Summary
כאן, דג זברה (Danio rerio) משמש כמודל לחקר תגובות אלרגיות ותגובות חיסוניות הקשורות לתסמונת אלפא-גל (AGS) על ידי הערכת תגובות אלרגיות לרוק קרציות וצריכת בשר יונקים.
Abstract
קרציות הן וקטורים של פרוקי רגליים הגורמים למחלות על ידי העברת פתוגנים, ועקיצותיהם יכולות להיות קשורות לתגובות אלרגיות המשפיעות על בריאות האדם ברחבי העולם. אצל אנשים מסוימים, רמות גבוהות של נוגדנים אימונוגלובולינים E נגד גליקן Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) נגרמו על ידי עקיצות קרציות. תגובות אנפילקטיות המתווכות על ידי גליקופרוטאינים וגליקוליפידים המכילים את הגליקן α-גל, הנמצאים ברוק הקרציות, קשורות לתסמונת אלפא-גל (AGS) או אלרגיה לבשר יונקים. דג זברה (Danio rerio) הפך למודל חולייתי נפוץ לחקר פתולוגיות שונות. במחקר זה, דגי זברה שימשו כמודל לחקר תגובות אלרגיות בתגובה לצריכת בשר α-גל ויונקים, מכיוון שבדומה לבני אדם, הם אינם מסנתזים גליקן זה. לשם כך הוערכו דפוסי התנהגות ותגובות אלרגיות אנפילקטיות דימומיות בתגובה לרוק קרציות Ixodes ricinus ולצריכת בשר יונקים. גישה ניסיונית זו מאפשרת קבלת נתונים תקפים התומכים במודל בעלי החיים של דגי הזברה לחקר אלרגיות המועברות על ידי קרציות, כולל AGS.
Introduction
קרציות הן וקטורים של פתוגנים הגורמים למחלות והם גם הגורם לתגובות אלרגיות, המשפיעות על בריאותם של בני אדם ובעלי חיים ברחבי העולם 1,2. במהלך הזנת קרציות, ביומולקולות ברוק הקרציות, במיוחד חלבונים ושומנים, להקל על האכלה של ectoparasites אלה, הימנעות הגנות המארח3. חלק מהביומולקולות של הרוק עם גליקן Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) מובילות לייצור רמות נוגדנים גבוהות נגד α-Gal IgE לאחר עקיצת הקרציה, רק אצל אנשים מסוימים, מה שידוע בשם תסמונת α-גל (AGS)4. זוהי מחלה הקשורה לאלרגיה בתיווך IgE שעלולה לגרום לאנפילקסיס לעקיצות קרציות, צריכת בשר יונקים שאינם פרימטים, וכמה תרופות כגון cetuximab5. התגובות ל-α-גל הן לעיתים קרובות חמורות ולעיתים עלולות להיות קטלניות 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
α-גל מצוי בכל היונקים למעט קופי העולם הישן, קופים ובני אדם שאין להם יכולת לסנתז α-גל13. עם זאת, פתוגנים כגון חיידקים ופרוטוזואה מבטאים גליקן זה על פני השטח שלהם, אשר יכול לגרום לייצור כמויות גבוהות של נוגדנים נגד α-גל IgM/IgG ועשוי להיות מנגנון הגנה מפני פתוגנים אלה16,17. עם זאת, ייצור נוגדנים נגד α-גל מעלה את הסיכון לפתח אלרגיות אנטי-α-גל בתיווך IgE 7,13. נוגדנים טבעיים נגד α-גל המיוצרים בבני אדם, בעיקר מתת-הסוגים IgM/IgG, עשויים להיות קשורים לשינוי זה הקיים בחיידקים ממיקרוביוטת המעי16. AGS יכולה להיות אבחנה קלינית מאתגרת, שכן שיטת האבחון העיקרית כרגע מבוססת על היסטוריה קלינית של תגובות אלרגיות מאוחרות, הקשורות במיוחד לאלרגיות למזון (כלומר, גרד, כוורות מקומיות, או אנגיואדמה חוזרת לאנפילקסיס, אורטיקריה ותסמינים במערכת העיכול) ומדידת רמות נוגדנים IgE נגד α-גל9. ממצאים עדכניים מצביעים על כך שעקיצות קרציות מהוות את אחד הסיכונים העיקריים בהופעת AGS 18,19, עלייה של פי 20 ומעלה ברמות IgE ל-α-גל בעקבות עקיצת קרציות 19, היסטוריה של עקיצות קרציות בחולים עם AGS20,21,22, קיומם של נוגדנים תגובתיים לאנטיגנים של קרציות בחולי AGS 19, וכי Anti-α-Gal IgE קשורים קשר הדוק לרמות IgE נגד קרציות19,23, אך נדרשים מחקרים נוספים כדי להעריך אילו ביומולקולות מעורבות בפועל.
