Summary
Qui, il pesce zebra (Danio rerio) viene utilizzato come modello per studiare le reazioni allergiche e le risposte immunitarie correlate alla sindrome alfa-Gal (AGS) valutando le reazioni allergiche alla saliva delle zecche e al consumo di carne di mammifero.
Abstract
Le zecche sono vettori di artropodi che causano malattie per trasmissione di agenti patogeni e le cui punture potrebbero essere correlate a reazioni allergiche che hanno un impatto sulla salute umana in tutto il mondo. In alcuni individui, alti livelli di anticorpi immunoglobuline E contro il glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) sono stati indotti da punture di zecca. Le reazioni anafilattiche mediate da glicoproteine e glicolipidi contenenti il glicano α-Gal, presente nella saliva delle zecche, sono correlate alla sindrome alfa-Gal (AGS) o all'allergia alla carne di mammifero. Il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un modello di vertebrati ampiamente utilizzato per lo studio di diverse patologie. In questo studio, il pesce zebra è stato utilizzato come modello per lo studio delle reazioni allergiche in risposta al consumo di carne di α-Gal e di mammifero perché, come gli esseri umani, non sintetizzano questo glicano. A tale scopo, sono stati valutati i modelli comportamentali e le reazioni allergiche di tipo anafilattico emorragico in risposta alla saliva della zecca Ixodes ricinus e al consumo di carne di mammifero. Questo approccio sperimentale consente di ottenere dati validi che supportano il modello animale zebrafish per lo studio delle allergie trasmesse dalle zecche incluso AGS.
Introduction
Le zecche sono vettori di agenti patogeni che causano malattie e sono anche la causa di reazioni allergiche, che influenzano la salute degli esseri umani e degli animali in tutto il mondo 1,2. Durante l'alimentazione delle zecche, le biomolecole nella saliva delle zecche, in particolare proteine e lipidi, facilitano l'alimentazione di questi ectoparassiti, evitando le difese dell'ospite3. Alcune biomolecole di saliva con glicani Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modificano la produzione di alti livelli di anticorpi anti-α-Gal IgE dopo la puntura di zecca, solo in alcuni individui, che è noto come sindrome α-Gal (AGS)4. Questa è una malattia associata all'allergia IgE-mediata che può causare anafilassi alle punture di zecca, consumo di carne di mammifero non primate e alcuni farmaci come cetuximab5. Le reazioni a α-Gal sono spesso gravi e talvolta possono essere fatali 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Il α-Gal si trova in tutti i mammiferi ad eccezione delle scimmie del Vecchio Mondo, delle scimmie e degli esseri umani che non hanno la capacità di sintetizzare α-Gal13. Tuttavia, agenti patogeni come batteri e protozoi esprimono questo glicano sulla loro superficie, che può indurre la produzione di elevate quantità di anticorpi anti-α-Gal IgM/IgG e può essere un meccanismo protettivo contro questi patogeni16,17. Tuttavia, la produzione di anticorpi anti-α-Gal aumenta il rischio di sviluppare allergie anti-α-Gal mediate da IgE 7,13. Gli anticorpi anti-α-Gal naturali prodotti nell'uomo, principalmente dei sottotipi IgM/IgG, potrebbero essere associati a questa modificazione presente nei batteri del microbiota intestinale16. L'AGS può essere una diagnosi clinica impegnativa, poiché il principale metodo diagnostico al momento si basa su una storia clinica di reazioni allergiche ritardate, in particolare associate ad allergie alimentari (cioè prurito, orticaria localizzata o angioedema ricorrente ad anafilassi, orticaria e sintomi gastrointestinali) e la misurazione dei livelli di anticorpi anti-α-Gal IgE9. I risultati attuali suggeriscono che le punture di zecca costituiscono uno dei principali rischi nella comparsa di AGS 18,19, un aumento di 20 volte o più dei livelli di IgE a α-Gal a seguito di una puntura di zecca 19, una storia di punture di zecca in pazienti con AGS20,21,22, l'esistenza di anticorpi reattivi agli antigeni delle zecche nei pazienti AGS 19, e che le IgE anti-α-Gal sono fortemente correlate ai livelli di IgE anti-zecca19,23, ma sono necessari ulteriori studi per valutare quali biomolecole sono effettivamente coinvolte.
