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Bioengineering

Résolution de problèmes pratiques liés à la micro-indentation basée sur la microscopie à force atomique sur des explants de cartilage articulaire humain

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64371
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

Summary

Nous présentons une approche étape par étape pour identifier et résoudre les problèmes les plus courants associés aux micro-indentations de la microscopie à force atomique. Nous illustrons les problèmes émergents sur les explants de cartilage articulaire humain natif caractérisés par divers degrés de dégénérescence induite par l’arthrose.

Abstract

Sans aucun doute, la microscopie à force atomique (AFM) est actuellement l’une des techniques les plus puissantes et les plus utiles pour évaluer les micro et même nano-signaux dans le domaine biologique. Cependant, comme pour toute autre approche microscopique, des défis méthodologiques peuvent survenir. En particulier, les caractéristiques de l’échantillon, la préparation de l’échantillon, le type d’instrument et la sonde d’indentation peuvent entraîner des artefacts indésirables. Dans ce protocole, nous illustrons ces problèmes émergents sur des explants de cartilage articulaire sains et arthrosiques. À cette fin, nous montrons d’abord par une approche étape par étape comment générer, classer et classer visuellement des disques cartilagineux articulaires ex vivo selon différents stades de dégénérescence au moyen d’une grande imagerie par fluorescence en mosaïque 2D des explants de tissus entiers. La principale force du modèle ex vivo est qu’il comprend du cartilage humain natif et âgé qui permet d’étudier les changements liés à l’arthrose, de l’apparition précoce à la progression. En outre, les pièges courants dans la préparation des tissus, ainsi que la procédure AFM proprement dite ainsi que l’analyse des données ultérieure, sont également présentés. Nous montrons comment des étapes basiques mais cruciales telles que la préparation et le traitement des échantillons, les caractéristiques topographiques des échantillons causées par une dégénérescence avancée et l’interaction entre l’échantillon et la pointe de l’échantillon peuvent avoir un impact sur l’acquisition des données. Nous soumettons également à un examen minutieux les problèmes les plus courants de l’AFM et décrivons, dans la mesure du possible, comment les surmonter. La connaissance de ces limites est de la plus haute importance pour l’acquisition et l’interprétation correctes des données et, en fin de compte, l’intégration des résultats dans un contexte scientifique plus large.

Introduction

En raison de la taille toujours plus petite des appareils et des systèmes électroniques, le développement rapide de la technologie et des équipements micro et nano a pris de l’ampleur. L’un de ces dispositifs est la microscopie à force atomique (AFM), qui peut balayer des surfaces biologiques et récupérer des informations topographiques ou biomécaniques à l’échelle nanométrique et micrométrique 1,2. Parmi ses nombreuses fonctionnalités, cet outil peut être utilisé comme un micro- ainsi qu’un nano-pénétrateur pour obtenir des informations sur les propriétés mécaniques de divers systèmes biologiques 3,4,5,6. Les données sont collectées par contact physique avec la surface à travers une sonde mécanique, qui peut être aussi petite qu’environ 1 nm à son extrémité7. La déformation résultante de l’échantillon est alors affichée en fonction de la profondeur d’indentation de la pointe en porte-à-faux et de la force appliquée sur l’échantillon8.

L’arthrose est une maladie chronique dégénérative à long terme caractérisée par une détérioration du cartilage articulaire des articulations et des tissus environnants, ce qui peut entraîner une exposition complète des surfaces osseuses. Le fardeau de l’arthrose est considérable ; À l’heure actuelle, la moitié des femmes et un tiers des hommes âgés de 65 ans et plus souffrent d’arthrose9. Les traumatismes, l’obésité et l’altération de la biomécanique de l’articulation10 qui en résulte déterminent la dégénérescence du cartilage articulaire, qui est considérée comme un résultat final commun. L’étude pionnière de Ganz et al. a postulé que les premières étapes du processus d’arthrose peuvent impliquer les propriétés biomécaniques du cartilage11, et depuis lors, les chercheurs ont confirmé cette hypothèse12. De même, il est généralement admis que les propriétés biomécaniques du tissu sont fonctionnellement orchestrées par l’organisation ultrastructurale ainsi que par la diaphonie cellule-cellule et cellule-matrice. Toute altération peut avoir un impact considérable sur le fonctionnement biomécanique global des tissus13. À ce jour, le diagnostic d’arthrose est clinique et repose sur une radiographie sur film simple14. Cette approche est à double face : d’une part, l’absence d’un seuil dégénératif défini pour formuler le diagnostic d’arthrose rend la maladie difficile à quantifier et, d’autre part, les méthodes d’imagerie manquent de sensibilité et de standardisation et ne peuvent pas détecter les lésions cartilagineuses localisées15,16,17. À cette fin, l’évaluation des propriétés mécaniques du cartilage présente l’avantage décisif de décrire un paramètre qui change au cours de l’arthrose quelle que soit l’étiologie de la maladie et qui a une influence directe sur la fonctionnalité tissulaire à un stade très précoce. Les instruments d’indentation mesurent la force par laquelle le tissu résiste à l’indentation. En fait, il ne s’agit pas d’un concept nouveau ; Les premières études remontent aux années 1980 et 1990. Au cours de cette période, de nombreuses études ont suggéré que les instruments d’indentation conçus pour les mesures arthroscopiques du cartilage articulaire pourraient être bien adaptés pour détecter les changements dégénératifs dans le cartilage. Il y a encore 30 ans, certaines études ont pu démontrer que les instruments d’indentation étaient capables de détecter in vivo des changements à la surface du cartilage pendant la dégénérescence tissulaire en effectuant des mesures de rigidité compressive lors de l’arthroscopie18,19,20.

L’indentation AFM (AFM-IT) du cartilage articulaire fournit des informations sur une propriété mécanique essentielle du tissu, à savoir la rigidité. Il s’agit d’un paramètre mécanique qui décrit la relation entre une charge non destructive appliquée et la déformation résultante de la zone tissulaire dentelée21. L’AFM-IT s’est avérée capable de quantifier les modifications de la rigidité en fonction de l’âge dans les réseaux de collagène macroscopiquement non affectés, différenciant ainsi les changements pathologiques associés à l’apparition de l’arthrose (grade 0 sur l’échelle d’Outerbridge dans le cartilage articulaire)22. Nous avons précédemment montré que les AFM-ITs, sur la base de l’organisation spatiale des chondrocytes en tant que biomarqueur basé sur l’image pour la dégénérescence précoce du cartilage, permettent non seulement de quantifier mais aussi d’identifier les premiers changements mécaniques dégénératifs. Ces résultats ont déjà été confirmés par d’autres23,24. Par conséquent, l’AFM-IT agit comme un outil intéressant pour diagnostiquer et identifier les changements dégénératifs précoces. Ces changements peuvent déjà être mesurés au niveau cellulaire, ce qui redéfinit la compréhension du processus physiopathologique de l’arthrose.

Dans ce protocole, nous démontrons une procédure complète de classification histologique et biomécanique des explants de cartilage articulaire, de la préparation des explants de cartilage natif à l’acquisition et au traitement des données AFM. À travers une approche étape par étape, nous montrons comment générer, classer et classer visuellement le tissu cartilagineux articulaire selon différents stades de dégénérescence au moyen d’une imagerie 2D en grande mosaïque, suivie d’indentations micro-AFM.

