C,D). Artefakter kan orsakas av flera kontaktpunkter mellan sond och prov (på grund av den ojämna ytan av degenererat brosk) eller oönskad vävnadsrörelse (synlig genom förändringar i fokalplanet). Dessa artefakter kan ses i de genererade kraft-avståndskurvorna och tyder antingen på en suboptimal kontakt mellan AFM-konsolen och broskytan eller felaktig provfixering på petriskålen (se figur 5A-D).

Figure 1
Figur 1: Flödesschema över det experimentella förfarandet. Sammanfattning av de experimentella stegen i kronologisk ordning, från intraoperativt resekerade broskprover till generering av 4 mm x 1 mm broskskivor, fluorescensfärgning och sortering av diskarna på grundval av den cellulära mönsterorganisationen med hjälp av top-down- och side-view-avbildning, och slutligen elasticitetsbedömning med hjälp av atomkraftsmätningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Fluorescensavbildning av representativa broskskivor. (A) Mosaik 2D-bilder och ett zoomat exemplifierat fält av broskskivor färgade med cellmembranpermeabelt färgämne vid 100x förstoring. Den övre skivan visar en representativ skiva med en enda sträng, medan den nedre är representativ för en stor klusterskiva (nederst). (B) Mosaikbild av en skiva med diffust mönster sedd från ytan (överst) och samma skiva avbildad från undersidan (nederst). C) Sidovy av kärnfärgning av 60 μm skivor av broskskivor. Det vita skalstrecket representerar 500 μm för mosaikbilderna (större synfält, A [vänster panel], B, C) och 100 μm för de inzoomade, fokuserade bilderna (A [höger panel]). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Explanterade ledbroskskivor. (A) Representativ bild av en genererad 4 mm x 1 mm broskskiva explantation från färskt humant ledbrosk. Skalstrecket som avbildas i vitt representerar 2 mm. (B) Representativ bild av naturligt osteoartrit brosk där vävnadsytan uppvisar makroskopiskt synligt ytligt flimmer och klyfta. Skalstrecket som avbildas i vitt representerar 1 000 mm. (C) Schematisk avbildning av den fibrillerade broskytan. D) Före AFM-mätningarna fixerades var och en av broskskivorna på lämpligt sätt med hjälp av biokompatibelt provlim på ytan av AFM-petriskålen för att undvika artefakter på grund av att provet avlossnade under de faktiska intryckningsmätningarna enligt punkt E. Den vita skalan representerar 4 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Representativa resultat från atomkraftsmikroskopimätningar av ledbroskskivor sorterade på grundval av deras dominerande cellulära mönsterorganisation . (A) Lådagram som visar medianen för den beräknade Youngs modul på fem diskar, en för varje cellulärt mönster, som härrör från en patient. Totalt utfördes 25 mätningar på varje skiva (fem mätningar för fem olika mätplatser). Den svarta linjen inuti rektangeln representerar medianvärdet, rektangelns nedre och övre extremiteter representerar den första respektive tredje kvartilen, och felstaplarna representerar de lägsta och högsta värdena för varje grupp. (B) Punktdiagram som visar de 125 intrycksdjuppunkterna för varje cellulärt mönster. (C) Exemplariska kraft-avståndskurvor erhållna med AFM med en beräknad Youngs modul på 0,4 kPa. D) En representativ bestämning av Hertz passform och kontaktpunkt för den kraft-avståndskurva som visas i punkt C. X-axeln visar den vertikala spetspositionen (vilket är det avstånd som korsas av piezo, där längden som står för den utskjutande böjningen automatiskt subtraheras från kontaktdelen av kraft-avståndskurvan). *p < 0,05. För statistisk analys användes Friedman-testet. Förkortningar: SS = enkla strängar; DS = dubbla strängar; SC = små kluster; BC = stora kluster. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Exempel på felaktiga kraft-avståndskurvor . (A) Kraft-avståndskurvan visar en massiv avvikelse följt av återhämtning nära baslinjenivån innan en kontinuerlig inbuktning av ytan observeras. Detta fenomen kan hänföras till ett relativt stort hinder (t.ex. stora ytklyftor som sticker ut från broskets översta lager). (B) Den förlängda kraft-avståndskurvan visar flera små toppar. Dessa kurvor tros orsakas av oregelbundenheter i mikroskala på broskytan (t.ex. flimmer). Både (C) och (D) visar kraft-avståndskurvor med bifasiska banor. Båda kraft-avståndskurvorna är representativa för dålig provfixering och provdrift. Det är också ganska vanligt i dessa fall att se en plötslig förändring i fokalplanet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som en progressiv och multifaktoriell sjukdom utlöser artros strukturella och funktionella förändringar i ledbrosket. Under hela artrosförloppet åtföljs försämringar av mekaniska egenskaper av strukturella och biokemiska förändringar på ledbroskets yta27,31. De tidigaste patologiska händelserna som inträffar vid artros är proteoglykanutarmning i kombination med störning av kollagennätverket32,33,34. Sådana tidiga subtila ytförändringar är svåra att lokalisera och identifiera med bulktestning, eftersom det mekaniska beteendet är genomsnittligt över hela vävnadsdjupet. En fråga som fortfarande är obesvarad är om funktionella förändringar på organ- och vävnadsnivå relaterar till strukturella och funktionella förändringar på mikro- eller nanonivå. För detta ändamål anses AFM vara en av de känsligaste metoderna, som kan upptäcka de tidigaste biomekaniska förändringarna som uppstår vid debutav OA 7. Det möjliggör styvhetsmätningar på både mikro- och nanometerskalor i nativa prover, vilket ger information om de mekaniska egenskaperna hos ledbrosk35,36. I detta protokoll, med hjälp av mikro-AFM-fördjupningar, mätte vi de elastiska egenskaperna hos friska och osteoartritiska ledbroskplantor mänskliga explantat. Resultaten visade att broskexplantaten är mycket representativa för tidiga lokala OA-händelser med en anmärkningsvärd gradvis minskning av styvheten som förekommer i mönsterspecifika broskexplantat. Vidare är resultaten i linje med tidigare publicerad forskning som visade en anmärkningsvärd minskning av styvheten tillsammans med den cellulära mönsterorganisationen23,24,27,37.