בנוסף, תרחיש אפשרי נוסף הוא חולים המציגים תגובות אלרגיות חזקות לעקיצות קרציות ורמות גבוהות של נוגדנים נגד α-Gal IgE אך עמידים לצריכת בשר יונקים12. לכן, אלרגיה לבשר יונקים יכולה להיות סוג מסוים של אלרגיה הקשורה לעקיצת קרציות. מיני הקרציות העיקריים הקשורים ל-AGS כוללים את Amblyomma americanum (ארה"ב), Amblyomma sculptum (ברזיל), Amblyomma testudinarium ו-Haemaphysalis longicornis (יפן), Ixodes holocyclus (אוסטרליה) ו-Ixodes ricinus (הווקטור העיקרי של Borreliosis ליים באירופה)11,24.
המודל היחיד ששימש להערכת ייצור IgE הקשור לעקיצות קרציות הוא מודל העכבר המהונדס גנטית עם הגן לעכברי α-1,3-גלקטוסילטרנספראז (α-Gal KO)25,26 מכיוון שכמו יונקים אחרים, גם עכברים מבטאים α-גל על חלבונים ושומנים ואינם מייצרים IgE ל-α-Gal. עם זאת, דג זברה (Danio rerio) הוא מודל שימושי למחקר ביו-רפואי המיושם על יונקים מכיוון שהוא חולק קווי דמיון אנטומיים רבים עם יונקים, וכמו בני אדם, גם אינו מסוגל לסנתז α-גל. מכיוון ש-α-גל אינו מיוצר באופן טבעי בדגי זברה, זהו מודל זול, קל למניפולציה ומאפשר מדגם גבוה לחקר תגובות אלרגיות הקשורות ל-α-Gal.
במחקר זה, דגי זברה משמשים כאורגניזם מודל כדי לאפיין ולתאר תגובות אלרגיות מקומיות, דפוסי התנהגות, ואת המנגנונים המולקולריים הקשורים לתגובה לרגישות מלעורית לרוק קרציות26,27 וצריכת בשר יונקים לאחר מכן. לשם כך, דגים נחשפים לרוק קרציות על ידי הזרקה תוך עורית ולאחר מכן מוזנים במזון כלבים, המכיל מוצרים שמקורם בבשר יונקים המתאימים לשימוש בבעלי חיים המכיל α-גל27, ואז נבדקות תגובות אלרגיות אפשריות הקשורות. שיטה זו עשויה להיות מיושמת על המחקר של biomolecules אחרים הקשורים לתהליכים אלרגיים, במיוחד אלה הקשורים AGS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת קסטילה לה מנצ'ה במסגרת המחקר "הערכת התגובה החיסונית לחיסון מומת של M. bovis ואתגר עם M. marinum במספר דגם דג הזברה PR-2017-05-12."
קרציות התקבלו ממושבת המעבדה, שם דגימות מייצגות של קרציות במושבה נבדקו על ידי PCR לפתוגנים נפוצים של קרציותכדי לאשר את היעדר הפתוגנים, ונשמרו במכון לפרזיטולוגיה, המרכז הביולוגי של האקדמיה הצ'כית למדעים (IP BC CAS), צ'כיה.כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לחוק הגנת בעלי חיים של הרפובליקה הצ'כית מס '246/1992 Sb (אישור אתיקה מס '34/2018).
1. טיפול בדגי זברה
הערה: הניסוי נועד להעריך תגובות אלרגיות ואת התגובה החיסונית בדגי זברה שטופלו ברוק קרציות בתגובה לצריכת בשר יונקים.
- טפלו בדגים (כפי שמוסבר בסעיף 4) ברוק קרציות, מסחרי Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (ראה טבלת חומרים), המשמש כבקרה חיובית, עם מלוחים חוצצי פוספט (PBS) כבקרה שלילית. דגי זברה בוגרים מחולקים באופן אקראי לשלוש קבוצות מאוזנות מגדרית (איור 1).
הערה: ניתן להעריך כל תרכובת רצויה אחרת הקשורה ל- AGS באמצעות מודל זה.
2. Ixodes ricinus מיצוי רוק קרציות
- השתמשו בקרציות נקבות נטולות פתוגן למחצה המוזנות במשך 6-7 ימים בשרקנים.
- טפל בקרצייה עם 5 μL של תמיסה 2% (wt/vol) של פילוקרפין הידרוכלוריד ב- PBS (ראה טבלת חומרים) ב- pH 7.4 לתוך ההמוקול באמצעות מזרק 50 μL עם מחט 0.33 מ"מ כפי שתואר קודם לכן28 כדי לגרום לייצור רוק הקרציות.
הערה: הטיפול בקרציות נעשה באמצעות מלקחיים; היזהר לא להפעיל יותר מדי כוח כאשר אוחזים בהם. - לאסוף רוק באמצעות קצה 10 μL רכוב על micropipette.
- הציגו בזהירות את החוד בתוך היפוסטום הקרציה.
- שמור את הרוק בצינור של 1.5 מ"ל על קרח, אגר אותו ואחסן אותו ב -80 ° C כפי שתואר קודם27.
- לקבוע את ריכוז חלבון הרוק, כדי לקבוע את כמות החלבון שיש להזריק לדגים כמו במחקרים קודמים27 באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA (ראה טבלת חומרים) בעקבות המלצות היצרן.