Inoltre, un altro scenario possibile sono i pazienti che presentano forti reazioni allergiche alle punture di zecca e alti livelli di anticorpi anti-α-Gal IgE, ma sono tolleranti al consumo di carne di mammifero12. Pertanto, l'allergia alla carne di mammifero potrebbe essere un particolare tipo di allergia correlata al morso di zecca. Le principali specie di zecche associate all'AGS includono Amblyomma americanum (USA), Amblyomma sculptum (Brasile), Amblyomma testudinarium e Haemaphysalis longicornis (Giappone), Ixodes holocyclus (Australia) e Ixodes ricinus (il principale vettore della borreliosi di Lyme in Europa)11,24.
L'unico modello che è stato utilizzato per valutare la produzione di IgE correlata alle punture di zecca è il modello murino geneticamente modificato con il gene per topi α-1,3-galattosiltransferasi knocked out (α-Gal KO)25,26 perché, come altri mammiferi, i topi esprimono anche α-Gal su proteine e lipidi e non producono IgE in α-Gal. Tuttavia, il pesce zebra (Danio rerio) è un modello utile per la ricerca biomedica applicata ai mammiferi perché condivide molte somiglianze anatomiche con i mammiferi e, come gli umani, non è anche in grado di sintetizzare α-Gal. Poiché α-Gal non è prodotto naturalmente nel pesce zebra, è un modello economico, facile da manipolare e consente un'elevata dimensione del campione per lo studio delle reazioni allergiche correlate al α-Gal.
In questo studio, il pesce zebra viene utilizzato come organismo modello per caratterizzare e descrivere le reazioni allergiche locali, i modelli comportamentali e i meccanismi molecolari associati alla risposta alla sensibilizzazione percutanea alla saliva delle zecche26,27 e al successivo consumo di carne di mammifero. A tale scopo, i pesci vengono esposti alla saliva delle zecche mediante iniezione intradermica e quindi vengono nutriti con mangimi per cani, che contengono prodotti derivati dalla carne di mammifero adatti all'uso animale che contengono α-Gal27, quindi vengono valutate eventuali reazioni allergiche correlate. Questo metodo può essere applicato allo studio di altre biomolecole correlate ai processi allergici, in particolare quelli correlati all'AGS.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato etico per la sperimentazione animale dell'Università di Castilla La Mancha nell'ambito dello studio "Valutazione della risposta immunitaria al vaccino M. bovis inattivato e sfida con M. marinum nel numero di modello del pesce zebra PR-2017-05-12".
Le zecche sono state ottenute dalla colonia di laboratorio, dove campioni rappresentativi di zecche nella colonia sono stati testati mediante PCR per i patogeni comuni delle zecche per confermare l'assenza di agenti patogeni e mantenuti presso l'Istituto di Parassitologia, Centro di biologia dell'Accademia ceca delle scienze (IP BC CAS), Repubblica ceca.Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la legge sulla protezione degli animali della Repubblica ceca n. 246/1992 Sb (approvazione etica n. 34/2018).
1. Trattamento zebrafish
NOTA: Lo studio è progettato per valutare le reazioni allergiche e la risposta immunitaria nel pesce zebra trattato con saliva di zecca in risposta al consumo di carne di mammifero.
- Trattare il pesce (come spiegato nella sezione 4) con saliva di zecca, commerciale Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (vedere Tabella dei materiali), usato come controllo positivo, con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) come controllo negativo. Il pesce zebra adulto è distribuito casualmente in tre gruppi equilibrati dal punto di vista del genere (Figura 1).
NOTA: Qualsiasi altro composto desiderato correlato all'AGS può essere valutato utilizzando questo modello.
