Summary
Her brukes sebrafisk (Danio rerio) som en modell for å studere allergiske reaksjoner og immunresponser relatert til alfa-Gal syndrom (AGS) ved å evaluere allergiske reaksjoner på spytt og pattedyrkjøttforbruk.
Abstract
Flått er leddyrvektorer som forårsaker sykdom ved patogenoverføring, og hvis bitt kan være relatert til allergiske reaksjoner som påvirker menneskers helse over hele verden. Hos noen individer har høye nivåer av immunoglobulin E-antistoffer mot glykanen Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) blitt indusert av flåttbitt. Anafylaktiske reaksjoner mediert av glykoproteiner og glykolipider som inneholder glykan-α-Gal, tilstede i kryssspytt, er relatert til alfa-Gal syndrom (AGS) eller pattedyrkjøttallergi. Sebrafisk (Danio rerio) har blitt en mye brukt virveldyrmodell for studier av ulike patologier. I denne studien ble sebrafisk brukt som en modell for studiet av allergiske reaksjoner som respons på α-Gal og pattedyrs kjøttforbruk fordi de, som mennesker, ikke syntetiserer dette glykanet. For dette formål ble atferdsmønstre og hemorragiske anafylaktiske allergiske reaksjoner som respons på Ixodes ricinus tick spytt og pattedyrs kjøttforbruk evaluert. Denne eksperimentelle tilnærmingen tillater obtention av gyldige data som støtter sebrafiskdyrmodellen for studier av flåttbårne allergier, inkludert AGS.
Introduction
Flått er vektorer av patogener som forårsaker sykdommer og er også årsaken til allergiske reaksjoner, som påvirker helsen til mennesker og dyr over hele verden 1,2. Under flåttfôring letter biomolekyler i kryssspytt, spesielt proteiner og lipider, fôringen av disse ektoparasittene, og unngår vertsforsvar3. Noen spyttbiomolekyler med glykan-Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modifikasjoner fører til produksjon av høye anti-α-Gal IgE-antistoffnivåer etter flåttbitt, bare hos noen individer, som er kjent som α-Gal syndrom (AGS)4. Dette er en sykdom assosiert med IgE-mediert allergi som kan resultere i anafylaksi til flåttbitt, ikke-primat pattedyrkjøttforbruk og noen stoffer som cetuximab5. Reaksjoner på α-Gal er ofte alvorlige og noen ganger kan være dødelig 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
α-Gal finnes i alle pattedyr bortsett fra aper, aper og mennesker fra den gamle verden som ikke har evnen til å syntetisere α-Gal13. Imidlertid uttrykker patogener som bakterier og protozoer denne glykanen på overflaten, noe som kan indusere produksjon av høye mengder anti-α-Gal IgM / IgG-antistoffer og kan være en beskyttelsesmekanisme mot disse patogenene16,17. Imidlertid øker produksjonen av anti-α-Gal-antistoffer risikoen for å utvikle IgE-medierte anti-α-Gal-allergier 7,13. Naturlige anti-α-Gal-antistoffer produsert hos mennesker, hovedsakelig av IgM / IgG-subtypene, kan være assosiert med denne modifikasjonen som er tilstede i bakterier fra tarmmikrobiota16. AGS kan være en utfordrende klinisk diagnose, da den viktigste diagnostiske metoden for øyeblikket er basert på en klinisk historie med forsinkede allergiske reaksjoner, spesielt forbundet med matallergier (dvs. kløe, lokalisert elveblest eller tilbakevendende angioødem til anafylaksi, urtikaria, og gastrointestinale symptomer) og måling av IgE anti-α-Gal antistoffnivåer 9. Nåværende funn tyder på at flåttbitt utgjør en av de viktigste risikoene ved utseendet til AGS 18,19, en 20 ganger eller større økning i IgE-nivåer til α-Gal etter et flåttbitt 19, en historie med flåttbitt hos pasienter med AGS20,21,22, eksistensen av antistoffer reaktive mot kryssantigener hos AGS-pasienter 19, og at anti-α-Gal IgE er sterkt relatert til anti-tick IgE-nivåer19,23, men det er behov for ytterligere studier for å vurdere hvilke biomolekyler som faktisk er involvert.