Même si, à l’heure actuelle, l’AFM-IT est l’un des outils les plus sensibles pour mesurer les modifications biomécaniques du cartilage7, comme toute autre technique instrumentale, elle présente des limites et des particularités pratiques25 qui peuvent conduire à une acquisition erronée des données. À cette fin, nous soumettons à un examen minutieux les problèmes les plus courants qui surviennent lors des mesures AFM des explants de cartilage et décrivons, dans la mesure du possible, comment les minimiser ou les surmonter. Il s’agit notamment des aspects topographiques des échantillons et des difficultés à les stabiliser dans un environnement compatible avec l’AFM, des particularités physiques de la surface du tissu et des difficultés qui en résultent pour effectuer des mesures AFM sur de telles surfaces. Des exemples de courbes force-distance erronées sont également présentés, en mettant l’accent sur les conditions qui peuvent les provoquer. D’autres limitations inhérentes à la géométrie de la pointe en porte-à-faux et à l’utilisation du modèle Hertz pour l’analyse des données sont également discutées.

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Protocol

Des condyles fémoraux prélevés sur des patients subissant une arthroplastie totale du genou à l’hôpital universitaire de Tübingen, en Allemagne, ont été utilisés. Seuls des échantillons de cartilage articulaire provenant de patients atteints de pathologies articulaires dégénératives et post-traumatiques ont été inclus dans cette étude. L’approbation des comités d’éthique départementaux, institutionnels et locaux a été obtenue avant le début de l’étude (projet n° 674/2016BO2). Le consentement éclairé écrit de tous les patients a été reçu avant la participation.

NOTE : La figure 1 présente un organigramme des étapes de l’expérience dans leur ordre chronologique.

1. Traitement tissulaire et génération de disques cartilagineux

  1. Préparation des tissus
    1. Après la résection postopératoire, placer les échantillons de cartilage dans un récipient rempli de milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 5 % (v/v) de pénicilline-streptomycine. Assurez-vous que les échantillons sont complètement immergés dans le milieu. La durée entre la résection chirurgicale et le traitement ultérieur du cartilage ne doit pas dépasser 24 h. S’assurer que, tout au long du traitement, les échantillons sont complètement immergés dans le milieu pour éviter le dessèchement des échantillons.
    2. Coupez le cartilage de l’os à l’aide d’un scalpel.
  2. Génération de disques cartilagineux
    1. Générer des disques cartilagineux de 4 mm de diamètre à l’aide d’un poinçon de biopsie.
      REMARQUE : Il est important de sélectionner et de réséquer les zones du condyle où l’épaisseur de la couche de cartilage dépasse 1 mm. Cela peut être problématique, en particulier autour des zones porteuses, où la couche de cartilage perd généralement de son épaisseur en raison des processus d’usure ou de dégénérescence.
    2. Placez les disques cartilagineux de 4 mm précédemment générés sur un dispositif de coupe sur mesure et fixez et maintenez les disques cartilagineux stables à l’aide d’une spatule. Lors de la mise en place des disques cartilagineux sur le dispositif de coupe, des précautions doivent être prises. Positionnez les échantillons de manière à ce que la couche supérieure du cartilage (la zone superficielle du cartilage articulaire) ne fasse pas face à la lame
    3. Coupez les disques cartilagineux à l’aide d’une lame de rasoir. Des échantillons de cartilage en forme de disque de 4 mm x 1 mm sont ainsi générés. Pour éviter le dessèchement de l’échantillon, effectuez une coupe de tissu le plus rapidement possible.
    4. Prélever chaque disque à l’aide d’une spatule et placer les disques cartilagineux générés dans des tubes de 1,5 mL contenant 1 mL de DMEM complété par 5 % (v/v) de pénicilline-streptomycine. Placez environ 15 disques dans un tube.
  3. Cryotome sectionnant les disques cartilagineux (pour les coupes perpendiculaires)
    REMARQUE : Cette étape est facultative et peut être utilisée si une visualisation en vue latérale de la distribution du motif cellulaire dans les disques cartilagineux est souhaitée. Il peut être utilisé comme méthode de vérification car la distribution du motif cellulaire est une caractéristique 3D du cartilage articulaire26. Il est également possible d’utiliser des coupes optiques et des reconstructions 3D de l’ensemble des disques cartilagineux à l’aide d’un microscope confocal, ce qui élimine la nécessité de sectionner les échantillons comme décrit dans le protocole.
    1. Recouvrez le disque cartilagineux d’un milieu d’enrobage soluble dans l’eau et placez-le sur son bord sur le bouton du cryotome (avec la surface du disque perpendiculaire à la surface du bouton). Dans le dispositif cryotome, le milieu d’enrobage gèle à basse température.
    2. À l’aide d’un cryotome standard, sectionnez le tissu latéralement à une épaisseur de 60 μm jusqu’à ce que le milieu du disque soit atteint (c’est-à-dire lorsque les cryosections atteignent une longueur de 4 mm) et prélevez les tranches. En sectionnant l’explant discale perpendiculairement, toutes les zones du cartilage (superficielles, moyennes et profondes) peuvent être visualisées.
    3. Recueillir les sections sur une lame de verre et retirer le milieu d’enrobage soluble dans l’eau en lavant trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).