Bekräftade inhemska humana modeller som efterliknar olika aspekter av OA-patogenes och progression behövs för närvarande för att ta itu med bristerna i translationell forskning och utmaningarna med att översätta in vitro-data till en klinisk miljö. Hittills kan ingen modell exakt representera det komplexa mänskliga broskfacket, än mindre de åldersrelaterade ledvävnader som är benägna att drabbas av artros som svar på sjukdomsinitierande stimuli38. De mest använda explanteringsbaserade modellerna hittills var av nötkreaturs- eller nötkreatursursprung och tillämpade antingen en stark inflammatorisk cytokinbehandling eller mekanisk belastning 39,40,41. Detta protokoll, å andra sidan, visar hur man genererar små (4 mm x 1 mm) explanterade skivformade humana broskprover, som indikerar de enskilda stadierna av specifika OA-händelser. Broskexplantaten sorteras och stadietilldelas med hjälp av den cellulära rumsliga organisationen som en bildbaserad biomarkör30,42. Eftersom tidiga förändringar i biomekaniska egenskaper kan identifieras och kvantifieras redan så snart dubbla strängar börjar uppstå23,27, i ett skede där broskytan fortfarande verkar makroskopiskt intakt 26, möjliggör denna explantbaserade modell undersökning av ett lokalt inhemskt broskfack och kan ge insiktsfull information om tidig OA. Dessutom kan denna broskmodell vara användbar för att undersöka cellernas och matrisens svar på mekaniska och inflammatoriska förändringar i en 3D-naturlig lokal livsmiljö38,39. Eftersom de är relativt enkla och lätta att generera kan dessa broskexplantat också användas för att studera OA-heterogenitet, vilket är en begränsande faktor vid utveckling och testning av sjukdomsmodifierande OA-läkemedel43. Det måste också noteras att skalbarhet och beroende av patienter som genomgår ledproteskirurgi är två av modellens brister.

