Summary
Atomik kuvvet mikroskobu mikro girintileriyle ilgili en yaygın sorunları belirlemek ve ele almak için adım adım bir yaklaşım sunuyoruz. Çeşitli derecelerde osteoartrit kaynaklı dejenerasyon ile karakterize edilen yerli insan eklem kıkırdak eksplantlarında ortaya çıkan sorunları örneklendiriyoruz.
Abstract
Şüphesiz, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) şu anda biyolojik alandaki mikro ve hatta nano ipuçlarını değerlendirmek için en güçlü ve kullanışlı tekniklerden biridir. Bununla birlikte, diğer mikroskobik yaklaşımlarda olduğu gibi, metodolojik zorluklar ortaya çıkabilir. Özellikle, numunenin özellikleri, numune hazırlama, alet tipi ve girinti probu istenmeyen artefaktlara yol açabilir. Bu protokolde, ortaya çıkan bu sorunları sağlıklı ve osteoartritik eklem kıkırdağı eksplantları üzerinde örneklendiriyoruz. Bu amaçla, ilk olarak, tüm doku eksplantlarının büyük 2D mozaik floresan görüntülemesi yoluyla, farklı dejenerasyon aşamalarına göre ex vivo eklem kıkırdak disklerinin nasıl oluşturulacağını, derecelendirileceğini ve görsel olarak nasıl sınıflandırılacağını adım adım gösteriyoruz. Ex vivo modelin en büyük gücü, erken başlangıçtan ilerlemeye kadar osteoartrit ile ilişkili değişikliklerin araştırılmasına izin veren yaşlı, yerli, insan kıkırdağını içermesidir. Ek olarak, doku hazırlamadaki yaygın tuzakların yanı sıra gerçek AFM prosedürü ve sonraki veri analizi de sunulmaktadır. Numune hazırlama ve işleme, gelişmiş dejenerasyonun neden olduğu topografik numune özellikleri ve numune-uç etkileşimi gibi temel ancak önemli adımların veri toplamayı nasıl etkileyebileceğini gösteriyoruz. Ayrıca AFM'deki en yaygın sorunları incelemeye tabi tutuyoruz ve mümkün olduğunda bunların nasıl üstesinden gelineceğini açıklıyoruz. Bu sınırlamaların bilinmesi, doğru veri toplama, yorumlama ve nihayetinde bulguların geniş bir bilimsel bağlama yerleştirilmesi için son derece önemlidir.
Introduction
Elektronik cihazların ve sistemlerin sürekli küçülen boyutu nedeniyle, mikro ve nano tabanlı teknoloji ve ekipmanların hızlı gelişimi ivme kazanmıştır. Böyle bir cihaz, biyolojik yüzeyleri tarayabilen ve hem nano hem de mikrometre ölçeklerinde topografik veya biyomekanik bilgileri alabilenatomik kuvvet mikroskobudur (AFM) 1,2. Geniş özellikleri arasında, bu araç, çeşitli biyolojik sistemlerin mekanik özellikleri hakkında bilgi edinmek için bir mikro ve bir nano girinti olarak çalıştırılabilir 3,4,5,6. Veriler, ucunda yaklaşık 1 nm kadar küçük olabilen mekanik bir prob aracılığıyla yüzeyle fiziksel temas yoluyla toplanır7. Numunenin ortaya çıkan deformasyonu daha sonra konsol ucunun girinti derinliğine ve numuneye uygulanan kuvvetegöre görüntülenir 8.
Osteoartrit (OA), eklemlerde ve çevre dokularda eklem kıkırdağının bozulması ile karakterize, kemik yüzeylerinin tamamen açığa çıkmasına yol açabilen uzun süreli dejeneratif kronik bir hastalıktır. AE'nin yükü büyüktür; Şu anda, 65 yaş ve üstü tüm kadınların yarısı ve tüm erkeklerin üçte biri OA9'dan muzdariptir. Travmalar, obezite ve bunun sonucunda eklemindeğişmiş biyomekaniği 10, ortak bir sonuç olarak görülen eklem kıkırdak dejenerasyonunu belirler. Ganz ve arkadaşlarının öncü çalışması, OA sürecinin ilk adımlarının kıkırdak11'in biyomekanik özelliklerini içerebileceğini öne sürdü ve o zamandan beri araştırmacılar bu hipotezidoğruladılar 12. Benzer şekilde, dokunun biyomekanik özelliklerinin, hücre-hücre ve hücre-matris karışmasının yanı sıra ultrastrüktürel organizasyon tarafından işlevsel olarak düzenlendiği genel olarak kabul edilir. Herhangi bir değişiklik, genel doku biyomekanik işleyişini önemli ölçüde etkileyebilir13. Bugüne kadar, OA tanısı kliniktir ve düz film radyografisine dayanmaktadır14. Bu yaklaşım iki yönlüdür: birincisi, OA tanısını formüle etmek için tanımlanmış bir dejeneratif kesme eşiğinin olmaması, durumun ölçülmesini zorlaştırır ve ikincisi, görüntüleme yöntemleri duyarlılık ve standardizasyondan yoksundur ve lokalize kıkırdak hasarını tespit edemez15,16,17. Bu amaçla, kıkırdağın mekanik özelliklerinin değerlendirilmesi, hastalığın etiyolojisinden bağımsız olarak OA'nın seyri sırasında değişen ve çok erken bir aşamada doku işlevselliği üzerinde doğrudan etkisi olan bir parametreyi tanımlaması gibi belirleyici bir avantaja sahiptir. Girinti aletleri, dokunun girintiye direnme kuvvetini ölçer. Bu aslında yeni bir kavram değil; En eski çalışmalar 1980'lere ve 1990'lara kadar uzanıyor. Bu dönemde, çok sayıda çalışma, eklem kıkırdağının artroskopik ölçümleri için tasarlanmış indentasyon aletlerinin kıkırdaktaki dejeneratif değişiklikleri saptamak için çok uygun olabileceğini düşündürmektedir. 30 yıl önce bile, bazı çalışmalar, girinti aletlerinin artroskopi sırasında basınç sertliği ölçümleri yaparak doku dejenerasyonu sırasında kıkırdak yüzeyindeki in vivo değişiklikleri tespit edebildiğini gösterebildi18,19,20.
Eklem kıkırdağının AFM girintisi (AFM-IT), dokunun önemli bir mekanik özelliği, yani sertlik hakkında bilgi sağlar. Bu, uygulanan, tahribatsız bir yük ile girintili doku alanının21 ortaya çıkan deformasyonu arasındaki ilişkiyi tanımlayan mekanik bir parametredir. AFM-IT'nin makroskopik olarak etkilenmemiş kollajen ağlarında sertlikteki yaşa bağlı değişiklikleri ölçebildiği, böylece OA başlangıcı ile ilişkili patolojik değişiklikler arasında ayrım yapabildiği gösterilmiştir (eklem kıkırdağında Outerbridge ölçeğinde derece 0)22. Daha önce, AFM-IT'lerin, erken kıkırdak dejenerasyonu için görüntü tabanlı bir biyobelirteç olarak uzamsal kondrosit organizasyonu temelinde, en erken dejeneratif mekanik değişikliklerin yalnızca ölçülmesine değil, aynı zamanda gerçekten belirlenmesine de izin verdiğini göstermiştik. Bu bulgular başkaları tarafından zaten doğrulanmıştır23,24. Bu nedenle, AFM-IT, erken dejeneratif değişiklikleri teşhis etmek ve tanımlamak için ilginç bir araç görevi görür. Bu değişiklikler zaten hücresel düzeyde ölçülebilir ve OA patofizyolojik sürecinin anlaşılmasını yeniden şekillendirir.
Bu protokolde, doğal kıkırdak eksplantlarının hazırlanmasından AFM veri toplama ve işlemeye kadar eklem kıkırdak eksplantlarının eksiksiz bir histolojik ve biyomekanik derecelendirme prosedürünü gösteriyoruz. Adım adım bir yaklaşımla, eklem kıkırdak dokusunun farklı dejenerasyon aşamalarına göre nasıl oluşturulacağını, derecelendirileceğini ve görsel olarak sınıflandırılacağını, 2D büyük mozaik görüntüleme ve ardından mikro-AFM girintileri ile gösteriyoruz.