2. Tri des disques cartilagineux en fonction du modèle spatial cellulaire

  1. Coloration des échantillons de cartilage en forme de disque
    1. Placer un disque cartilagineux (section 1.2) dans chaque puits d’une plaque à 96 puits et ajouter 130 μL de colorant de fluorescence perméable aux cellules à une dilution de 1 :1 000 dans chaque puits.
    2. Inspectez visuellement l’ensemble de la plaque et assurez-vous qu’un seul disque est placé dans chaque puits. Incuber la plaque pendant 30 min dans l’incubateur de culture cellulaire standard à 37 °C.
  2. Coloration des tranches de cartilage de 60 μm
    1. Placez délicatement les sections du disque cartilagineux (section 1.3) sur des lames de microscope en verre à l’aide d’une pince.
    2. Recouvrez les sections de cartilage d’un milieu de montage contenant une contre-coloration nucléaire DAPI et placez délicatement des lamelles adaptées à la microscopie à fluorescence.
    3. Scellez les bords de chaque lamelle avec du vernis à ongles transparent ordinaire et laissez sécher pendant 3 min.
  3. Tri et imagerie du cartilage de haut en bas et de côté
    REMARQUE : Chaque disque doit être examiné au microscope à fluorescence. L’objectif de cette étape est de trier les disques en fonction de leur motif cellulaire prédominant (cordes simples, cordes doubles, petits amas, gros amas ou diffus).
    1. Placez la plaque à 96 puits sur le support de plaque du microscope à fluorescence.
    2. Choisir le filtre de fluorescence approprié de Em 495 nm/Ex 515 nm (pour l’imagerie descendante des disques cartilagineux préparés à la section 2.1.) ou Em 358 nm/Ex 461 nm (pour l’imagerie en vue latérale des coupes de cartilage préparées à la section 2.2) et l’objectif 10x.
      REMARQUE : L’utilisation de l’objectif 10x permet d’inspecter toute la circonférence du disque et d’exclure les échantillons présentant une coloration inhomogène ou incorrecte. Cependant, l’utilisation uniquement de la vue descendante peut entraîner la perception de changements dans l’organisation cellulaire à la suite de l’analyse des couches tissulaires plus profondes rendues visibles à l’observation descendante par érosion superficielle. À titre d’exemple, une corde ascendante suivant les arcades de collagène pourrait être perçue comme une cellule unique ou des cellules dispersées (motif diffus)26. Par conséquent, les deux côtés des disques doivent être inspectés pour s’assurer que le motif cellulaire est correctement sélectionné.
    3. Déterminer visuellement le motif cellulaire affiché dans chaque disque cartilagineux. Il est peu probable qu’un disque n’ait qu’un seul type de motif cellulaire. Pour la partie du disque où la disposition des chondrocytes ne correspond pas au motif d’intérêt, n’accepter les échantillons que si le motif indésirable se trouve à la périphérie même, là où les mesures AFM n’ont pas lieu (c’est-à-dire jusqu’à 0,5 mm du bord du disque), et s’assurer que cela ne dépasse pas 10 % de la surface totale du disque27, Chapitre 28.
  4. Acquisition d’images de l’ensemble des disques cartilagineux
    1. Sélectionnez l’objectif 10x du microscope et placez-le sous le puits présélectionné contenant un disque cartilagineux individuel. Concentrez-vous sur le disque pour voir le motif cellulaire.
    2. Sélectionnez la fonction Navigateur pour obtenir une vue d’ensemble de l’ensemble du puits. Utilisez le bouton gauche de la souris et faites-le glisser pour naviguer vers une autre position de scène. À l’aide de la molette de la souris, effectuez un zoom avant et arrière.
      REMARQUE : À ce stade, un aperçu du puits avec l’échantillon entier peut être vu en double-cliquant sur chaque zone d’intérêt de manière séquentielle.
    3. Sélectionnez un carré qui englobe la zone d’intérêt à numériser ; À ce stade, toutes les tuiles individuelles qui composent la mosaïque deviennent visibles.
    4. Ajustez l’exposition/l’intensité lumineuse de manière à ce que les cellules puissent être clairement visualisées à partir de l’arrière-plan. À ce stade, la luminosité/le contraste de l’image a été ajusté pour toutes les tuiles et ne peut plus être personnalisé individuellement pour chaque tuile.
      REMARQUE : Comme les cellules proches du bord du disque émettent souvent un signal de fluorescence plus élevé que les cellules au centre, les paramètres d’exposition/intensité lumineuse doivent être adaptés.
      1. Pour évaluer si le temps d’exposition est approprié pour un canal particulier, examinez la distribution du signal dans l’histogramme. En utilisant le mécanisme d’exposition automatique inclus dans le logiciel d’imagerie du microscope, visualisez toutes les cellules résidant dans le disque.
    5. Sélectionnez l’option Point de mise au point de la carte du logiciel, puis sélectionnez chaque tuile individuelle en cliquant avec le bouton gauche de la souris au centre de celle-ci.
    6. Sélectionnez l’option Carte de mise au point. Une fenêtre s’affiche avec toutes les tuiles précédemment sélectionnées. Double-cliquez sur une vignette de la liste pour l’afficher et la mettre au point.
    7. Cliquez sur Définir Z pour enregistrer le plan focal et passer à la vignette suivante. Après avoir ajusté le plan focal pour chaque mosaïque, commencez l’acquisition de l’image en appuyant sur Démarrer la numérisation.
      1. Si la numérisation affiche des barres horizontales et/ou verticales plus sombres, cela peut être dû à un éclairage inadéquat et inégal des images individuelles. Résolvez ce problème en utilisant l’option Linked Shading intégrée au logiciel avant l’analyse proprement dite.
    8. Enregistrez, exportez et annotez correctement les images.