3. תחזוקה של דגי זברה
- שמרו על דגי זברה במערכת מים זורמת ב-27°C עם מחזור בהיר/כהה של 14 שעות/10 שעות (איור 2).
- האכילו את הדגים פעמיים ביום בשעות 9:30 בבוקר ו-13:30 במזון יבש לדגים (50-70 מיקרוגרם לדגים) עד היום השני.
- יש להאכיל את הדגים פעמיים ביום בשעות 9:30 בבוקר ו-13:30 במזון יבש לכלבים (50-70 מק"ג/דגים) מהיום השני לאחר הזרקת הטיפול ועד סוף הניסוי
4. הזרקת דגי זברה
- בחר 10 דגים בכל קבוצה עם יחס דומה של נקבות/זכרים ומשקל דומה.
הערה: קבוצה 1 מכילה דגים המוזרקים עם PBS, קבוצה 2 מכילה דגים המוזרקים עם רוק קרציות, וקבוצה 3 מכילה דגים המוזרקים עם α-גל. - הרדימו את הדג לזמן קצר על ידי טבילה ב-0.02% טריקאין מתאן-סולפונט (MS-222) (סרט 1).
הערה: דגים מורדמים כראוי מראים נשימה רגילה וללא שחייה, בעוד שניתן למקם אותם בתחתית מיכל המים או לצוף. כל דג חייב להיות מורדם בנפרד כדי למנוע נזק פיזיולוגי אפשרי. - לכדו את הדגים המורדמים באמצעות רשת דיג.
- הניחו את הדג על חצי צידו בעזרת מלקחיים או ידיים בזהירות, על ספוג רטוב, כאשר הסנפיר הקאודלי בצד ימין כדי להזריק את התרכובות באותו כיוון על מנת לשלוט בנגעים.
- הזריקו קבוצות דגים תוך עורית, כמו במחקרים קודמים26, בשריר בקוטר 5 מ"מ לסנפיר הקאודלי ובזווית של 45 מעלות ביחס לגוף הדג (סרט 2). השתמש בטיפול המתאים בימים 0, 3 ו- 8 כפי שתואר קודם לכן 27 עם מזרק 100 μL מצויד במחט 1 ס"מ, 29 גרם עם 1 μL (עם 9 מיקרוגרם / μL של חלבון) של רוק I. ricinus ב 10 μL של PBS (רוק קרציות), 5 מיקרוגרם של α-גל ב 10 μL PBS (α-Gal)27, ו-10 מיקרוליטר של PBS (איור 3).
הערה: הטיפול חייב להיעשות במהירות ובזהירות כדי למנוע נזק פיזי לבעל החיים.
ביומולקולות אחרות ברוק הקרציות ניתנות להערכה בעקבות פרוטוקול זה. - החזירו את הדגים המטופלים למיכל מים מתוקים ללא הרדמה לצורך התאוששות.
הערה: ניתן להכניס את כל הדגים מאותה קבוצה לאותו מיכל מים לצורך התאוששות.
5. האכלת דגי זברה
- מועכים את מזון הכלב עם טיט ו pestle.
- יש להאכיל 50-70 מק"ג/דגים פעמיים ביום בשעות 9:30 ו-13:30 במזון דגים יבש עד היום השני.
- יש להאכיל 50-70 מק"ג/דגים פעמיים ביום בשעות 9:30 ו-13:30 במחית מזון לכלבים מהיום השני לאחר הזרקת הטיפול ועד סוף הניסוי ביום השמיני.
הערה: אם יש להעריך סמני חסינות או טיטרים של נוגדנים לנוגדן α-Gal או IgE בתגובה לטיפולים או להזנה במהלך החיסונים השונים, יהיה צורך בהזנה עד סוף הניסוי.
6. הערכת תגובות, נגעים והתנהגות אלרגיים בדגי זברה
- בחנו את סוג הדימום של תגובות אלרגיות (אדמומיות בעור, שינוי צבע ודימום) באמצעות זכוכית מגדלת או סטריאומיקרוסקופ לצורך דיוק, וציינו את מיקום הופעתן על הדגים בעקבות הסיווג הכלול בטבלה 1 (איור 4A).
הערה: התגובות האלרגיות המוצגות באיור 4 הופיעו לאחר הזרקת רוק קרציות וצריכת מזון המכיל בשר אדום. לכן, התגובות המתוארות הן סוג התגובות הקשורות ל- AGS, שכן תגובות דומות מופיעות בהקשר הקליני.- שימו לב אם מופיעה תגובה כלשהי לאחר טיפולים ותוך מתן מזון פעמיים ביום בזמן שהדגים נמצאים במיכל המים.
- בחנו את התנהגות הדגים על ידי הערכת השינויים27 בדפוסי השחייה (ניידות, מהירות, עמידה ללא תנועה בתחתית מיכל המים ושחייה בזיגזג) בעקבות הסיווג הכלול בטבלה 1.
