Summary
Ici, le poisson zèbre (Danio rerio) est utilisé comme modèle pour étudier les réactions allergiques et les réponses immunitaires liées au syndrome alpha-Gal (AGS) en évaluant les réactions allergiques à la salive des tiques et à la consommation de viande de mammifère.
Abstract
Les tiques sont des arthropodes vecteurs qui causent des maladies par transmission d’agents pathogènes et dont les piqûres pourraient être liées à des réactions allergiques ayant un impact sur la santé humaine dans le monde entier. Chez certaines personnes, des taux élevés d’anticorps anti-immunoglobuline E dirigés contre le glycane Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) ont été induits par des piqûres de tiques. Les réactions anaphylactiques médiées par les glycoprotéines et les glycolipides contenant le glycane α-Gal, présent dans la salive des tiques, sont liées au syndrome alpha-Gal (AGS) ou à l’allergie à la viande chez les mammifères. Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle vertébré largement utilisé pour l’étude de différentes pathologies. Dans cette étude, le poisson zèbre a été utilisé comme modèle pour l’étude des réactions allergiques en réponse à la consommation de viande de α-Gal et de mammifères car, comme les humains, ils ne synthétisent pas ce glycane. À cette fin, les modèles comportementaux et les réactions allergiques hémorragiques de type anaphylactique en réponse à la salive de tiques Ixodes ricinus et à la consommation de viande de mammifère ont été évalués. Cette approche expérimentale permet d’obtenir des données valides qui soutiennent le modèle animal du poisson zèbre pour l’étude des allergies transmises par les tiques, y compris l’AGS.
Introduction
Les tiques sont des vecteurs d’agents pathogènes qui causent des maladies et sont également la cause de réactions allergiques, affectant la santé des humains et des animaux dans le mondeentier 1,2. Lors de l’alimentation des tiques, les biomolécules contenues dans la salive des tiques, en particulier les protéines et les lipides, facilitent l’alimentation de ces ectoparasites, évitant ainsi les défenses de l’hôte3. Certaines biomolécules salivaires avec des modifications du glycane Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) entraînent la production d’anticorps IgE anti-α-Gal élevés après la piqûre de tique, seulement chez certains individus, connu sous le nom de syndrome de α-Gal (AGS)4. Il s’agit d’une maladie associée à une allergie médiée par les IgE qui peut entraîner une anaphylaxie aux piqûres de tiques, à la consommation de viande de mammifères non primates et à certains médicaments tels que le cétuximab5. Les réactions au α-Gal sont souvent graves et peuvent parfois être fatales 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Le α-Gal se trouve chez tous les mammifères, à l’exception des singes de l’Ancien Monde, des singes et des humains qui n’ont pas la capacité de synthétiser α-Gal13. Cependant, les agents pathogènes tels que les bactéries et les protozoaires expriment ce glycane à leur surface, ce qui peut induire la production de grandes quantités d’anticorps IgM/IgG anti-α-Gal et peut constituer un mécanisme de protection contre ces agents pathogènes16,17. Cependant, la production d’anticorps anti-α-Gal augmente le risque de développer des allergies aux anti-α-Gal médiées par les IgE 7,13. Les anticorps naturels anti-α-Gal produits chez l’homme, principalement des sous-types IgM/IgG, pourraient être associés à cette modification présente dans les bactéries du microbiote intestinal16. L’AGS peut être un diagnostic clinique difficile, car la principale méthode de diagnostic à l’heure actuelle est basée sur des antécédents cliniques de réactions allergiques retardées, en particulier associées à des allergies alimentaires (c.-à-d. prurit, urticaire localisé ou œdème de Quincke récurrent à l’anaphylaxie, à l’urticaire et aux symptômes gastro-intestinaux) et la mesure des taux d’anticorps IgE anti-α-Gal9. Les résultats actuels suggèrent que les piqûres de tiques constituent l’un des principaux risques liés à l’apparition d’AGS 18,19, à une augmentation de 20 fois ou plus des taux d’IgE à α-Gal après une piqûre de tique 19, à des antécédents de piqûres de tiques chez les patients atteints d’AGS20,21,22, à l’existence d’anticorps réactifs aux antigènes à tiques chez les patients atteints d’AGS 19, et que les IgE anti-α-Gal sont fortement liées aux taux d’IgE anti-tiques19,23, mais que d’autres études sont nécessaires pour évaluer quelles biomolécules sont réellement impliquées.