Şu anda, AFM-IT, kıkırdaktaki7 biyomekanik değişiklikleri ölçmek için en hassas araçlardan biri olmasına rağmen, diğer herhangi bir enstrümantal teknik gibi, hatalı veri toplamaya yol açabilecek sınırlamaları ve pratik özellikleri25 vardır. Bu amaçla, kıkırdak eksplantlarının AFM ölçümleri sırasında ortaya çıkan en yaygın sorunları incelemeye tabi tutuyoruz ve mümkünse bunların nasıl en aza indirileceğini veya üstesinden gelineceğini açıklıyoruz. Bunlar, numunelerin topografik yönlerini ve bunları AFM uyumlu bir ortamda stabilize etmenin zorluklarını, doku yüzeyinin fiziksel özelliklerini ve bu tür yüzeylerde AFM ölçümlerinin gerçekleştirilmesinde ortaya çıkan zorlukları içerir. Hatalı kuvvet-mesafe eğrilerinin örnekleri de sunulmakta ve bunlara neden olabilecek koşullar vurgulanmaktadır. Konsol ucunun geometrisine özgü ek sınırlamalar ve veri analizi için Hertz modelinin kullanımı da tartışılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Almanya'da Tübingen Üniversite Hastanesi'nde total diz artroplastisi yapılan hastalardan toplanan femoral kondiller kullanıldı. Bu çalışmaya sadece dejeneratif ve posttravmatik eklem patolojileri olan hastalardan alınan eklem kıkırdak örnekleri dahil edildi. Çalışma başlamadan önce bölüm, kurum ve yerel etik kurul onayı alınmıştır (Proje no.674/2016BO2). Katılım öncesi tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.
NOT: Deney adımlarının kronolojik sırasına göre bir akış şeması Şekil 1'de verilmiştir.
1. Doku işleme ve kıkırdak disklerinin oluşturulması
- Doku hazırlığı
- Ameliyat sonrası rezeksiyonu takiben, kıkırdak örneklerini %5 (h/h) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) ile dolu bir kaba koyun. Numunelerin ortama tamamen daldırıldığından emin olun. Cerrahi rezeksiyon ile kıkırdağın daha fazla işlenmesi arasındaki süre 24 saati geçmemelidir. Numunenin kurumasını önlemek için tüm işlem boyunca numunelerin tamamen ortama daldırıldığından emin olun.
- Bir neşter kullanarak kıkırdağı kemikten kesin.
- Kıkırdak disk üretimi
- Biyopsi zımbası kullanarak 4 mm çapında kıkırdak diskleri oluşturun.
NOT: Kıkırdak tabakası kalınlığının 1 mm'yi geçtiği kondil bölgelerinin seçilmesi ve çıkarılması önemlidir. Bu, özellikle kıkırdak tabakasının tipik olarak aşınma ve yıpranma süreçleri veya dejenerasyon nedeniyle kalınlığını kaybettiği yük taşıma bölgelerinde sorunlu olabilir. - Önceden oluşturulmuş 4 mm'lik kıkırdak diskleri özel yapım bir kesme cihazına yerleştirin ve kıkırdak diskleri bir spatula yardımıyla sabitleyin ve sabit tutun. Kıkırdak diskleri kesme cihazına yerleştirirken dikkatli olunmalıdır. Numuneleri, kıkırdağın en üst tabakası (eklem kıkırdağının yüzeysel bölgesi) bıçağa bakmayacak şekilde konumlandırın
- Kıkırdak diskleri jiletle kesin. Böylece 4 mm x 1 mm'lik disk şeklinde kıkırdak örnekleri oluşturulur. Numunenin kurumasını önlemek için, doku kesimini mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin.
- Her diski bir spatula yardımıyla toplayın ve oluşturulan kıkırdak disklerini %5 (h/h) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş 1 mL DMEM içeren 1,5 mL'lik tüplere yerleştirin. Bir tüpe yaklaşık 15 disk yerleştirin.
- Biyopsi zımbası kullanarak 4 mm çapında kıkırdak diskleri oluşturun.
- Kıkırdak disklerin kriyotom kesiti (dik dilimler için)
NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve kıkırdak diskleri içindeki hücresel patern dağılımının yandan görünüşlü bir görselleştirmesi isteniyorsa kullanılabilir. Hücresel paternin dağılımı eklem kıkırdağının 3 boyutlu bir özelliği olduğu için bir doğrulama yöntemi olarak kullanılabilir26. Konfokal mikroskop kullanılarak tüm kıkırdak disklerinin optik kesitleri ve 3D rekonstrüksiyonları da kullanılabilir, bu nedenle numunelerin protokolde açıklandığı gibi kesitlenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır.- Kıkırdak diskini suda çözünür gömme ortamı ile örtün ve kriyotom düğmesinin kenarına yerleştirin (diskin yüzeyi düğmenin yüzeyine dik olacak şekilde). Kriyotom cihazında, gömme ortamı düşük sıcaklıklarda donar.
- Standart bir kriyotom kullanarak, diskin ortasına ulaşılana kadar (yani kriyoseksiyonlar 4 mm uzunluğa ulaştığında) dokuyu 60 μm kalınlığında yanlara doğru bölümlere ayırın ve dilimleri toplayın. Disk eksplantını dik olarak bölümlere ayırarak, kıkırdağın tüm bölgeleri (yüzeysel, orta ve derin) görselleştirilebilir.
- Bölümleri bir cam slayt üzerinde toplayın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayarak suda çözünür gömme ortamını çıkarın.
2. Hücresel uzamsal modelin bir fonksiyonu olarak kıkırdak disk sıralaması
- Disk şeklindeki kıkırdak örneklerinin boyanması
- 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir kıkırdak diski (bölüm 1.2) yerleştirin ve her oyuğa 1:1.000 seyreltmede 130 μL hücre geçirgen floresan boya ekleyin.
- Tüm plakayı görsel olarak inceleyin ve her bir oyuğa yalnızca bir disk yerleştirildiğinden emin olun. Plakayı 37 ° C'de standart hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika inkübe edin.
- 60 μm'lik kıkırdak dilimlerinin boyanması
- Kıkırdak disk kesitlerini (bölüm 1.3) forseps yardımıyla cam mikroskop lamlarına nazikçe yerleştirin.
- Kıkırdak bölümlerini nükleer DAPI karşı boyama içeren montaj ortamı ile örtün ve floresan mikroskobu için uygun lameller hafifçe yerleştirin.
- Her lamelin kenarlarını normal şeffaf oje ile kapatın ve 3 dakika kurumasını bekleyin.
- Yukarıdan aşağıya ve yandan görünüşlü kıkırdak sıralama ve görüntüleme
NOT: Her disk floresan mikroskobu altında incelenmelidir. Bu adımın amacı, diskleri baskın hücresel modellerine (tek sicimler, çift sicimler, küçük kümeler, büyük kümeler veya dağınık) göre sıralamaktır.- 96 oyuklu plakayı floresan mikroskobunun plaka tutucusuna yerleştirin.
- Em 495 nm/Ex 515 nm (bölüm 2.1'de hazırlanan kıkırdak disklerinin yukarıdan aşağıya görüntülenmesi için) veya Em 358 nm/Ex 461 nm (bölüm 2.2'de hazırlanan kıkırdak bölümlerinin yandan görünüm görüntülemesi için) ve 10x objektif için uygun floresan filtresini seçin.
NOT: 10x objektifin kullanılması, diskin tüm çevresinin incelenmesine olanak tanır ve homojen olmayan veya uygun olmayan boyamaya sahip numuneler hariç tutulabilir. Bununla birlikte, yalnızca yukarıdan aşağıya görünümün kullanılması, yüzeysel erozyon ile yukarıdan aşağıya gözlem için görünür hale getirilen daha derin doku katmanlarının analizinin bir sonucu olarak hücresel organizasyondaki değişikliklerin algılanmasına neden olabilir. Örnek olarak, kollajen kemerlerini takip eden artan bir ip, tek bir hücre veya dağınık hücreler (dağınık desen) olarak algılanabilir26. Sonuç olarak, uygun hücresel model seçimini sağlamak için disklerin her iki tarafı da incelenmelidir. - Her kıkırdak diskinde görüntülenen hücresel deseni görsel olarak belirleyin. Bir diskin yalnızca bir tür hücresel modele sahip olması olası değildir. Diskin kondrosit düzenlemesinin ilgilenilen modelle eşleşmediği kısmı için, numuneleri yalnızca istenmeyen desen AFM ölçümlerinin yapılmadığı (yani, disk sınırından 0,5 mm'ye kadar) en çevredeyse kabul edin ve bunun diskin toplam yüzeyinin %10'unu geçmediğinden eminolun 27, 28.
- Tüm kıkırdak disklerinin görüntü alımı
- Mikroskobun 10x objektifini seçin ve ayrı bir kıkırdak diski içeren önceden seçilmiş kuyunun altına yerleştirin. Hücresel deseni görmek için diske odaklanın.
- Tüm kuyuya genel bir bakış elde etmek için Gezgin İşlevini seçin. Farklı bir sahne konumuna gitmek için farenin sol düğmesini kullanın ve sürükleyin. Fare tekerleği ile yakınlaştırın ve uzaklaştırın.