Det är välkänt att ledbrosk uppvisar ett märkligt beteende beroende på vilken skalnivå som testas. Som indikerats av Loparic et al., beter sig brosket på mikroskala som ett ostrukturerat och enhetligt material35, och ett sådant tillvägagångssätt ger en approximation av lokaliserad total broskstyvhet. I en studie från 2004 av Stolz et al.44 jämfördes både mikro- och nanofördjupningar vid bedömning av ledbroskets strukturmekaniska egenskaper. Författarna betonade att för sfärisk inbuktning av ledbrosket i mikroskala delar de fina strukturella komponenterna i nanoskala (dvs. enskilda kollagenfibrer och proteoglykaner) vanligtvis uppgiften att bära last. I sådana skiljer sig de aggregerade mekaniska egenskaperna markant från de enskilda nanokomponenternas. Samma författare föreslog att en kombination av mikro- och nanofördjupningar skulle kunna användas för att bedöma de övergripande lokala styvhetsprofilerna för ledbrosk, såväl som styvheten relaterad till de fina strukturella komponenterna44.

Många AFM-baserade intryckningsexperiment har använt skarpa pyramidala utskjutande spetsar (radie = 15-20 nm)22,36,44 för att bedöma broskmekanik. Även om nanofördjupningar med vassa konsoler för närvarande anses vara mer lämpade för att bedöma de finaste mekaniska egenskaperna, ger sfäriska utskjutande spetsar resultat som är mer konsekventa och lättare att modellera och tolka vid testning av mjuka biologiska prover44,45. Dessutom visade Stolz et al. att AFM-nano-fördjupningar av enzymatiskt (dvs. elastas) nedbrutet ledbrosk inte är möjliga eftersom vävnaden blir så klibbig att vidhäftning av spetsprov dominerar kraft-avståndskurvorna, vilket gör data omöjliga44.

I de aktuella AFM-mätningarna användes en fribärande spets med en sfärisk utskjutande spets med en radie på 5 μm. Valet av fribärande motor motiverades av avsikten att beräkna medelvärdet av vävnadens mekaniska egenskaper över en ganska stor yta samtidigt som man minimerade skadorna på broskytan. Förhållandet mellan den fribärande kraften och den resulterande provfördjupningen anpassades med Hertz passformsmodell. Vid användning av sfäriska indenterare rekommenderas Hertz-passformsmodellen, där de attraktiva krafterna som verkar mellan den utskjutande spetsen och provytan försummas46. Ekvationerna för Hertzmodellen visas i Eq.1 och Eq.2.

Equation 1Ekv.1

Equation 2Ekv.2

där F = kraft; E = Youngs modul; v = Poissons förhållande; δ = indrag; a = kontaktcirkelns radie, och Rs = sfärens radie.

Modellen beräknar slutligen cellulär/vävnadselasticiteten47, formellt uttryckt som Youngs modul (E). Hertz passformsmodell tar hänsyn till flera egenskaper såsom spetsens form och storlek, intryckning och provets deformerbarhet. Om dessa krav inte uppfylls på bästa sätt kan modellen ge en felaktig uppskattning av Youngs modul46.

Hertz-anpassningsmodellen antar att töjningen och den elastiska spänningen beror linjärt på elasticitetsmodulen, vilket innebär att intryckningen i provet förblir mycket mindre än själva provtjockleken46. Detta antagande uppfylldes lätt i denna uppställning, där broskexplantorna hade en tjocklek på 1 mm jämfört med fördjupningar på några mikrometer.