En outre, un autre scénario possible est celui des patients qui présentent de fortes réactions allergiques aux piqûres de tiques et des taux élevés d’anticorps anti-α-Gal IgE, mais qui sont tolérants à la consommation de viande de mammifères12. Par conséquent, l’allergie à la viande chez les mammifères pourrait être un type particulier d’allergie liée aux piqûres de tiques. Les principales espèces de tiques associées à l’AGS sont Amblyomma americanum (États-Unis), Amblyomma sculptum (Brésil), Amblyomma testudinarium et Haemaphysalis longicornis (Japon), Ixodes holocyclus (Australie) et Ixodes ricinus (principal vecteur de la borréliose de Lyme en Europe )11,24.
Le seul modèle qui a été utilisé pour évaluer la production d’IgE liée aux piqûres de tiques est le modèle murin génétiquement modifié avec le gène de la α-1,3-galactosyltransférase assommée (α-Gal KO)25,26 parce que, comme d’autres mammifères, les souris expriment également α-Gal sur les protéines et les lipides et ne produisent pas d’IgE à α-Gal. Cependant, le poisson zèbre (Danio rerio) est un modèle utile pour la recherche biomédicale appliquée aux mammifères car il partage de nombreuses similitudes anatomiques avec les mammifères et, comme les humains, est également incapable de synthétiser α-Gal. Étant donné que le α-Gal n’est pas produit naturellement chez le poisson zèbre, il s’agit d’un modèle abordable, facile à manipuler et permettant une taille d’échantillon élevée pour l’étude des réactions allergiques liées au α-Gal.
Dans cette étude, le poisson zèbre est utilisé comme organisme modèle pour caractériser et décrire les réactions allergiques locales, les modèles comportementaux et les mécanismes moléculaires associés à la réponse à la sensibilisation percutanée à la salive des tiques26,27 et à la consommation subséquente de viande de mammifère. À cette fin, les poissons sont exposés à la salive des tiques par injection intradermique, puis sont nourris avec des aliments pour chiens, qui contiennent des produits dérivés de viande de mammifères adaptés à l’usage animal qui contiennent α-Gal27, puis les réactions allergiques connexes possibles sont évaluées. Cette méthode peut être appliquée à l’étude d’autres biomolécules liées aux processus allergiques, en particulier ceux liés à l’AGS.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Castille-La Manche dans le cadre de l’étude « Évaluation de la réponse immunitaire au vaccin inactivé contre M. bovis et provocation avec M. marinum dans le numéro de modèle du poisson zèbre PR-2017-05-12 ».
Les tiques ont été obtenues à partir de la colonie de laboratoire, où des échantillons représentatifs de tiques de la colonie ont été testés par PCR pour les agents pathogènes communs des tiques afin de confirmer l’absence d’agents pathogènes, et conservés à l’Institut de parasitologie, Centre de biologie de l’Académie tchèque des sciences (IP BC CAS), République tchèque.Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément à la loi sur la protection des animaux de la République tchèque n ° 246/1992 Sb (approbation éthique n ° 34/2018).
1. Traitement du poisson zèbre
NOTE: L’essai est conçu pour évaluer les réactions allergiques et la réponse immunitaire chez le poisson zèbre traité avec de la salive de tique en réponse à la consommation de viande de mammifère.
- Traiter le poisson (comme expliqué à la rubrique 4) avec de la salive de tique, Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) commerciale (voir le tableau des matières), utilisée comme témoin positif, avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme témoin négatif. Le poisson-zèbre adulte est réparti au hasard en trois groupes équilibrés entre les sexes (figure 1).