3. Approche biomécanique des explants cartilagineux

  1. Préparation de l’échantillon pour les mesures AFM
    1. Fixez chaque disque cartilagineux présélectionné contenant un motif cellulaire (section 2) dans des boîtes de Pétri à l’aide d’une colle biocompatible. Ajoutez suffisamment d’échantillon de colle sur les côtés supérieur, inférieur, gauche et droit du disque.
    2. Recouvrez les disques de 2,5 mL de milieu L-15 de Leibovitz sans L-glutamine. Ajouter délicatement le milieu Leibowitz sur les échantillons pour éviter que l’échantillon ne se détache de la surface en raison des ondes créées par le milieu.
  2. Chargement des échantillons dans l’AFM
    1. Placez la boîte de Pétri dans le porte-échantillon de l’appareil AFM et allumez le chauffage de la boîte de Pétri réglé sur 37 °C. Laissez la boîte de culture tissulaire atteindre la température souhaitée. Ceci est fait pour exclure d’éventuels artefacts causés par la variation de température.
  3. Calibrage en porte-à-faux AFM
    1. Initialisez la configuration du logiciel comme décrit précédemment par Danalache et al.29.
    2. Sélectionnez un support en porte-à-faux en brique de verre approprié pour les mesures de liquide et placez-le soigneusement sur la tête AFM. Un mécanisme de verrouillage sécurise la brique de verre dans la tête de l’AFM. Assurez-vous que la surface réfléchissante de la brique de verre est droite et parallèle au support AFM.
    3. Placez le porte-à-faux sur la surface du support en porte-à-faux en brique de verre avec soin. Le porte-à-faux lui-même doit reposer sur le plan optique poli, au centre de la brique de verre.
    4. Placez soigneusement une jupe en silicone (membrane en silicone) sur la base du support en porte-à-faux afin d’éviter la condensation moyenne dans la tête de l’AFM.
    5. Abaissez le porte-à-faux par pas de 100 μm à l’aide de la fonction moteur pas à pas jusqu’à ce qu’il soit complètement immergé dans le fluide.
    6. Exécutez une approche de scanner avec les paramètres d’approche décrits par Danalache et al.29. Rétractez le porte-à-faux de 100 μm une fois que le fond de la boîte de Pétri est atteint.
    7. Calibrez le porte-à-faux en suivant les étapes exactes et exécutez les paramètres décrits par Danalache et al.29. À la fin de l’étalonnage, la déviation verticale est enregistrée et affichée en newtons (N) unités de force plutôt qu’en volts (V), l’unité de l’enregistrement d’origine par le détecteur à photodiode. Dans les expériences ici, un point de consigne de 4,47 nN a résulté après l’étalonnage.
    8. À l’aide de la fonction de moteur pas à pas, rétractez le porte-à-faux à 1 000 μm.
  4. Identification du site de mesure du cartilage souhaité sous l’AFM
    REMARQUE : En raison de l’épaisseur de 1 mm des disques cartilagineux, le porte-à-faux n’est pas visible dans le champ de vision lors de la navigation sur l’échantillon.
    1. Utilisez la caméra CCD du microscope pour identifier le porte-à-faux. Le porte-à-faux AFM doit être positionné dans une zone sans échantillon de la boîte de Pétri.
    2. Commencer une approche par scanner avec le porte-à-faux sur une zone propre et sans échantillon de la boîte de Pétri, en utilisant les mêmes paramètres que ceux décrits par Danalache et al.29.
    3. Rétractez davantage le porte-à-faux à 1,5 mm du bas de la plaque à l’aide de la commande du moteur pas à pas. Cette étape est cruciale afin d’éviter une collision directe entre le porte-à-faux et l’échantillon.
    4. Passez de la vue fond clair à la vue fluorescence et identifiez visuellement le haut du disque.
    5. Déplacez le porte-échantillon AFM d’exactement 2 mm vers le milieu du disque. Ce point est considéré comme le centre du disque cartilagineux.
    6. Effectuez une approche par scanner et, une fois que la surface du disque cartilagineux est atteinte, rétractez le porte-à-faux de 100 μm.
  5. Mesures de la courbe force-distance
    1. Concentrez-vous sur les cellules positionnées sur le site de mesure souhaité. Cliquez sur le bouton Exécuter pour lancer les mesures et la génération des courbes force-distance dans la position ciblée.
    2. Acquérir cinq courbes force-distance sur chaque site de mesure. Rétractez le porte-à-faux de 500 μm et déplacez-le vers le site de mesure suivant.
      REMARQUE : La rétraction du porte-à-faux est une étape cruciale, car la surface du disque cartilagineux n’est pas homogène et présente des irrégularités. Une butte élevée à la surface de l’échantillon peut entraîner une collision dramatique, entraînant des dommages indésirables à la pointe du porte-à-faux ou à l’échantillon. Nous recommandons de sélectionner un minimum de cinq sites de mesure différents dispersés sur la surface du disque et d’acquérir un minimum de cinq courbes force-distance à chaque site.
    3. Inspectez les courbes force-distance et enregistrez-les.
  6. Estimation des modules de Young à l’aide du modèle d’ajustement de Hertz
    1. Ouvrez les courbes force-distance générées à analyser (fichier .jpk) dans le logiciel d’analyse de données à l’aide de l’option Ouvrir un lot de courbes de spectroscopie .
    2. Sélectionnez le modèle d’ajustement Hertz , puis sélectionnez l’option d’ajustement de l’élasticité .
      1. L’option d’ajustement de l’élasticité effectue automatiquement les calculs suivants sur la courbe force-distance sélectionnée : calcule la ligne de base et soustrait de l’ensemble de la courbe pour supprimer le décalage de la ligne de base (la ligne de base est ramenée à zéro sur l’axe des y) ; détermine le point de contact en détectant le point où la courbe force-distance croise la ligne de force nulle (le point de contact est mis à zéro sur l’axe des abscisses) ; calcule la séparation pointe-échantillon (le signal de hauteur du piézoélectrique tenant compte de la flexion du porte-à-faux est soustrait) ; et ajuste automatiquement la courbe force-distance avec le modèle sélectionné. Si vous le souhaitez, chacune de ces étapes peut également être effectuée indépendamment.
    3. Adaptez-le à l’aide des paramètres d’ajustement suivants : un coefficient de Poisson de 0,5 et le rayon de pointe en porte-à-faux approprié.
      REMARQUE : Lors de l’utilisation d’un porte-à-faux avec une pointe sphérique en porte-à-faux, le modèle Hertz fit doit être utilisé. Le porte-à-faux utilisé dans cette étude avait une pointe sphérique d’un rayon de 5 μm. Nous recommandons d’ajuster la courbe force-distance jusqu’à ce que la force maximale appliquée soit atteinte (point de consigne).
    4. Vérifiez visuellement l’ajustement de la courbe force-distance pour vous assurer de son exactitude. Cette étape doit être effectuée pour chacune des courbes force-distance analysées.
  7. Détermination de la profondeur d’indentation
    REMARQUE : Selon l’outil d’analyse de données utilisé, ce processus peut différer. L’expérimentateur peut facilement lire la profondeur d’indentation en suivant une série d’étapes incluses dans le programme d’analyse des données.
    1. Ouvrez chacune des courbes force-distance générées dans le logiciel d’analyse de données et sélectionnez le modèle d’ajustement de Hertz comme processus d’analyse.
    2. Appliquez l’option Soustraire le décalage de la ligne de base à la mise à zéro de l’axe de déviation verticale (axe y) et sélectionnez la fonction Décalage + Inclinaison .
    3. Utilisez la fonction Rechercher un point de contact pour identifier automatiquement le point de contact , qui est automatiquement ramené à une coordonnée x de zéro.
    4. Soustrayez la distance en tenant compte uniquement de la déflexion en porte-à-faux de la hauteur piézoélectrique brute pendant l’indentation à l’aide de la fonction Position verticale de la pointe .
    5. Sélectionnez l’option Ajustement de l’élasticité pour afficher la courbe force-distance traitée et sélectionnez la zone du graphique de manière à ce qu’elle s’aligne avec la valeur la plus négative sur l’axe vertical de position de la pointe (axe des abscisses).
    6. Lisez et documentez l’indentation à partir de la zone X Min dans l’onglet des paramètres. Enregistrez et documentez les résultats.

4. Analyse statistique

  1. Ouvrez le logiciel de statistiques. Sélectionnez Nouveau jeu de données dans le menu déroulant.
  2. Ouvrez l’onglet Vue des variables après avoir sélectionné le fichier DataSet . Définissez les variables numériques pour chaque catégorie de motifs cellulaires : chaînes simples = SS, chaînes doubles = DS, petits clusters = SC, grands clusters = BC, diffus et modules de Young.
  3. Dans l’onglet de la vue des données, entrez les données des modules de Young mesurés pour chacune des catégories de modèles cellulaires correspondantes. Analysez la distribution des données en sélectionnant Analyser dans la barre de menus, puis Analyse exploratoire des données.
  4. Sélectionnez Modules de Young comme variable dépendante et Modèle cellulaire comme liste de facteurs. Une boîte à moustaches utilisée pour la section des résultats s’affiche parmi les résultats dans le fichier de sortie.
  5. Pour effectuer une analyse statistique, choisissez Échantillons dépendants dans la section de test non paramétrique de l’onglet de la barre de menus d’analyse. Sélectionnez Modules de Young en tant que champs de test et Modèle cellulaire en tant que groupes sous l’onglet Champs. Appuyez sur Exécuter.
    REMARQUE : Les résultats sont affichés dans le fichier de sortie. Pour l’analyse statistique, un test de Friedman est effectué.
  6. Incorporez les valeurs p du test non paramétrique dans la boîte à moustaches créée à l’étape 4.4. Enregistrez les résultats en cliquant sur Fichier dans la barre de menus et en sélectionnant Enregistrer.