Ledbrosk kan modelleras som ett poröst viskoelastiskt material48,49. Det viskoelastiska beteendet är resultatet av friktion mellan de intracellulära / cytoplasmatiska eller matrisbeståndsdelarna såsom molekyler, organeller och kollagen-proteoglykannätverket50,51. Som namnet antyder kombinerar viskoelastiska material två distinkta egenskaper: viskösa - materialet deformeras långsamt när det utsätts för en yttre belastning - och elastiskt - materialet återgår till sin ursprungliga konfiguration när den applicerade belastningen avlägsnas52,53. Det viskoelastiska beteendet manifesteras som en hysteres mellan inflygnings- och retraktionskurvorna i kraft-avståndskurvorna 46,52, liknande de som erhölls i denna studie (Figur 4C). Dessutom är ett kännetecken för viskoelastiska material att deras mekaniska egenskaper beror på deformationshastigheten, där materialets styvhet ökar med den hastighet med vilken belastningen appliceras (intryckningshastighet)54. Således, genom att välja olika belastningshastigheter, genereras en familj av kraft-avståndskurvor, som var och en representerar de mekaniska egenskaperna hos det testade provet vid varje belastningshastighet52. Så när man försöker jämföra resultaten av olika arbeten är det viktigt att ta hänsyn till alla indragsparametrar. Sammantaget, vid mätning på mikrometerskalan (som i denna studie med en 5 μm sfärisk utskjutande spets), beter sig ledbrosk som ett ostrukturerat och enhetligt material, vilket genererar en kumulativ elasticitetsmodul som inkluderar både elastiska och viskösa bidrag till styvhet på grund av vävnadens poroviskoelastiska natur35.

Ett annat antagande i Hertz-modellen är att intryckningsdjupet är lägre än radien för den sfäriska utskjutande spetsen55. Intryckningsdjupet representerar den maximala förskjutningen av den utskjutande spetsen efter första kontakten med provet. Vid maximal belastning är det maximala intryckningsdjupet den totala förskjutningen av provet och den utskjutande spetsen. Bueckles riktlinje anger ett maximalt intryckningsdjup på 10 % av den totala tjockleken på ett prov med samma struktur underhela 56, annars varierar resultaten beroende på förhållandet mellan djup och tjocklek. För en fribärande spetsradie på 5 μm var broskexplantaten i denna studie indragna vid 1,1 μm i genomsnitt, med några få toppar på 3 μm i några få fall, särskilt för de mycket degenererade broskexplantaten. I det här fallet söktes en kompromiss, eftersom det i experimentmiljön krävs relativt höga krafter i samband med stora fördjupningar för att neutralisera ojämnheterna på ytan av degenererat brosk. En mildare inbuktning skulle resultera i undersökning av ytligt flimmer och kollagenfissurering, som båda är vanliga egenskaper hos starkt degenererat brosk57.

Avgörande för Hertz fit-modellen är också den korrekta identifieringen av den punkt där den utskjutande spetsen kommer i direkt kontakt med provet, allmänt kallad kontaktpunkten. Detta kan dock visa sig vara problematiskt när man drar in för klibbiga eller för mjuka prover, eftersom det kan resultera i flera kontaktpunkter mellan sond och prov58,59. I själva verket, som så fint betonats av A-Hassan et al., är den exakta bestämningen av kontaktpunkten ett av de mest irriterande problemenför mjuka biologiska vävnader. Denna effekt observerades också i de naturliga osteoartritiska broskexplantaten, eftersom vävnadsytan, beroende på degenerationsstadiet, förlorar sina ursprungliga mekaniska egenskaper och ofta är ojämn, vilket ger ytligt flimmer och klyvning (Figur 3B,C). Detta fenomen noterades särskilt i broskexplantaten där det dominerande cellmönstret var stora kluster (Figur 2C). Dessa inhomogeniteter i broskytan kan leda till flera kontaktpunkter mellan sond och prover och därmed felaktiga resultat. Stora nedböjningar observerades i vissa fall, följt av en snabb återhämtning av baslinjen före den slutliga sträckningen av kraft-avståndskurvan (figur 5A). Detta kan tillskrivas ett stort hinder i den utskjutande spetsens väg (t.ex. avancerade flimmerområden med fransigt och spjälkande brosk). I andra fall var den slutliga lutningen på kraft-avståndskurvan spridd med mindre oregelbundenheter (figur 5B), vilket indikerar kontakt med successivt mindre hinder (t.ex. mikroflimmer av vävnaden). I sådana fall måste mätstället mätas om eller till och med ändras för att säkerställa uppgifternas tillförlitlighet och reproducerbarhet. För detta ändamål är det också viktigt att noggrant inspektera AFM:s kraft-avståndskurva-utgång för korrekt identifiering av kontaktpunkten. Detta är en viktig punkt att vara medveten om, eftersom det har visat sig att en felaktig identifiering av kontaktpunkten med 50 nm resulterar i en felaktig uppskattning av värdet på E med storleksordningen61. Flera studier har börjat använda automatiserade metoder för att bestämma kontaktpunkten för kraft-avståndskurvor, med målet att kringgå subjektiv användarinmatning vid uppskattning av kontaktpunkten genom visuell inspektion och förbättra noggrannheten. Detta blir ännu mer avgörande när man har att göra med ett stort antal kraftförskjutningskurvor, som de som genereras i cellmekaniska mätningar47,62. Även om flera strategier har föreslagits för att automatisera kontaktpunktsbestämningen 47,63,64,65, är den optimala strategin starkt beroende av experimentella förhållanden och faktorer såsom modellen som används för att analysera data, sondens form, den (icke-)vidhäftande mekaniska interaktionen mellan den utskjutande spetsen och provet, samt provets (icke-)Hertzska beteende 63.