2. Estrazione della saliva della zecca Ixodes ricinus
- Utilizzare zecche femminili semi-ingorgate prive di agenti patogeni alimentate per 6-7 giorni su porcellini d'India.
- Trattare la zecca con 5 μL di una soluzione al 2% (p.c./vol) di pilocarpina cloridrato in PBS (vedere Tabella dei materiali) a pH 7,4 nell'emocele usando una siringa da 50 μL con un ago da 0,33 mm come descritto in precedenza28 per indurre la produzione di saliva delle zecche.
NOTA: le zecche vengono gestite con una pinza; Fai attenzione a non applicare troppa forza quando li afferri. - Raccogliere la saliva utilizzando una punta da 10 μL montata su una micropipetta.
- Introdurre la punta all'interno dell'ipostoma zecca con attenzione.
- Tenere la saliva in un tubo da 1,5 ml di ghiaccio, metterla in pool e conservarla a -80 °C come descritto in precedenza27.
- Determinare la concentrazione di proteine della saliva, per stabilire la quantità di proteine da iniettare nel pesce come negli studi precedenti27 utilizzando un kit di analisi delle proteine BCA (vedere la tabella dei materiali) seguendo le raccomandazioni del produttore.
3. Mantenimento del pesce zebra
- Mantenere il pesce zebra in un sistema di flusso d'acqua a 27 °C con un ciclo luce/buio di 14 h/10 h (Figura 2).
- Nutrire il pesce due volte al giorno alle 9:30 e alle 13:30 con mangime secco per pesci (50-70 μg / pesce) fino al giorno 2.
- Nutrire il pesce due volte al giorno alle 9:30 e alle 13:30 con mangime secco per cani (50-70 μg/pesce) dal giorno 2 dopo l'iniezione di trattamento fino alla fine dell'esperimento
4. Iniezione di zebrafish
- Seleziona 10 pesci per gruppo con un rapporto simile di femmine / maschi e peso simile.
NOTA: Il gruppo 1 contiene pesci iniettati con PBS, il gruppo 2 contiene pesci iniettati con saliva di zecca e il gruppo 3 contiene pesci iniettati con α-Gal. - Anestetizzare brevemente il pesce mediante immersione in tricaina metansolfonato allo 0,02% (MS-222) (Filmato 1).
NOTA: I pesci correttamente anestetizzati mostrano una respirazione normale e nessun nuoto, mentre potrebbero essere posizionati sul fondo del serbatoio dell'acqua o galleggianti. Ogni pesce deve essere anestetizzato individualmente per evitare possibili danni fisiologici. - Cattura il pesce anestetizzato usando una rete da pesca.
- Posizionare il pesce sul suo mezzo lato usando una pinza o le mani con attenzione, su una spugna bagnata, con la pinna caudale sul lato destro per iniettare i composti nella stessa direzione per controllare le lesioni.
- Iniettare gruppi di pesci per via intradermica, come negli studi precedenti26, nel muscolo a 5 mm dalla pinna caudale e con un angolo di 45° rispetto al corpo del pesce (Filmato 2). Usare il trattamento appropriato ai giorni 0, 3 e 8 come descritto in precedenza 27 con una siringa da 100 μL dotata di un ago da 1 cm, 29 G con 1 μL (con 9 μg/μL di proteine) di saliva I. ricinus in 10 μL di PBS (saliva da zecche), 5 μg di α-Gal in 10 μL di PBS (α-Gal)27, e 10 μL di PBS (Figura 3).
NOTA: La manipolazione deve essere effettuata rapidamente e con attenzione per evitare danni fisici all'animale.
Altre biomolecole nella saliva delle zecche possono essere valutate seguendo questo protocollo. - Rimettere il pesce trattato in un acquario d'acqua dolce senza anestesia per il recupero.
NOTA: Tutti i pesci dello stesso gruppo possono essere collocati nello stesso serbatoio dell'acqua per il recupero.