- להעריך תמותה מצטברת, ולדווח על מספר הדגים המתים כולל השעה / יום המוות (איור 4B).
הערה: כל הפרמטרים מוערכים מיד לאחר הטיפול או לאחר שינוי ההזנה ועוקבים אחריהם מדי יום עד סוף הניסוי ביום 8 תוך סיווג משתנים איכותיים (טבלה 1). כהמלצה, הערכה זו צריכה להתבצע על ידי איש מקצוע בעל ידע בדגי זברה כדי לשקול שינויים התנהגותיים בהתבסס על הרקע והניסיון שלהם בעבודה עם מודל בעלי חיים זה. - חשב את מספר דגי הזברה ליום עם תגובות אלרגיות מדווחות, התנהגות חריגה ושינויים בהזנה בכל קבוצה והשווה בין קבוצות על ידי בדיקת ANOVA חד-כיוונית.
7. איסוף דוגמאות
- הרדימו את הדג על ידי טבילה ב-0.04% MS-222 ביום ה-8.
הערה: אספו גם את הדגימות מהדגים שמתו מתגובות אלרגיות במהלך הניסוי. - מקבעים את הדג על צלחת פרפין עם סיכות.
- לאסוף סרום מן כלי הדם זימים 29 של הדגים מיד לאחר המתת חסד, כאשר הזימים עדיין מושקים בדם, באמצעות מזרק 0.5 מ"ל מצויד 1 ס"מ,29 גרם מחט. יש לאחסן אותו בצינור בנפח 1.5 מ"ל בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש (סרט 3).
- חותכים את הדג עם להב אזמל ולהעריך את הנגעים הפנימיים (נגעים hemorrhagic או גרנולומות)27,30 אם הם מופיעים.
הערה: נגעים אינם מופיעים בהכרח אך יש לרשום אותם אם כן. - אספו את המעי (סרט 4) ואת הכליה (סרט 5) מכל דג בצינורות ריקים נפרדים של 1.5 מ"ל, כפי שתואר קודם לכן31, ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס (איור 4C).
- יש לחלץ רנ"א כולל ממעי דגי הזברה ומדגימות הכליה באמצעות ערכת טיהור RNA (ראו טבלת חומרים).
- לנתח את ביטוי הגנים הקשורים לתגובה חיסונית כפי שתואר קודם לכן30,32 (ראה טבלה 2 עבור רצפי פריימר) בדגי זברה, ביצוע תגובת שרשרת כמותית של שעתוק לאחור-פולימראז (RT-qPCR) באמצעות תערובת שעתוק לאחור עבור RT-qPCR (ראה טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן. נרמלו את ערכי cT mRNA כנגד D. rerio GAPDH, והשוו בין קבוצות (דגים שטופלו ברוק, α-Gal והקבוצות שטופלו ב-PBS) באמצעות מבחן t סטודנטיאלי עם שונות לא שוויונית.
- קבע טיטרים נוגדנים מסוג IgM המזהים α-Gal בדגי זברה בדגימות סרום על ידי ELISA כפי שתואר קודם לכן27,30. רשום את טיטרי הנוגדנים כערכי O.D.450 ננומטר, באמצעות קורא צלחות, והשווה בין קבוצות (דגים שטופלו ברוק, α-גל והקבוצות שטופלו ב- PBS) באמצעות מבחן t סטודנט עם שונות לא שווה.
הערה: קביעת טיטרים של נוגדנים IgM וניתוח גנים ביטוי היא אופציונלית ומבוצעת רק אם נדרש מידע אימונולוגי. תערובת RT-qPCR היא ערכת סינתזת cDNA גדיל ראשון לניתוח ביטוי גנים באמצעות qPCR בזמן אמת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המוצג כאן מבוסס על מספר היבטים של ניסויים שפורסמו בעבר27,30 ותוצאות שבוצעו במעבדה שלנו, שם מודל דג הזברה מבוסס ומאומת לחקר AGS והתגובה החיסונית ל- α-Gal מכיוון שגם בני אדם וגם דגי זברה אינם מסנתזים מולקולה זו13. מודל זה מאפשר אפיון והערכה של מגוון תגובות אלרגיות כתוצאה מתגובת המאכסן לרוק הקרציות (איור 4) והשלכותיהן על AGS. בנוסף, שינויים בהתנהגות כגון שחייה איטית (סרט 6), שכיבה על תחתית המיכל (סרט 7), ולא אכילה, רטט או תנועה מזגזגת (סרט 8) נצפים בדגים בתגובה לטיפול ברוק קרציות שאינו נצפה בדגי הביקורת; ממצאים אלה משמעותיים במיוחד לאחר מתן מזון לכלבים ביום השני. בשלב זה, הדגים כבר היו רגישים לרוק אלפא-גל וקרציות, והחל מתן בשר אדום דרך ההזנה. לבסוף, נצפתה שכיחות משמעותית של תגובות אלרגיות בדגים שטופלו ברוק קרציות (איור 4A,B וטבלה 3), רק דגי זברה שנחשפו לרוק הקרציות פיתחו תגובות אלרגיות, והראו רגישות וסבילות מהירות. לעומת זאת, במחקרים קודמים, דגי זברה שניזונו ממזון דגים לא פיתחו נגע או תגובה נראים לעין27. השינוי ההתנהגותי היה בולט יותר בדגים שטופלו ברוק קרציות מאשר רק α-גל (איור 5). ניתוח נוסף של הביטוי של יוצרי התגובה החיסונית המייצגים ביותר (IFN, TLR 2, IL1 β ו-AKR2) בוצע על ידי RT-PCR (טבלה 3), על מנת לחקור תגובות חיסוניות שונות לטיפולים. התוצאות הראו הבדלים בין קבוצות דגי זברה בכליה, שם נראה כי רוב סמני התגובה החיסונית היו מופחתים בדגים שטופלו ברוק וב α-גל בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 6), אך לא נמצאו הבדלים משמעותיים בביטוי גנים במעי. מחקרים קודמים על תגובות אלרגיות למרכיבי רוק שונים של קרציות בדגי זברה הראו תוצאות דומות27. בנוסף, כתוצאות מייצגות, דגי זברה שטופלו ברוק קרציות ו-α-Gal באמצעות פרוטוקול זה פיתחו נוגדני IgM נגד α-Gal שהראו רמות גבוהות יותר מאשר בדגים שטופלו ב-PBS (איור 7), כפי שנמצא במחקרים קודמים27,30.