I tillegg er et annet mulig scenario pasienter som presenterer sterke allergiske reaksjoner på flåttbitt og høye nivåer av anti-α-Gal IgE-antistoffer, men er tolerante mot pattedyrs kjøttforbruk12. Derfor kan pattedyrkjøttallergi være en bestemt type flåttbittrelatert allergi. De viktigste flåttartene assosiert med AGS inkluderer Amblyomma americanum (USA), Amblyomma sculptum (Brasil), Amblyomma testudinarium og Haemaphysalis longicornis (Japan), Ixodes holocyclus (Australia) og Ixodes ricinus (hovedvektoren av Lyme borreliosis i Europa)11,24.
Den eneste modellen som har blitt brukt til å evaluere IgE-produksjon relatert til flåttbitt er musemodellen genetisk modifisert med genet for α-1,3-galaktosyltransferase slått ut (α-Gal KO) mus25,26 fordi mus som andre pattedyr også uttrykker α-Gal på proteiner og lipider og ikke produserer IgE til α-Gal. Imidlertid er sebrafisk (Danio rerio) en nyttig modell for biomedisinsk forskning anvendt på pattedyr fordi den deler mange anatomiske likheter med pattedyr og, som mennesker, heller ikke er i stand til å syntetisere α-Gal. Siden α-Gal ikke produseres naturlig i sebrafisk, er det en rimelig modell, lett å manipulere, og tillater en høy prøvestørrelse for studiet av α-Gal-relaterte allergiske reaksjoner.
I denne studien brukes sebrafisk som en modellorganisme for å karakterisere og beskrive lokale allergiske reaksjoner, atferdsmønstre og molekylære mekanismer assosiert med respons på perkutan sensibilisering for kryssspytt26,27 og påfølgende pattedyrkjøttforbruk. Til dette formål blir fisk utsatt for kryssspytt ved intradermal injeksjon og blir deretter matet med hundefôr, som inneholder pattedyrkjøttavledede produkter egnet for dyrebruk som inneholder α-Gal27, og mulige relaterte allergiske reaksjoner vurderes. Denne metoden kan brukes til studier av andre biomolekyler relatert til allergiske prosesser, spesielt de som er relatert til AGS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene beskrevet her er godkjent av den etiske komiteen for dyreforsøk ved Universitetet i Castilla La Mancha under studien "Evaluering av immunresponsen mot inaktivert M. bovis-vaksine og utfordring med M. marinum i sebrafiskmodellnummeret PR-2017-05-12."
Flått ble hentet fra laboratoriekolonien, hvor representative prøver av flått i kolonien ble testet ved PCR for vanlige krysspatogenerfor å bekrefte fraværet av patogener, og opprettholdt ved Institutt for parasitologi, Biologisenteret for det tsjekkiske vitenskapsakademiet (IP BC CAS), Tsjekkia.Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med dyrevernloven i Tsjekkia nr. 246/1992 Sb (etikkgodkjenning nr. 34/2018).
1. Sebrafisk behandling
MERK: Forsøket er designet for å evaluere allergiske reaksjoner og immunresponsen hos sebrafisk behandlet med flåttspytt som respons på pattedyrkjøttforbruk.
- Behandle fisken (som forklart i avsnitt 4) med flåttspytt, kommersiell Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (se materialtabell), brukt som positiv kontroll, med fosfatbufret saltvann (PBS) som negativ kontroll. Voksne sebrafisk er tilfeldig fordelt i tre kjønnsbalanserte grupper (figur 1).
MERK: Enhver annen ønsket forbindelse relatert til AGS kan evalueres ved hjelp av denne modellen.
2. Ixodes ricinus tick spytt ekstraksjon
- Bruk semi-engorged patogenfrie kvinnelige flått matet i 6-7 dager på marsvin.
- Behandle flåtten med 5 μL av en 2% (vekt/vol) løsning av pilokarpinhydroklorid i PBS (se materialtabell) ved pH 7,4 i hemokoelen ved bruk av en 50 μL sprøyte med en 0,33 mm nål som tidligere ble beskrevet28 for å indusere kryssspyttproduksjon.
MERK: Flått håndteres ved hjelp av tang; Vær forsiktig så du ikke bruker for mye styrke når du griper dem. - Samle spytt ved hjelp av en 10 μL spiss montert på en mikropipette.
- Introduser spissen inne i flåtthypostomen nøye.
- Oppbevar spyttet i et 1,5 ml rør på is, basseng det og oppbevar det ved -80 °C som tidligere beskrevet27.
- Bestem spyttproteinkonsentrasjonen for å fastslå mengden protein som skal injiseres i fisken som i tidligere studier27 ved hjelp av et BCA Protein Assay Kit (se materialtabell) etter produsentens anbefalinger.