5. Alimentazione del pesce zebra
- Schiacciare il cibo per cani con un mortaio e un pestello.
- Alimentare 50-70 μg/pesce due volte al giorno alle 9:30 e alle 13:30 con mangime secco per pesci fino al giorno 2.
- Alimentare 50-70 μg/pesce due volte al giorno alle 9:30 e alle 13:30 con purè di mangime per cani dal giorno 2 dopo l'iniezione di trattamento fino alla fine dell'esperimento il giorno 8.
NOTA: Se devono essere valutati marcatori di immunità o titoli anticorpali agli anticorpi α-Gal o IgE in risposta ai trattamenti o al mangime durante le diverse inoculazioni, l'alimentazione sarebbe necessaria fino alla fine dell'esperimento.
6. Valutazione delle reazioni allergiche, delle lesioni e del comportamento nel pesce zebra
- Esaminare il tipo emorragico di reazioni allergiche (arrossamento della pelle, scolorimento ed emorragia) utilizzando una lente d'ingrandimento o uno stereomicroscopio per l'accuratezza e indicare la posizione del loro aspetto sul pesce seguendo la categorizzazione inclusa nella Tabella 1 (Figura 4A).
NOTA: Le reazioni allergiche presentate nella Figura 4 sono apparse dopo l'iniezione di saliva di zecca e il consumo di mangimi contenenti carne rossa. Pertanto, le reazioni descritte sono il tipo di reazioni associate all'AGS, poiché reazioni simili compaiono nel contesto clinico.- Osservare se appare qualche reazione dopo i trattamenti e durante la somministrazione di cibo due volte al giorno mentre i pesci sono nel serbatoio dell'acqua.
- Esaminare il comportamento dei pesci valutando i cambiamenti27 nei modelli di nuoto (mobilità, velocità, stare immobili sul fondo del serbatoio dell'acqua e nuotare a zigzag) seguendo la categorizzazione inclusa nella Tabella 1.
- Valutare la mortalità accumulata, riportando il numero di pesci morti, compresa l'ora/giorno della morte (Figura 4B).
NOTA: Tutti i parametri vengono valutati subito dopo il trattamento o dopo il cambio di mangime e seguiti quotidianamente fino alla fine dell'esperimento il giorno 8 categorizzando le variabili qualitative (Tabella 1). Come raccomandazione, questa valutazione dovrebbe essere condotta da un professionista con conoscenze sul pesce zebra per considerare i cambiamenti comportamentali in base al loro background e all'esperienza di lavoro con questo modello animale. - Calcola il numero di zebrafish al giorno con reazioni allergiche segnalate, comportamento anormale e cambiamenti alimentari in ciascun gruppo e confronta tra i gruppi con un test ANOVA unidirezionale.
7. Raccolta dei campioni
- Eutanasia il pesce per immersione in 0,04% MS-222 il giorno 8.
NOTA: Raccogliere anche i campioni dai pesci che muoiono per reazioni allergiche durante il processo. - Fissare il pesce su un piatto di paraffina con spilli.
- Raccogliere il siero dai vasi sanguigni branchiali 29 del pesce immediatamente dopo l'eutanasia, quando le branchie sono ancora irrigate con sangue, usando una siringa da 0,5 ml dotata di un ago da 1 cm e29 G. Conservare in un tubo da 1,5 mL a -20 °C fino all'uso (Filmato 3).
- Tagliare il pesce sagittalmente con una lama di bisturi e valutare le lesioni interne (lesioni emorragiche o granulomi)27,30 se compaiono.
NOTA: Le lesioni non compaiono necessariamente, ma devono essere registrate se lo fanno. - Raccogliere l'intestino (Filmato 4) e il rene (Filmato 5) da ciascun pesce in provette vuote separate da 1,5 ml, come descritto in precedenza31, e conservarle a -80 C (Figura 4C).
- Estrarre l'RNA totale dai campioni di intestino e rene del pesce zebra utilizzando un kit di purificazione dell'RNA (vedi Tabella dei materiali).