איור 1: תכנון ניסויי עבור ניסוי בדגי זברה. דגים מוזרקים תוך עורית עם α-גל, רוק קרציות ו-PBS כבקרה שלילית. הדגימות נאספות לאחר מותו של דג או בסוף הניסוי. דגימות יכולות לשמש לניתוח רמות IgM אנטי-α-Gal וביטוי של סמנים גנטיים נבחרים של תגובה חיסונית על ידי qRT-PCR27. שינויים התנהגותיים או תגובות אלרגיות נרשמים במהלך הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מתקן ניסויי של דגי זברה. דגי הזברה נשמרים במערכת מים זורמים ב 27 ° C עם מחזור אור / כהה של 14 שעות / 10 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הזרקת טיפול בדגי זברה. הזרקת טיפול בדגי זברה עם מזרק 100 μL המצויד במחט 1 ס"מ, 29 גרם מבוצעת תוך עורית במרחק של 5 מ"מ מהסנפיר הקאודלי. הדגים מורדמים ומטופלים בזה אחר זה על ספוג טבול במים חמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: עדות לתגובות דימומיות אנפילקטיות בדגי זברה שהוזרקו להם רוק קרציות ומתו ביום השני לפני שינוי ההזנה. (A) דגים עם תגובות אלרגיות במיכל לאחר הטיפול. (B) דגים מתים מתגובות אנפילקטיות דימומיות (סוג תגובה אלרגית: שינוי צבע ואדמומיות בעור. (ג) איסוף דוגמאות. חיצים אדומים מציינים את המעי ועיגולים אדומים מציינים את הכליה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: דפוס התנהגותי שנצפה אצל דגים. דפוסי התנהגות חריגים כללו שחייה איטית, עמידה נייחת בתחתית מיכל המים ושחייה בזיגזג. החיצים הכחולים מציינים את זמן הטיפול, והחץ האדום מציין את הזמן לעבור ממזון דגים להאכלת כלבים. דגים שניזונו ממזון כלבים הושוו בין דגי ביקורת שטופלו ברוק לבין דגי ביקורת שטופלו ב-PBS על ידי בדיקת ANOVA חד-כיוונית (p = 0.05; N = 5 דגים / קבוצה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ביטוי של סמני תגובה חיסונית נבחרים בכליה של דג זברה. ניתוח ביטוי גנים על ידי qRT-PCR בכליה של דגי זברה בסוף הניסוי. ערכי cT mRNA מנורמלים כנגד D. rerio GAPDH, מוצגים כממוצע ± SD, ומושווים בין דגים שטופלו ברוק, α-Gal, לבין קבוצת הביקורת שטופלה ב- PBS על ידי מבחן t סטודנט עם שונות לא שוויונית (*p < 0.05; N = 3-7). נתון זה אומץמ-27 ושוחזר באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: נוגדנים מסוג IgM. נוגדני IgM של דגי זברה כנגד α-Gal נקבעים על ידי ELISA, המיוצג כממוצע ± SD O.D. ב 450 ננומטר ומושווה בין דגים שטופלו ברוק, α -Gal, לבין קבוצת הביקורת שטופלה ב- PBS על ידי מבחן t סטודנט עם שונות לא שוויונית (*p < 0.005; N = 3-7). נתון זה אומץמ-27 ושוחזר באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: נגעים ודפוסי התנהגות שהוערכו. סיווג משתנים איכותיים. הפרמטרים המוערכים איכותית הם פציעות (על סנפירים ומאזניים), שחייה, האכלה והאם מותו של הדג נגרם על ידי הבדיקה או על ידי טיפול. כשיקול סובייקטיבי, כל משתנה מסווג מקל מאוד לחמור אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.