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Representative Results

À l’aide d’un dispositif de coupe fabriqué par nos soins, nous avons pu explanter et générer de petits disques cartilagineux (4 mm x 1 mm) à partir de condyles humains frais contenant un seul motif spatial cellulaire30 de cordes simples (SS, Figure 2A), de cordes doubles (DS), de petits amas (SC), de grands amas (BC ; Figure 2A) et diffuse (Figure 2B). Un explant de cartilage représentatif est représenté à la figure 3A. La sélection des disques ne présentant qu’un seul type de motif a été effectuée à l’aide d’une imagerie par fluorescence descendante (Figure 2). La variation topographique du disque de surface cartilagineux a été illustrée par l’imagerie en vue latérale de coupes de 60 μm d’épaisseur générées à partir des disques cartilagineux (Figure 2C). À la surface des disques cartilagineux arthrosiques explantés, une fibrillation superficielle et une fente matricielle étaient présentes (Figure 3B,C). Cela était particulièrement notable dans les disques représentatifs de la progression avancée de l’arthrose, représentée par la présence de BC (Figure 2A). Après tri post-fluorescence, la rigidité des disques a été évaluée par micro-indentations AFM. À cette fin, les disques cartilagineux générés ont été fixés avec succès dans la boîte de Pétri AFM à l’aide d’une colle biocompatible (Figure 3D) afin d’éviter la dérive de l’échantillon pendant les mesures (Figure 3E). La quantité de colle utilisée doit être ajustée. Une quantité insuffisante de colle entraînera une instabilité du disque, tandis qu’un ajout excessif de colle peut entraîner une propagation indésirable de la colle sous et/ou sur le disque cartilagineux. Ce dernier conduit à des artefacts de mesure et à une mauvaise identification du disque au microscope à fluorescence. Une application inadéquate de colle ou des mouvements brusques de l’échantillon pendant la fixation sont des problèmes fréquents qui provoquent le détachement du tissu de la boîte de Pétri et doivent être évités.

Une réduction représentative de la rigidité graduelle le long de la disposition des motifs cellulaires est illustrée à la figure 4A. Les valeurs de rigidité étaient plus élevées dans les disques contenant une SS (médiane de 2,6 kPa) représentative des zones cartilagineuses saines non compromises. Avec l’apparition et la progression de l’arthrose, les mesures de l’AFM ont montré une forte diminution progressive de la rigidité de 42 % dans le DS (1,5 kPa), de 77 % dans le SC (0,6 kPa) et, finalement, de 88 % dans les stades avancés représentés par le BC (0,3 kPa ; Graphique 4A). Les disques contenant un motif diffus présentaient une élasticité élevée avec une variation importante des valeurs individuelles du module de Young. Pour tous les disques cartilagineux auxquels on a assigné une organisation cellulaire prédominante, la profondeur d’indentation associée au point de consigne utilisé (4,477 nN) s’est avérée inversement proportionnelle à la rigidité (Figure 4B). Une courbe force-distance générée représentative est illustrée à la figure 4C, et un ajustement de Hertz ainsi que l’identification du point de contact sont illustrés à la figure 4D.

L’ajustement correct dépend, entre autres, de la détermination correcte de la ligne de base. Si la détection automatique de la ligne de base est erronée (par exemple, en raison d’une ligne de base turbulente), l’ajustement peut également être déterminé manuellement et permet à l’utilisateur de sélectionner une ligne de base plus représentative pour les mesures. Cependant, si la courbe force-distance générée ne permet pas un ajustement correct, elle doit être écartée. La figure 5 montre des exemples de courbes force-distance incorrectes. Il peut être difficile de générer des courbes force-distance appropriées sur les explants de cartilage articulaire arthrosique en raison de la surface irrégulière du tissu, d’une part (des exemples sont présentés dans les figures 5A, B) et de l’instabilité de l’échantillon causée par une mauvaise fixation de l’échantillon (exemples illustrés dans les figures 5C et D). Les artéfacts peuvent être causés par de multiples points de contact entre la sonde et l’échantillon (en raison de la surface inégale du cartilage dégénéré) ou par un mouvement indésirable des tissus (visible par des changements dans le plan focal). Ces artefacts sont visibles dans les courbes force-distance générées et indiquent soit un contact sous-optimal entre le porte-à-faux de l’AFM et la surface cartilagineuse, soit une mauvaise fixation de l’échantillon à la boîte de Pétri (voir la figure 5A-D).

Figure 1
Figure 1 : Organigramme de la procédure expérimentale. Résumé des étapes expérimentales dans l’ordre chronologique, depuis les échantillons de cartilage réséqués en peropératoire jusqu’à la génération de disques cartilagineux de 4 mm x 1 mm, la coloration par fluorescence et le tri des disques sur la base de l’organisation des motifs cellulaires au moyen d’une imagerie descendante et latérale, et, enfin, l’évaluation de l’élasticité au moyen de mesures de force atomique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Imagerie par fluorescence de disques cartilagineux représentatifs. (A) Images 2D en mosaïque et un champ exemplaire zoomé de disques cartilagineux colorés avec un colorant perméable à la membrane cellulaire à un grossissement de 100x. Le disque supérieur affiche un disque représentatif à cordes simples, tandis que le disque inférieur est représentatif d’un grand disque en grappe (en bas). (B) Image en mosaïque d’un disque à motif diffus vu de la surface (en haut) et du même disque photographié de la face inférieure (en bas). (C) Vue latérale de la coloration nucléaire de tranches de disques cartilagineux de 60 μm. La barre d’échelle blanche représente 500 μm pour les images en mosaïque (champ de vision plus large, A [panneau de gauche], B, C) et 100 μm pour les images agrandies et nettes (A [panneau de droite]). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Disques cartilagineux explantés. (A) Image représentative d’un disque cartilagineux généré de 4 mm x 1 mm explant à partir de cartilage articulaire humain frais. La barre d’échelle représentée en blanc représente 2 mm. (B) Image représentative du cartilage arthrosique natif où la surface tissulaire présente une fibrillation superficielle et une fente visibles macroscopiquement. La barre d’échelle représentée en blanc représente 1 000 mm. (C) Représentation schématique de la surface du cartilage fibrillé. (D) Avant les mesures de l’AFM, chacun des explants du disque cartilagineux a été correctement fixé à la surface de la boîte de Pétri de l’AFM au moyen d’une colle d’échantillon biocompatible afin d’éviter les artefacts dus à la dérive de l’échantillon pendant les mesures d’indentation réelles, comme indiqué en (E). La barre d’échelle blanche représente 4 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Résultats représentatifs des mesures de microscopie à force atomique de disques cartilagineux triés sur la base de leur organisation cellulaire prédominante. (A) Boîte à moustaches affichant la médiane des modules de Young calculés de cinq disques, un pour chaque motif cellulaire, provenant d’un patient. Au total, 25 mesures ont été effectuées sur chaque disque (cinq mesures pour cinq sites de mesure distincts). La ligne noire à l’intérieur du rectangle représente la valeur médiane, les extrémités inférieure et supérieure du rectangle représentent respectivement les premier et troisième quartiles, et les barres d’erreur représentent les valeurs les plus basses et les plus élevées pour chaque groupe. (B) Tracé de points représentant les 125 points de profondeur d’indentation pour chaque motif cellulaire. (C) Courbes force-distance exemplaires acquises avec l’AFM avec un module de Young calculé de 0,4 kPa. (D) Une détermination représentative de l’ajustement de Hertz et du point de contact pour la courbe force-distance indiquée en (C). L’axe des abscisses affiche la position verticale de la pointe (c’est-à-dire la distance parcourue par le piézo, la longueur tenant compte de la flexion en porte-à-faux étant automatiquement soustraite de la partie de contact de la courbe force-distance). *p < 0,05. Pour l’analyse statistique, le test de Friedman a été utilisé. Abréviations : SS = chaînes simples ; DS = double cordes ; SC = petits amas ; BC = gros clusters. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Exemples de courbes force-distance erronées. (A) La courbe force-distance montre une déviation massive suivie d’une récupération près du niveau de base avant qu’une indentation continue de la surface ne soit observée. Ce phénomène peut être attribué à un obstacle relativement important (par exemple, de grandes fentes superficielles dépassant de la couche supérieure du cartilage). (B) La courbe force-distance étendue montre plusieurs petits pics. On pense que ces courbures sont causées par des irrégularités à micro-échelle sur la surface du cartilage (par exemple, la fibrillation). (C) et (D) affichent tous deux des courbes force-distance avec des trajectoires biphasiques. Les deux courbes force-distance sont représentatives d’une mauvaise fixation de l’échantillon et d’une dérive de l’échantillon. Il est également assez fréquent dans ces cas de voir un changement soudain dans le plan focal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