- Analizzare l'espressione di geni correlati alla risposta immunitaria come precedentemente descritto30,32 (vedere Tabella 2 per le sequenze di primer) nel pesce zebra, eseguendo una reazione quantitativa a catena della trascrizione-polimerasi inversa (RT-qPCR) utilizzando una miscela di trascrizione inversa per RT-qPCR (vedere Tabella dei materiali), secondo le istruzioni del produttore. Normalizzare i valori di mRNA cT rispetto a D. rerio GAPDH e confrontare tra gruppi (pesci trattati con saliva, α-Gal e gruppi trattati con PBS) utilizzando un test t di Student con varianza disuguale.
- Determinare i titoli anticorpali IgM che riconoscono α-Gal nel pesce zebra nei campioni di siero mediante ELISA come descritto in precedenza27,30. Registrare i titoli anticorpali come valori O.D.450 nm, utilizzando un lettore di piastre, e confrontare tra i gruppi (pesci trattati con saliva, α-Gal e i gruppi trattati con PBS) utilizzando un test t di Student con varianza disuguale.
NOTA: La determinazione dei titoli anticorpali IgM e l'analisi genica di espressione sono facoltative e condotte solo se sono richieste informazioni immunologiche. RT-qPCR mix è un kit di sintesi del cDNA di primo filamento per l'analisi dell'espressione genica utilizzando qPCR in tempo reale.
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Representative Results
Il protocollo qui presentato si basa su diversi aspetti degli esperimenti precedentemente pubblicati 27,30 e sui risultati eseguiti nel nostro laboratorio dove viene stabilito e validato il modello del pesce zebra per lo studio dell'AGS e della risposta immunitaria al α-Gal perché sia l'uomo che il pesce zebra non sintetizzano questa molecola13. Questo modello consente la caratterizzazione e la valutazione di una varietà di reazioni allergiche come risultato della risposta dell'ospite alla saliva delle zecche (Figura 4) e della loro implicazione nell'AGS. Inoltre, alterazioni nel comportamento come il nuoto lento (Filmato 6), sdraiarsi sul fondo della vasca (Filmato 7) e non mangiare, vibrare o zigzagare (Filmato 8) sono osservati nel pesce in risposta al trattamento della saliva delle zecche che non è osservato nel pesce di controllo; Questi risultati sono particolarmente significativi dopo la somministrazione di cibo per cani il giorno 2. A questo punto, i pesci erano già sensibilizzati con alfa-gal e saliva di zecche, e iniziò la somministrazione di carne rossa attraverso il mangime. Infine, si osserva un'incidenza significativa di reazioni allergiche nei pesci trattati con saliva di zecca (Figura 4A, B e Tabella 3), solo i pesci zebra che erano stati esposti alla saliva delle zecche hanno sviluppato reazioni allergiche, mostrando una rapida desensibilizzazione e tolleranza. D'altra parte, in studi precedenti, il pesce zebra alimentato con cibo per pesci non ha sviluppato alcuna lesione o reazione visibile27. Il cambiamento comportamentale è stato più pronunciato nei pesci trattati con saliva di zecca rispetto al solo α-Gal (Figura 5). Ulteriori analisi dell'espressione dei responsabili della risposta immunitaria più rappresentativi (IFN, TLR 2, IL1 β e AKR2) sono state eseguite mediante RT-PCR (Tabella 3), al fine di studiare diverse risposte immunitarie ai trattamenti. I risultati hanno mostrato differenze tra i gruppi di zebrafish nel rene, dove la maggior parte dei marcatori di risposta immunitaria sembrava essere sottoregolata nei pesci trattati con saliva e α-Gal rispetto al gruppo di controllo (Figura 6), ma non sono state riscontrate differenze significative nell'espressione genica nell'intestino. Precedenti studi sulle reazioni allergiche a diversi componenti della saliva delle zecche nei pesci zebra hanno mostrato risultati simili27. Inoltre, come risultati rappresentativi, il pesce zebra trattato con saliva di zecca e α-Gal utilizzando questo protocollo ha sviluppato anticorpi IgM contro α-Gal che hanno mostrato livelli più elevati rispetto ai pesci trattati con PBS (Figura 7), come è stato trovato in studi precedenti27,30.