NOT: Bu noktada, her bir ilgi alanına sırayla çift tıklanarak tüm numuneyi içeren kuyunun bir önizlemesi görülebilir. - Taranacak ilgi alanını kapsayan bir kare seçin; Bu noktada, mozaiği oluşturan tüm tek karolar görünür hale gelecektir.
- Hücrelerin arka plandan net bir şekilde görselleştirilebilmesi için pozlamayı/ışık yoğunluğunu ayarlayın. Bu noktada, resmin parlaklığı/kontrastı tüm döşemeler için ayarlanmıştır ve artık her döşeme için ayrı ayrı özelleştirilemez.
NOT: Diskin kenarına yakın hücreler genellikle merkezdeki hücrelerden daha yüksek bir floresan sinyali yaydığından, pozlama/ışık yoğunluğu ayarlarının uyarlanması gerekir.- Pozlama süresinin belirli bir kanal için uygun olup olmadığını değerlendirmek için, histogramdaki sinyalin dağılımını inceleyin. Mikroskobun görüntü yazılımında bulunan otomatik pozlama mekanizmasını kullanarak, disk içinde bulunan tüm hücreleri görselleştirin.
- Yazılımın Odak Haritası Noktası seçeneğini seçin ve ardından ortasına sol tıklayarak her bir döşemeyi seçin.
- Odak Haritası seçeneğini seçin. Önceden seçilen tüm kutucukları içeren bir pencere görüntülenir. Görüntülemek ve doğru odağa getirmek için listedeki bir kutucuğa çift tıklayın.
- Odak planını kaydetmek ve bir sonraki kutucuğa geçmek için Z Ayarla'yı tıklatın. Her bir döşeme için odak planını ayarladıktan sonra, Taramayı Başlat'a basarak görüntü almaya başlayın.
- Tarama daha koyu yatay ve/veya dikey çubuklar görüntülüyorsa, bunun nedeni tek karelerin yanlış ve eşit olmayan şekilde aydınlatılması olabilir. Bunu, gerçek taramadan önce yazılımda bulunan Bağlantılı Gölgelendirme seçeneğini kullanarak çözün.
- Görüntüleri kaydedin, dışa aktarın ve doğru şekilde açıklama ekleyin.
3. Kıkırdak eksplantlarının biyomekanik yaklaşımı
- AFM ölçümleri için numune hazırlama
- Hücresel bir desen (bölüm 2) içeren önceden seçilmiş her kıkırdak diskini biyouyumlu yapıştırıcı ile Petri kaplarına sabitleyin. Diskin üst, alt, sol ve sağ taraflarına yeterli miktarda numune yapıştırıcısı ekleyin.
- Diskleri L-glutamin içermeyen 2,5 mL Leibovitz L-15 ortamı ile örtün. Ortam tarafından oluşturulan dalgalar nedeniyle numunenin yüzeyden ayrılmasını önlemek için Leibowitz ortamını numunelerin üzerine nazikçe ekleyin.
- Numunelerin AFM'ye yüklenmesi
- Petri kabını AFM cihazının numune tutucusuna yerleştirin ve 37 °C'ye ayarlanmış Petri bulaşık ısıtıcısını açın. Doku kültürü kabının istenen sıcaklığa ulaşmasına izin verin. Bu, sıcaklık değişiminin neden olduğu olası artefaktları dışlamak için yapılır.
- AFM-konsol kalibrasyonu
- Yazılım kurulumunu daha önce Danalache ve ark.29 tarafından açıklandığı gibi başlatın.
- Sıvı ölçümleri için uygun bir cam blok konsol tutucu seçin ve dikkatlice AFM kafasına yerleştirin. Bir kilitleme mekanizması, cam bloğu AFM kafasına sabitler. Cam bloğun yansıtıcı yüzeyinin düz ve AFM tutucuya paralel olduğundan emin olun.
- Konsolu cam blok konsol tutucunun yüzeyine dikkatlice yerleştirin. Konsolun kendisi, cam bloğun ortasındaki cilalı optik düzlem üzerinde durmalıdır.
- AFM kafasında orta yoğuşmayı önlemek için konsol tutucunun tabanına dikkatlice bir silikon etek (silikon membran) yerleştirin.
- Step motor fonksiyonunu kullanarak konsolu 100 μm'lik adımlarla tamamen ortama daldırılana kadar indirin.
- Danalache ve ark.29 tarafından açıklanan yaklaşım parametreleriyle bir tarayıcı yaklaşımı çalıştırın. Petri kabının dibine ulaşıldığında konsolu 100 μm geri çekin.
- Tam adımları kullanarak konsolu kalibre edin ve Danalache ve ark.29 tarafından açıklanan parametreleri çalıştırın. Kalibrasyonun sonunda, dikey sapma kaydedilir ve fotodiyot dedektörü tarafından orijinal kayıt birimi olan volt (V) yerine Newton (N) kuvvet birimlerinde görüntülenir. Buradaki deneylerde, kalibrasyondan sonra 4.47 nN'lik bir ayar noktası ortaya çıktı.
- Step motor fonksiyonunu kullanarak konsolu 1.000 μm'ye kadar geri çekin.
- AFM altında istenen kıkırdak ölçüm yerinin belirlenmesi
NOT: Kıkırdak disklerin kalınlığının 1 mm olması nedeniyle, numune üzerinde gezinirken konsol görüş alanında görünmez.- Konsolu tanımlamak için mikroskobun CCD kamerasını kullanın. AFM konsolu, Petri kabının numune alınmayan bir alanına yerleştirilmelidir.
- Danalache ve ark.29 tarafından açıklanan parametrelerin aynısını kullanarak, Petri kabının temiz, örneksiz bir alanında konsol ile bir tarayıcı yaklaşımı başlatın.
- Step motor kontrolü ile konsolu plakanın altından 1.5 mm uzağa geri çekin. Bu adım, konsol ile numune arasında doğrudan bir çarpışmayı önlemek için çok önemlidir.
- Parlak alandan floresan görünümüne geçin ve diskin üst kısmını görsel olarak belirleyin.
- AFM numune tutucuyu diskin ortasına doğru tam olarak 2 mm hareket ettirin. Bu nokta kıkırdak diskin merkezi olarak kabul edilir.
- Bir tarayıcı yaklaşımı çalıştırın ve kıkırdak diskin yüzeyine ulaşıldığında, konsolu 100 μm geri çekin.
- Kuvvet-mesafe eğrisi ölçümleri
- İstenilen ölçüm bölgesinde konumlandırılan hücrelere odaklanın. Ölçümleri ve hedeflenen konumda kuvvet-mesafe eğrilerinin oluşturulmasını başlatmak için Çalıştır düğmesine tıklayın.
- Her ölçüm bölgesinde beş kuvvet-mesafe eğrisi elde edin. Konsolu 500 μm geri çekin ve konsolu bir sonraki ölçüm alanına taşıyın.
NOT: Kıkırdak disk yüzeyi homojen olmadığı ve düzensizlikleri olduğu için konsolun geri çekilmesi çok önemli bir adımdır. Numunenin yüzeyindeki yüksek bir tepecik, dramatik bir çarpışmaya neden olarak istenmeyen konsol ucuna/numune hasarına yol açabilir. Diskin yüzeyine dağılmış en az beş farklı ölçüm bölgesi seçmenizi ve her bölgede en az beş kuvvet mesafesi eğrisi elde etmenizi öneririz. - Kuvvet mesafesi eğrilerini inceleyin ve kaydedin.
- Hertz uyum modeli kullanılarak Young moduli'nin tahmini
- Analiz edilecek oluşturulan kuvvet-mesafe eğrilerini (.jpk dosyası) veri analiz yazılımında Toplu Spektroskopi Eğrileri Aç seçeneğini kullanarak açın.
- Hertz sığdırma modelini seçin ve ardından Esneklik sığdırma seçeneğini belirleyin.
- Esneklik sığdırma seçeneği, seçilen kuvvet mesafesi eğrisi üzerinde aşağıdaki hesaplamaları otomatik olarak gerçekleştirir: taban çizgisini hesaplar ve taban çizgisi uzaklığını kaldırmak için tüm eğriden çıkarır (taban çizgisi y ekseninde sıfıra geri getirilir); kuvvet-mesafe eğrisinin sıfır kuvvet çizgisini geçtiği noktayı tespit ederek temas noktasını belirler (temas noktası x ekseninde sıfıra ayarlanır); uç-numune ayrımını hesaplar (konsolun bükülmesini hesaba katan piezo'nun yükseklik sinyali çıkarılır); ve kuvvet-mesafe eğrisini seçilen modele otomatik olarak uyar. İstenirse, bu adımların her biri bağımsız olarak da gerçekleştirilebilir.
- Aşağıdaki uyum parametrelerini kullanarak uyarlayın: 0,5 Poisson oranı ve uygun konsol ucu yarıçapı.