Provavvikelse är ett annat vanligt problem som kan orsaka artefakter och felaktig bestämning av kontaktpunkt (figur 3E). Det betyder i princip att provet inte är korrekt monterat i provhållaren (petriskålen) och att provet rör sig under AFM-mätningarna. Effekten är särskilt uttalad när AFM-konsolen flyttas till en ny mätplats. Denna aspekt kan lätt observeras under de faktiska mätningarna genom en plötslig förändring i fokalplanet. De resulterande kraft-avståndskurvorna har typiskt en bifasisk utsträckt lutning, med en svag stigning till en början, vilket motsvarar en minskning av det tomma utrymmet mellan skivans botten och petriskålen när skivan trycks ner av konsolen (se figur 3E), följt av en fastare lutning i den andra delen av sluttningen. vilket indikerar att skivan dras in ytterligare nu när den är i direkt kontakt med petriskålens botten (Figur 5C,D). För att övervinna förvrängningarna kan man försöka fixa proverna bättre genom att använda ett lämpligt provlim (figur 3D), hålla temperaturen konstant genom att stänga av externa värmekällor (lampor) för att undvika termisk drift och utföra snabba skanningsmätningar. I experimenten här observerade vi en fribärande avböjningsdrift som inträffade inom de första 15 minuterna efter att konsolen sänkts ner i media (på grund av plötsliga temperaturförändringar). Efter denna tidsförlopp är driften vanligtvis försumbar. Som ett resultat rekommenderar vi experimentatorn att noggrant undersöka baslinjen efter fribärande nedsänkning och att börja mäta när den har stabiliserats. Varaktigheten av denna process kan variera mycket beroende på vilken konsol som används.

En annan kritisk parameter för alla AFM-mätningar är börvärdet, som förenklat kan förenklas ett mått på den kraft som utskjutaren applicerar på provet. För kontaktläget (som används i denna studie) representerar börvärdet en viss avböjning av konsolen. När du utför flera skanningar eller flera platsrepetitioner, som i protokollet här, kan den fribärande spetsen adsorbera partiklar från provytan, vilket gör det ibland nödvändigt att ta bort utskjutaren, rengöra den ordentligt66 och sedan kalibrera om innan du fortsätter med mätningarna.