REMARQUE : Tout autre composé souhaité lié à l’AGS peut être évalué à l’aide de ce modèle.
2. Extraction de la salive des tiques Ixodes ricinus
- Utilisez des tiques femelles semi-engorgées exemptes d’agents pathogènes nourries pendant 6-7 jours sur des cobayes.
- Traiter la tique avec 5 μL d’une solution à 2 % (poids/vol) de chlorhydrate de pilocarpine dans du PBS (voir le tableau des matières) à pH 7,4 dans l’hémocèle à l’aide d’une seringue de 50 μL avec une aiguille de 0,33 mm, comme décrit précédemment28 , pour induire la production de salive de tiques.
REMARQUE: Les tiques sont manipulées à l’aide de forceps; Faites attention à ne pas appliquer trop de force lorsque vous les saisissez. - Recueillir la salive à l’aide d’un embout de 10 μL monté sur une micropipette.
- Introduisez soigneusement l’embout à l’intérieur de l’hypostome de la tique.
- Conservez la salive dans un tube de 1,5 ml sur de la glace, mettez-la en piscine et conservez-la à -80 °C comme décrit précédemment27.
- Déterminer la concentration en protéines salivaires, pour établir la quantité de protéines à injecter dans le poisson comme dans les études précédentes27 à l’aide d’une trousse de dosage des protéines BCA (voir le tableau des matériaux) en suivant les recommandations du fabricant.
3. Entretien du poisson zèbre
- Maintenir le poisson zèbre dans un système d’eau à écoulement continu à 27 °C avec un cycle lumière/obscurité de 14 h/10 h (figure 2).
- Nourrissez les poissons deux fois par jour à 9 h 30 et à 13 h 30 avec des aliments secs pour poissons (50 à 70 μg/poisson) jusqu’au jour 2.
- Nourrir les poissons deux fois par jour à 9 h 30 et 13 h 30 avec des aliments secs pour chiens (50-70 μg/poisson) du jour 2 après l’injection de traitement jusqu’à la fin de l’expérience
4. Injection de poisson zèbre
- Sélectionnez 10 poissons par groupe avec un ratio femelles/mâles similaire et un poids similaire.
REMARQUE : Le groupe 1 contient les poissons injectés avec du PBS, le groupe 2 contient les poissons injectés avec de la salive de tique et le groupe 3 contient les poissons injectés avec du α-Gal. - Anesthésier brièvement le poisson par immersion dans du méthanesulfonate de tricaïne à 0,02 % (MS-222) (film 1).
REMARQUE: Les poissons correctement anesthésiés montrent une respiration normale et aucune baignade, alors qu’ils pourraient être placés au fond du réservoir d’eau ou flottants. Chaque poisson doit être anesthésié individuellement pour éviter d’éventuels dommages physiologiques. - Capturez les poissons anesthésiés à l’aide d’un filet de pêche.
- Placez le poisson sur sa moitié latérale à l’aide d’une pince ou des mains avec précaution, sur une éponge humide, avec la nageoire caudale du côté droit pour injecter les composés dans le même sens afin de contrôler les lésions.
- Injecter des groupes de poissons par voie intradermique, comme dans les études précédentes26, dans le muscle à 5 mm de la nageoire caudale et à un angle de 45° par rapport au corps du poisson (Film 2). Utiliser le traitement approprié aux jours 0, 3 et 8 tel que décrit précédemment 27 avec une seringue de 100 μL munie d’une aiguille de 1 cm, 29 G contenant 1 μL (avec 9 μg/μL de protéines) de salive d’I. ricinus dans 10 μL de PBS (salive de tiques), 5 μg de α-Gal dans 10 μL de PBS (α-Gal)27, et 10 μL de PBS (figure 3).