En tant que maladie progressive et multifactorielle, l’arthrose déclenche des changements structurels et fonctionnels dans le cartilage articulaire. Tout au long de l’arthrose, les altérations des caractéristiques mécaniques s’accompagnent de modifications structurelles et biochimiques à la surface du cartilage articulaire27,31. Les premiers événements pathologiques survenant dans l’arthrose sont l’épuisement des protéoglycanes associée à une perturbation du réseau de collagène32,33,34. De tels changements de surface subtils précoces sont difficiles à identifier avec des tests en vrac, car le comportement mécanique est moyenné sur toute la profondeur du tissu. De plus, une question qui n’a pas encore été abordée est de savoir si les changements fonctionnels au niveau des organes et des tissus sont liés à des changements structurels et fonctionnels à l’échelle micro ou nanométrique. À cette fin, l’AFM est considérée comme l’une des méthodes les plus sensibles, capable de détecter les premiers changements biomécaniques survenant avec l’apparition de l’arthrose7. Il permet des mesures de rigidité à l’échelle micrométrique et nanométrique dans des échantillons natifs, fournissant des informations sur les propriétés mécaniques du cartilage articulaire35,36. Dans ce protocole, à l’aide d’indentations micro-AFM, nous avons mesuré les propriétés élastiques d’explants humains de cartilage articulaire sain et arthrosique. Les résultats ont montré que les explants de cartilage sont très représentatifs des événements d’arthrose locale précoces, avec une diminution progressive notable de la rigidité survenant dans les explants de cartilage spécifiques au motif. De plus, les résultats sont conformes aux recherches publiées précédemment qui ont montré une diminution notable de la rigidité le long de l’organisation des motifs cellulaires23,24,27,37.

Des modèles humains natifs corroborés qui imitent divers aspects de la pathogenèse et de la progression de l’arthrose sont actuellement nécessaires pour combler les lacunes de la recherche translationnelle et les défis liés à la transposition des données in vitro dans un contexte clinique. À ce jour, aucun modèle ne peut représenter avec précision le compartiment cartilagineux natif de l’homme, et encore moins les tissus articulaires liés à l’âge qui sont sujets à l’arthrose en réponse à des stimuli déclencheurs de maladies38. Jusqu’à présent, les modèles à base d’explants les plus couramment utilisés étaient d’origine bovine ou bovine et appliquaient soit un traitement par cytokines inflammatoires fortes, soit une charge mécanique 39,40,41. Ce protocole, quant à lui, montre comment générer de petits échantillons de cartilage humain explantés (4 mm x 1 mm) en forme de disque, qui sont indicatifs des stades individuels d’événements d’arthrose spécifiques. Les explants de cartilage sont triés et les stades sont attribués à l’aide de l’organisation spatiale cellulaire comme biomarqueur basé sur l’image30,42. Étant donné que les changements précoces dans les propriétés biomécaniques peuvent déjà être identifiés et quantifiés dès que les doubles cordes commencent à apparaître23,27, à un stade où la surface du cartilage semble encore macroscopiquement intacte26, ce modèle basé sur l’explantation permet l’étude d’un compartiment cartilagineux natif local et peut fournir des informations perspicaces sur l’arthrose précoce. De plus, ce modèle de cartilage pourrait être utile pour étudier la réponse des cellules et de la matrice aux altérations mécaniques et inflammatoires dans un habitat local indigène3D 38,39. Étant relativement simples et faciles à générer, ces explants de cartilage peuvent également être utilisés pour étudier l’hétérogénéité de l’arthrose, qui est un facteur limitant dans le développement et la mise à l’essai de médicaments modificateurs de la maladie contre l’arthrose43. Il convient également de noter que l’évolutivité et la dépendance à l’égard des patients subissant une chirurgie de remplacement articulaire sont deux des lacunes du modèle.

Il est bien connu que le cartilage articulaire présente un comportement particulier en fonction du niveau d’échelle testé. Comme l’indiquent Loparic et al., à l’échelle microscopique, le cartilage se comporte comme un matériau non structuré et uniforme35, et une telle approche donne une approximation de la rigidité globale du cartilage localisée. En ce qui concerne la question de savoir si les micro- ou nano-indentations sont mieux adaptées, une étude réalisée en 2004 par Stolz et al.44 a comparé les indentations à l’échelle micro et nanométrique pour évaluer les propriétés structurelles et mécaniques du cartilage articulaire. Les auteurs ont souligné que pour l’indentation sphérique à l’échelle microscopique du cartilage articulaire, les composants structurels fins à l’échelle nanométrique (c’est-à-dire les fibres de collagène individuelles et les protéoglycanes) partagent généralement la tâche de supporter. À cet égard, les propriétés mécaniques de l’agrégat diffèrent nettement de celles des nanocomposants individuels. Les mêmes auteurs ont proposé qu’une combinaison de micro- et nano-indentations puisse être utilisée pour évaluer les profils de rigidité locale globale du cartilage articulaire, ainsi que la rigidité liée aux composants structurels fins44.

De nombreuses expériences d’indentation basées sur l’AFM ont utilisé des pointes pyramidales pointues en porte-à-faux (rayon = 15-20 nm)22,36,44 pour évaluer la mécanique du cartilage. Bien que les nanoindentations avec des porte-à-faux pointus soient actuellement considérées comme plus adaptées à l’évaluation des propriétés mécaniques les plus fines, les pointes sphériques en porte-à-faux produisent des résultats plus cohérents et plus faciles à modéliser et à interpréter lors de l’analyse d’échantillons biologiques mous44,45. De plus, Stolz et al. ont démontré que les nano-indentations AFM du cartilage articulaire dégradé enzymatiquement (c’est-à-dire l’élastase) ne sont pas possibles parce que le tissu devient si collant que l’adhérence de l’échantillon de pointe domine les courbes force-distance, ce qui rend les données irréalisables44.