טבלה 2: פריימרים אוליגונוקלאוטידים וטמפרטורות חישול עבור qRT-PCR. טבלה זו אומצה מתוך30 ושוחזרה באישור. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: תוצאות מייצגות. רשומות של אלרגיות ומוות של דגי זברה וביטוי של סמני תגובה חיסונית נבחרים מנותחים על ידי qRT-PCR בכליות ובמעי של דגי זברה. ערכי mRNA cT מנורמלים כנגד D. rerio GAPDH ומושווים בין דגים שטופלו ברוק, α-Gal, לבין קבוצת הביקורת שטופלה ב-PBS על ידי מבחן t סטודנטיאלי עם שונות לא שוויונית (*p < 0.05; N = 3-7). טבלה זו אומצה מ-27,30 ושוחזרה באישור. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
סרט 1: דגים מורדמים. הדג המורדם אינו מראה תנועה או שוחה אלא ממשיך לנשום. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
סרט 2: הזרקת הטיפול בדגים. הדגים מורדמים על ספוג רטוב ומזריקים בזווית של 45 מעלות לגופם עם הטיפול המצוין. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
סרט 3: איסוף סרום מכלי הדם של הזמיר. הדג קבוע על צלחת פרפין עם סיכות וסרום נאסף מן הזימים באמצעות מזרק 0.5 מ"ל מצויד 1 ס"מ, 29 גרם מחט. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
סרט 4: אוסף מעיים מדג שעבר המתת חסד. הדג נחתך באמצעות להב אזמל והמעי נאסף בפינצטה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
סרט 5: איסוף כליות מדג שעבר המתת חסד. שלפוחית השחייה מוסרת, והכליה נאספת. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
סרט 6: היבטים התנהגותיים מייצגים שנצפו בדגי זברה מטופלים. דג אחד הראה שחייה איטית. כל הדגים מאותה קבוצה נמצאים באותו מיכל, הסרטון הוא דוגמה להמחשת התנהגות זו, וכמה דגים עשויים להיות בעלי התנהגות זו בשעות שונות של היום. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
סרט 7: היבטים התנהגותיים מייצגים שנצפו בדגי זברה מטופלים. דג אחד נשאר בתחתית המיכל. כל הדגים מאותה קבוצה נמצאים באותו מיכל, הסרטונים הם דוגמה להמחשת התנהגות זו, וכמה דגים עשויים להיות בעלי התנהגות זו בשעות שונות של היום. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
סרט 8: היבטים התנהגותיים מייצגים שנצפו בדגי זברה מטופלים. דג אחד הראה שחייה רוטטת. כל הדגים מאותה קבוצה נמצאים באותו מיכל, הסרטונים הם דוגמה להמחשת התנהגות זו, וכמה דגים עשויים להיות בעלי התנהגות זו בשעות שונות של היום. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דג זברה הוא מודל חסכוני וקל לטיפול שהיה גם כלי אפשרי מאוד לחקר מנגנונים מולקולריים של התגובה החיסונית, מחלות פתוגנים, בדיקות תרופות חדשניות, חיסון והגנה מפני זיהומים33,34,35. המחקר על התנהגות דגי הזברה שימושי מכיוון שמחקרים קודמים מצאו כי חלק ממיני הדגים נשארים ללא תנועה בתחתית המיכל כאשר הם בסטרס, מה שמשפיע על צריכת המזון שלהם, אוכלים פחות; בנוסף, זיגזג כאשר הם זזים יכול להיות קשור גם עם מתח דגיםוחרדה 36,37. המידע שיופק ממחקרים על ידי הערכת פרמטרים אלה בדגי זברה יספק הבנה בסיסית של האינטראקציות המולקולריות והמנגנונים המולקולריים המעורבים בתגובה החיסונית של המארח ל- α-Gal שעשויים להוביל להתפתחות AGS, כולל אלרגיה לצריכת בשר יונקים.
כדי למנוע תגובות חיוביות כוזבות למולקולה המוזרקת, חשוב לבצע הזרקה תוך-עורית לא עמוקה, במקביל לגוף דג הזברה, ולהעריך אם הדג ניזוק בזמן ההזרקה. דג עם פציעה כתוצאה מטיפול או חדירת מחט לא צריך להיכלל בניתוח. בנוסף, מומלץ מאוד שאיש מקצוע בעל ידע בדגי זברה יעריך שינויים בהתנהגות כגון שחייה והאכלה על מנת לשקול שינויים התנהגותיים על סמך הרקע והניסיון שלהם בעבודה עם מודל38 זה. שיקול חשוב נוסף הוא הרדמה; מינון הולם חשוב למצב האופטימלי של הדגימות שנאספו. בנוסף, במהלך הטיפול בהזרקה, נמנעת תגובת מתח בולטת יותר, אשר יכולה לפצות על קשיים אפשריים הקשורים לאבחון מתח29.