REMARQUE : La manipulation doit être effectuée rapidement et avec soin afin d’éviter tout dommage physique à l’animal.
D’autres biomolécules dans la salive des tiques peuvent être évaluées en suivant ce protocole. - Replacez le poisson traité dans un réservoir d’eau douce sans anesthésie pour la récupération.
NOTE: Tous les poissons du même groupe peuvent être placés dans le même réservoir d’eau pour récupération.
5. Alimentation du poisson zèbre
- Écrasez la nourriture pour chiens avec un mortier et un pilon.
- Nourrir 50 à 70 μg/poisson deux fois par jour à 9 h 30 et à 13 h 30 avec des aliments secs pour poissons jusqu’au jour 2.
- Nourrir 50 à 70 μg/poisson deux fois par jour à 9 h 30 et à 13 h 30 avec de la purée pour chiens du jour 2 après l’injection de traitement jusqu’à la fin de l’expérience le jour 8.
REMARQUE : Si les marqueurs d’immunité ou les titres d’anticorps dirigés contre les anticorps α-Gal ou IgE en réponse aux traitements ou à l’alimentation tout au long des différentes inoculations doivent être évalués, l’alimentation serait nécessaire jusqu’à la fin de l’expérience.
6. Évaluation des réactions allergiques, des lésions et du comportement chez le poisson zèbre
- Examiner les réactions allergiques de type hémorragique (rougeur de la peau, décoloration et hémorragie) à l’aide d’une loupe ou d’un stéréomicroscope pour en vérifier l’exactitude et indiquer l’emplacement de leur apparence sur le poisson en suivant la catégorisation incluse dans le tableau 1 (figure 4A).
REMARQUE : Les réactions allergiques présentées à la figure 4 sont apparues après l’injection de salive de tique et la consommation d’aliments contenant de la viande rouge. Par conséquent, les réactions décrites sont le type de réactions associées à l’AGS, car des réactions similaires apparaissent dans le contexte clinique.- Observez si une réaction apparaît après les traitements et lors de l’administration de nourriture deux fois par jour pendant que les poissons sont dans le réservoir d’eau.
- Examiner le comportement des poissons en évaluant les changements27 dans les habitudes de nage (mobilité, vitesse, immobile au fond du réservoir d’eau et nage en zigzag) en suivant la catégorisation incluse dans le tableau 1.
- Évaluer la mortalité accumulée, en indiquant le nombre de poissons morts, y compris l’heure et le jour de la mort (figure 4B).
REMARQUE : Tous les paramètres sont évalués juste après le traitement ou après le changement d’aliment et suivis quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérience, le jour 8, catégorisant les variables qualitatives (tableau 1). À titre de recommandation, cette évaluation devrait être menée par un professionnel ayant des connaissances sur le poisson zèbre pour envisager des changements de comportement en fonction de ses antécédents et de son expérience de travail avec ce modèle animal. - Calculez le nombre de poissons-zèbres par jour avec les réactions allergiques signalées, les comportements anormaux et les changements d’alimentation dans chaque groupe et comparez les groupes par un test ANOVA unidirectionnel.
7. Prélèvement d’échantillons
- Euthanasier le poisson par immersion dans du MS-222 à 0,04 % le jour 8.
REMARQUE: Prélevez également les échantillons des poissons qui meurent de réactions allergiques pendant l’essai. - Fixez le poisson sur une assiette de paraffine avec des épingles.
- Prélever le sérum des vaisseaux de sang branchial29 des poissons immédiatement après l’euthanasie, lorsque les branchies sont encore irriguées avec du sang, à l’aide d’une seringue de 0,5 mL munie d’une aiguille de 1 cm de29 G. Conservez-le dans un tube de 1,5 mL à -20 °C jusqu’à utilisation (Film 3).
- Couper le poisson sagittalement avec une lame de scalpel et évaluer les lésions internes (lésions hémorragiques ou granulomes)27,30 si elles apparaissent.