3. Vedlikehold av sebrafisk
- Hold sebrafisk i et gjennomstrømningsvannsystem ved 27 °C med en lys/mørk syklus på 14 t/10 timer (figur 2).
- Fôr fisken to ganger daglig kl. 09.30 og kl. 13.30 med tørrfiskefôr (50-70 μg/fisk) frem til dag 2.
- Fôr fisken to ganger daglig kl. 09.30 og kl. 13.30 med tørrfôr (50-70 μg/fisk) fra dag 2 etter injeksjon av behandling til forsøkets slutt
4. Sebrafiskinjeksjon
- Velg 10 fisk per gruppe med likt forhold mellom hunner/hanner og tilsvarende vekt.
MERK: Gruppe 1 inneholder fisk injisert med PBS, gruppe 2 inneholder fisk injisert med flåttspytt, og gruppe 3 inneholder fisk injisert med α-Gal. - Bedøv fisken kort ved nedsenking i 0,02% trikain metansulfonat (MS-222) (film 1).
MERK: Riktig bedøvet fisk viser normal pust og ingen svømming, mens de kan plasseres i bunnen av vanntanken eller flytende. Hver fisk må bedøves individuelt for å unngå mulig fysiologisk skade. - Fang den bedøvede fisken ved hjelp av et fiskenett.
- Plasser fisken på halvsiden med tang eller hender forsiktig, på en våt svamp, med kaudalfinen på høyre side for å injisere forbindelsene i samme retning for å kontrollere lesjonene.
- Injiser grupper av fisk intradermalt, som i tidligere studier26, i muskelen ved 5 mm til halefinnen og i 45° vinkel i forhold til fiskens kropp (Film 2). Bruk egnet behandling på dag 0, 3 og 8 som tidligere beskrevet 27 med en 100 μL sprøyte utstyrt med en 1 cm, 29 G nål med 1 μL (med 9 μg / μL protein) I. ricinus spytt i 10 mikrol PBS (kryssspytt), 5 mikrogram α-Gal i 10 mikrol PBS (α-Gal)27, og 10 μL PBS (figur 3).
MERK: Håndtering må gjøres raskt og forsiktig for å unngå fysisk skade på dyret.
Andre biomolekyler i flåttspytt kan evalueres etter denne protokollen. - Plasser den behandlede fisken tilbake i en ferskvannstank uten anestesi for utvinning.
MERK: All fisk i samme gruppe kan plasseres i samme vanntank for gjenvinning.
5. Fôring av sebrafisk
- Mos hundematen med en mørtel og pistill.
- Fôr 50-70 μg/fisk to ganger daglig kl. 09.30 og kl. 13.30 med tørrfôr til dag 2.
- Fôr 50-70 μg/fisk to ganger daglig kl. 09.30 og kl. 13.30 med moset hundefôr fra dag 2 etter behandlingsinjeksjonen til forsøkets slutt på dag 8.
MERK: Hvis immunitetsmarkører eller antistofftitere mot α-Gal- eller IgE-antistoff som respons på behandlingene eller fôret gjennom de forskjellige inokulasjonene skal evalueres, vil fôring være nødvendig til slutten av forsøket.
6. Evaluering av allergiske reaksjoner, lesjoner og atferd hos sebrafisk
- Undersøk den hemorragiske typen allergiske reaksjoner (hudrødhet, misfarging og blødning) ved hjelp av et forstørrelsesglass eller stereomikroskop for nøyaktighet og angi plasseringen av utseendet på fisken etter kategoriseringen inkludert i tabell 1 (figur 4A).
MERK: De allergiske reaksjonene presentert i figur 4 dukket opp etter injeksjon av kryssspytt og forbruk av fôr som inneholder rødt kjøtt. Derfor er de beskrevne reaksjonene typen reaksjoner forbundet med AGS, da lignende reaksjoner vises i klinisk sammenheng.- Vær oppmerksom på om det oppstår noen reaksjon etter behandlinger og mens du administrerer mat to ganger om dagen mens fisken er i vanntanken.
- Undersøk fiskens atferd ved å evaluere endringene27 i svømmemønstre (mobilitet, hastighet, stå ubevegelig i bunnen av vanntanken og sikksakksvømming) etter kategoriseringen inkludert i tabell 1.
- Evaluer akkumulert dødelighet, rapportering av antall døde fisk inkludert tid / dag for død (figur 4B).