התוצאות הראו כי מודל דגי הזברה יכול גם לקדם את האפשרויות להערכת הסיכונים לפתח AGS לאחר עקיצת קרציה ותגובות אלרגיות אחרות. יתר על כן, מטרות לאבחון, טיפולים, ומניעה של אלרגיות אלה ניתן ליישם על בני אדם, שכן שיטה זו ואת הפרמטרים המוערכים מאפשרים אפיון מדויק יותר של תגובות אלרגיות בדגי זברה.
שיטה זו יכולה לאפשר להעריך מולקולות ביוגניות אחרות ברוק, האחראיות לתגובות אלרגיות ונמצאות ברוק הקרציות. תכולת α-גל ברוק הקרציות כומתה בעבר27, אך לא ידוע אילו תרכובות אחרות עשויות להיות מעורבות בהתפתחות AGS. תגובות אלרגיות נצפו בקבוצות שטופלו ברוק קרציות וב-α-Gal, אך לא בקבוצות PBS (טבלה 3), אולם ההתנהגות מושפעת יותר בקבוצת הרוק של הקרציות מאשר בקבוצת α-גל (איור 5). מנתונים אלה, ההשערה שלנו תהיה שביומולקולות אחרות בשילוב עם אלפא-גל מעורבות ב-AGS, ולכן ניסויים נוספים צריכים לחקור אילו מולקולות אחרות שנמצאות ברוק משפיעות על ממצאים אלה. נוסף על כך, טיטרים של נוגדנים נגד אלפא-גל היו גבוהים משמעותית בדגי זברה שטופלו ברוק קרציות ובאלפא-גל, אשר, כמו במחקרים קודמים26,29, הראו תגובה חיסונית לאלפא-גל שנמצא ברוק הקרציות (איור 7).
לבסוף, סמני התגובה החיסונית הופיעו בירידה בוויסות בקבוצות דגי זברה שטופלו ברוק קרציות ובאלפא גל בהשוואה לקבוצה שטופלה ב-PBS (טבלה 3 ואיור 6). תוצאות אלה תואמות את אלה שהתקבלו במחקרים אחרים שבהם נבדקו ביומולקולות אחרות הקשורות ל- AGS27, אך בניגוד למחקרים קודמים25 שבהם עכברי α-Gal KO בתגובה לעקיצות קרציות וצריכת בשר אדום הראו תגובת IgE וביטוי מווסת של קולטן דמוי אגרה דלקתי (TLR) ומסלולי איתות IL-1, שהביאו להפעלת Akr2. לכן, נדרשים מחקרים נוספים כדי להבין את מסלולי ההפעלה של תגובות אלה לרוק קרציות ולביומולקולות אחרות בדגי זברה, שניתן להשיג על ידי יישום מתודולוגיה זו.
לאחר מכן, מתודולוגיה זו עשויה לאפשר סינון עבור ביומולקולות אשר לבדן או בשילוב מעוררות תגובות אלרגיות ואשר עלולות להשפיע על התגובה החיסונית של המארח המוביל למחלות אלרגיות כגון AGS ואלרגיות אחרות המועברות על ידי קרציות27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לחברי קבוצת SaBio על שיתוף הפעולה בתכנון הניסוי והסיוע הטכני עם מתקן ניסויי הדגים ולחואן גלסרן סאז (IN-CSIC-UMH, ספרד) על אספקת דגי הזברה. עבודה זו נתמכה על ידי Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, ספרד והאיחוד האירופי-פדרציה (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras ממומן על ידי Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, ספרד, מענק IJC2020-042710-I.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food - Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
References
- de la Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13 (18), 6938-6946 (2008).
- de la Fuente, J., et al. Tick-pathogen interactions and vector competence: identification of molecular drivers for tick-borne diseases. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 114 (2017).
- Villar, M., et al. Characterization of tick salivary gland and saliva alphagalactome reveals candidate alpha-gal syndrome disease biomarkers. Expert Review of Proteomics. 18 (12), 1099-1116 (2021).
- Chmelař, J., Kotál, J., Kovaříková, A., Kotsyfakis, M. The use of tick salivary proteins as novel therapeutics. Frontiers in Physiology. 10, 812 (2019).
- Chung, C. H., et al. Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The New England Journal of Medicine. 358 (11), 1109-1117 (2008).
- Van Nunen, S. A., O'Connor, K. S., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans. The Medical Journal of Australia. 190 (9), 510-511 (2009).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Environmental and molecular drivers of the α-Gal syndrome. Frontiers in Immunology. 10, 1210 (2019).
- de la Fuente, J., Pacheco, I., Villar, M., Cabezas-Cruz, A. The alpha-Gal syndrome: new insights into the tick-host conflict and cooperation. Parasites & Vectors. 12 (1), 154 (2019).
- Platts-Mills, T. A. E., et al. On the cause and consequences of IgE to galactose-α-1,3-galactose: A report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases workshop on understanding IgE-mediated mammalian meat allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (4), 1061-1071 (2020).
- Commins, S. P., et al. Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (2), 426-433 (2009).