REMARQUE: Les lésions n’apparaissent pas nécessairement, mais doivent être enregistrées si elles le font. - Prélever l’intestin (film 4) et le rein (film 5) de chaque poisson dans des tubes vides séparés de 1,5 mL, comme décrit précédemment31, et les conserver à -80 °C (figure 4C).
- Extraire l’ARN total des échantillons d’intestin et de rein du poisson zèbre à l’aide d’une trousse de purification de l’ARN (voir le tableau des matériaux).
- Analyser l’expression des gènes liés à la réponse immunitaire telle que décrite précédemment30,32 (voir le tableau 2 pour les séquences d’amorce) chez le poisson zèbre, en effectuant une réaction en chaîne quantitative de transcription inverse-polymérase (RT-qPCR) en utilisant un mélange de transcription inverse pour RT-qPCR (voir le tableau des matériaux), conformément aux instructions du fabricant. Normaliser les valeurs cT de l’ARNm par rapport à D. rerio GAPDH et comparer entre les groupes (poissons traités avec de la salive, α-Gal et les groupes traités par PBS) à l’aide d’un test t de Student avec une variance inégale.
- Déterminer les titres d’anticorps IgM qui reconnaissent le α-Gal chez le poisson zèbre dans les échantillons de sérum par ELISA, comme décrit précédemment27,30. Enregistrer les titres d’anticorps sous forme de valeurs O.D.450 nm, à l’aide d’un lecteur de plaque, et comparer entre les groupes (poissons traités avec de la salive, α-Gal et les groupes traités PBS) à l’aide d’un test t de Student avec une variance inégale.
REMARQUE : La détermination des titres d’anticorps IgM et l’analyse des gènes d’expression sont facultatives et ne sont effectuées que si des informations immunologiques sont requises. Le mélange RT-qPCR est un kit de synthèse d’ADNc premier brin pour l’analyse de l’expression génique à l’aide de la qPCR en temps réel.
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Representative Results
Le protocole présenté ici est basé sur plusieurs aspects d’expériences précédemment publiées27,30 et de résultats réalisés dans notre laboratoire où le modèle de poisson zèbre est établi et validé pour l’étude de l’AGS et de la réponse immunitaire au α-Gal car les humains et les poissons-zèbres ne synthétisent pas cette molécule13. Ce modèle permet la caractérisation et l’évaluation d’une variété de réactions allergiques résultant de la réponse de l’hôte à la salive des tiques (Figure 4) et de leur implication dans le SGA. De plus, des altérations du comportement telles que nager lentement (film 6), s’allonger sur le fond de l’aquarium (film 7) et ne pas manger, vibrer ou zigzaguer (film 8) sont observées chez le poisson en réponse au traitement salivaire des tiques qui n’est pas observé chez le poisson témoin; Ces résultats sont particulièrement significatifs après l’administration d’aliments pour chiens le jour 2. À ce stade, les poissons étaient déjà sensibilisés à la salive alpha-gal et aux tiques, et l’administration de viande rouge par l’alimentation a commencé. Enfin, une incidence significative de réactions allergiques est observée chez les poissons traités avec de la salive de tiques (Figure 4A, B et Tableau 3), seul le poisson zèbre qui avait été exposé à la salive des tiques a développé des réactions allergiques, montrant une désensibilisation et une tolérance rapides. D’autre part, dans des études antérieures, le poisson zèbre nourri avec de la nourriture pour poissons n’a pas développé de lésion ou de réaction visible27. Le changement de comportement était plus prononcé chez les poissons traités avec de la salive de tique qu’avec seulement α-Gal (Figure 5). Une analyse supplémentaire de l’expression des fabricants de réponses immunitaires les plus représentatifs (IFN, TLR 2, IL1 β et AKR2) a été réalisée par RT-PCR (Tableau 3), afin d’étudier différentes réponses immunitaires aux traitements. Les résultats ont montré des différences entre les groupes de poissons-zèbres dans le rein, où les marqueurs de réponse immunitaire les plus semblaient être régulés à la baisse chez les poissons traités avec de la salive et du α-Gal par rapport au groupe témoin (Figure 6), mais aucune différence significative n’a été trouvée dans l’expression des gènes dans l’intestin. Des études antérieures sur les réactions allergiques à différents composants de la salive des tiques chez le poisson zèbre ont montré des résultats similaires27. De plus, comme résultats représentatifs, le poisson zèbre traité avec de la salive de tique et du α-Gal à l’aide de ce protocole a développé des anticorps IgM contre le α-Gal qui ont montré des niveaux plus élevés que chez les poissons traités avec PBS (Figure 7), comme cela a été constaté dans des études antérieures27,30.