Dans les mesures actuelles de l’AFM, un porte-à-faux avec une pointe sphérique en porte-à-faux d’un rayon de 5 μm a été utilisé. Le choix du porte-à-faux a été motivé par l’intention de faire la moyenne des propriétés mécaniques du tissu sur une surface assez grande tout en minimisant les dommages infligés à la surface du cartilage. La relation entre la force appliquée en porte-à-faux et l’indentation de l’échantillon résultante a été ajustée avec le modèle d’ajustement de Hertz. Lors de l’utilisation de pénétrateurs sphériques, il est recommandé d’utiliser le modèle d’ajustement Hertz, les forces d’attraction agissant entre la pointe en porte-à-faux et la surface de l’échantillon étant négligées46. Les équations du modèle hertzien sont présentées dans les équations 1 et 2.

Equation 1Éq.1

Equation 2Éq.2

Où F = force ; E = module de Young ; v = coefficient de Poisson ; δ = indentation ; a = rayon du cercle de contact ; et Rs = rayon de la sphère.

Le modèle calcule finalement l’élasticité cellulaire/tissulaire47, formellement exprimée sous la forme du module de Young (E). Le modèle d’ajustement Hertz prend en compte plusieurs caractéristiques telles que la forme et la taille de la pointe, l’indentation et la déformabilité de l’échantillon. Si ces exigences ne sont pas parfaitement remplies, le modèle peut fournir une estimation inexacte du module de Young46.

Le modèle d’ajustement de Hertz suppose que la déformation et la contrainte élastique dépendent linéairement du module d’élasticité, ce qui implique que l’indentation dans l’échantillon reste beaucoup plus petite que l’épaisseur de l’échantillon lui-même46. Cette hypothèse a été facilement respectée dans cette configuration, où les explants de cartilage avaient une épaisseur de 1 mm par rapport à des indentations de quelques micromètres.

Le cartilage articulaire peut être modélisé comme un matériau viscoélastique poreux48,49. Le comportement viscoélastique résulte du frottement entre les constituants intracellulaires/cytoplasmiques ou matriciels tels que les molécules, les organites et le réseau collagène-protéoglycane50,51. Comme leur nom l’indique, les matériaux viscoélastiques combinent deux propriétés distinctes : visqueux - le matériau se déforme lentement lorsqu’il est soumis à une charge externe - et élastique - le matériau revient à sa configuration initiale une fois la charge appliquée retirée52,53. Le comportement viscoélastique se manifeste par une hystérésis entre les courbes d’approche (étendue) et de rétraction dans les courbes force-distance 46,52, similaire à celles obtenues dans cette étude (Figure 4C). De plus, l’une des caractéristiques des matériaux viscoélastiques est que leurs propriétés mécaniques dépendent de la vitesse de déformation, la rigidité du matériau augmentant avec la vitesse d’application de la charge (vitesse d’indentation)54. Ainsi, en sélectionnant différentes vitesses de charge, une famille de courbes force-distance est générée, chacune d’entre elles représentant les propriétés mécaniques de l’échantillon testé à chaque vitesse de charge52. Ainsi, lorsque l’on tente de comparer les résultats de différents travaux, il est essentiel de prendre en compte tous les paramètres d’indentation. Dans l’ensemble, lors de la mesure à l’échelle micrométrique (comme dans cette étude avec une pointe sphérique en porte-à-faux de 5 μm), le cartilage articulaire se comporte comme un matériau non structuré et uniforme, générant un module d’élasticité cumulatif qui comprend à la fois des contributions élastiques et visqueuses à la rigidité en raison de la nature poroviscoélastique du tissu35.

Une autre hypothèse du modèle hertzien est que la profondeur d’indentation est inférieure au rayon de la pointe sphérique en porte-à-faux55. La profondeur d’indentation représente le déplacement maximal de la pointe en porte-à-faux après le premier contact avec l’échantillon. À la charge maximale, la profondeur d’indentation maximale est le déplacement total de l’échantillon et de la pointe en porte-à-faux. La ligne directrice de Bueckle stipule une profondeur d’indentation maximale de 10% de l’épaisseur totale d’un échantillon avec la même structure tout au long de56, sinon, les résultats varient en fonction du rapport profondeur/épaisseur. Pour un rayon de pointe en porte-à-faux de 5 μm, les explants de cartilage de cette étude ont été en retrait à 1,1 μm en moyenne, avec quelques pics de 3 μm dans quelques cas, en particulier pour les explants de cartilage fortement dégénérés. Dans ce cas, un compromis a été recherché, car, dans le cadre expérimental, des forces relativement élevées associées à de grandes indentations sont nécessaires pour neutraliser les irrégularités superficielles du cartilage dégénéré. Une indentation plus légère entraînerait l’examen d’une fibrillation superficielle et d’une fissuration du collagène, qui sont toutes deux des caractéristiques communes ducartilage fortement dégénéré.

Pour le modèle d’ajustement de Hertz, il est également crucial d’identifier correctement le point où la pointe en porte-à-faux entre en contact direct avec l’échantillon, appelé de manière générique le point de contact. Cependant, cela peut s’avérer problématique lors de l’indentation d’échantillons trop collants ou trop mous, car cela peut entraîner plusieurs points de contact sonde-échantillon58,59. En fait, comme l’ont si bien souligné A-Hassan et al., pour les tissus biologiques mous, la détermination précise du point de contact est l’un des problèmes les plus épineux60. Cet effet a également été observé dans les explants de cartilage arthrosique natif, car, selon le stade de dégénérescence, la surface tissulaire perd ses caractéristiques mécaniques natives et est souvent inégale, présentant une fibrillation superficielle et une fente (Figure 3B,C). Ce phénomène a été particulièrement observé dans les explants de cartilage où le schéma cellulaire dominant était constitué de gros amas (Figure 2C). Ces inhomogénéités à la surface du cartilage peuvent conduire à de multiples points de contact sonde-échantillon et, par conséquent, à des résultats erronés. D’importantes déviations ont été observées dans certains cas, suivies d’une récupération rapide de la ligne de base avant le dernier tronçon de la courbe force-distance (figure 5A). Cela pourrait être attribué à un obstacle important sur la trajectoire de la pointe en porte-à-faux (par exemple, des zones de fibrillation avancée avec du cartilage effiloché et fendant). Dans d’autres cas, la pente finale de la courbe force-distance était parsemée d’irrégularités plus petites (figure 5B), indiquant un contact avec des obstacles successivement plus petits (par exemple, une micro-fibrillation du tissu). Dans de tels cas, le site de mesure doit être remesuré ou même modifié pour garantir la fiabilité et la reproductibilité des données. À cette fin, il est également important d’inspecter soigneusement la courbe force-distance de sortie de l’AFM pour l’identification correcte du point de contact. Il s’agit d’un point crucial à prendre en compte, car il a été démontré qu’une identification incorrecte du point de contact à 50 nm entraîne une estimation erronée de la valeur de E d’un ordre de grandeur61. Plusieurs études ont commencé à utiliser des approches automatisées pour déterminer le point de contact des courbes force-distance, dans le but de contourner l’entrée subjective de l’utilisateur lors de l’estimation du point de contact par inspection visuelle et d’améliorer la précision. Cela devient encore plus crucial lorsqu’il s’agit d’un grand nombre de courbes force-déplacement, telles que celles générées dans les mesures de mécanique des cellules47,62. Bien que plusieurs stratégies aient été proposées pour automatiser la détermination du point de contact 47,63,64,65, la stratégie optimale dépend fortement des conditions expérimentales et de facteurs tels que le modèle utilisé pour analyser les données, la forme de la sonde, l’interaction mécanique (non-)adhésive entre la pointe en porte-à-faux et l’échantillon, ainsi que le comportement (non-)hertzien de l’échantillon 63.