- Platts-Mills, T. A. E., Schuyler, A. J., Tripathi, A., Commins, S. P. Anaphylaxis to the carbohydrate side chain alpha-gal. Immunology and Allergy Clinics of North America. 35 (2), 247-260 (2015).
- Mateos-Hernández, L., et al. Tick-host conflict: immunoglobulin E antibodies to tick proteins in patients with anaphylaxis to tick bite. Oncotarget. 8 (13), 20630-20644 (2017).
- Galili, U. Evolution in primates by "Catastrophic-selection" interplay between enveloped virus epidemics, mutated genes of enzymes synthesizing carbohydrate antigens, and natural anti-carbohydrate antibodies. American Journal of Physical Anthropology. 168 (2), 352-363 (2019).
- Hilger, C., Fischer, J., Wölbing, F., Biedermann, T. Role and mechanism of galactose-alpha-1,3-galactose in the elicitation of delayed anaphylactic reactions to red meat. Current Allergy and Asthma Reports. 19 (1), 3 (2019).
- Cabezas-Cruz, A., Valdés, J., de la Fuente, J. Cancer research meets tick vectors for infectious diseases. The Lancet. Infectious Diseases. 14 (10), 916-917 (2014).
- Yilmaz, B., et al. Gut microbiota elicits a protective immune response against malaria transmission. Cell. 159 (6), 1277-1289 (2014).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Regulation of the immune response to α-Gal and vector-borne diseases. Trends in Parasitology. 31 (10), 470-476 (2015).
- Weins, A. B., Eberlein, B., Biedermann, T. Diagnostics of alpha-gal syndrome: Current standards, pitfalls and perspectives. Der Hautarzt; Zeitschrift Fur Dermatologie, Venerologie, Und Verwandte Gebiete. 70 (1), 36-43 (2019).
- Commins, S. P., et al. The relevance of tick bites to the production of IgE antibodies to the mammalian oligosaccharide galactose-α-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1286-1293 (2011).
- Fischer, J., Yazdi, A. S., Biedermann, T. Clinical spectrum of α-Gal syndrome: from immediate-type to delayed immediate-type reactions to mammalian innards and meat. Allergo Journal International. 25 (2), 55-62 (2016).
- Hodžić, A., et al. Infection with Toxocara canis inhibits the production of IgE antibodies to α-Gal in humans: towards a conceptual framework of the hygiene hypothesis. Vaccines. 8 (2), 167 (2020).
- Kiewiet, M. B. G., et al. Clinical and serological characterization of the α-Gal syndrome-importance of atopy for symptom severity in a European cohort. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. In Practice. 8 (6), 2027-2034 (2020).
- Steinke, J. W., Platts-Mills, T. A. E., Commins, S. P. The alpha-gal story: lessons learned from connecting the dots. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 589-596 (2015).
- Hashizume, H., et al. Repeated Amblyomma testudinarium tick bites are associated with increased galactose-α-1,3-galactose carbohydrate IgE antibody levels: A retrospective cohort study in a single institution. Journal of the American Academy of Dermatology. 78 (6), 1135-1141 (2018).
- Chandrasekhar, J. L., et al. Cutaneous exposure to clinically relevant lone star ticks promotes IgE production and hypersensitivity through CD4+ T cell- and MyD88-dependent pathways in mice. Journal of Immunology. 203 (4), 813-824 (2019).
- Araujo, R. N., et al. Amblyomma sculptum tick saliva: α-Gal identification, antibody response and possible association with red meat allergy in Brazil. International Journal for Parasitology. 46 (3), 213-220 (2016).
- Contreras, M., et al. Allergic reactions and immunity in response to tick salivary biogenic substances and red meat consumption in the zebrafish model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 78 (2020).
- Poole, N. M., Mamidanna, G., Smith, R. A., Coons, L. B., Cole, J. A. Prostaglandin E(2) in tick saliva regulates macrophage cell migration and cytokine profile. Parasites & Vectors. 6 (2), 261 (2013).
- Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. Blood will tell: what hematological analyses can reveal about fish welfare. Frontiers in Veterinary Science. 8, 616955 (2021).
- Pacheco, I., et al. Vaccination with alpha-gal protects against mycobacterial infection in the zebrafish model of tuberculosis. Vaccines. 8 (2), 195 (2020).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), e1717 (2010).
- Lu, M. -W., et al. The interferon response is involved in nervous necrosis virus acute and persistent infection in zebrafish infection model. Molecular Immunology. 45 (4), 1146-1152 (2008).
- Saralahti, A., et al. Adult zebrafish model for pneumococcal pathogenesis. Developmental and Comparative Immunology. 42 (2), 345-353 (2014).
- Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 7 (3), 312 (2018).
- Katoch, S., Patial, V. Zebrafish: An emerging model system to study liver diseases and related drug discovery. Journal of Applied Toxicology. 41 (1), 33-51 (2021).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Xin, N., Jiang, Y., Liu, S., Zhou, Y., Cheng, Y. Effects of prednisolone on behavior and hypothalamic-pituitary-interrenal axis activity in zebrafish. Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103325 (2020).
- Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2020).