Figura 1: Disegno sperimentale per la sperimentazione del pesce zebra. I pesci vengono iniettati per via intradermica con α-Gal, saliva di zecca e PBS come controllo negativo. I campioni vengono raccolti dopo la morte di un pesce o alla fine dell'esperimento. I campioni potrebbero essere utilizzati per l'analisi dei livelli di IgM anti-α-Gal e l'espressione di marcatori genici selezionati di risposta immunitaria mediante qRT-PCR27. Cambiamenti comportamentali o reazioni allergiche vengono registrati durante l'esperimento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Struttura sperimentale del pesce zebra. I pesci zebra sono mantenuti in un sistema di flusso d'acqua a 27 °C con un ciclo luce/buio di 14 h/10 h. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Iniezione di trattamento con zebrafish. L'iniezione di trattamento del pesce zebra con una siringa da 100 μL dotata di un ago da 1 cm e 29 G viene eseguita per via intradermica a una distanza di 5 mm dalla pinna caudale. I pesci vengono anestetizzati e trattati uno ad uno su una spugna immersa in acqua tiepida. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Evidenza di reazioni emorragiche di tipo anafilattico in zebrafish iniettati con saliva di zecca e che sono morti il giorno 2 prima del cambio di alimentazione. (A) Pesci con reazioni allergiche nell'acquario dopo il trattamento. (B) Pesci morti per reazioni anafilattiche emorragiche (tipo di reazione allergica: scolorimento e arrossamento della pelle. (C) Raccolta di campioni. Le frecce rosse indicano l'intestino e i cerchi rossi indicano il rene. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Modello comportamentale osservato nei pesci. I modelli di comportamento anormali consistevano nel nuoto lento, nello stare fermi sul fondo del serbatoio dell'acqua e nel nuoto a zigzag. Le frecce blu indicano il tempo del trattamento e la freccia rossa indica il momento di passare dal mangime per pesci al mangime per cani. I pesci nutriti con cibo per cani sono stati confrontati tra pesci di controllo trattati con saliva e pesci di controllo trattati con PBS mediante un test ANOVA unidirezionale (p = 0,05; N = 5 pesci/gruppo). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Espressione di marcatori di risposta immunitaria selezionati nel rene zebrafish. Analisi dell'espressione genica mediante qRT-PCR nel rene del pesce zebra alla fine dell'esperimento. I valori di mRNA cT sono normalizzati rispetto a D. rerio GAPDH, presentati come media ± SD, e confrontati tra pesci trattati con saliva, α-Gal e il gruppo di controllo trattato con PBS mediante un test t di Student con varianza diseguale (*p < 0,05; N = 3-7). Questa cifra è stata adottata da27 e riprodotta con autorizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Titoli anticorpali IgM. I titoli anticorpali IgM del pesce zebra contro α-Gal sono determinati da ELISA, rappresentato come la media ± SD O.D. a 450 nm e confrontato tra pesci trattati con saliva, α -Gal e il gruppo di controllo trattato con PBS da un test t di Student con varianza disuguale (*p < 0,005; N = 3-7). Questa cifra è stata adottata da27 e riprodotta con autorizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Lesioni e modelli di comportamento valutati. Categorizzazione delle variabili qualitative. I parametri che vengono valutati qualitativamente sono le lesioni (su pinne e squame), il nuoto, l'alimentazione e se la morte del pesce è causata dal test o dalla manipolazione. Come considerazione soggettiva, ogni variabile è classificata da molto lieve a grave Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Primer oligonucleotidici e temperature di ricottura per qRT-PCR. Questa tabella è stata adottata da30 e riprodotta con autorizzazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Risultati rappresentativi. Le registrazioni di allergie e decessi per zebrafish e l'espressione di marcatori di risposta immunitaria selezionati vengono analizzati mediante qRT-PCR nel rene e nell'intestino del pesce zebra. I valori di mRNA cT sono normalizzati rispetto a D. rerio GAPDH e confrontati tra pesci trattati con saliva, α -Gal e il gruppo di controllo trattato con PBS da un test t di Student con varianza diseguale (*p < 0,05; N = 3-7). Questa tabella è stata adottata dalle 27,30 e riprodotta con autorizzazione. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Filmato 1: Pesce anestetizzato. Il pesce anestetizzato non mostra movimento o nuoto ma continua a respirare. Clicca qui per scaricare questo film.