La dérive de l’échantillon est un autre problème courant qui peut causer des artefacts et une détermination erronée du point de contact (figure 3E). Cela signifie essentiellement que l’échantillon n’est pas correctement monté dans le porte-échantillon (boîte de Pétri) et que l’échantillon se déplace pendant les mesures AFM. L’effet est particulièrement prononcé lors du déplacement du porte-à-faux AFM vers un nouveau site de mesure. Cet aspect peut être facilement observé lors des mesures réelles par un changement soudain du plan focal. Les courbes force-distance qui en résultent ont généralement une pente biphasique étendue, avec une légère élévation au début, correspondant au rétrécissement de l’espace vide entre le bas du disque et la boîte de Pétri lorsque le disque est poussé vers le bas par le porte-à-faux (voir Figure 3E), suivi d’une inclinaison plus ferme dans la deuxième section de la pente, ce qui indique que le disque est en plus dentelé maintenant qu’il est en contact direct avec le fond de la boîte de Pétri (Figure 5C,D). Pour surmonter les distorsions, on peut essayer de mieux fixer les échantillons en utilisant un adhésif adéquat pour les échantillons (Figure 3D), en maintenant la température constante en éteignant les sources de chaleur externes (lumières) pour éviter la dérive thermique, et en effectuant des mesures de balayage rapides. Dans les expériences ici, nous avons observé une dérive de déviation en porte-à-faux qui s’est produite dans les 15 premières minutes de l’immersion du porte-à-faux dans le milieu (en raison de changements soudains de température). Après ce laps de temps, la dérive est généralement négligeable. Par conséquent, nous conseillons à l’expérimentateur d’examiner attentivement la ligne de base après l’immersion en porte-à-faux et de commencer à mesurer une fois qu’elle s’est stabilisée. La durée de ce processus peut varier considérablement en fonction du porte-à-faux utilisé.

Un autre paramètre critique pour toute mesure AFM est le point de consigne, qui est, de manière simpliste, une mesure de la force appliquée par le porte-à-faux à l’échantillon. Pour le mode de contact (tel qu’il est utilisé dans cette étude), le point de consigne représente une certaine déviation du porte-à-faux. Lors de l’exécution de plusieurs scans ou de plusieurs répétitions de site, comme dans le protocole ici, la pointe en porte-à-faux peut adsorber les particules de la surface de l’échantillon, ce qui rend parfois nécessaire de retirer le porte-à-faux, de le nettoyer correctement66, puis de le recalibrer avant de procéder aux mesures.

Si les micro-indentations AFM offrent des opportunités de collecte de données nouvelles et intéressantes, notamment dans le contexte du cartilage arthrosique, la cohérence et la reproductibilité des données produites dépendent fortement de plusieurs paramètres, comme indiqué ci-dessus. Lors de l’utilisation de cette approche pour évaluer les changements mécaniques causés par la dégénérescence du tissu cartilagineux, des mesures pilotes sur divers modèles spatiaux doivent d’abord être effectuées afin d’adapter les résultats au plan expérimental spécifique. Les mesures pilotes de l’AFM doivent être effectuées selon la méthode la plus normalisable, en prélevant suffisamment d’échantillons (p. ex., cinq disques) du même modèle pour donner une indication de l’étendue de la variabilité des données. Ceci est particulièrement important lorsqu’il s’agit de quantifier et d’évaluer les premiers changements pertinents de rigidité de l’arthrose (c.-à-d. entre les cordes simples et les cordes doubles, figure 4A). En fait, dans une étude précédente, en utilisant une approche similaire, nous avons montré qu’une taille d’échantillon de 30 spécimens humains était nécessaire pour évaluer les changements biomécaniques de la matrice en fonction de l’organisation spatiale des cellules37.

De plus, bon nombre des étapes présentées dans ce protocole sont sujettes à l’erreur humaine et dépendent fortement de l’expérience de l’opérateur. Compte tenu de tous les facteurs qui peuvent influencer les résultats réels de l’AFM, les valeurs absolues de E rapportées dans cette étude ne sont pas généralisables et sont plutôt spécifiques à ce dispositif expérimental. Cependant, la relation présentée ici entre les différents modules de Young et les explants de cartilage basés sur des motifs cellulaires (plus le motif spatial est pathologique, plus le module d’élasticité [EM] du cartilage est faible) n’est pas affectée, car les résultats sont cohérents avec des études antérieures montrant des changements de rigidité en fonction de l’organisation du modèle cellulaire23,37.

Dans l’ensemble, ce protocole étape par étape démontre la fonctionnalité des explants de cartilage articulaire natif 3D standardisés, qui sont non seulement représentatifs des événements de réorganisation cellulaire induits par l’arthrose allant de l’apparition à la progression avancée, mais sont également associés à une diminution progressive de la rigidité. Les explants peuvent refléter un modèle biomimétique fiable pour l’étude de l’apparition et de la progression de l’arthrose, permettant de tester et de développer différentes modalités de traitement ex vivo. L’utilisation d’un tel modèle d’explant humain en combinaison avec une évaluation biomécanique basée sur l’AFM pourrait entraîner un changement de paradigme pour la recherche biomédicale et l’industrie pharmaceutique, ouvrant la voie à de nouvelles façons d’identifier les médicaments efficaces contre l’arthrose.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions les chirurgiens orthopédistes du service de chirurgie orthopédique de l’hôpital universitaire de Tübingen pour avoir fourni les échantillons de tissus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head  CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany JPK00518
Biocompatible sample glue  Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany H000033
Calcein AM Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA 14948 Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SAA-SPH-5UM Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device  Self-made  n/a Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope Leica Biosystems, Wetzlar, Germany DFC3000G
Cryotome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany CM3050S 
Data Processing Software for the AFM Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)  Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany 41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) Leica Biosystems, Wetzlar, Germany 11889113
Glass block cantiliver holder Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SP-90-05 Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine  Merck KGaA, Darmstadt, Germany F1315
Microscope glass slides Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS294775X50
Mounting medium With DAPI ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany 50011 Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany T-05-0117
Scalpel Feather Medical Products, Osaka, Japan 2023-01
Silicone Skirt Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program - SPSS IBM, Armonk, New York, USA SPSS Statistics 22 Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes  TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands SA6255012 Water-soluble embedding medium 

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Rétraction Numéro 188 Explants de cartilage articulaire microscopie à force atomique modules élastiques modèle ex vivo indentation du modèle de Hertz préparation tissulaire
Résolution de problèmes pratiques liés à la micro-indentation basée sur la microscopie à force atomique sur des explants de cartilage articulaire humain
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Daniel, C., Alexander, D., Umrath, F., Danalache, M. Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (188), e64371, doi:10.3791/64371 (2022).

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