NOT: Küresel konsol uçlu bir konsol kullanırken, Hertz fit modeli kullanılmalıdır. Bu çalışmada kullanılan konsol, 5 μm yarıçaplı küresel bir uca sahipti. Uygulanan maksimum kuvvete ulaşılana kadar (ayar noktası) kuvvet mesafesi eğrisini takmanızı öneririz. - Doğruluğu sağlamak için kuvvet-mesafe eğrisinin uyumunu görsel olarak kontrol edin. Bu adım, analiz edilen kuvvet-mesafe eğrilerinin her biri için yapılmalıdır.
- Girinti derinliği belirleme
NOT: Kullanılan veri analiz aracına bağlı olarak bu işlem farklılık gösterebilir. Deneyci, veri analiz programında yer alan bir dizi adımı izleyerek girinti derinliğini kolayca okuyabilir.- Oluşturulan kuvvet-mesafe eğrilerinin her birini veri analiz yazılımında açın ve analiz süreci olarak Hertz fit Modelini seçin.
- Dikey sapma eksenini (y ekseni) sıfırlamak için Taban Çizgisi Uzaklığını Çıkar seçeneğini uygulayın ve Kaydırma + Eğim işlevini seçin.
- Otomatik olarak sıfır x koordinatına getirilen temas noktasını otomatik olarak tanımlamak için Temas Noktası Bul işlevini kullanın.
- Dikey Uç Konumu işlevini kullanarak, girinti sırasında ham piezo yüksekliğinden yalnızca konsol sapmasını hesaba katan mesafeyi çıkarın.
- İşlenmiş kuvvet-mesafe eğrisini görüntülemek için Esneklik Sığdırma seçeneğini belirleyin ve grafiğin alanını, Dikey Uç Konumu Ekseninde (x ekseni) en negatif değerle hizalanacak şekilde seçin.
- Girintiyi parametre sekmesindeki X Min kutusundan okuyun ve belgeleyin. Sonuçları kaydedin ve belgeleyin.
4. İstatistiksel analiz
- İstatistik yazılımını açın. Açılan menüden Yeni Veri Kümesi'ni seçin.
- DataSet dosyasını seçtikten sonra Değişken Görünümü sekmesini açın. Her hücresel örüntü kategorisi için sayısal değişkenleri tanımlayın: tek diziler = SS, çift diziler = DS, küçük kümeler = SC, büyük kümeler = BC, dağınık ve Young moduli.
- Veri görünümü sekmesinde, karşılık gelen hücresel model kategorilerinin her biri için ölçülen Young modül verilerini girin. Menü çubuğundan Çözümle'yi ve ardından Araştırmacı Veri Analizi'ni seçerek veri dağıtımını analiz edin.
- Bağımlı değişken olarak Young'ın Moduli'sini ve faktör listesi olarak Hücresel Model'i seçin. Sonuçlar bölümü için kullanılan bir kutu çizimi, çıktı dosyasındaki sonuçlar arasında görüntülenir.
- İstatistiksel bir analiz yapmak için, analiz menü çubuğu sekmesinin parametrik olmayan test bölümünde Bağımlı Örnekler'i seçin. Alanlar sekmesi altında Test Alanları olarak Young's Moduli'yi ve Gruplar olarak Hücresel Desen'i seçin. Çalıştır'a basın.
NOT: Sonuçlar çıktı dosyasında görüntülenir. İstatistiksel analiz için bir Friedman testi yapılır. - Parametrik olmayan testin p değerlerini, adım 4.4'te oluşturulan kutu grafiğine dahil edin. Menü çubuğunda Dosya'ya tıklayıp Kaydet'i seçerek sonuçları kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kendi kendine yapılan bir kesme cihazı kullanarak, tek bir hücresel uzamsal desen içeren taze insan kondillerinden küçük (4 mm x 1 mm) kıkırdak diskleri çıkarabildik ve üretebildik30 tek sicim (SS, Şekil 2A), çift sicimler (DS), küçük kümeler (SC), büyük kümeler (BC; Şekil 2A) ve dağınık (Şekil 2B). Temsili bir kıkırdak eksplantı Şekil 3A'da gösterilmiştir. Yalnızca bir tür desen gösteren disklerin seçimi, yukarıdan aşağıya floresan görüntüleme kullanılarak yapılmıştır (Şekil 2). Kıkırdak yüzey diskinin topografik varyasyonu, kıkırdak disklerinden oluşturulan 60 μm kalınlığındaki kesitlerin yandan görüntülenmesi ile daha da gösterilmiştir (Şekil 2C). Ekilen osteoartritik kıkırdak disklerin yüzeyinde yüzeyel fibrilasyon ve matriks yarıkları mevcuttu (Şekil 3B,C). Bu, özellikle BC'nin varlığı ile temsil edilen ileri OA ilerlemesini temsil eden disklerde dikkat çekiciydi (Şekil 2A). Floresan sonrası sıralamayı takiben, disklerin sertliği AFM mikro girintileri ile değerlendirildi. Bu amaçla, üretilen kıkırdak diskleri, ölçümler sırasında numunenin sürüklenmesini önlemek için biyouyumlu yapıştırıcı (Şekil 3D) vasıtasıyla AFM Petri kabına başarılı bir şekilde sabitlendi (Şekil 3E). Kullanılan tutkal miktarı ayarlanmalıdır. Yetersiz miktarda yapıştırıcı disk instabilitesine neden olurken, çok fazla yapıştırıcı eklemek, yapıştırıcının kıkırdak diskin altına ve/veya üstüne istenmeyen bir şekilde yayılmasına neden olabilir. Sonuncusu, ölçüm artefaktlarına ve floresan mikroskobu altında diskin zayıf tanımlanmasına yol açar. Yetersiz yapıştırıcı uygulaması veya fiksasyon sırasında numunenin ani hareketleri, dokunun Petri kabından ayrılmasına neden olan sık karşılaşılan sorunlardır ve bundan kaçınılmalıdır.
Hücresel model düzenlemesinin yanı sıra temsili bir kademeli sertlik azalması Şekil 4A'da gösterilmektedir. Sertlik değerleri, bozulmamış fundalık kıkırdak alanlarını temsil eden SS (medyan 2.6 kPa) içeren disklerde daha yüksekti. OA başlangıcı ve ilerlemesi ile AFM ölçümleri, DS'de (1.5 kPa) sertlikte% 42, SC'de% 77 (0.6 kPa) ve nihayetinde BC ile temsil edilen ileri aşamalarda% 88'lik güçlü bir kademeli azalma gösterdi (0.3 kPa; Şekil 4A). Dağınık bir desen içeren diskler, Young modülü tek değerlerinin önemli bir varyasyonu ile yüksek bir elastikiyet sergiledi. Atanmış baskın hücresel patern organizasyonuna sahip tüm kıkırdak diskleri için, kullanılan ayar noktası (4.477 nN) ile ilişkili girinti derinliğinin sertlik ile ters orantılı olduğu bulundu (Şekil 4B). Temsili olarak oluşturulan bir kuvvet-mesafe eğrisi Şekil 4C'de gösterilmiştir ve bir Hertz uyumu ve temas noktasının tanımlanması Şekil 4D'de gösterilmiştir.
Doğru uyum, diğer faktörlerin yanı sıra, taban çizgisinin doğru belirlenmesine bağlıdır. Otomatik referans değer algılama hatalıysa (örneğin, türbülanslı bir referans değer nedeniyle), uyum manuel olarak da belirlenebilir ve kullanıcının ölçümler için daha temsili bir referans değer seçmesine olanak tanır. Bununla birlikte, oluşturulan kuvvet-mesafe eğrisi uygun bir oturuşa izin vermiyorsa, atılmalıdır. Şekil 5, yanlış kuvvet-mesafe eğrilerinin örneklerini göstermektedir. Osteoartritik eklem kıkırdağı eksplantları üzerinde uygun kuvvet-mesafe eğrileri oluşturmak, bir yandan dokunun düzensiz yüzeyi (örnekler Şekil 5A,B'de gösterilmiştir) ve numunenin yanlış numune fiksasyonundan kaynaklanan kararsızlığı (Şekil 5C,D'de gösterilen örnekler) nedeniyle zor olabilir. Artefaktlar, çoklu prob-numune temas noktalarından (dejenere kıkırdağın pürüzlü yüzeyi nedeniyle) veya istenmeyen doku hareketinden (odak düzlemindeki değişikliklerle görülebilir) kaynaklanabilir. Bu artefaktlar, oluşturulan kuvvet-mesafe eğrilerinde görülebilir ve AFM konsolu ile kıkırdak yüzeyi arasında optimal olmayan bir temasın veya Petri kabına yanlış numune fiksasyonunun göstergesidir (bkz. Şekil 5A-D).