Filmato 2: Iniezione del trattamento nel pesce. I pesci vengono posti anestetizzati su una spugna bagnata e iniettati con un angolo di 45° al loro corpo con il trattamento indicato. Clicca qui per scaricare questo film.
Filmato 3: Raccolta di siero dai vasi sanguigni branchiali. Il pesce viene fissato su una piastra di paraffina con spilli e il siero viene raccolto dalle branchie utilizzando una siringa da 0,5 ml dotata di un ago da 1 cm e 29 G. Clicca qui per scaricare questo film.
Movie 4: Raccolta di intestini da un pesce eutanasia. Il pesce viene tagliato sagittalmente usando una lama di bisturi e l'intestino viene raccolto con una pinzetta. Clicca qui per scaricare questo film.
Movie 5: Raccolta di reni da un pesce eutanasia. La vescica natatoria viene rimossa e il rene viene raccolto. Clicca qui per scaricare questo film.
Filmato 6: Aspetti comportamentali rappresentativi osservati nel pesce zebra trattato. Un pesce ha mostrato un nuoto lento. Tutti i pesci dello stesso gruppo sono nello stesso acquario, Il video è un esempio per illustrare questo comportamento, e diversi pesci possono avere questo comportamento in diversi momenti della giornata. Clicca qui per scaricare questo film.
Filmato 7: Aspetti comportamentali rappresentativi osservati nel pesce zebra trattato. Un pesce è rimasto sul fondo del serbatoio. Tutti i pesci dello stesso gruppo sono nello stesso acquario, I video sono un esempio per illustrare questo comportamento, e diversi pesci possono avere questo comportamento in diversi momenti della giornata. Clicca qui per scaricare questo film.
Filmato 8: Aspetti comportamentali rappresentativi osservati nel pesce zebra trattato. Un pesce ha mostrato un nuoto vibrante. Tutti i pesci dello stesso gruppo sono nello stesso acquario, I video sono un esempio per illustrare questo comportamento, e diversi pesci possono avere questo comportamento in diversi momenti della giornata. Clicca qui per scaricare questo film.
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Discussion
Il pesce zebra è un modello economico e facile da maneggiare che è stato anche uno strumento molto fattibile per lo studio dei meccanismi molecolari della risposta immunitaria, delle malattie patogene, dei nuovi test farmacologici, della vaccinazione e della protezione contro le infezioni33,34,35. Lo studio sul comportamento del pesce zebra è utile poiché studi precedenti hanno scoperto che alcune specie di pesci rimangono immobili sul fondo della vasca quando sono stressate, il che influisce sul loro consumo di cibo, mangiando meno; Inoltre, zigzagare quando si muovono potrebbe anche essere associato a stress e ansia dei pesci36,37. Le informazioni generate dagli studi valutando questi parametri nel pesce zebra forniranno una comprensione fondamentale delle interazioni molecolari zecche-ospite e dei meccanismi coinvolti nella risposta immunitaria dell'ospite al α-Gal che possono portare allo sviluppo di AGS, compresa l'allergia al consumo di carne di mammifero.