MERK: Alle parametere evalueres rett etter behandling eller etter endring av fôr og følges daglig til slutten av forsøket på dag 8 kategorisering av kvalitative variabler (tabell 1). Som en anbefaling bør denne evalueringen utføres av en fagperson med kunnskap om sebrafisk for å vurdere atferdsendringer basert på deres bakgrunn og erfaring med å jobbe med denne dyremodellen. - Beregn antall sebrafisk per dag med rapporterte allergiske reaksjoner, unormal oppførsel og fôringsendringer i hver gruppe og sammenlign mellom grupper med en enveis ANOVA-test.
7. Innsamling av prøver
- Avlive fisken ved nedsenking i 0,04% MS-222 på dag 8.
MERK: Samle også prøvene fra fisken som dør av allergiske reaksjoner under forsøket. - Fest fisken på en parafinplate med pinner.
- Samle serum fra gjelleblodkarene 29 av fisken umiddelbart etter eutanasi, når gjellene fortsatt er vannet med blod, ved hjelp av en 0,5 ml sprøyte utstyrt med en 1 cm,29 G nål. Oppbevar den i en 1,5 ml tube ved -20 °C til bruk (film 3).
- Skjær fisken sagittalt med et skalpellblad og vurder de indre lesjonene (hemorragiske lesjoner eller granulomer)27,30 hvis de oppstår.
MERK: Lesjoner vises ikke nødvendigvis, men må registreres hvis de gjør det. - Samle tarm (film 4) og nyre (film 5) fra hver fisk i separate tomme 1,5 ml rør, som tidligere beskrevet31, og oppbevar dem ved -80 C (figur 4C).
- Ekstraher totalt RNA fra sebrafisktarmen og nyreprøver ved hjelp av et RNA-rensesett (se materialtabell).
- Analyser uttrykket av gener relatert til immunrespons som tidligere beskrevet30,32 (se tabell 2 for primersekvenser) i sebrafisk, og utfør en kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) ved bruk av en revers transkripsjonsblanding for RT-qPCR (se materialfortegnelse), i henhold til produsentens instruksjoner. Normaliser mRNA cT-verdiene mot D. rerio GAPDH, og sammenlign mellom grupper (fisk behandlet med spytt, α-Gal og PBS-behandlede grupper) ved hjelp av en Student t-test med ulik varians.
- Bestem IgM antistofftitere som gjenkjenner α-Gal i sebrafisk i serumprøver av ELISA som beskrevet tidligere27,30. Registrer antistofftitere som O.D.450 nm-verdier ved hjelp av en plateleser, og sammenlign mellom grupper (fisk behandlet med spytt, α-Gal og PBS-behandlede grupper) ved hjelp av en Student t-test med ulik varians.
MERK: Bestemmelse av IgM-antistofftitere og ekspresjonsgenanalyse er valgfri og utføres bare hvis immunologisk informasjon er nødvendig. RT-qPCR-blanding er et førstestrengs cDNA-syntesesett for genuttrykksanalyse ved bruk av sanntids qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som presenteres her er basert på flere aspekter av tidligere publiserte eksperimenter27,30 og resultater utført i vårt laboratorium hvor sebrafiskmodellen er etablert og validert for studiet av AGS og immunresponsen mot α-Gal fordi både mennesker og sebrafisk ikke syntetiserer dette molekylet13. Denne modellen tillater karakterisering og evaluering av en rekke allergiske reaksjoner som følge av vertsresponsen på kryssspytt (figur 4) og deres implikasjon i AGS. I tillegg observeres endringer i atferd som langsom svømming (film 6), liggende på bunnen av tanken (film 7) og ikke spise, vibrere eller sikksakkbevegelse (film 8) hos fisken som respons på kryssspyttbehandling som ikke observeres i kontrollfisken; Disse funnene er spesielt signifikante etter administrering av hundemat på dag 2. På dette tidspunktet var fisken allerede sensibilisert med alfa-gal og kryssspytt, og administrasjonen av rødt kjøtt gjennom fôret begynte. Endelig observeres en signifikant forekomst av allergiske reaksjoner hos fisk behandlet med flåttspytt (figur 4A, B og tabell 3), bare sebrafisk som hadde vært utsatt for flåttspytt utviklet allergiske reaksjoner, som viste rask desensibilisering og toleranse. På den annen side, i tidligere studier, utviklet sebrafisk matet med fiskemat ingen synlig lesjon eller reaksjon27. Atferdsendringen var mer uttalt hos fisken behandlet med flåttspytt enn hos bare α-Gal (figur 5). Ytterligere analyse av uttrykket til de mest representative immunresponsmakerne (IFN, TLR 2, IL1 β og AKR2) ble utført av RT-PCR (tabell 3) for å studere forskjellige immunresponser på behandlingene. Resultatene viste forskjeller mellom sebrafiskgruppene i nyrene, der de fleste immunresponsmarkørene så ut til å være nedregulert hos fisk behandlet med spytt og α-Gal sammenlignet med kontrollgruppen (figur 6), men det ble ikke funnet signifikante forskjeller i genuttrykk i tarmen. Tidligere studier om allergiske reaksjoner på ulike flåttspyttkomponenter i sebrafisk viste lignende resultater27. I tillegg, som representative resultater, utviklet sebrafisk behandlet med flåttspytt og α-Gal ved hjelp av denne protokollen IgM-antistoffer mot α-Gal som viste høyere nivåer enn hos fisk behandlet med PBS (figur 7), som det ble funnet i tidligere studier27,30.