Şekil 1: Deneysel prosedürün akış şeması. İntraoperatif olarak rezeke edilen kıkırdak örneklerinden başlayarak 4 mm x 1 mm kıkırdak disklerin oluşturulmasına, yukarıdan aşağıya ve yandan görüntüleme yoluyla hücresel patern organizasyonuna göre disklerin floresan boyanması ve sıralanmasına ve son olarak atomik kuvvet ölçümleri ile elastikiyet değerlendirmesine kadar deneysel adımların kronolojik sırayla özeti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Temsili kıkırdak disklerinin floresan görüntülemesi. (A) Mozaik 2D görüntüler ve 100x büyütmede hücre zarı geçirgen boya ile boyanmış yakınlaştırılmış örnek bir kıkırdak disk alanı. Üstteki disk, temsili bir tek telli diski gösterirken, alttaki büyük bir küme diskini (altta) temsil eder. (B) Dağınık desenli bir diskin yüzeyden (üstte) ve aynı diskin alttan (altta) görülen mozaik resmi. (C) Kıkırdak disklerinin 60 μm dilimlerinin nükleer boyanmasının yandan görünümü. Beyaz ölçek çubuğu, mozaik resimler için 500 μm'yi (daha geniş görüş alanı, A [sol panel], B, C) ve yakınlaştırılmış, odaklanmış resimler için 100 μm'yi (A[sağ panel]) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ekilen eklem kıkırdak diskleri. (A) Taze insan eklem kıkırdağından üretilen 4 mm x 1 mm kıkırdak diskinin temsili görüntüsü. Beyaz renkle gösterilen ölçek çubuğu 2 mm'yi temsil eder. (B) Doku yüzeyinin makroskopik olarak görülebilen yüzeysel fibrilasyon ve yarık gösterdiği doğal osteoartritik kıkırdağın temsili görüntüsü. Beyaz renkle gösterilen ölçek çubuğu 1.000 mm'yi temsil eder. (C) Fibrillenmiş kıkırdak yüzeyinin şematik gösterimi. (D) AFM ölçümlerinden önce, kıkırdak disk eksplantlarının her biri, (E)'de gösterildiği gibi gerçek girinti ölçümleri sırasında numune kaymasından kaynaklanan artefaktları önlemek için AFM Petri kabının yüzeyine biyo-uyumlu numune yapıştırıcısı vasıtasıyla düzgün bir şekilde sabitlendi. Beyaz ölçek çubuğu 4 mm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Eklem kıkırdak disklerinin atomik kuvvet mikroskobu ölçümlerinin temsili sonuçları, baskın hücresel model organizasyonlarına göre sıralanmıştır . (A) Bir hastadan kaynaklanan, her hücresel model için bir tane olmak üzere, hesaplanan Young modülünün beş diskin medyanını gösteren kutu grafiği. Her diskte toplam 25 ölçüm yapıldı (beş farklı ölçüm bölgesi için beş ölçüm). Dikdörtgenin içindeki siyah çizgi medyan değeri, dikdörtgenin alt ve üst uçları sırasıyla birinci ve üçüncü çeyrekleri temsil eder ve hata çubukları her grup için en düşük ve en yüksek değerleri temsil eder. (B) Her hücresel model için 125 girinti derinliği noktasını gösteren nokta çizimi. (C) 0.4 kPa'lık hesaplanmış bir Young modülü ile AFM ile elde edilen örnek kuvvet-mesafe eğrileri. (D) (C)'de gösterilen kuvvet-mesafe eğrisi için temsili bir Hertz uyum ve temas noktası belirlemesi. X ekseni dikey uç konumunu gösterir (bu, piezo tarafından geçilen mesafedir, konsol bükülmesini hesaba katan uzunluk, kuvvet-mesafe eğrisinin temas kısmından otomatik olarak çıkarılır). *p < 0.05. İstatistiksel analiz için Friedman testi kullanıldı. Kısaltmalar: SS = tek dizeler; DS = çift dizeler; SC = küçük kümeler; BC = büyük kümeler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hatalı kuvvet-mesafe eğrilerine örnekler . (A) Kuvvet-mesafe eğrisi, yüzeyin sürekli bir girintisi gözlemlenmeden önce taban çizgisi seviyesine yakın bir toparlanmanın ardından büyük bir sapma gösterir. Bu fenomen nispeten büyük bir engele bağlanabilir (örneğin, kıkırdağın en üst tabakasından çıkıntı yapan büyük yüzey yarıkları). (B) Uzatılmış kuvvet-mesafe eğrisi birden fazla küçük tepe noktası gösterir. Bu eğriliklerin kıkırdak yüzeyindeki mikro ölçekli düzensizliklerden (örneğin fibrilasyon) kaynaklandığı düşünülmektedir. Hem (C) hem de (D) bifazik kurslarla kuvvet-mesafe eğrilerini gösterir. Her iki kuvvet-mesafe eğrisi de zayıf numune fiksasyonunu ve numune sürüklenmesini temsil eder. Bu durumlarda odak düzleminde ani bir değişiklik görmek de oldukça yaygındır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İlerleyici ve multifaktöriyel bir hastalık olan OA, eklem kıkırdağında yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri tetikler. OA seyri boyunca, mekanik özelliklerdeki bozulmalara eklem kıkırdağı yüzeyindeki yapısal ve biyokimyasal değişiklikler eşlik eder27,31. OA'da meydana gelen en erken patolojik olaylar, kollajen ağının bozulması ile birlikte proteoglikan tükenmesidir32,33,34. Bu tür erken ince yüzey değişikliklerinin toplu testlerle tespit edilmesi ve tanımlanması zordur, çünkü mekanik davranışın tüm doku derinliği boyunca ortalaması alınır. Ek olarak, organ ve doku seviyelerindeki fonksiyonel değişikliklerin mikro veya nano ölçekli yapısal ve fonksiyonel değişikliklerle ilişkili olup olmadığı hala ele alınmamış bir sorudur. Bu amaçla, AFM, OA başlangıcı ile meydana gelen en erken biyomekanik değişiklikleri tespit edebilen en hassas yöntemlerden biri olarak kabul edilir7. Doğal numunelerde hem mikro hem de nanometre ölçeklerinde sertlik ölçümlerine izin vererek eklem kıkırdağının mekanik özellikleri hakkında bilgi sağlar35,36. Bu protokolde, mikro-AFM indentasyonları kullanılarak, sağlıklı ve osteoartritik eklem kıkırdağı insan eksplantlarının elastik özelliklerini ölçtük. Sonuçlar, kıkırdak eksplantlarının, paterne özgü kıkırdak eksplantlarında meydana gelen sertlikte kayda değer kademeli bir azalma ile erken lokal OA olaylarını yüksek oranda temsil ettiğini gösterdi. Ayrıca, sonuçlar, hücresel model organizasyonu23,24,27,37 ile birlikte kayda değer bir sertlik düşüşü gösteren önceki yayınlanmış araştırmalarla uyumludur.
Translasyonel araştırmaların eksikliklerini ve in vitro verileri klinik bir ortama çevirmenin zorluklarını ele almak için OA patogenezinin ve ilerlemesinin çeşitli yönlerini taklit eden doğrulanmış yerli insan modellerine şu anda ihtiyaç duyulmaktadır. Bugüne kadar, hiçbir model, hastalık başlatıcı uyaranlara yanıt olarak OA'ya yatkın olan yaşa bağlı eklem dokuları bir yana, karmaşık doğal insan kıkırdak bölmesini doğru bir şekilde temsil edemez38. Şimdiye kadar en yaygın olarak kullanılan eksplant bazlı modeller sığır veya sığır kökenliydi ve ya güçlü bir inflamatuar sitokin tedavisi ya da mekanik yüklemeuyguladı 39,40,41. Öte yandan bu protokol, belirli OA olaylarının bireysel aşamalarının göstergesi olan küçük (4 mm x 1 mm) ekilmiş disk şeklinde insan kıkırdak örneklerinin nasıl oluşturulacağını gösterir. Kıkırdak eksplantları sıralanır ve görüntü tabanlı bir biyobelirteç olarak hücresel uzamsal organizasyon kullanılarak evre atanır30,42. Biyomekanik özelliklerdeki erken değişiklikler, kıkırdak yüzeyinin hala makroskopik olarak sağlam göründüğü bir aşamada 23,27 çift teller ortaya çıkmaya başlarbaşlamaz tanımlanabildiğinden ve ölçülebildiğinden26, bu eksplant bazlı model, lokal bir doğal kıkırdak kompartmanının araştırılmasına izin verir ve erken OA hakkında kapsamlı bilgi sağlayabilir. Ayrıca, bu kıkırdak modeli, 3 boyutlu doğal bir yerel habitatta38,39 mekanik ve enflamatuar değişikliklere hücrelerin ve matris yanıtının araştırılmasında yararlı olabilir. Nispeten basit ve üretilmesi kolay olan bu kıkırdak eksplantları, hastalığı modifiye eden OA ilaçlarının geliştirilmesinde ve test edilmesinde sınırlayıcı bir faktör olan OA heterojenliğini incelemek için de kullanılabilir43. Ayrıca, eklem replasman ameliyatı geçiren hastalara ölçeklenebilirlik ve bağımlılığın, modelin eksikliklerinden ikisi olduğu da belirtilmelidir.
