Summary
Hier wird Zebrafisch (Danio rerio) als Modell verwendet, um allergische Reaktionen und Immunreaktionen im Zusammenhang mit dem Alpha-Gal-Syndrom (AGS) zu untersuchen, indem allergische Reaktionen auf Zeckenspeichel und Säugetierfleischkonsum bewertet werden.
Abstract
Zecken sind Arthropodenvektoren, die durch die Übertragung von Krankheitserregern Krankheiten verursachen und deren Bisse mit allergischen Reaktionen zusammenhängen könnten, die sich weltweit auf die menschliche Gesundheit auswirken. Bei einigen Individuen wurden hohe Konzentrationen von Immunglobulin-E-Antikörpern gegen das Glykan Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) durch Zeckenstiche induziert. Anaphylaktische Reaktionen, die durch Glykoproteine und Glykolipide vermittelt werden, die das im Zeckenspeichel vorhandene Glykan α-Gal enthalten, stehen im Zusammenhang mit dem Alpha-Gal-Syndrom (AGS) oder einer Säugetierfleischallergie. Zebrafisch (Danio rerio) hat sich zu einem weit verbreiteten Wirbeltiermodell für die Untersuchung verschiedener Pathologien entwickelt. In dieser Studie wurde Zebrafisch als Modell für die Untersuchung allergischer Reaktionen als Reaktion auf den Verzehr von α-Gal und Säugetierfleisch verwendet, da sie wie Menschen dieses Glykan nicht synthetisieren. Zu diesem Zweck wurden Verhaltensmuster und hämorrhagische anaphylaktische allergische Reaktionen als Reaktion auf den Speichel von Ixodes ricinus-Zecken und den Verzehr von Säugetierfleisch untersucht. Dieser experimentelle Ansatz ermöglicht die Gewinnung valider Daten, die das Zebrafisch-Tiermodell für die Untersuchung von durch Zecken übertragenen Allergien einschließlich AGS unterstützen.
Introduction
Zecken sind Überträger von Krankheitserregern, die Krankheiten verursachen und auch allergische Reaktionen verursachen, die die Gesundheit von Mensch und Tier weltweit beeinträchtigen 1,2. Während der Zeckenfütterung erleichtern Biomoleküle im Zeckenspeichel, insbesondere Proteine und Lipide, die Fütterung dieser Ektoparasiten und vermeiden die Abwehrkräfte des Wirts3. Einige Speichel-Biomoleküle mit Glykan-Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal)-Modifikationen führen nur bei einigen Personen zur Produktion hoher Anti-α-Gal-IgE-Antikörperspiegel nach dem Zeckenstich, was als α-Gal-Syndrom (AGS) bekannt ist4. Dies ist eine Krankheit, die mit einer IgE-vermittelten Allergie verbunden ist, die zu einer Anaphylaxie gegen Zeckenstiche, zum Verzehr von Fleisch von Nicht-Primaten bei Säugetieren und einigen Medikamenten wie Cetuximab5 führen kann. Die Reaktionen auf α-Gal sind oft schwerwiegend und können manchmal tödlich sein 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Das α-Gal kommt in allen Säugetieren vor, mit Ausnahme von Altweltaffen, Menschenaffen und Menschen, die nicht in der Lage sind, α-Gal13 zu synthetisieren. Krankheitserreger wie Bakterien und Protozoen exprimieren dieses Glykan jedoch auf ihrer Oberfläche, was die Produktion hoher Mengen an Anti-α-Gal-IgM/IgG-Antikörpern induzieren kann und ein Schutzmechanismus gegen diese Erreger sein kann16,17. Die Produktion von Anti-α-Gal-Antikörpern erhöht jedoch das Risiko, IgE-vermittelte Anti-α-Gal-Allergien zu entwickeln 7,13. Natürliche Anti-α-Gal-Antikörper, die beim Menschen produziert werden, hauptsächlich der IgM/IgG-Subtypen, könnten mit dieser Modifikation in Verbindung gebracht werden, die in Bakterien aus der Darmmikrobiotavorhanden ist 16. AGS kann eine schwierige klinische Diagnose sein, da die wichtigste diagnostische Methode derzeit auf einer klinischen Vorgeschichte verzögerter allergischer Reaktionen basiert, insbesondere im Zusammenhang mit Nahrungsmittelallergien (d. h. Juckreiz, lokalisierte Nesselsucht oder rezidivierendes Angioödem mit Anaphylaxie, Urtikaria und gastrointestinalen Symptomen) und der Messung von IgE-Anti-α-Gal-Antikörperspiegeln9. Aktuelle Ergebnisse deuten darauf hin, dass Zeckenstiche eines der Hauptrisiken für das Auftreten von AGS 18,19 darstellen, ein 20-facher oder größerer Anstieg des IgE-Spiegels auf α-Gal nach einem Zeckenstich 19, eine Vorgeschichte von Zeckenstichen bei Patienten mit AGS20,21,22, das Vorhandensein von Antikörpern, die auf Zeckenantigene reaktiv sind, bei AGS-Patienten 19, und dass Anti-α-Gal-IgE stark mit Anti-Zecken-IgE-Spiegeln19,23 zusammenhängt, aber weitere Studien erforderlich sind, um zu beurteilen, welche Biomoleküle tatsächlich beteiligt sind.