Figure 1 : Conception expérimentale de l’essai sur le poisson zèbre. Les poissons reçoivent une injection intradermique de α-Gal, de salive de tique et de PBS comme contrôle négatif. Les échantillons sont prélevés après la mort d’un poisson ou à la fin de l’expérience. Les échantillons pourraient être utilisés pour l’analyse des taux d’IgM anti-α-Gal et l’expression de marqueurs génétiques de réponse immunitaire sélectionnés par qRT-PCR27. Des changements de comportement ou des réactions allergiques sont enregistrés tout au long de l’expérience. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Installation expérimentale sur le poisson zèbre. Les poissons-zèbres sont maintenus dans un système d’écoulement continu à 27 °C avec un cycle lumière/obscurité de 14 h/10 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Injection de traitement du poisson zèbre. L’injection de traitement du poisson zèbre avec une seringue de 100 μL munie d’une aiguille de 1 cm et 29 G est effectuée par voie intradermique à une distance de 5 mm de la nageoire caudale. Les poissons sont anesthésiés et traités un par un sur une éponge trempée dans de l’eau tiède. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Signes de réactions hémorragiques de type anaphylactique chez le poisson zèbre auquel on a injecté de la salive de tique et qui est mort le jour 2 avant le changement d’alimentation. (A) Poisson présentant des réactions allergiques dans l’aquarium après traitement. (B) Poisson mort de réactions anaphylactiques hémorragiques (type de réaction allergique: décoloration et rougeur de la peau. (C) Prélèvement d’échantillons. Les flèches rouges indiquent l’intestin et les cercles rouges indiquent le rein. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Modèle de comportement observé chez les poissons. Les comportements anormaux consistaient en une nage lente, une position stationnaire au fond du réservoir d’eau et une nage en zigzag. Les flèches bleues indiquent le moment du traitement et la flèche rouge indique le temps de passer de l’alimentation pour poissons à la nourriture pour chien. Les poissons nourris avec de la nourriture pour chiens ont été comparés entre les poissons témoins traités à la salive et les poissons témoins traités au PBS au moyen d’un test ANOVA unidirectionnel (p = 0,05; N = 5 poissons/groupe). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Expression de certains marqueurs de réponse immunitaire dans le rein du poisson zèbre. Analyse de l’expression génique par qRT-PCR dans le rein du poisson zèbre à la fin de l’expérience. Les valeurs cT de l’ARNm sont normalisées par rapport au GAPDH de D. rerio, présentées comme moyenne ± écart-type, et comparées entre les poissons traités avec de la salive, du α-Gal, et le groupe témoin traité par PBS par un test t de Student avec une variance inégale (*p < 0,05; N = 3-7). Ce chiffre a été adopté à partir de27 et reproduit avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Titres d’anticorps IgM. Les titres d’anticorps IgM du poisson zèbre contre le α-Gal sont déterminés par ELISA, représenté comme la moyenne ± DS O.D. à 450 nm et comparés entre les poissons traités avec de la salive, α-Gal, et le groupe témoin traité PBS par un test t de Student avec une variance inégale (*p < 0,005; N = 3-7). Ce chiffre a été adopté à partir de27 et reproduit avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Lésions et comportements évalués. Catégorisation des variables qualitatives. Les paramètres évalués qualitativement sont les blessures (sur les nageoires et les écailles), la natation, l’alimentation et si la mort du poisson est causée par l’essai ou par la manipulation. À titre de considération subjective, chaque variable est classée de très légère à sévère Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Amorces des oligonucléotides et températures de recuit pour la qRT-PCR. Ce tableau a été adopté à partir du30 et reproduit avec permission. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Résultats représentatifs. Les enregistrements des allergies et des décès de poisson zèbre et l’expression de marqueurs de réponse immunitaire sélectionnés sont analysés par qRT-PCR dans les reins et l’intestin du poisson zèbre. Les valeurs cT de l’ARNm sont normalisées par rapport à D. rerio GAPDH et comparées entre les poissons traités avec de la salive, α-Gal, et le groupe témoin traité par PBS par un test t de Student avec une variance inégale (*p < 0,05; N = 3-7). Ce tableau a été adopté à partir de27,30 et reproduit avec permission. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Film 1 : Poisson anesthésié. Le poisson anesthésié ne montre pas de mouvement ou de nage mais continue à respirer. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film 2: Injection du traitement dans le poisson. Les poissons sont placés anesthésiés sur une éponge humide et injectés à un angle de 45° par rapport à leur corps avec le traitement indiqué. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film 3: Collecte de sérum dans les vaisseaux du sang branchial. Le poisson est fixé sur une plaque de paraffine avec des épingles et le sérum est recueilli dans les branchies à l’aide d’une seringue de 0,5 ml munie d’une aiguille de 1 cm et 29 g. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film 4: Collecte intestinale d’un poisson euthanasié. Le poisson est coupé sagittiquement à l’aide d’une lame de scalpel et l’intestin est recueilli avec une pince à épiler. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film 5: Collecte de reins d’un poisson euthanasié. La vessie natatoire est retirée et le rein est recueilli. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film 6: Aspects comportementaux représentatifs observés chez le poisson zèbre traité. Un poisson a montré une nage lente. Tous les poissons d’un même groupe sont dans le même bassin, La vidéo est un exemple pour illustrer ce comportement, et plusieurs poissons peuvent avoir ce comportement à différents moments de la journée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film 7: Aspects comportementaux représentatifs observés chez le poisson-zèbre traité. Un poisson est resté au fond de l’aquarium. Tous les poissons d’un même groupe sont dans le même bassin, Les vidéos sont un exemple pour illustrer ce comportement, et plusieurs poissons peuvent avoir ce comportement à différents moments de la journée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
Film 8: Aspects comportementaux représentatifs observés chez le poisson-zèbre traité. Un poisson a montré une nage vibrante. Tous les poissons d’un même groupe sont dans le même bassin, Les vidéos sont un exemple pour illustrer ce comportement, et plusieurs poissons peuvent avoir ce comportement à différents moments de la journée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.
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Discussion
Le poisson zèbre est un modèle rentable et facile à manipuler qui a également été un outil très pratique pour l’étude des mécanismes moléculaires de la réponse immunitaire, des maladies pathogènes, des tests de nouveaux médicaments, de la vaccination et de la protection contre les infections33,34,35. L’étude sur le comportement du poisson zèbre est utile car des études antérieures ont montré que certaines espèces de poissons restent immobiles au fond de l’aquarium lorsqu’elles sont stressées, ce qui affecte leur consommation alimentaire, en mangeant moins; De plus, le zigzag lorsqu’ils se déplacent pourrait également être associé au stress et à l’anxiétédes poissons 36,37. L’information générée par les études en évaluant ces paramètres chez le poisson zèbre fournira une compréhension fondamentale des interactions moléculaires tique-hôte et des mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire de l’hôte au α-Gal qui peuvent conduire au développement de l’AGS, y compris l’allergie à la consommation de viande de mammifère.