Figur 1: Eksperimentelt design for sebrafiskforsøk. Fisk injiseres intradermalt med α-Gal, kryssspytt og PBS som en negativ kontroll. Prøver samles inn etter at en fisk dør eller ved slutten av forsøket. Prøver kan brukes til analyse av anti-α-Gal IgM-nivåer og ekspresjon av utvalgte immunresponsgenmarkører ved qRT-PCR27. Atferdsendringer eller allergiske reaksjoner registreres gjennom hele forsøket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sebrafisk forsøksanlegg. Sebrafisken holdes i et gjennomstrømningsvannsystem ved 27 °C med en lys/mørk syklus på 14 timer/10 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Injeksjon av sebrafiskbehandling. Sebrafiskbehandlingsinjeksjon med en 100 μL sprøyte påsatt en 1 cm og 29 G kanyle utføres intradermalt i en avstand på 5 mm fra halefinnen. Fisken bedøves og behandles en etter en over en svamp dyppet i varmt vann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Påvist hemoragiske reaksjoner av anafylaktisk type hos sebrafisk injisert med flåttspytt og som døde dag 2 før fôringsskifte. (A) Fisk med allergiske reaksjoner i tanken etter behandling. (B) Fisk død av hemoragiske anafylaktiske reaksjoner (allergisk reaksjonstype: misfarging og rødhet i huden. (C) Prøveinnsamling. Røde piler indikerer tarmen og røde sirkler indikerer nyrene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Atferdsmønster observert hos fisk. Unormale atferdsmønstre besto av langsom svømming, stående stille i bunnen av vanntanken og sikksakksvømming. Blå piler angir behandlingstidspunktet, og den røde pilen angir tidspunktet for overgang fra fiskefôr til hundefôr. Fisk fôret med hundefôr ble sammenlignet mellom spyttbehandlet og PBS-behandlet kontrollfisk med enveis ANOVA-test (p = 0,05; N = 5 fisk/gruppe). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Ekspresjon av utvalgte immunresponsmarkører i sebrafisknyre. Genekspresjonsanalyse ved qRT-PCR i nyrene til sebrafisk ved slutten av forsøket. mRNA cT-verdiene normaliseres mot D. rerio GAPDH, presentert som gjennomsnitt ± SD, og sammenlignes mellom fisk behandlet med spytt, α-Gal, og PBS-behandlet kontrollgruppe med Student t-test med ulik varians (*p < 0,05; N = 3-7). Dette tallet er vedtatt fra27 og gjengitt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: IgM-antistofftitere. IgM-antistofftitere av sebrafisk mot α-Gal bestemmes av ELISA, representert som gjennomsnittlig ± SD O.D. ved 450 nm og sammenlignet mellom fisk behandlet med spytt, α -Gal, og PBS-behandlet kontrollgruppe ved en Student t-test med ulik varians (*p < 0,005; N = 3-7). Dette tallet er vedtatt fra27 og gjengitt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Lesjoner og atferdsmønstre evaluert. Kategorisering av kvalitative variabler. Parametrene som vurderes kvalitativt er skader (på finner og skjell), svømming, fôring og om fiskens død skyldes testen eller håndteringen. Som en subjektiv vurdering er hver variabel kategorisert fra svært mild til alvorlig Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Oligonukleotidprimere og glødetemperaturer for qRT-PCR. Denne tabellen er vedtatt fra30 og gjengitt med tillatelse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Representative resultater. Registreringer av sebrafiskallergier og dødsfall og uttrykk for utvalgte immunresponsmarkører analyseres ved qRT-PCR i nyre og tarm hos sebrafisk. mRNA cT-verdiene normaliseres mot D. rerio GAPDH og sammenlignes mellom fisk behandlet med spytt, α -Gal, og den PBS-behandlede kontrollgruppen med en Student t-test med ulik varians (*p < 0,05; N = 3-7). Denne tabellen er vedtatt fra 27,30 og gjengitt med tillatelse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Film 1: Bedøvet fisk. Den bedøvede fisken viser ikke bevegelse eller svømmer, men fortsetter å puste. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 2: Injeksjon av behandlingen i fisken. Fisken legges bedøvet på en våt svamp og injiseres i en 45° vinkel mot kroppen med den indikerte behandlingen. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 3: Serumsamling fra gjelleblodårene. Fisken festes på en parafinplate med pinner og serum samles opp fra gjellene ved hjelp av en 0,5 ml sprøyte påsatt en 1 cm, 29 G kanyle. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 4: Tarmsamling fra en avlivet fisk. Fisken kuttes sagittalt ved hjelp av et skalpellblad og tarmen samles med pinsett. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 5: Nyresamling fra en avlivet fisk. Svømmeblæren fjernes, og nyrene samles inn. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 6: Representative atferdsaspekter observert hos behandlet sebrafisk. En fisk viste langsom svømming. Alle fisk fra samme gruppe er i samme kar, Videoen er et eksempel for å illustrere denne oppførselen, og flere fisk kan ha denne oppførselen på forskjellige tider av døgnet. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 7: Representative atferdsaspekter observert hos behandlet sebrafisk. En fisk holdt seg på bunnen av tanken. Alle fisk fra samme gruppe er i samme kar, Videoene er et eksempel for å illustrere denne oppførselen, og flere fisk kan ha denne oppførselen på forskjellige tider av døgnet. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 8: Representative atferdsaspekter observert hos behandlet sebrafisk. En fisk viste vibrerende svømming. Alle fisk fra samme gruppe er i samme kar, Videoene er et eksempel for å illustrere denne oppførselen, og flere fisk kan ha denne oppførselen på forskjellige tider av døgnet. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sebrafisk er en kostnadseffektiv og letthåndterlig modell som også har vært et svært gjennomførbart verktøy for studier av molekylære mekanismer for immunresponsen, patogensykdommer, ny legemiddeltesting og vaksinasjon og beskyttelse mot infeksjoner33,34,35. Studien om oppførselen til sebrafisk er nyttig siden tidligere studier har funnet ut at noen fiskearter forblir ubevegelige i bunnen av tanken når de er stresset, noe som påvirker matforbruket, spiser mindre; I tillegg kan sikksakk når de beveger seg også være forbundet med fiskestress og angst36,37. Informasjonen generert fra studier ved å evaluere disse parametrene i sebrafisk vil gi en grunnleggende forståelse av kryss-vert molekylære interaksjoner og mekanismer involvert i vertsimmunrespons mot α-Gal som kan føre til utvikling av AGS, inkludert allergi mot pattedyrkjøttforbruk.
For å unngå falske positive reaksjoner på det injiserte molekylet, er det viktig å utføre en intradermal injeksjon ikke veldig dypt, parallelt med sebrafiskkroppen, og å vurdere om fisken er skadet på injeksjonstidspunktet. En fisk med skade som følge av håndtering eller nåleinntrengning skal ikke inkluderes i analysen. I tillegg anbefales det sterkt at en profesjonell med kunnskap om sebrafisk evaluerer endringer i atferd som svømming og fôring for å vurdere atferdsendringer basert på deres bakgrunn og erfaring med å jobbe med denne modellen38. Et annet viktig hensyn er anestesi; En tilstrekkelig dose er viktig for optimal tilstand av de innsamlede prøvene. I tillegg, under injeksjonsbehandlingen, unngås en mer uttalt stressrespons, noe som kan kompensere for mulige vanskeligheter knyttet til stressdiagnose29.
Resultatene viste at sebrafiskmodellen også kunne fremme mulighetene for å evaluere risikoen for å utvikle AGS etter flåttbitt og andre allergiske reaksjoner. Videre kan mål for diagnose, behandling og forebygging av disse allergiene brukes på mennesker, siden denne metoden og parametrene som evalueres tillater mer nøyaktig karakterisering av allergiske reaksjoner hos sebrafisk.