Eklem kıkırdağının, test edilen ölçek seviyesine bağlı olarak kendine özgü bir davranış sergilediği iyi bilinmektedir. Loparic ve ark. tarafından belirtildiği gibi, mikro ölçekte, kıkırdak yapılandırılmamış ve tek tip bir malzeme35 gibi davranır ve böyle bir yaklaşım, lokalize genel kıkırdak sertliğinin yaklaşık bir tahminini verir. Mikro veya nano girintilerin daha uygun olup olmadığı ile ilgili olarak, Stolz ve ark.44 tarafından 2004 yılında yapılan bir çalışmada, eklem kıkırdağının yapı-mekanik özelliklerinin değerlendirilmesinde hem mikro hem de nano ölçekli girintiler karşılaştırılmıştır. Yazarlar, eklem kıkırdağının mikro ölçekli küresel girintisi için, nano ölçekli ince yapısal bileşenlerin (yani, bireysel kollajen lifleri ve proteoglikanlar) genellikle yük taşıma görevini paylaştığını vurguladılar. Bu şekilde, agrega mekanik özellikleri, tek tek nanobileşenlerinkinden belirgin şekilde farklıdır. Aynı yazarlar, eklem kıkırdağının genel lokal sertlik profillerini ve ayrıca ince yapısal bileşenlerle ilgili sertliği değerlendirmek için mikro ve nano girintilerin bir kombinasyonunun kullanılabileceğini öne sürdüler44.
Çok sayıda AFM tabanlı girinti deneyi, kıkırdak mekaniğini değerlendirmek için keskin piramidal konsol uçları (yarıçap = 15-20 nm)22,36,44 kullanmıştır. Keskin konsollara sahip nano girintilerin şu anda en iyi mekanik özellikleri değerlendirmek için daha uygun olduğu düşünülse de, küresel konsol uçları, yumuşak biyolojik numuneleri test ederken daha tutarlı ve modellenmesi ve yorumlanması daha kolay sonuçlar üretir44,45. Ayrıca, Stolz ve ark. enzimatik olarak (yani elastaz) bozulmuş eklem kıkırdağının AFM nano girintilerinin mümkün olmadığını, çünkü doku o kadar yapışkan hale geldiğini ve uç-numune yapışmasının kuvvet-mesafe eğrilerine hakim olduğunu ve verileri olanaksız hale getirdiğini göstermiştir44.
Mevcut AFM ölçümlerinde, küresel konsol ucu 5 μm yarıçaplı bir konsol kullanılmıştır. Konsol seçimi, kıkırdak yüzeyinde meydana gelen hasarı en aza indirirken, dokunun mekanik özelliklerini oldukça geniş bir yüzey üzerinde ortalamak niyetiyle motive edildi. Konsol tarafından uygulanan kuvvet ile ortaya çıkan numune girintisi arasındaki ilişki, Hertz uyum modeli ile donatıldı. Küresel girintiler kullanılırken, konsol ucu ile numune yüzeyi arasında etki eden çekici kuvvetler ihmal edilerek Hertz fit modeli önerilir46. Hertz modeli için denklemler Denklem 1 ve Denklem 2'de gösterilmiştir.
Eşitlik 1
Eşitlik 2
Burada F = kuvvet; E = Young modülü; v = Poisson oranı; δ = girinti; a = temas çemberinin yarıçapı; ve RS = kürenin yarıçapı.
Model nihayetinde resmi olarak Young modülü (E) olarak ifade edilen hücresel/doku elastikiyetini47 hesaplar. Hertz uyum modeli, uç şekli ve boyutu, girinti ve numune deforme olabilirliği gibi çeşitli özellikleri dikkate alır. Bu gereksinimler ideal olarak karşılanmazsa, model Young modülü46'nın yanlış bir tahminini sağlayabilir.
Hertz uyum modeli, gerinim ve elastik gerilimin doğrusal olarak elastik modüle bağlı olduğunu varsayar, bu da numunedeki girintinin numune kalınlığının kendisinden çok daha küçük kaldığını ima eder46. Bu varsayım, kıkırdak eksplantlarının birkaç mikrometrelik girintilere kıyasla 1 mm kalınlığa sahip olduğu bu kurulumda kolayca karşılandı.
Eklem kıkırdağı, gözenekli viskoelastik bir malzeme olarak modellenebilir48,49. Viskoelastik davranış, moleküller, organeller ve kollajen-proteoglikan ağı50,51 gibi hücre içi/sitoplazmik veya matris bileşenleri arasındaki sürtünmeden kaynaklanır. Adından da anlaşılacağı gibi, viskoelastik malzemeler iki farklı özelliği birleştirir: viskoz - malzeme harici bir yüke maruz kaldığında yavaşça deforme olur - ve elastik - uygulanan yük kaldırıldığında malzeme ilk konfigürasyonuna geri döner52,53. Viskoelastik davranış, bu çalışmada elde edilenlere benzer şekilde, kuvvet-mesafe eğrileri 46,52'deki yaklaşım (uzatılmış) ve geri çekme eğrileri arasında bir histerezis olarak kendini gösterir (Şekil 4C). Ayrıca, viskoelastik malzemelerin bir özelliği, mekanik özelliklerinin deformasyon hızına bağlı olması ve malzemenin sertliğinin yükleme uygulanma hızıyla (girinti hızı) artmasıdır54. Böylece, farklı yükleme hızları seçilerek, her biri her yükleme hızında52 test edilen numunenin mekanik özelliklerini temsil eden bir kuvvet-mesafe eğrileri ailesi oluşturulur. Bu nedenle, çeşitli çalışmaların sonuçlarını karşılaştırmaya çalışırken, tüm girinti parametrelerini hesaba katmak çok önemlidir. Genel olarak, mikrometre ölçeğinde ölçüm yaparken (5 μm küresel konsol ucu ile bu çalışmada olduğu gibi), eklem kıkırdağı yapılandırılmamış ve tek tip bir malzeme gibi davranır ve dokunun poroviskoelastik yapısı nedeniyle sertliğe hem elastik hem de viskoz katkıları içeren kümülatif bir elastik modül oluşturur35.
Hertz modelinin bir başka varsayımı, girinti derinliğinin küresel konsol ucunun55 yarıçapından daha düşük olmasıdır. Girinti derinliği, numuneyle ilk temastan sonra konsol ucunun maksimum yer değiştirmesini temsil eder. Maksimum yükte, maksimum girinti derinliği, numunenin ve konsol ucunun genel yer değiştirmesidir. Bueckle'ın kılavuzu, 10 boyunca aynı yapıya sahip bir numunenin toplam kalınlığının maksimum %56'u kadar bir girinti derinliğini belirtir, aksi takdirde sonuçlar derinlik-kalınlık oranına göre değişir. 5 μm'lik bir konsol ucu yarıçapı için, bu çalışmadaki kıkırdak eksplantları ortalama 1.1 μm'de girintili olup, özellikle yüksek oranda dejenere kıkırdak eksplantları için birkaç durumda 3 μm'lik birkaç tepe noktası olmuştur. Bu durumda, deneysel ortamda, dejenere kıkırdağın yüzey düzensizliklerini nötralize etmek için büyük girintilerle ilişkili nispeten yüksek kuvvetler gerektiğinden, bir uzlaşma arandı. Daha hafif bir girinti, her ikisi de yüksek oranda dejenere kıkırdağın ortak özellikleri olan yüzeysel fibrilasyon ve kollajen fissürünün incelenmesine neden olacaktır57.