Per evitare reazioni false positive alla molecola iniettata, è importante eseguire un'iniezione intradermica non molto profonda, parallela al corpo del pesce zebra, e valutare se il pesce è danneggiato al momento dell'iniezione. Un pesce con lesioni derivanti dalla manipolazione o dalla penetrazione dell'ago non deve essere incluso nell'analisi. Inoltre, si raccomanda vivamente che un professionista con conoscenza del pesce zebra valuti i cambiamenti nel comportamento come il nuoto e l'alimentazione al fine di considerare i cambiamenti comportamentali in base al loro background e all'esperienza di lavoro con questo modello38. Un'altra considerazione importante è l'anestesia; Una dose adeguata è importante per le condizioni ottimali dei campioni raccolti. Inoltre, durante il trattamento iniettivo, viene evitata una risposta allo stress più pronunciata, che può compensare possibili difficoltà legate alla diagnosi dello stress29.
I risultati hanno mostrato che il modello zebrafish potrebbe anche avanzare le possibilità di valutare i rischi di sviluppare AGS dopo una puntura di zecca e altre reazioni allergiche. Inoltre, gli obiettivi per la diagnosi, i trattamenti e la prevenzione di queste allergie possono essere applicati agli esseri umani, poiché questo metodo e i parametri valutati consentono una caratterizzazione più accurata delle reazioni allergiche nel pesce zebra.
Questo metodo potrebbe consentire di valutare altre molecole biogeniche salivari, responsabili di reazioni allergiche e presenti nella saliva delle zecche. Il contenuto di α-Gal nella saliva delle zecche è stato precedentemente quantificato27, ma non è noto quali altri composti possano essere coinvolti nello sviluppo di AGS. Le reazioni allergiche sono state osservate nei gruppi trattati con saliva di zecca e α-Gal ma non nei gruppi PBS (Tabella 3), tuttavia il comportamento è più influenzato nel gruppo trattato con saliva di zecche rispetto al gruppo α-Gal (Figura 5). Da questi dati, la nostra ipotesi sarebbe che altre biomolecole in combinazione con alfa-Gal siano coinvolte nell'AGS, quindi ulteriori esperimenti dovrebbero studiare quali altre molecole presenti nella saliva hanno un'influenza su questi risultati. Inoltre, i titoli anticorpali anti-alfa-gal erano significativamente più alti nei pesci zebra trattati con saliva di zecca e alfa-gal, che, come negli studi precedenti26,29, hanno mostrato una risposta immunitaria all'alfa-gal presente nella saliva delle zecche (Figura 7).
Infine, i marcatori di risposta immunitaria apparivano sottoregolati nei gruppi di zebrafish trattati con saliva di zecca e alfa gal rispetto al gruppo trattato con PBS (Tabella 3 e Figura 6). Questi risultati sono coerenti con quelli ottenuti in altri studi in cui sono state testate altre biomolecole correlate all'AGS27, ma rispetto agli studi precedenti25 in cui i topi α-Gal KO in risposta a punture di zecche e consumo di carne rossa hanno mostrato una risposta IgE e un'espressione sovraregolata delle vie di segnalazione infiammatorie del recettore Toll-like (TLR) e IL-1, che ha portato all'attivazione dell'Akr2. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per comprendere i percorsi di attivazione di queste risposte alla saliva delle zecche e ad altre biomolecole nel pesce zebra che potrebbero essere raggiunti con l'applicazione di questa metodologia.
Quindi, questa metodologia può consentire lo screening per le biomolecole che da sole o in combinazione scatenano reazioni allergiche e che potrebbero influenzare la risposta immunitaria dell'ospite portando a malattie allergiche come AGS e altre allergie trasmesse dalle zecche27.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i membri del gruppo SaBio per la loro collaborazione nella progettazione sperimentale e l'assistenza tecnica con l'impianto sperimentale del pesce e Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Spagna) per aver fornito il pesce zebra. Questo lavoro è stato sostenuto da Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Spagna e EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras è finanziata dal Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spagna, sovvenzione IJC2020-042710-I.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food - Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
References
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