Medan AFM-mikrointryckningar ger nya och intressanta datainsamlingsmöjligheter, särskilt i samband med osteoartrit brosk, är konsistensen och reproducerbarheten av de data som produceras starkt beroende av flera parametrar, som beskrivs ovan. När man använder detta tillvägagångssätt för att bedöma de mekaniska förändringar som orsakas av broskvävnadsdegeneration, måste vissa pilotmätningar på olika rumsliga mönster först utföras för att skala upp resultaten till den specifika experimentella designen. Pilotmätningar av AFM bör utföras med det mest standardiserade förfarandet och ta tillräckligt många prover (t.ex. fem skivor) av samma mönster för att ge en indikation på omfattningen av datavariabiliteten. Detta är särskilt viktigt när man försöker kvantifiera och bedöma de tidigaste relevanta förändringarna i OA-styvhet (dvs. mellan enkla strängar och dubbla strängar, figur 4A). Faktum är att i en tidigare studie, med ett liknande tillvägagångssätt, visade vi att en provstorlek på 30 mänskliga prover krävdes för att bedöma biomekaniska förändringar i matrisen som en funktion av cellernas rumsliga organisation37.

Dessutom är många av de steg som presenteras i detta protokoll känsliga för mänskliga fel och är starkt beroende av operatörens erfarenhet. Med tanke på alla faktorer som kan påverka de faktiska AFM-resultaten är de absoluta E-värdena som rapporteras i denna studie inte generaliserbara och är ganska specifika för denna experimentella uppställning. Förhållandet som presenteras här mellan de olika Youngs moduler och de cellulära mönsterbaserade broskexplantaten (ju mer patologiskt det rumsliga mönstret, desto lägre elasticitetsmodul [EM] i brosket) påverkas inte, eftersom resultaten överensstämmer med tidigare studier som visar att styvhetsförändringar som en funktion av cellulär mönsterorganisation23,37.