Hertz uyum modeli için çok önemli olan, konsol ucunun numuneyle doğrudan temas ettiği noktanın doğru tanımlanmasıdır ve genel olarak temas noktası olarak adlandırılır. Bununla birlikte, bu, çok yapışkan veya çok yumuşak numunelerin girintilenmesi sırasında sorunlu olabilir, çünkü birden fazla prob-numune temas noktasına58,59 neden olabilir. Aslında, A-Hassan ve arkadaşlarının güzel bir şekilde vurguladığı gibi, yumuşak biyolojik dokular için, temas noktasının doğru belirlenmesi en can sıkıcı sorunlardan biridir60. Bu etki, doğal osteoartritik kıkırdak eksplantlarında da gözlenmiştir, çünkü dejenerasyon aşamasına bağlı olarak, doku yüzeyi doğal mekanik özelliklerini kaybeder ve genellikle düzensizdir, yüzeysel fibrilasyon ve yarık gösterir (Şekil 3B, C). Bu fenomen özellikle baskın hücresel modelin büyük kümeler olduğu kıkırdak eksplantlarında belirtilmiştir (Şekil 2C). Kıkırdak yüzeyindeki bu homojen olmayanlar, birden fazla prob-numune temas noktasına ve dolayısıyla hatalı sonuçlara yol açabilir. Bazı durumlarda büyük sapmalar gözlendi, ardından kuvvet-mesafe eğrisinin son gerilmesinden önce taban çizgisinin hızlı bir şekilde toparlanması izlendi (Şekil 5A). Bu, konsol ucunun yolundaki büyük bir engele bağlanabilir (örneğin, yıpranan ve ayrılan kıkırdak ile ileri fibrilasyon alanları). Diğer durumlarda, kuvvet-mesafe eğrisinin son eğimi daha küçük düzensizliklerle dağılmıştır (Şekil 5B), bu da art arda daha küçük engellerle (örneğin, dokunun mikro-fibrilasyonu) teması gösterir. Bu gibi durumlarda, veri güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için ölçüm yeri yeniden ölçülmeli ve hatta değiştirilmelidir. Bu amaçla, temas noktasının doğru tanımlanması için AFM'nin kuvvet-mesafe eğrisi çıktısını dikkatlice incelemek de önemlidir. Bu, dikkat edilmesi gereken çok önemli bir noktadır, çünkü temas noktasının 50 nm ile yanlış tanımlanmasının, E değerinin61 büyüklük sırasına göre yanlış bir tahminine yol açtığı gösterilmiştir. Birkaç çalışma, görsel inceleme ile temas noktasını tahmin ederken öznel kullanıcı girdisini atlamak ve doğruluğu artırmak amacıyla, kuvvet-mesafe eğrilerinin temas noktasını belirlemek için otomatik yaklaşımlar kullanmaya başlamıştır. Bu, hücre mekaniği ölçümlerindeüretilenler gibi çok sayıda kuvvet-yer değiştirme eğrisi ile uğraşırken daha da önemli hale gelir 47,62. Temas noktası belirlemesini 47,63,64,65 otomatikleştirmek için çeşitli stratejiler önerilmiş olsa da, optimal strateji büyük ölçüde deneysel koşullara ve verileri analiz etmek için kullanılan model, probun şekli, konsol ucu ile numune arasındaki (olmayan) yapışkan mekanik etkileşim ve numunenin (olmayan) Hertzian davranışı gibi faktörlerebağlıdır 63.
Numune kayması, artefaktlara ve hatalı temas noktası belirlemesine neden olabilecek başka bir yaygın sorundur (Şekil 3E). Temel olarak, numunenin numune tutucuya (Petri kabı) düzgün şekilde monte edilmediği ve numunenin AFM ölçümleri sırasında hareket ettiği anlamına gelir. Bu etki, özellikle AFM konsolunu yeni bir ölçüm alanına taşırken belirgindir. Bu özellik, gerçek ölçümler sırasında odak düzlemindeki ani bir değişiklikle kolayca gözlemlenebilir. Ortaya çıkan kuvvet-mesafe eğrileri tipik olarak, disk konsol tarafından aşağı itilirken diskin tabanı ile Petri kabı arasındaki boş alanın daralmasına karşılık gelen, ilk başta hafif bir yükselme ile iki fazlı uzatılmış bir eğime sahiptir (bkz. Şekil 3E), ardından eğimin ikinci bölümünde daha sıkı bir eğim, diskin Petri kabının tabanı ile doğrudan temas halinde olduğu için daha da girintili olduğunu gösterir (Şekil 5C,D). Bozulmaların üstesinden gelmek için, yeterli bir numune yapıştırıcısı kullanarak (Şekil 3D), termal sürüklenmeyi önlemek için harici ısı kaynaklarını (ışıklar) kapatarak sıcaklığı sabit tutarak ve hızlı tarama ölçümleri yaparak numuneleri daha iyi sabitlemeye çalışılabilir. Buradaki deneylerde, konsolun ortama daldırılmasının ilk 15 dakikasında (sıcaklıktaki ani değişiklikler nedeniyle) meydana gelen bir konsol sapma kayması gözlemledik. Bu zaman atlamasından sonra, sapma genellikle ihmal edilebilir. Sonuç olarak, deneyciye konsol daldırıldıktan sonra taban çizgisini dikkatlice incelemesini ve stabilize olduktan sonra ölçüme başlamasını tavsiye ederiz. Bu işlemin süresi, kullanılan konsola bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir.
Herhangi bir AFM ölçümü için bir diğer kritik parametre, basitçe konsol tarafından numuneye uygulanan kuvvetin bir ölçüsü olan ayar noktasıdır. Temas modu için (bu çalışmada kullanıldığı gibi), ayar noktası konsolun belirli bir sapmasını temsil eder. Buradaki protokolde olduğu gibi birkaç tarama veya birkaç saha tekrarı gerçekleştirirken, konsol ucu numune yüzeyinden partikülleri adsorbe edebilir, bu nedenle bazen konsolun çıkarılmasını, uygun şekildetemizlenmesini 66 ve ardından ölçümlere devam etmeden önce yeniden kalibre edilmesini gerekli kılar.
AFM mikro girintileri, özellikle osteoartritik kıkırdak bağlamında yeni ve ilginç veri toplama fırsatları sunarken, üretilen verilerin tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği, yukarıda belirtildiği gibi büyük ölçüde çeşitli parametrelere bağlıdır. Kıkırdak dokusu dejenerasyonunun neden olduğu mekanik değişiklikleri değerlendirmek için bu yaklaşımı kullanırken, sonuçları spesifik deneysel tasarıma ölçeklendirmek için önce çeşitli uzamsal modeller üzerinde bazı pilot ölçümler yapılmalıdır. Pilot AFM ölçümleri, veri değişkenliğinin kapsamının bir göstergesini sağlamak için aynı modelden yeterli numune (örneğin, beş disk) alınarak en standartlaştırılabilir prosedürle gerçekleştirilmelidir. Bu, özellikle ilgili en erken OA sertlik değişikliklerini ölçmeye ve değerlendirmeye çalışırken önemlidir (yani, tek teller ve çift teller arasında, Şekil 4A). Aslında, önceki bir çalışmada, benzer bir yaklaşım kullanarak, hücrelerin 30 mekansal organizasyonunun bir fonksiyonu olarak matristeki biyomekanik değişiklikleri değerlendirmek için37 insan örneğinden oluşan bir örneklem büyüklüğünün gerekli olduğunu gösterdik.
Ayrıca, bu protokolde sunulan adımların çoğu insan hatasına açıktır ve büyük ölçüde operatörün deneyimine dayanır. Gerçek AFM sonuçlarını etkileyebilecek tüm faktörler göz önüne alındığında, bu çalışmada bildirilen mutlak E değerleri genelleştirilemez ve bu deney düzeneğine oldukça özgüdür. Bununla birlikte, burada çeşitli Young modülleri ile hücresel patern tabanlı kıkırdak eksplantları arasında sunulan ilişki (uzamsal patern ne kadar patolojik olursa, kıkırdağın elastik modülü [EM] o kadar düşük olur) etkilenmez, çünkü bulgular hücresel patern organizasyonunun bir fonksiyonu olarak sertlik değişikliklerini gösteren önceki çalışmalarla tutarlıdır23,37.
Genel olarak, bu adım adım protokol, yalnızca başlangıçtan ileri ilerlemeye kadar değişen OA güdümlü hücresel yeniden yapılanma olaylarını temsil etmekle kalmayıp, aynı zamanda sertlikte kademeli bir azalma ile ilişkili olan standartlaştırılmış 3D doğal eklem kıkırdak eksplantlarının işlevselliğini gösterir. Eksplantlar, OA başlangıcını ve ilerlemesini incelemek için güvenilir bir biyomimetik modeli yansıtabilir ve farklı tedavi modalitelerinin ex vivo olarak test edilmesine ve geliştirilmesine olanak tanır. AFM tabanlı biyomekanik değerlendirme ile birlikte böyle bir insan eksplant modelinin kullanılması, biyomedikal araştırmalar ve ilaç endüstrisi için bir paradigma değişikliğine neden olabilir ve büyük ölçüde ihtiyaç duyulan etkili OA ilaçlarını tanımlamanın yeni yollarının önünü açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Tübingen Üniversite Hastanesi Ortopedik Cerrahi Anabilim Dalı'ndan ortopedi cerrahlarına doku örneklerini sağladıkları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1397-89-3 | |
| Atomic force microscop (AFM) head | CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| Biocompatible sample glue | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | H000033 | |
| Calcein AM | Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA | 14948 | Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging |
| Cantilever | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SAA-SPH-5UM | Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm, geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius |
| Cartilage ctting device | Self-made | n/a | Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm |
| CDD camera integrated in the AFM | The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany | DFK 31BF03 | |
| CDD camera integrated in the fluorescence microscope | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DFC3000G | |
| Cryotome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | CM3050S | |
| Data Processing Software for the AFM | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Version 5.0.86, can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany | 41966052 | |
| Fluorescence Microscope (Leica DMi8) | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | 11889113 | |
| Glass block cantiliver holder | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | SP-90-05 | Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker). |
| Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F1315 | |
| Microscope glass slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | CLS294775X50 | |
| Mounting medium With DAPI | ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany | 50011 | Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs side view imaging |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4333 | |
| Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Scalpel | Feather Medical Products, Osaka, Japan | 2023-01 | |
| Silicone Skirt | Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany | n/a | Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent medium condensation in the AFM head. |
| Statistical program - SPSS | IBM, Armonk, New York, USA | SPSS Statistics 22 | Vesion 280.0.0.0 (190) |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | SA6255012 | Water-soluble embedding medium |
References
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
- Deng, X., et al. Application of atomic force microscopy in cancer research. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 102 (2018).
- Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Rabinovich, Y., et al. Atomic force microscopy measurement of the elastic properties of the kidney epithelial cells. Journal of Colloid and Interface Science. 285 (1), 125-135 (2005).
- Dufrêne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces. Nature Reviews Microbiology. 2 (6), 451-460 (2004).
- Cykowska, A., Danalache, M., Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Hofmann, U. K. Detecting early osteoarthritis through changes in biomechanical properties - A review of recent advances in indentation technologies in a clinical arthroscopic setup. Journal of Biomechanics. 132, 110955 (2022).
- Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
- Fuchs, J., Kuhnert, R., Scheidt-Nave, C.
- Felson, D. T.
- Ganz, R., Leunig, M., Leunig-Ganz, K., Harris, W. H.
- Saxby, D. J., Lloyd, D. G. Osteoarthritis year in review 2016: Mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (2), 190-198 (2017).
- Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instructional Course Lectures. 47, 487-504 (1998).
- Braun, H. J., Gold, G. E.
- Guermazi, A., Roemer, F. W., Burstein, D., Hayashi, D. Why radiography should no longer be considered a surrogate outcome measure for longitudinal assessment of cartilage in knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), 247 (2011).
- Guermazi, A., et al. Different thresholds for detecting osteophytes and joint space narrowing exist between the site investigators and the centralized reader in a multicenter knee osteoarthritis study--Data from the Osteoarthritis Initiative. Skeletal Radiology. 41 (2), 179-186 (2012).
- Bedson, J., Croft, P. R. The discordance between clinical and radiographic knee osteoarthritis: A systematic search and summary of the literature. BMC Musculoskeletal Disorders. 9 (1), 116 (2008).
- Dashefsky, J. H. Arthroscopic measurement of chondromalacia of patella cartilage using a microminiature pressure transducer. Arthroscopy. 3 (2), 80-85 (1987).
- Berkenblit, S. I., Frank, E. H., Salant, E. P., Grodzinsky, A. J. Nondestructive detection of cartilage degeneration using electromechanical surface spectroscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 116 (4), 384-392 (1994).
- Appleyard, R. C., Swain, M. V., Khanna, S., Murrell, G. A. The accuracy and reliability of a novel handheld dynamic indentation probe for analysing articular cartilage. Physics in Medicine and Biology. 46 (2), 541-550 (2001).
- Hsieh, C. H., et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (4), 480-488 (2008).
- Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 4 (3), 186-192 (2009).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomaterialia. 126, 315-325 (2021).
- Eaton, P., Batziou, K. Artifacts and Practical Issues in Atomic Force Microscopy. Atomic Force Microscopy: Methods and Protocols. Santos, N. C., Carvalho, F. A. , Springer. New York, NY. 3-28 (2019).
- Danalache, M., et al. Exploration of changes in spatial chondrocyte organisation in human osteoarthritic cartilage by means of 3D imaging. Scientific Reports. 11, 9783 (2021).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Wilusz, R. E., DeFrate, L. E., Guilak, F. Immunofluorescence-guided atomic force microscopy to measure the micromechanical properties of the pericellular matrix of porcine articular cartilage. Journal of The Royal Society Interface. 9 (76), 2997-3007 (2012).
- Guilak, F., Ratcliffe, A., Lane, N., Rosenwasser, M. P., Mow, V. C. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 12 (4), 474-484 (1994).
- Billinghurst, R. C., et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. The Journal of Clinical Investigation. 99 (7), 1534-1545 (1997).
- Wu, P. J., et al. Detection of proteoglycan loss from articular cartilage using Brillouin microscopy, with applications to osteoarthritis. Biomedical Optics Express. 10 (5), 2457-2466 (2019).
- Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: Validation with a gel-microfiber composite. Biophysical Journal. 98 (11), 2731-2740 (2010).
- Moshtagh, P. R., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. The elastic modulus of articular cartilage at nano-scale and micro-scale measured using indentation type atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 22, 359-360 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 19, 109409 (2019).
- Houtman, E., et al. Human osteochondral explants: Reliable biomimetic models to investigate disease mechanisms and develop personalized treatments for osteoarthritis. Rheumatology and Therapy. 8 (1), 499-515 (2021).
- Anderson, J. R., Phelan, M. M., Foddy, L., Clegg, P. D., Peffers, M. J. Ex vivo equine cartilage explant osteoarthritis model: A metabolomics and proteomics study. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3652-3667 (2020).
- Chen, C. T., Torzilli, P. A. In vitro cartilage explant injury models. Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. Olson, S. A., Gauilak, F. , Springer. New York, NY. 29-40 (2015).
- Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. -C. An ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants. Journal of Visualized Experiments. (153), e59467 (2019).
- Rolauffs, B., Williams, J., Grodzinsky, A., E Kuettner, K., Cole, A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Deveza, L. A., Loeser, R. F. Is osteoarthritis one disease or a collection of many. Rheumatology. 57, 34-42 (2018).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), 3269-3283 (2004).
- Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
- Krieg, M., et al.
- Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267 (2016).
- Mow, V. C., Kuei, S. C., Lai, W. M., Armstrong, C. G. Biphasic creep and stress relaxation of articular cartilage in compression? Theory and experiments. Journal of Biomechanical Engineering. 102 (1), 73-84 (1980).
- Armstrong, C. G., Lai, W. M., Mow, V. C. An analysis of the unconfined compression of articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 106 (2), 165-173 (1984).
- Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5 (8), 636-640 (2006).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Rheology of the active cell cortex in mitosis. Biophysical Journal. 111 (3), 589-600 (2016).
- Gould, T. E., Jesunathadas, M., Nazarenko, S., Piland, S. G. Chapter 6 - Mouth Protection in Sports. Materials in Sports Equipment (Second Edition). Subic, A. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 199-231 (2019).
- Kontomaris, S. V., Malamou, A. Hertz model or Oliver & Pharr analysis? Tutorial regarding AFM nanoindentation experiments on biological samples. Materials Research Express. 7 (3), 033001 (2020).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Wu, C. -E., Lin, K. -H., Juang, J. -Y. Hertzian load-displacement relation holds for spherical indentation on soft elastic solids undergoing large deformations. Tribology International. 97, 71-76 (2016).
- Westbrook, J. H., Conrad, H. The Science of Hardness Testing and its Research Applications. , American Society for Metal. Metals Park, Ohio. (1973).
- Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Stylianou, A., Kontomaris, S. V., Grant, C., Alexandratou, E. Atomic force microscopy on biological materials related to pathological conditions. Scanning. 2019, 8452851 (2019).
- Sokolov, I. Atomic force microscopy in cancer cell research. Cancer Nanotechnology. 1, 1-17 (2007).
- Emad, A., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
- Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: Importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
- Shoelson, B., Dimitriadis, E. K., Cai, H., Kachar, B., Chadwick, R. S. Evidence and implications of inhomogeneity in tectorial membrane elasticity. Biophysical Journal. 87 (4), 2768-2777 (2004).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
- Rudoy, D., Yuen, S. G., Howe, R. D., Wolfe, P. J. Bayesian change-point analysis for atomic force microscopy and soft material indentation. Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). 59 (4), 573-593 (2010).
- Benítez, R., Moreno-Flores, S., Bolós, V. J., Toca-Herrera, J. L. A new automatic contact point detection algorithm for AFM force curves. Microscopy Research and Technique. 76 (8), 870-876 (2013).
- Timashev, P. S., et al. Cleaning of cantilevers for atomic force microscopy in supercritical carbon dioxide. Russian Journal of Physical Chemistry B. 8 (8), 1081-1086 (2014).