Denne metoden kan tillate andre spytt biogene molekyler, ansvarlig for allergiske reaksjoner og tilstede i kryssspytt, for å bli evaluert. α-Gal-innholdet i flåttspytt er tidligere kvantifisert27, men det er ikke kjent hvilke andre forbindelser som kan være involvert i utviklingen av AGS. Allergiske reaksjoner ble observert i grupper behandlet med flåttspytt og α-Gal, men ikke i PBS-grupper (tab 3), men atferden er mer påvirket i gruppen som behandles med flåttspytt enn i α-Gal-gruppen (figur 5). Fra disse dataene vil vår hypotese være at andre biomolekyler i kombinasjon med alfa-Gal er involvert i AGS, så videre eksperimenter bør studere hvilke andre molekyler som er tilstede i spytt, har innflytelse på disse funnene. I tillegg var anti-alfa-gal antistofftitere signifikant høyere hos sebrafisk behandlet med flåttspytt og alfa-gal, som, som i tidligere studier26,29, viste en immunrespons mot alfa-gal tilstede i flåttspytt (figur 7).
Til slutt oppstod immunresponsmarkører nedregulert i sebrafiskgrupper behandlet med flåttspytt og alfagal sammenlignet med PBS-behandlede grupper (tabell 3 og figur 6). Disse resultatene stemmer overens med de som er oppnådd i andre studier der andre AGS-relaterte biomolekyler ble testet27, men i motsetning til tidligere studier25 hvor α-Gal KO-mus som respons på kryssbitt og rødt kjøttforbruk viste en IgE-respons og et oppregulert uttrykk for inflammatorisk tolllignende reseptor (TLR) og IL-1-signalveier, noe som resulterte i aktivering av Akr2. Derfor er det behov for ytterligere studier for å forstå aktiveringsveiene til disse responsene på flåttspytt og andre biomolekyler i sebrafisk som kan oppnås ved anvendelse av denne metodikken.
Deretter kan denne metoden tillate screening for biomolekyler som alene eller i kombinasjon utløser allergiske reaksjoner, og som kan påvirke vertsimmunresponsen som fører til allergiske sykdommer som AGS og andre flåttbårne allergier27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke medlemmer av SaBio-gruppen for deres samarbeid i eksperimentell design og teknisk assistanse med fiskeforsøksanlegget og Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Spania) for å levere sebrafisk. Dette arbeidet ble støttet av Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Spania og EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras er finansiert av Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spania, stipend IJC2020-042710-I.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food - Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
References
- de la Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13 (18), 6938-6946 (2008).
- de la Fuente, J., et al. Tick-pathogen interactions and vector competence: identification of molecular drivers for tick-borne diseases. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 114 (2017).
- Villar, M., et al. Characterization of tick salivary gland and saliva alphagalactome reveals candidate alpha-gal syndrome disease biomarkers. Expert Review of Proteomics. 18 (12), 1099-1116 (2021).
- Chmelař, J., Kotál, J., Kovaříková, A., Kotsyfakis, M. The use of tick salivary proteins as novel therapeutics. Frontiers in Physiology. 10, 812 (2019).
- Chung, C. H., et al. Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The New England Journal of Medicine. 358 (11), 1109-1117 (2008).
- Van Nunen, S. A., O'Connor, K. S., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans. The Medical Journal of Australia. 190 (9), 510-511 (2009).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Environmental and molecular drivers of the α-Gal syndrome. Frontiers in Immunology. 10, 1210 (2019).
- de la Fuente, J., Pacheco, I., Villar, M., Cabezas-Cruz, A. The alpha-Gal syndrome: new insights into the tick-host conflict and cooperation. Parasites & Vectors. 12 (1), 154 (2019).
- Platts-Mills, T. A. E., et al. On the cause and consequences of IgE to galactose-α-1,3-galactose: A report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases workshop on understanding IgE-mediated mammalian meat allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (4), 1061-1071 (2020).
- Commins, S. P., et al. Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (2), 426-433 (2009).
- Platts-Mills, T. A. E., Schuyler, A. J., Tripathi, A., Commins, S. P. Anaphylaxis to the carbohydrate side chain alpha-gal. Immunology and Allergy Clinics of North America. 35 (2), 247-260 (2015).
- Mateos-Hernández, L., et al. Tick-host conflict: immunoglobulin E antibodies to tick proteins in patients with anaphylaxis to tick bite. Oncotarget. 8 (13), 20630-20644 (2017).
- Galili, U. Evolution in primates by "Catastrophic-selection" interplay between enveloped virus epidemics, mutated genes of enzymes synthesizing carbohydrate antigens, and natural anti-carbohydrate antibodies. American Journal of Physical Anthropology. 168 (2), 352-363 (2019).
- Hilger, C., Fischer, J., Wölbing, F., Biedermann, T. Role and mechanism of galactose-alpha-1,3-galactose in the elicitation of delayed anaphylactic reactions to red meat. Current Allergy and Asthma Reports. 19 (1), 3 (2019).
- Cabezas-Cruz, A., Valdés, J., de la Fuente, J. Cancer research meets tick vectors for infectious diseases. The Lancet. Infectious Diseases. 14 (10), 916-917 (2014).
- Yilmaz, B., et al. Gut microbiota elicits a protective immune response against malaria transmission. Cell. 159 (6), 1277-1289 (2014).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Regulation of the immune response to α-Gal and vector-borne diseases. Trends in Parasitology. 31 (10), 470-476 (2015).
- Weins, A. B., Eberlein, B., Biedermann, T. Diagnostics of alpha-gal syndrome: Current standards, pitfalls and perspectives. Der Hautarzt; Zeitschrift Fur Dermatologie, Venerologie, Und Verwandte Gebiete. 70 (1), 36-43 (2019).
- Commins, S. P., et al. The relevance of tick bites to the production of IgE antibodies to the mammalian oligosaccharide galactose-α-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1286-1293 (2011).
- Fischer, J., Yazdi, A. S., Biedermann, T. Clinical spectrum of α-Gal syndrome: from immediate-type to delayed immediate-type reactions to mammalian innards and meat. Allergo Journal International. 25 (2), 55-62 (2016).
- Hodžić, A., et al. Infection with Toxocara canis inhibits the production of IgE antibodies to α-Gal in humans: towards a conceptual framework of the hygiene hypothesis. Vaccines. 8 (2), 167 (2020).
- Kiewiet, M. B. G., et al. Clinical and serological characterization of the α-Gal syndrome-importance of atopy for symptom severity in a European cohort. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. In Practice. 8 (6), 2027-2034 (2020).
- Steinke, J. W., Platts-Mills, T. A. E., Commins, S. P. The alpha-gal story: lessons learned from connecting the dots. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 589-596 (2015).
- Hashizume, H., et al. Repeated Amblyomma testudinarium tick bites are associated with increased galactose-α-1,3-galactose carbohydrate IgE antibody levels: A retrospective cohort study in a single institution. Journal of the American Academy of Dermatology. 78 (6), 1135-1141 (2018).
- Chandrasekhar, J. L., et al. Cutaneous exposure to clinically relevant lone star ticks promotes IgE production and hypersensitivity through CD4+ T cell- and MyD88-dependent pathways in mice. Journal of Immunology. 203 (4), 813-824 (2019).
- Araujo, R. N., et al. Amblyomma sculptum tick saliva: α-Gal identification, antibody response and possible association with red meat allergy in Brazil. International Journal for Parasitology. 46 (3), 213-220 (2016).
- Contreras, M., et al. Allergic reactions and immunity in response to tick salivary biogenic substances and red meat consumption in the zebrafish model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 78 (2020).
- Poole, N. M., Mamidanna, G., Smith, R. A., Coons, L. B., Cole, J. A. Prostaglandin E(2) in tick saliva regulates macrophage cell migration and cytokine profile. Parasites & Vectors. 6 (2), 261 (2013).
- Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. Blood will tell: what hematological analyses can reveal about fish welfare. Frontiers in Veterinary Science. 8, 616955 (2021).
- Pacheco, I., et al. Vaccination with alpha-gal protects against mycobacterial infection in the zebrafish model of tuberculosis. Vaccines. 8 (2), 195 (2020).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), e1717 (2010).
- Lu, M. -W., et al. The interferon response is involved in nervous necrosis virus acute and persistent infection in zebrafish infection model. Molecular Immunology. 45 (4), 1146-1152 (2008).
- Saralahti, A., et al. Adult zebrafish model for pneumococcal pathogenesis. Developmental and Comparative Immunology. 42 (2), 345-353 (2014).
- Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 7 (3), 312 (2018).
- Katoch, S., Patial, V. Zebrafish: An emerging model system to study liver diseases and related drug discovery. Journal of Applied Toxicology. 41 (1), 33-51 (2021).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Xin, N., Jiang, Y., Liu, S., Zhou, Y., Cheng, Y. Effects of prednisolone on behavior and hypothalamic-pituitary-interrenal axis activity in zebrafish. Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103325 (2020).
- Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2020).