Sammantaget visar detta steg-för-steg-protokoll funktionaliteten hos standardiserade 3D-nativa ledbroskexplantat, som inte bara är representativa för OA-drivna cellulära omorganisationshändelser som sträcker sig från debut till avancerad progression utan också är förknippade med en gradvis minskning av styvhet. Explantaten kan återspegla en tillförlitlig biomimetisk modell för att studera artros debut och progression, vilket gör det möjligt att testa och utveckla olika behandlingsmetoder ex vivo. Användningen av en sådan human explantationsmodell i kombination med AFM-baserad biomekanisk bedömning kan resultera i ett paradigmskifte för biomedicinsk forskning och läkemedelsindustrin, vilket banar väg för nya sätt att identifiera välbehövliga effektiva artrosläkemedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar ortopedkirurgerna från avdelningen för ortopedisk kirurgi vid universitetssjukhuset i Tübingen för att de har tillhandahållit vävnadsprover.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head  CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany JPK00518
Biocompatible sample glue  Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany H000033
Calcein AM Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA 14948 Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SAA-SPH-5UM Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device  Self-made  n/a Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope Leica Biosystems, Wetzlar, Germany DFC3000G
Cryotome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany CM3050S 
Data Processing Software for the AFM Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)  Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany 41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) Leica Biosystems, Wetzlar, Germany 11889113
Glass block cantiliver holder Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SP-90-05 Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine  Merck KGaA, Darmstadt, Germany F1315
Microscope glass slides Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS294775X50
Mounting medium With DAPI ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany 50011 Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany T-05-0117
Scalpel Feather Medical Products, Osaka, Japan 2023-01
Silicone Skirt Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSS IBM, Armonk, New York, USA SPSS Statistics 22 Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes  TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands SA6255012 Water-soluble embedding medium 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application of atomic force microscopy in cancer research. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 102 (2018).
  3. Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  4. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  5. Rabinovich, Y., et al. Atomic force microscopy measurement of the elastic properties of the kidney epithelial cells. Journal of Colloid and Interface Science. 285 (1), 125-135 (2005).
  6. Dufrêne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces. Nature Reviews Microbiology. 2 (6), 451-460 (2004).
  7. Cykowska, A., Danalache, M., Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Hofmann, U. K. Detecting early osteoarthritis through changes in biomechanical properties - A review of recent advances in indentation technologies in a clinical arthroscopic setup. Journal of Biomechanics. 132, 110955 (2022).
  8. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  9. Fuchs, J., Kuhnert, R., Scheidt-Nave, C. 12-Monats-Prävalenz von Arthrose in Deutschland. Journal of Health Monitoring. 2, 55-60 (2017).
  10. Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
  11. Ganz, R., Leunig, M., Leunig-Ganz, K., Harris, W. H. The etiology of osteoarthritis of the hip. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (2), 264-272 (2008).
  12. Saxby, D. J., Lloyd, D. G. Osteoarthritis year in review 2016: Mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (2), 190-198 (2017).
  13. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instructional Course Lectures. 47, 487-504 (1998).
  14. Braun, H. J., Gold, G. E. Diagnosis of osteoarthritis: Imaging. Bone. 51 (2), 278-288 (2012).
  15. Guermazi, A., Roemer, F. W., Burstein, D., Hayashi, D. Why radiography should no longer be considered a surrogate outcome measure for longitudinal assessment of cartilage in knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), 247 (2011).
  16. Guermazi, A., et al. Different thresholds for detecting osteophytes and joint space narrowing exist between the site investigators and the centralized reader in a multicenter knee osteoarthritis study--Data from the Osteoarthritis Initiative. Skeletal Radiology. 41 (2), 179-186 (2012).
  17. Bedson, J., Croft, P. R. The discordance between clinical and radiographic knee osteoarthritis: A systematic search and summary of the literature. BMC Musculoskeletal Disorders. 9 (1), 116 (2008).
  18. Dashefsky, J. H. Arthroscopic measurement of chondromalacia of patella cartilage using a microminiature pressure transducer. Arthroscopy. 3 (2), 80-85 (1987).
  19. Berkenblit, S. I., Frank, E. H., Salant, E. P., Grodzinsky, A. J. Nondestructive detection of cartilage degeneration using electromechanical surface spectroscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 116 (4), 384-392 (1994).
  20. Appleyard, R. C., Swain, M. V., Khanna, S., Murrell, G. A. The accuracy and reliability of a novel handheld dynamic indentation probe for analysing articular cartilage. Physics in Medicine and Biology. 46 (2), 541-550 (2001).
  21. Hsieh, C. H., et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (4), 480-488 (2008).
  22. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 4 (3), 186-192 (2009).
  23. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  24. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomaterialia. 126, 315-325 (2021).
  25. Eaton, P., Batziou, K. Artifacts and Practical Issues in Atomic Force Microscopy. Atomic Force Microscopy: Methods and Protocols. Santos, N. C., Carvalho, F. A. , Springer. New York, NY. 3-28 (2019).
  26. Danalache, M., et al. Exploration of changes in spatial chondrocyte organisation in human osteoarthritic cartilage by means of 3D imaging. Scientific Reports. 11, 9783 (2021).