Pour éviter les réactions faussement positives à la molécule injectée, il est important d’effectuer une injection intradermique pas très profonde, parallèlement au corps du poisson zèbre, et d’évaluer si le poisson est endommagé au moment de l’injection. Un poisson blessé par la manipulation ou la pénétration d’une aiguille ne doit pas être inclus dans l’analyse. De plus, il est fortement recommandé qu’un professionnel connaissant le poisson zèbre évalue les changements de comportement tels que la natation et l’alimentation afin d’envisager des changements de comportement en fonction de ses antécédents et de son expérience de travail avec ce modèle38. Une autre considération importante est l’anesthésie; Une dose adéquate est importante pour l’état optimal des échantillons prélevés. De plus, lors du traitement par injection, une réponse au stress plus prononcée est évitée, ce qui peut compenser d’éventuelles difficultés liées au diagnostic de stress29.
Les résultats ont montré que le modèle du poisson zèbre pouvait également faire progresser les possibilités d’évaluation des risques de développer un AGS après une piqûre de tique et d’autres réactions allergiques. En outre, des cibles pour le diagnostic, les traitements et la prévention de ces allergies peuvent être appliquées aux humains, car cette méthode et les paramètres évalués permettent une caractérisation plus précise des réactions allergiques chez le poisson zèbre.
Cette méthode pourrait permettre d’évaluer d’autres molécules biogènes salivaires, responsables de réactions allergiques et présentes dans la salive des tiques. La teneur en α-Gal dans la salive des tiques a déjà été quantifiée27, mais on ne sait pas quels autres composés peuvent être impliqués dans le développement de l’AGS. Des réactions allergiques ont été observées dans les groupes traités avec de la salive de tiques et du α-Gal, mais pas dans les groupes PBS (tableau 3), mais le comportement est plus affecté dans le groupe traité par la salive des tiques que dans le groupe α-Gal (Figure 5). À partir de ces données, notre hypothèse serait que d’autres biomolécules en combinaison avec l’alpha-Gal sont impliquées dans l’AGS, de sorte que d’autres expériences devraient étudier quelles autres molécules présentes dans la salive ont une influence sur ces résultats. De plus, les titres d’anticorps anti-alpha-gal étaient significativement plus élevés chez le poisson zèbre traité avec de la salive de tique et de l’alpha-gal, qui, comme dans les études précédentes26,29, a montré une réponse immunitaire à l’alpha-gal présent dans la salive des tiques (Figure 7).
Enfin, les marqueurs de réponse immunitaire semblaient régulés à la baisse dans les groupes de poissons-zèbres traités avec de la salive de tique et de la gal alpha par rapport au groupe traité par PBS (tableau 3 et figure 6). Ces résultats sont cohérents avec ceux obtenus dans d’autres études où d’autres biomolécules liées à l’AGS ont été testées27, mais contrairement aux études précédentes25 où des souris KO α-Gal en réponse à des piqûres de tiques et à la consommation de viande rouge ont montré une réponse IgE et une expression régulée à la hausse des voies de signalisation inflammatoires du récepteur de type Toll (TLR) et de l’IL-1, ce qui a entraîné l’activation de l’Akr2. Par conséquent, d’autres études sont nécessaires pour comprendre les voies d’activation de ces réponses à la salive des tiques et à d’autres biomolécules chez le poisson zèbre qui pourraient être obtenues par l’application de cette méthodologie.
Ensuite, cette méthodologie peut permettre de dépister des biomolécules qui, seules ou en combinaison, déclenchent des réactions allergiques et qui pourraient affecter la réponse immunitaire de l’hôte conduisant à des maladies allergiques telles que l’AGS et d’autres allergies transmises par les tiques27.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres du groupe SaBio pour leur collaboration dans la conception expérimentale et l’assistance technique avec l’installation expérimentale sur les poissons et Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Espagne) pour avoir fourni le poisson zèbre. Ce travail a été soutenu par Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Espagne et EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras est financée par le Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Espagne, subvention IJC2020-042710-I.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food - Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
References
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