Ein weiteres mögliches Szenario sind Patienten, die starke allergische Reaktionen auf Zeckenstiche und hohe Konzentrationen von Anti-α-Gal-IgE-Antikörpern aufweisen, aber tolerant gegenüber dem Verzehr von Säugetierfleisch sind12. Daher könnte die Fleischallergie bei Säugetieren eine bestimmte Art von Allergie im Zusammenhang mit Zeckenstichen sein. Zu den wichtigsten Zeckenarten, die mit AGS assoziiert werden, gehören Amblyomma americanum (USA), Amblyomma sculptum (Brasilien), Amblyomma testudinarium und Haemaphysalis longicornis (Japan), Ixodes holocyclus (Australien) und Ixodes ricinus (der Hauptvektor der Lyme-Borreliose in Europa)11,24.
Das einzige Modell, das verwendet wurde, um die IgE-Produktion im Zusammenhang mit Zeckenstichen zu bewerten, ist das Mausmodell, das genetisch mit dem Gen für α−1,3-Galactosyltransferase-ausgeschaltete (α-Gal KO) Mäuse25,26 modifiziert wurde, da Mäuse wie andere Säugetiere auch α-Gal auf Proteinen und Lipiden exprimieren und kein IgE zu α-Gal produzieren. Der Zebrafisch (Danio rerio) ist jedoch ein nützliches Modell für die biomedizinische Forschung an Säugetieren, da er viele anatomische Ähnlichkeiten mit Säugetieren aufweist und wie der Mensch auch nicht in der Lage ist, α-Gal zu synthetisieren. Da α-Gal nicht auf natürliche Weise im Zebrafisch produziert wird, ist es ein erschwingliches Modell, das leicht zu manipulieren ist und eine hohe Stichprobengröße für die Untersuchung von α-Gal-bedingten allergischen Reaktionen ermöglicht.
In dieser Studie wird Zebrafisch als Modellorganismus verwendet, um lokale allergische Reaktionen, Verhaltensmuster und die molekularen Mechanismen zu charakterisieren und zu beschreiben, die mit der Reaktion auf die perkutane Sensibilisierung auf Zeckenspeichel26,27 und den anschließenden Verzehr von Säugetierfleisch verbunden sind. Zu diesem Zweck werden die Fische durch intradermale Injektion Zeckenspeichel ausgesetzt und dann mit Hundefutter gefüttert, das Säugetierfleischprodukte enthält, die für den Tiergebrauch geeignet sind und α-Gal27 enthalten, dann werden mögliche damit verbundene allergische Reaktionen bewertet. Diese Methode kann auf die Untersuchung anderer Biomoleküle angewendet werden, die mit allergischen Prozessen zusammenhängen, insbesondere solchen, die mit AGS zusammenhängen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der Universität Kastilien-La Mancha im Rahmen der Studie "Evaluation of the immune response to inactivated M. bovis vaccine and challenge with M. marinum in the zebrafish model number PR-2017-05-12" genehmigt.
Zecken wurden aus der Laborkolonie gewonnen, wo repräsentative Proben von Zecken in der Kolonie mittels PCR auf häufige Zeckenpathogene getestet wurden, um die Abwesenheit von Krankheitserregern zu bestätigen, und am Institut für Parasitologie, Biologiezentrum der Tschechischen Akademie der Wissenschaften (IP BC CAS), Tschechische Republik, aufbewahrt wurden.Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz der Tschechischen Republik Nr. 246/1992 Sb (Ethikgenehmigung Nr. 34/2018) durchgeführt.
1. Zebrafisch-Behandlung
HINWEIS: Die Studie wurde entwickelt, um allergische Reaktionen und die Immunantwort bei Zebrafischen zu bewerten, die mit Zeckenspeichel als Reaktion auf den Verzehr von Säugetierfleisch behandelt wurden.
- Behandeln Sie den Fisch (wie in Abschnitt 4 erläutert) mit Zeckenspeichel, handelsüblichem Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (siehe Materialtabelle), der als Positivkontrolle verwendet wird, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Negativkontrolle. Erwachsene Zebrafische werden nach dem Zufallsprinzip in drei geschlechterspezifische Gruppen eingeteilt (Abbildung 1).
HINWEIS: Jede andere gewünschte Verbindung, die mit AGS zusammenhängt, kann mit diesem Modell bewertet werden.
2. Ixodes ricinus Zecken Speichelextraktion
- Verwenden Sie halb angeschwollene pathogenfreie weibliche Zecken, die 6-7 Tage lang an Meerschweinchen gefüttert wurden.
- Behandeln Sie die Zecke mit 5 μl einer 2%igen (Gew./vol) Lösung von Pilocarpinhydrochlorid in PBS (siehe Materialtabelle) bei einem pH-Wert von 7,4 in das Hämocoel mit einer 50-μl-Spritze mit einer 0,33-mm-Nadel, wie zuvor beschrieben28 , um die Zeckenspeichelproduktion zu induzieren.
HINWEIS: Zecken werden mit einer Pinzette behandelt; Achten Sie darauf, beim Greifen nicht zu viel Kraft aufzuwenden. - Sammeln Sie Speichel mit einer 10-μl-Spitze, die auf einer Mikropipette montiert ist.
- Führen Sie die Spitze vorsichtig in das Zeckenhypostom ein.
- Bewahren Sie den Speichel in einem 1,5-ml-Röhrchen auf Eis auf, sammeln Sie ihn und lagern Sie ihn bei -80 °C, wie zuvor beschrieben27.
- Bestimmen Sie die Speichelproteinkonzentration, um die Menge an Protein zu bestimmen, die in den Fisch injiziert werden soll, wie in früheren Studien27 , unter Verwendung eines BCA-Protein-Assay-Kits (siehe Materialtabelle) gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
3. Pflege von Zebrafischen
- Halten Sie Zebrafische in einem Durchflusswassersystem bei 27 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14 h/10 h (Abbildung 2).
- Füttern Sie die Fische bis zum 2. Tag zweimal täglich um 9:30 Uhr und 13:30 Uhr mit trockenem Fischfutter (50-70 μg/Fisch).
- Füttern Sie die Fische zweimal täglich um 9:30 Uhr und 13:30 Uhr mit trockenem Hundefutter (50-70 μg/Fisch) vom Tag 2 nach der Behandlungsinjektion bis zum Ende des Versuchs
4. Zebrafisch-Injektion
- Wählen Sie 10 Fische pro Gruppe mit einem ähnlichen Verhältnis von Weibchen zu Männchen und ähnlichem Gewicht.
HINWEIS: Gruppe 1 enthält Fische, denen PBS injiziert wurde, Gruppe 2 enthält Fische, denen Zeckenspeichel injiziert wurde, und Gruppe 3 enthält Fische, denen α-Gal injiziert wurde. - Betäuben Sie den Fisch kurzzeitig durch Eintauchen in 0,02% Tricainmethansulfonat (MS-222) (Film 1).
HINWEIS: Richtig betäubte Fische zeigen normale Atmung und schwimmen nicht, während sie am Boden des Wassertanks platziert oder schwimmend platziert werden können. Jeder Fisch muss einzeln betäubt werden, um mögliche physiologische Schäden zu vermeiden. - Fangen Sie den betäubten Fisch mit einem Fischernetz.
- Legen Sie den Fisch mit einer Pinzette oder den Händen vorsichtig auf einen feuchten Schwamm, mit der Schwanzflosse auf der rechten Seite, um die Verbindungen in die gleiche Richtung zu injizieren, um die Läsionen zu kontrollieren.
- Injizieren Sie Gruppen von Fischen intradermal, wie in früheren Studien26, in den Muskel in einem Abstand von 5 mm zur Schwanzflosse und in einem Winkel von 45° zum Körper des Fisches (Film 2). Verwenden Sie die geeignete Behandlung an den Tagen 0, 3 und 8 wie zuvor beschrieben 27 mit einer 100-μl-Spritze, die mit einer 1 cm, 29 g-Nadel mit 1 μl (mit 9 μg/μl Protein) I. ricinus-Speichel in 10 μl PBS (Zeckenspeichel), 5 μg α-Gal in 10 μl PBS (α-Gal)27 ausgestattet ist. und 10 μl PBS (Abbildung 3).
HINWEIS: Die Handhabung muss schnell und sorgfältig erfolgen, um körperliche Schäden am Tier zu vermeiden.
Andere Biomoleküle im Zeckenspeichel können nach diesem Protokoll bewertet werden. - Legen Sie den behandelten Fisch zur Genesung ohne Betäubung wieder in ein Süßwasserbecken.
HINWEIS: Alle Fische derselben Gruppe können zur Erholung in denselben Wassertank gesetzt werden.
5. Zebrafisch-Fütterung
- Das Hundefutter mit einem Mörser und Stößel zerdrücken.
- Füttern Sie 50-70 μg/Fisch zweimal täglich um 9:30 Uhr und 13:30 Uhr mit trockenem Fischfutter bis zum 2. Tag.
- Füttern Sie 50-70 μg/Fisch zweimal täglich um 9:30 Uhr und 13:30 Uhr mit Hundepüree von Tag 2 nach der Behandlungsinjektion bis zum Ende des Experiments am Tag 8.
HINWEIS: Wenn Immunitätsmarker oder Antikörpertiter gegen α-Gal- oder IgE-Antikörper als Reaktion auf die Behandlungen oder das Futter während der verschiedenen Impfungen bewertet werden sollen, wäre eine Fütterung bis zum Ende des Experiments erforderlich.
6. Bewertung von allergischen Reaktionen, Läsionen und Verhalten bei Zebrafischen
- Untersuchen Sie die hämorrhagische Art der allergischen Reaktionen (Hautrötung, Verfärbung und Blutung) mit einer Lupe oder einem Stereomikroskop auf Genauigkeit und geben Sie den Ort ihres Auftretens auf dem Fisch gemäß der in Tabelle 1 enthaltenen Kategorisierung an (Abbildung 4A).
HINWEIS: Die in Abbildung 4 dargestellten allergischen Reaktionen traten nach der Injektion von Zeckenspeichel und dem Verzehr von Futtermitteln mit rotem Fleisch auf. Daher handelt es sich bei den beschriebenen Reaktionen um die Art von Reaktionen, die mit AGS assoziiert sind, da ähnliche Reaktionen im klinischen Kontext auftreten.- Beobachten Sie, ob nach den Behandlungen und bei der Verabreichung von Futter zweimal täglich eine Reaktion auftritt, während sich die Fische im Wassertank befinden.
- Untersuchen Sie das Verhalten der Fische, indem Sie die Veränderungen27 in den Schwimmmustern (Mobilität, Geschwindigkeit, bewegungsloses Stehen am Boden des Wassertanks und Zickzackschwimmen) gemäß der in Tabelle 1 enthaltenen Kategorisierung bewerten.
- Bewerten Sie die kumulierte Mortalität und geben Sie die Anzahl der toten Fische einschließlich der Uhrzeit/des Todestages an (Abbildung 4B).
HINWEIS: Alle Parameter werden direkt nach der Behandlung oder nach dem Futterwechsel ausgewertet und täglich bis zum Ende des Experiments am Tag 8 beobachtet, wobei die qualitativen Variablen kategorisiert werden (Tabelle 1). Als Empfehlung sollte diese Bewertung von einem Fachmann mit Kenntnissen über Zebrafische durchgeführt werden, um Verhaltensänderungen auf der Grundlage seines Hintergrunds und seiner Erfahrung in der Arbeit mit diesem Tiermodell zu berücksichtigen. - Berechnen Sie die Anzahl der Zebrafische pro Tag mit gemeldeten allergischen Reaktionen, abnormalem Verhalten und Fütterungsänderungen in jeder Gruppe und vergleichen Sie die Gruppen durch einen Einweg-ANOVA-Test.
7. Probenentnahme
- Euthanasieren Sie den Fisch durch Eintauchen in 0,04% MS-222 am Tag 8.
HINWEIS: Sammeln Sie auch die Proben von Fischen, die während des Versuchs an allergischen Reaktionen sterben. - Befestigen Sie den Fisch mit Stiften auf einer Paraffinplatte.
- Sammeln Sie das Serum aus den Kiemenblutgefäßen 29 der Fische unmittelbar nach der Euthanasie, wenn die Kiemen noch mit Blut gespült sind, mit einer 0,5-ml-Spritze, die mit einer 1 cm,29 g Nadel ausgestattet ist. Lagern Sie es bis zur Verwendung in einem 1,5-ml-Röhrchen bei -20 °C (Film 3).
- Schneiden Sie den Fisch sagittal mit einer Skalpellklinge und beurteilen Sie die inneren Läsionen (hämorrhagische Läsionen oder Granulome)27,30, wenn sie auftreten.
HINWEIS: Läsionen treten nicht unbedingt auf, müssen aber registriert werden, wenn dies der Fall ist. - Sammeln Sie den Darm (Film 4) und die Niere (Film 5) von jedem Fisch in separaten leeren 1,5-ml-Röhrchen, wie zuvor beschrieben31, und lagern Sie sie bei -80 ° C (Abbildung 4C).
- Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus den Darm- und Nierenproben des Zebrafisches mit einem RNA-Aufreinigungskit (siehe Materialtabelle).
- Analysieren Sie die Expression von Genen, die mit der Immunantwort zusammenhängen, wie zuvor beschrieben30,32 (siehe Tabelle 2 für Primersequenzen) im Zebrafisch, indem Sie eine quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) unter Verwendung einer reversen Transkriptionsmischung für RT-qPCR (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchführen. Normalisieren Sie die mRNA-cT-Werte gegen D. rerio GAPDH und vergleichen Sie zwischen den Gruppen (mit Speichel behandelte Fische, α-Gal und die PBS-behandelten Gruppen) unter Verwendung eines Student-t-Tests mit ungleicher Varianz.
- Bestimmen Sie IgM-Antikörpertiter, die α-Gal im Zebrafisch in Serumproben erkennen, mittels ELISA, wie zuvor beschrieben 27,30. Zeichnen Sie die Antikörpertiter mit einem Plattenleser als O.D.450 nm-Werte auf und vergleichen Sie zwischen den Gruppen (mit Speichel behandelte Fische, α-Gal und die PBS-behandelten Gruppen) unter Verwendung eines Student-t-Tests mit ungleicher Varianz.
HINWEIS: Die Bestimmung von IgM-Antikörpertitern und die Analyse von Expressionsgenen ist optional und wird nur durchgeführt, wenn immunologische Informationen erforderlich sind. Der RT-qPCR-Mix ist ein Erststrang-cDNA-Synthesekit für die Genexpressionsanalyse mittels real-time qPCR.
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Representative Results
Das hier vorgestellte Protokoll basiert auf mehreren Aspekten zuvor veröffentlichter Experimente27,30 und Ergebnissen, die in unserem Labor durchgeführt wurden, wo das Zebrafischmodell für die Untersuchung von AGS und der Immunantwort auf α-Gal etabliert und validiert wird, da sowohl Menschen als auch Zebrafische dieses Molekül nicht synthetisieren13. Dieses Modell ermöglicht die Charakterisierung und Bewertung einer Vielzahl von allergischen Reaktionen als Folge der Reaktion des Wirts auf Zeckenspeichel (Abbildung 4) und deren Auswirkungen auf AGS. Darüber hinaus werden Verhaltensänderungen wie langsames Schwimmen (Film 6), Liegen auf dem Boden des Beckens (Film 7) und Nichtfressen, Vibrieren oder Zickzackbewegungen (Film 8) bei den Fischen als Reaktion auf eine Zeckenspeichelbehandlung beobachtet, die bei den Kontrollfischen nicht beobachtet wird; Diese Befunde sind besonders bedeutsam nach der Verabreichung von Hundefutter an Tag 2. Zu diesem Zeitpunkt waren die Fische bereits mit Alpha-Gal- und Zeckenspeichel sensibilisiert, und die Verabreichung von rotem Fleisch durch das Futter begann. Schließlich wird eine signifikante Inzidenz von allergischen Reaktionen bei Fischen beobachtet, die mit Zeckenspeichel behandelt wurden (Abbildung 4A, B und Tabelle 3), nur Zebrafische, die Zeckenspeichel ausgesetzt waren, entwickelten allergische Reaktionen, die eine schnelle Desensibilisierung und Toleranz zeigten. Andererseits entwickelten Zebrafische, die mit Fischfutter gefüttert wurden, in früheren Studien keine sichtbaren Läsionen oder Reaktionen27. Die Verhaltensänderung war bei den mit Zeckenspeichel behandelten Fischen ausgeprägter als bei nur α-Gal (Abbildung 5). Eine zusätzliche Analyse der Expression der repräsentativsten Immunantwortmacher (IFN, TLR 2, IL1 β und AKR2) wurde mittels RT-PCR durchgeführt (Tabelle 3), um verschiedene Immunantworten auf die Behandlungen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten Unterschiede zwischen Zebrafischgruppen in der Niere, wobei die meisten Immunantwortmarker bei Fischen, die mit Speichel und α-Gal behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrollgruppe herunterreguliert zu sein schienen (Abbildung 6), aber es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Genexpression im Darm gefunden. Frühere Studien über allergische Reaktionen auf verschiedene Zeckenspeichelbestandteile im Zebrafisch zeigten ähnliche Ergebnisse27. Darüber hinaus entwickelten Zebrafische, die mit Zeckenspeichel und α-Gal unter Verwendung dieses Protokolls behandelt wurden, als repräsentative Ergebnisse IgM-Antikörper gegen α-Gal, die höhere Konzentrationen aufwiesen als bei Fischen, die mit PBS behandelt wurden (Abbildung 7), wie in früheren Studien festgestellt wurde27,30.
Abbildung 1: Versuchsplanung für Zebrafischversuch. Den Fischen werden intradermal α-Gal, Zeckenspeichel und PBS als Negativkontrolle injiziert. Die Proben werden nach dem Tod eines Fisches oder am Ende des Experiments gesammelt. Die Proben könnten für die Analyse der Anti-α-Gal-IgM-Spiegel und der Expression ausgewählter Immunantwort-Genmarker mittels qRT-PCR27 verwendet werden. Verhaltensänderungen oder allergische Reaktionen werden während des gesamten Experiments aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Zebrafisch-Versuchsanlage. Die Zebrafische werden in einem Durchflusswassersystem bei 27 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14 h/10 h gehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Injektion zur Behandlung mit Zebrafischen. Die Injektion der Zebrafischbehandlung mit einer 100-μl-Spritze, die mit einer 1 cm, 29 g-Nadel ausgestattet ist, wird intradermal in einem Abstand von 5 mm von der Schwanzflosse durchgeführt. Die Fische werden betäubt und einzeln über einem in warmes Wasser getauchten Schwamm behandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Hinweise auf anaphylaktische hämorrhagische Reaktionen bei Zebrafischen, denen Zeckenspeichel injiziert wurde und die am Tag 2 vor der Fütterungsänderung starben. (A) Fische mit allergischen Reaktionen im Becken nach der Behandlung. (B) Fische, die an hämorrhagischen anaphylaktischen Reaktionen sterben (allergischer Reaktionstyp: Verfärbung und Hautrötung. (C) Entnahme von Proben. Rote Pfeile zeigen den Darm und rote Kreise die Niere an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Beobachtetes Verhaltensmuster bei Fischen. Abnormale Verhaltensmuster bestanden aus langsamem Schwimmen, stationärem Stehen am Boden des Wassertanks und Zickzackschwimmen. Blaue Pfeile zeigen den Zeitpunkt der Behandlung an, und der rote Pfeil zeigt die Zeit an, zu der von Fischfutter zu Hundefutter gewechselt werden muss. Fische, die mit Hundefutter gefüttert wurden, wurden zwischen Speichel- und PBS-behandelten Kontrollfischen durch einen Einweg-ANOVA-Test verglichen (p = 0,05; N = 5 Fische/Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Expression ausgewählter Immunantwortmarker in der Zebrafischniere. Genexpressionsanalyse mittels qRT-PCR in der Niere von Zebrafischen am Ende des Experiments. Die mRNA-cT-Werte werden gegen D. rerio GAPDH normiert, als durchschnittlicher ± SD dargestellt und zwischen mit Speichel, α-Gal behandelten Fischen und der PBS-behandelten Kontrollgruppe durch einen Student-t-Test mit ungleicher Varianz (*p < 0,05; N = 3-7). Diese Zahl wurde von27 übernommen und mit Genehmigung reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: IgM-Antikörpertiter. Die IgM-Antikörpertiter von Zebrafischen gegen α-Gal werden durch ELISA bestimmt, dargestellt als durchschnittlicher ± SD O.D. bei 450 nm und verglichen zwischen Fischen, die mit Speichel, α-Gal behandelt wurden, und der PBS-behandelten Kontrollgruppe durch einen Student-t-Test mit ungleicher Varianz (*p < 0,005; N = 3-7). Diese Zahl wurde von27 übernommen und mit Genehmigung reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Bewertete Läsionen und Verhaltensmuster. Kategorisierung qualitativer Variablen. Die Parameter, die qualitativ bewertet werden, sind Verletzungen (an Flossen und Schuppen), Schwimmen, Füttern und ob der Tod des Fisches durch den Test oder durch die Handhabung verursacht wird. Als subjektive Überlegung wird jede Variable von sehr leicht bis schwer kategorisiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Oligonukleotid-Primer und Annealing-Temperaturen für die qRT-PCR. Diese Tabelle wurde von30 übernommen und mit Genehmigung reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Repräsentative Ergebnisse. Aufzeichnungen von Zebrafischallergien und Todesfällen sowie die Expression ausgewählter Immunantwortmarker werden mittels qRT-PCR in der Niere und im Darm von Zebrafischen analysiert. Die mRNA-cT-Werte werden gegen D. rerio GAPDH normiert und zwischen Fischen, die mit Speichel, α-Gal behandelt wurden, und der PBS-behandelten Kontrollgruppe durch einen Student-t-Test mit ungleicher Varianz (*p < 0,05; N = 3-7). Diese Tabelle wurde von27,30 übernommen und mit Genehmigung reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Film 1: Betäubter Fisch. Der betäubte Fisch zeigt keine Bewegung oder schwimmt nicht, sondern atmet weiter. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 2: Injektion der Behandlung in den Fisch. Die Fische werden betäubt auf einen feuchten Schwamm gelegt und mit der angegebenen Behandlung in einem Winkel von 45° zu ihrem Körper injiziert. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 3: Serumentnahme aus den Kiemenblutgefäßen. Der Fisch wird mit Stiften auf einer Paraffinplatte fixiert und das Serum wird mit einer 0,5-ml-Spritze, die mit einer 1 cm, 29 g-Nadel ausgestattet ist, von den Kiemen gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 4: Darmentnahme von einem eingeschläferten Fisch. Der Fisch wird mit einer Skalpellklinge sagittal geschnitten und der Darm mit einer Pinzette gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 5: Nierenentnahme von einem eingeschläferten Fisch. Die Schwimmblase wird entfernt und die Niere wird gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 6: Repräsentative Verhaltensaspekte, die bei behandelten Zebrafischen beobachtet wurden. Ein Fisch zeigte langsames Schwimmen. Alle Fische aus derselben Gruppe befinden sich im selben Becken. Das Video ist ein Beispiel, um dieses Verhalten zu veranschaulichen, und mehrere Fische können dieses Verhalten zu verschiedenen Tageszeiten haben. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 7: Repräsentative Verhaltensaspekte, die bei behandelten Zebrafischen beobachtet wurden. Ein Fisch blieb am Boden des Beckens. Alle Fische aus der gleichen Gruppe befinden sich im selben Becken, Die Videos sind ein Beispiel, um dieses Verhalten zu veranschaulichen, und mehrere Fische können dieses Verhalten zu unterschiedlichen Tageszeiten haben. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 8: Repräsentative Verhaltensaspekte, die bei behandelten Zebrafischen beobachtet wurden. Ein Fisch zeigte vibrierendes Schwimmen. Alle Fische aus der gleichen Gruppe befinden sich im selben Becken, Die Videos sind ein Beispiel, um dieses Verhalten zu veranschaulichen, und mehrere Fische können dieses Verhalten zu unterschiedlichen Tageszeiten haben. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
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Discussion
Zebrafisch ist ein kostengünstiges und einfach zu handhabendes Modell, das sich auch als sehr praktikables Werkzeug für die Untersuchung molekularer Mechanismen der Immunantwort, von Erregerkrankheiten, neuartigen Arzneimitteltests sowie von Impfungen und Impfungen und zum Schutz vor Infektionen erwiesenhat 33,34,35. Die Studie über das Verhalten von Zebrafischen ist nützlich, da frühere Studien ergeben haben, dass einige Fischarten bei Stress bewegungslos am Boden des Beckens bleiben, was sich auf ihre Nahrungsaufnahme auswirkt und weniger frisst. Darüber hinaus könnte Zickzack, wenn sie sich bewegen, auch mit Stress und Angst der Fische in Verbindung gebracht werden36,37. Die Informationen, die aus Studien gewonnen werden, indem diese Parameter im Zebrafisch ausgewertet werden, werden ein grundlegendes Verständnis der molekularen Wechselwirkungen und Mechanismen zwischen Zecken und Wirt liefern, die an der Immunantwort des Wirts auf α-Gal beteiligt sind, die zur Entwicklung von AGS führen können, einschließlich einer Allergie gegen den Verzehr von Säugetierfleisch.
Um falsch positive Reaktionen auf das injizierte Molekül zu vermeiden, ist es wichtig, eine intradermale Injektion nicht sehr tief parallel zum Zebrafischkörper durchzuführen und zu beurteilen, ob der Fisch zum Zeitpunkt der Injektion beschädigt ist. Fische mit Verletzungen, die durch Handhabung oder Eindringen der Nadel verursacht wurden, sollten nicht in die Analyse einbezogen werden. Darüber hinaus wird dringend empfohlen, dass ein Fachmann mit Kenntnissen über Zebrafische Verhaltensänderungen wie Schwimmen und Füttern bewertet, um Verhaltensänderungen auf der Grundlage seines Hintergrunds und seiner Erfahrung mit diesem Modell zu berücksichtigen38. Eine weitere wichtige Überlegung ist die Anästhesie; Eine ausreichende Dosis ist wichtig für den optimalen Zustand der gesammelten Proben. Darüber hinaus wird während der Injektionsbehandlung eine ausgeprägtere Stressreaktion vermieden, die mögliche Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Stressdiagnose kompensieren kann29.
Die Ergebnisse zeigten, dass das Zebrafischmodell auch die Möglichkeiten zur Bewertung der Risiken der Entwicklung von AGS nach einem Zeckenstich und anderen allergischen Reaktionen verbessern könnte. Darüber hinaus können Ziele für die Diagnose, Behandlung und Prävention dieser Allergien auf den Menschen angewendet werden, da diese Methode und die ausgewerteten Parameter eine genauere Charakterisierung allergischer Reaktionen bei Zebrafischen ermöglichen.
Mit dieser Methode könnten andere speichelbiogene Moleküle, die für allergische Reaktionen verantwortlich sind und im Zeckenspeichel vorhanden sind, bewertet werden. Der α-Gal-Gehalt im Zeckenspeichel wurde zuvor quantifiziert27, aber es ist nicht bekannt, welche anderen Verbindungen an der Entwicklung von AGS beteiligt sein könnten. Allergische Reaktionen wurden in Gruppen beobachtet, die mit Zeckenspeichel und α-Gal behandelt wurden, jedoch nicht in PBS-Gruppen (Tabelle 3), jedoch ist das Verhalten in der mit Zeckenspeichel behandelten Gruppe stärker beeinflusst als in der α-Gal-Gruppe (Abbildung 5). Aus diesen Daten wäre unsere Hypothese, dass andere Biomoleküle in Kombination mit alpha-Gal an AGS beteiligt sind, so dass weitere Experimente untersuchen sollten, welche anderen im Speichel vorhandenen Moleküle einen Einfluss auf diese Ergebnisse haben. Darüber hinaus waren die Anti-Alpha-Gal-Antikörpertiter bei Zebrafischen, die mit Zeckenspeichel und Alpha-Gal behandelt wurden, signifikant höher, die, wie in früheren Studien26,29, eine Immunantwort auf das im Zeckenspeichel vorhandene Alpha-Gal zeigten (Abbildung 7).
Schließlich schienen die Immunantwortmarker in Zebrafischgruppen, die mit Zeckenspeichel und Alpha-Gal behandelt wurden, im Vergleich zur PBS-behandelten Gruppe herunterreguliert zu sein (Tabelle 3 und Abbildung 6). Diese Ergebnisse stimmen mit denen anderer Studien überein, in denen andere AGS-bezogene Biomoleküle getestet wurden27, aber im Gegensatz zu früheren Studien25 , in denen α-Gal-KO-Mäuse als Reaktion auf Zeckenstiche und den Verzehr von rotem Fleisch eine IgE-Antwort und eine hochregulierte Expression von entzündlichen Toll-like-Rezeptoren (TLR) und IL-1-Signalwegen zeigten, was zur Aktivierung des Akr2 führte. Daher sind weitere Studien erforderlich, um die Aktivierungswege dieser Reaktionen auf Zeckenspeichel und andere Biomoleküle im Zebrafisch zu verstehen, die durch die Anwendung dieser Methodik erreicht werden könnten.
Diese Methodik kann dann ein Screening auf Biomoleküle ermöglichen, die allein oder in Kombination allergische Reaktionen auslösen und die Immunantwort des Wirts beeinflussen könnten, was zu allergischen Erkrankungen wie AGS und anderen durch Zecken übertragenen Allergien führen könnte27.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei den Mitgliedern der SaBio-Gruppe für die Zusammenarbeit bei der Versuchsplanung und der technischen Unterstützung bei der Fischversuchsanlage und bei Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Spanien) für die Bereitstellung von Zebrafischen. Diese Arbeit wurde vom Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Spanien und EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00) unterstützt. Marinela Contreras wird gefördert durch das Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanien, Stipendium IJC2020-042710-I.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food - Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
References
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