  27. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  28. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  29. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
  30. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  31. Wilusz, R. E., DeFrate, L. E., Guilak, F. Immunofluorescence-guided atomic force microscopy to measure the micromechanical properties of the pericellular matrix of porcine articular cartilage. Journal of The Royal Society Interface. 9 (76), 2997-3007 (2012).
  32. Guilak, F., Ratcliffe, A., Lane, N., Rosenwasser, M. P., Mow, V. C. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 12 (4), 474-484 (1994).
  33. Billinghurst, R. C., et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. The Journal of Clinical Investigation. 99 (7), 1534-1545 (1997).
  34. Wu, P. J., et al. Detection of proteoglycan loss from articular cartilage using Brillouin microscopy, with applications to osteoarthritis. Biomedical Optics Express. 10 (5), 2457-2466 (2019).
  35. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: Validation with a gel-microfiber composite. Biophysical Journal. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  36. Moshtagh, P. R., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. The elastic modulus of articular cartilage at nano-scale and micro-scale measured using indentation type atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 22, 359-360 (2014).
  37. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 19, 109409 (2019).
  38. Houtman, E., et al. Human osteochondral explants: Reliable biomimetic models to investigate disease mechanisms and develop personalized treatments for osteoarthritis. Rheumatology and Therapy. 8 (1), 499-515 (2021).
  39. Anderson, J. R., Phelan, M. M., Foddy, L., Clegg, P. D., Peffers, M. J. Ex vivo equine cartilage explant osteoarthritis model: A metabolomics and proteomics study. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3652-3667 (2020).
  40. Chen, C. T., Torzilli, P. A. In vitro cartilage explant injury models. Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. Olson, S. A., Gauilak, F. , Springer. New York, NY. 29-40 (2015).
  41. Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. -C. An ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants. Journal of Visualized Experiments. (153), e59467 (2019).
  42. Rolauffs, B., Williams, J., Grodzinsky, A., E Kuettner, K., Cole, A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  43. Deveza, L. A., Loeser, R. F. Is osteoarthritis one disease or a collection of many. Rheumatology. 57, 34-42 (2018).
  44. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  45. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  46. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  47. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267 (2016).
  48. Mow, V. C., Kuei, S. C., Lai, W. M., Armstrong, C. G. Biphasic creep and stress relaxation of articular cartilage in compression? Theory and experiments. Journal of Biomechanical Engineering. 102 (1), 73-84 (1980).
  49. Armstrong, C. G., Lai, W. M., Mow, V. C. An analysis of the unconfined compression of articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 106 (2), 165-173 (1984).
  50. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5 (8), 636-640 (2006).
  51. Fischer-Friedrich, E., et al. Rheology of the active cell cortex in mitosis. Biophysical Journal. 111 (3), 589-600 (2016).
  52. Gould, T. E., Jesunathadas, M., Nazarenko, S., Piland, S. G. Chapter 6 - Mouth Protection in Sports. Materials in Sports Equipment (Second Edition). Subic, A. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 199-231 (2019).
  53. Kontomaris, S. V., Malamou, A. Hertz model or Oliver & Pharr analysis? Tutorial regarding AFM nanoindentation experiments on biological samples. Materials Research Express. 7 (3), 033001 (2020).
  54. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  55. Wu, C. -E., Lin, K. -H., Juang, J. -Y. Hertzian load-displacement relation holds for spherical indentation on soft elastic solids undergoing large deformations. Tribology International. 97, 71-76 (2016).
  56. Westbrook, J. H., Conrad, H. The Science of Hardness Testing and its Research Applications. , American Society for Metal. Metals Park, Ohio. (1973).
  57. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  58. Stylianou, A., Kontomaris, S. V., Grant, C., Alexandratou, E. Atomic force microscopy on biological materials related to pathological conditions. Scanning. 2019, 8452851 (2019).
  59. Sokolov, I. Atomic force microscopy in cancer cell research. Cancer Nanotechnology. 1, 1-17 (2007).
  60. Emad, A., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
  61. Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: Importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
  62. Shoelson, B., Dimitriadis, E. K., Cai, H., Kachar, B., Chadwick, R. S. Evidence and implications of inhomogeneity in tectorial membrane elasticity. Biophysical Journal. 87 (4), 2768-2777 (2004).
  63. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  64. Rudoy, D., Yuen, S. G., Howe, R. D., Wolfe, P. J. Bayesian change-point analysis for atomic force microscopy and soft material indentation. Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). 59 (4), 573-593 (2010).
  65. Benítez, R., Moreno-Flores, S., Bolós, V. J., Toca-Herrera, J. L. A new automatic contact point detection algorithm for AFM force curves. Microscopy Research and Technique. 76 (8), 870-876 (2013).
  66. Timashev, P. S., et al. Cleaning of cantilevers for atomic force microscopy in supercritical carbon dioxide. Russian Journal of Physical Chemistry B. 8 (8), 1081-1086 (2014).

Tags

Retraktion utgåva 188 Artikulär broskexplantation atomkraftsmikroskopi elastisk modul ex vivo-modell Hertz-modellindragning vävnadsberedning
Att ta itu med praktiska frågor i atomkraftsmikroskopibaserad mikrointryckning på humant ledbroskexplantat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daniel, C., Alexander, D., Umrath,… More

Daniel, C., Alexander, D., Umrath, F., Danalache, M. Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (188), e64371, doi:10.3791/64371 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter