Summary
Aquí, el pez cebra (Danio rerio) se utiliza como modelo para estudiar las reacciones alérgicas y las respuestas inmunes relacionadas con el síndrome alfa-Gal (AGS) mediante la evaluación de las reacciones alérgicas a la saliva de garrapatas y el consumo de carne de mamíferos.
Abstract
Las garrapatas son artrópodos vectores que causan enfermedades por transmisión de patógenos y cuyas picaduras podrían estar relacionadas con reacciones alérgicas que afectan la salud humana en todo el mundo. En algunos individuos, altos niveles de anticuerpos de inmunoglobulina E contra el glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) han sido inducidos por picaduras de garrapatas. Las reacciones anafilácticas mediadas por glicoproteínas y glicolípidos que contienen el glicano α-Gal, presentes en la saliva de garrapatas, están relacionadas con el síndrome alfa-Gal (AGS) o alergia a la carne de mamíferos. El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo vertebrado ampliamente utilizado para el estudio de diferentes patologías. En este estudio, el pez cebra se utilizó como modelo para el estudio de las reacciones alérgicas en respuesta al consumo de carne de α-Gal y mamíferos porque, al igual que los humanos, no sintetizan este glicano. Para este propósito, se evaluaron los patrones de comportamiento y las reacciones alérgicas de tipo anafiláctico hemorrágico en respuesta a la saliva de la garrapata Ixodes ricinus y el consumo de carne de mamíferos. Este enfoque experimental permite la obtención de datos válidos que respaldan el modelo animal de pez cebra para el estudio de alergias transmitidas por garrapatas, incluido el AGS.
Introduction
Las garrapatas son vectores de patógenos que causan enfermedades y también son la causa de reacciones alérgicas, afectando la salud de humanos y animales en todo el mundo 1,2. Durante la alimentación por garrapatas, las biomoléculas en la saliva de garrapatas, especialmente proteínas y lípidos, facilitan la alimentación de estos ectoparásitos, evitando las defensas del huésped3. Algunas biomoléculas de saliva con glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modificaciones conducen a la producción de altos niveles de anticuerpos anti-α-Gal IgE después de la picadura de garrapata, solo en algunos individuos, lo que se conoce como síndrome de α-Gal (AGS)4. Esta es una enfermedad asociada con la alergia mediada por IgE que puede provocar anafilaxia a las picaduras de garrapatas, consumo de carne de mamíferos no primates y algunos medicamentos como cetuximab5. Las reacciones a α-Gal a menudo son graves y a veces pueden ser fatales 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
El α-Gal se encuentra en todos los mamíferos, excepto en los monos, simios y humanos del Viejo Mundo que no tienen la capacidad de sintetizar α-Gal13. Sin embargo, patógenos como bacterias y protozoos expresan este glicano en su superficie, lo que puede inducir la producción de altas cantidades de anticuerpos anti-α-Gal IgM/IgG y puede ser un mecanismo protector contra estos patógenos16,17. Sin embargo, la producción de anticuerpos anti-α-Gal aumenta el riesgo de desarrollar alergias anti-α-Gal mediadas por IgE 7,13. Los anticuerpos naturales anti-α-Gal producidos en humanos, principalmente de los subtipos IgM/IgG, podrían estar asociados a esta modificación presente en bacterias de la microbiota intestinal16. El AGS puede ser un diagnóstico clínico difícil, ya que el principal método de diagnóstico en este momento se basa en una historia clínica de reacciones alérgicas tardías, especialmente asociadas con alergias alimentarias (es decir, prurito, urticaria localizada o angioedema recurrente a anafilaxia, urticaria y síntomas gastrointestinales) y la medición de los niveles de anticuerpos IgE anti-α-Gal9. Los hallazgos actuales sugieren que las picaduras de garrapatas constituyen uno de los principales riesgos en la aparición de AGS 18,19, un aumento de 20 veces o más en los niveles de IgE a α-Gal después de una picadura de garrapata 19, una historia de picaduras de garrapatas en pacientes con AGS20,21,22, la existencia de anticuerpos reactivos a los antígenos de garrapatas en pacientes con AGS 19, y que la IgE anti-α-Gal está fuertemente relacionada con los niveles de IgE anti-garrapatas19,23, pero se necesitan más estudios para evaluar qué biomoléculas están realmente involucradas.
Además, otro escenario posible son los pacientes que presentan fuertes reacciones alérgicas a las picaduras de garrapatas y altos niveles de anticuerpos anti-α-Gal IgE, pero son tolerantes al consumo de carne de mamíferos12. Por lo tanto, la alergia a la carne de mamífero podría ser un tipo particular de alergia relacionada con la picadura de garrapata. Las principales especies de garrapatas asociadas con AGS incluyen Amblyomma americanum (EE.UU.), Amblyomma sculptum (Brasil), Amblyomma testudinarium y Haemaphysalis longicornis (Japón), Ixodes holocyclus (Australia) e Ixodes ricinus (el principal vector de la borreliosis de Lyme en Europa)11,24.
El único modelo que se ha utilizado para evaluar la producción de IgE relacionada con las picaduras de garrapatas es el modelo de ratón modificado genéticamente con el gen para ratones α-1,3-galactosiltransferasa noqueada (α-Gal KO)25,26 porque al igual que otros mamíferos, los ratones también expresan α-Gal en proteínas y lípidos y no producen IgE a α-Gal. Sin embargo, el pez cebra (Danio rerio) es un modelo útil para la investigación biomédica aplicada a los mamíferos porque comparte muchas similitudes anatómicas con los mamíferos y, al igual que los humanos, también es incapaz de sintetizar α-Gal. Dado que α-Gal no se produce naturalmente en el pez cebra, es un modelo asequible, fácil de manipular y permite un alto tamaño de muestra para el estudio de reacciones alérgicas relacionadas con α-Gal.
En este estudio, el pez cebra se utiliza como organismo modelo para caracterizar y describir las reacciones alérgicas locales, los patrones de comportamiento y los mecanismos moleculares asociados con la respuesta a la sensibilización percutánea a la saliva de garrapatas26,27 y el posterior consumo de carne de mamíferos. Para este propósito, los peces se exponen a la saliva de garrapatas por inyección intradérmica y luego se alimentan con alimento para perros, que contiene productos derivados de la carne de mamíferos adecuados para uso animal que contienen α-Gal27, luego se evalúan posibles reacciones alérgicas relacionadas. Este método se puede aplicar al estudio de otras biomoléculas relacionadas con procesos alérgicos, especialmente las relacionadas con AGS.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Castilla La Mancha en el marco del estudio "Evaluación de la respuesta inmune a la vacuna inactivada contra M. bovis y desafío con M. marinum en el número de modelo de pez cebra PR-2017-05-12".
Las garrapatas se obtuvieron de la colonia de laboratorio, donde se analizaron muestras representativas de garrapatas en la colonia mediante PCR para detectar patógenos comunes de garrapatas para confirmar la ausencia de patógenos, y se mantuvieron en el Instituto de Parasitología, Centro de Biología de la Academia Checa de Ciencias (IP BC CAS), República Checa.Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Ley de Protección Animal de la República Checa No. 246/1992 Sb (aprobación ética No. 34/2018).
1. Tratamiento del pez cebra
NOTA: El ensayo está diseñado para evaluar las reacciones alérgicas y la respuesta inmune en el pez cebra tratado con saliva de garrapata en respuesta al consumo de carne de mamíferos.
- Tratar el pescado (como se explica en la sección 4) con saliva de garrapata, Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) comercial (ver Tabla de materiales), utilizada como control positivo, con solución salina tamponada con fosfato (PBS) como control negativo. El pez cebra adulto se distribuye aleatoriamente en tres grupos de género equilibrado (Figura 1).
NOTA: Cualquier otro compuesto deseado relacionado con AGS puede ser evaluado usando este modelo.
2. Extracción de saliva de garrapata Ixodes ricinus
- Use garrapatas hembras semi-hinchadas libres de patógenos alimentadas durante 6-7 días en conejillos de indias.
- Tratar la garrapata con 5 μL de una solución al 2% (peso / vol) de clorhidrato de pilocarpina en PBS (ver Tabla de materiales) a pH 7.4 en el hemocoel usando una jeringa de 50 μL con una aguja de 0.33 mm como se describió anteriormente28 para inducir la producción de saliva por garrapata.
NOTA: Las garrapatas se manejan con fórceps; Tenga cuidado de no aplicar demasiada fuerza al agarrarlos. - Recoger la saliva con una punta de 10 μL montada en una micropipeta.
- Introduzca la punta dentro del hipostoma de garrapatas con cuidado.
- Mantenga la saliva en un tubo de 1,5 ml sobre hielo, constrímela y guárdela a -80 °C como se describió anteriormente27.
- Determinar la concentración de proteína en saliva, para establecer la cantidad de proteína a inyectar en el pescado como en estudios previos27 utilizando un kit de ensayo de proteína BCA (ver Tabla de materiales) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
3. Mantenimiento del pez cebra
- Mantener el pez cebra en un sistema de agua de flujo continuo a 27 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 14 h/10 h (Figura 2).
- Alimente a los peces dos veces al día a las 9:30 a.m. y 1:30 p.m. con alimento seco para peces (50-70 μg / pescado) hasta el día 2.
- Alimente a los peces dos veces al día a las 9:30 a.m. y 1:30 p.m. con alimento seco para perros (50-70 μg / pez) desde el día 2 después de la inyección del tratamiento hasta el final del experimento
4. Inyección de pez cebra
- Seleccione 10 peces por grupo con una proporción similar de hembras / machos y peso similar.
NOTA: El grupo 1 contiene pescado inyectado con PBS, el grupo 2 contiene pescado inyectado con saliva de garrapatas y el grupo 3 contiene pescado inyectado con α-Gal. - Anestesiar brevemente el pescado por inmersión en metanosulfonato de tricaína al 0,02% (MS-222) (Película 1).
NOTA: Los peces debidamente anestesiados muestran respiración normal y no nadan, mientras que podrían colocarse en el fondo del tanque de agua o flotando. Cada pez debe ser anestesiado individualmente para evitar posibles daños fisiológicos. - Capturar los peces anestesiados utilizando una red de pesca.
- Coloque el pez en su mitad de lado usando fórceps o manos con cuidado, sobre una esponja húmeda, con la aleta caudal en el lado derecho para inyectar los compuestos en la misma dirección con el fin de controlar las lesiones.
- Inyectar grupos de peces por vía intradérmica, como en estudios previos26, en el músculo a 5 mm de la aleta caudal y en un ángulo de 45° en relación con el cuerpo del pez (Película 2). Utilizar el tratamiento adecuado en los días 0, 3 y 8 como se ha descrito anteriormente 27 con una jeringa de 100 μL equipada con una aguja de 1 cm, 29 G con 1 μL (con 9 μg/μL de proteína) de I. ricinus saliva en 10 μL de PBS (saliva por garrapata), 5 μg de α-Gal en 10 μL de PBS (α-Gal)27, y 10 μL de PBS (Figura 3).
NOTA: La manipulación debe hacerse rápida y cuidadosamente para evitar cualquier daño físico al animal.
Otras biomoléculas en la saliva de garrapatas se pueden evaluar siguiendo este protocolo. - Coloque los peces tratados nuevamente en un tanque de agua dulce sin anestesia para su recuperación.
NOTA: Todos los peces del mismo grupo se pueden colocar en el mismo tanque de agua para su recuperación.
5. Alimentación del pez cebra
- Machaca la comida para perros con un mortero.
- Alimente 50-70 μg/pescado dos veces al día a las 9:30 a.m. y 1:30 p.m. con alimento para peces secos hasta el día 2.
- Alimente 50-70 μg / pescado dos veces al día a las 9:30 a.m. y 1:30 p.m. con puré de alimento para perros desde el día 2 después de la inyección del tratamiento hasta el final del experimento el día 8.
NOTA: Si se van a evaluar los marcadores de inmunidad o los títulos de anticuerpos contra el anticuerpo α-Gal o IgE en respuesta a los tratamientos o la alimentación a lo largo de las diferentes inoculaciones, la alimentación sería necesaria hasta el final del experimento.
6. Evaluación de reacciones alérgicas, lesiones y comportamiento en pez cebra
- Examine el tipo hemorrágico de reacciones alérgicas (enrojecimiento de la piel, decoloración y hemorragia) utilizando una lupa o estereomicroscopio para verificar su precisión e indique la ubicación de su aparición en los peces siguiendo la categorización incluida en la Tabla 1 (Figura 4A).
NOTA: Las reacciones alérgicas presentadas en la Figura 4 aparecieron después de la inyección de saliva de garrapata y el consumo de alimentos que contienen carne roja. Por lo tanto, las reacciones descritas son el tipo de reacciones asociadas con AGS, ya que aparecen reacciones similares en el contexto clínico.- Observe si aparece alguna reacción después de los tratamientos y mientras se administran alimentos dos veces al día mientras los peces están en el tanque de agua.
- Examinar el comportamiento de los peces evaluando los cambios27 en los patrones de natación (movilidad, velocidad, permanecer inmóvil en el fondo del tanque de agua y natación en zigzag) siguiendo la categorización incluida en la Tabla 1.
- Evaluar la mortalidad acumulada, informando el número de peces muertos, incluida la hora/día de la muerte (Figura 4B).
NOTA: Todos los parámetros se evalúan inmediatamente después del tratamiento o después del cambio de alimento y se siguen diariamente hasta el final del experimento en el día 8 categorizando las variables cualitativas (Tabla 1). Como recomendación, esta evaluación debe ser realizada por un profesional con conocimientos sobre el pez cebra para considerar cambios de comportamiento en función de sus antecedentes y experiencia trabajando con este modelo animal. - Calcule el número de peces cebra por día con reacciones alérgicas reportadas, comportamiento anormal y cambios en la alimentación en cada grupo y compare entre grupos mediante una prueba ANOVA unidireccional.
7. Recogida de muestras
- Eutanasia de los peces por inmersión en 0.04% MS-222 el día 8.
NOTA: También recoja las muestras de los peces que mueren por reacciones alérgicas durante el ensayo. - Fije el pescado en una placa de parafina con alfileres.
- Recoger suero de los vasos sanguíneos branquiales 29 de los peces inmediatamente después de la eutanasia, cuando las branquias todavía están irrigadas con sangre, utilizando una jeringa de 0,5 ml equipada con una aguja de 1 cm,29 G. Almacénelo en un tubo de 1,5 ml a -20 °C hasta su uso (película 3).
- Cortar el pescado sagitalmente con una cuchilla de bisturí y evaluar las lesiones internas (lesiones hemorrágicas o granulomas)27,30 si aparecen.
NOTA: Las lesiones no aparecen necesariamente, pero deben registrarse si lo hacen. - Recoja el intestino (Película 4) y el riñón (Película 5) de cada pez en tubos vacíos separados de 1,5 ml, como se describió anteriormente31, y almacénelos a -80 C (Figura 4C).
- Extraiga el ARN total de las muestras de intestino y riñón del pez cebra utilizando un kit de purificación de ARN (consulte la Tabla de materiales).
- Analizar la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune como se describió anteriormente30,32 (ver Tabla 2 para secuencias de cebadores) en pez cebra, realizando una reacción en cadena cuantitativa de polimerasa con transcripción inversa (RT-qPCR) utilizando una mezcla de transcripción inversa para RT-qPCR (ver Tabla de materiales), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalizar los valores de cT de ARNm contra D. rerio GAPDH y comparar entre grupos (peces tratados con saliva, α-Gal y los grupos tratados con PBS) utilizando una prueba t de Student con varianza desigual.
- Determinar los títulos de anticuerpos IgM que reconocen α-Gal en pez cebra en muestras de suero por ELISA como se describió anteriormente27,30. Registre los títulos de anticuerpos como valores de O.D.450 nm, utilizando un lector de placas, y compare entre los grupos (peces tratados con saliva, α-Gal y los grupos tratados con PBS) utilizando una prueba t de Student con varianza desigual.
NOTA: La determinación de los títulos de anticuerpos IgM y el análisis de genes de expresión son opcionales y se realizan solo si se requiere información inmunológica. La mezcla RT-qPCR es un kit de síntesis de ADNc de primera cadena para el análisis de la expresión génica utilizando qPCR en tiempo real.
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Representative Results
El protocolo aquí presentado se basa en varios aspectos de experimentos previamente publicados27,30 y resultados realizados en nuestro laboratorio donde se establece y valida el modelo de pez cebra para el estudio del AGS y la respuesta inmune al α-Gal porque tanto los humanos como el pez cebra no sintetizan esta molécula13. Este modelo permite la caracterización y evaluación de una variedad de reacciones alérgicas como resultado de la respuesta del huésped a la saliva de garrapata (Figura 4) y su implicación en AGS. Además, se observan alteraciones en el comportamiento como nadar lentamente (Película 6), acostarse en el fondo del tanque (Película 7) y no comer, vibrar o zigzaguear (Película 8) en los peces en respuesta al tratamiento con saliva de garrapatas que no se observa en el pez control; Estos hallazgos son particularmente significativos después de la administración de alimentos para perros en el día 2. En este punto, los peces ya estaban sensibilizados con alfa-gal y saliva de garrapata, y comenzó la administración de carne roja a través del alimento. Finalmente, se observa una incidencia significativa de reacciones alérgicas en peces tratados con saliva de garrapata (Figura 4A, B y Tabla 3), solo el pez cebra que había estado expuesto a la saliva de garrapata desarrolló reacciones alérgicas, mostrando una rápida desensibilización y tolerancia. Por otro lado, en estudios previos, el pez cebra alimentado con alimento para peces no desarrolló ninguna lesión o reacción visible27. El cambio de comportamiento fue más pronunciado en los peces tratados con saliva de garrapatas que con solo α-Gal (Figura 5). Se realizó un análisis adicional de la expresión de los creadores de respuesta inmune más representativos (IFN, TLR 2, IL1 β y AKR2) mediante RT-PCR (Tabla 3), con el fin de estudiar diferentes respuestas inmunes a los tratamientos. Los resultados mostraron diferencias entre los grupos de pez cebra en el riñón, donde la mayoría de los marcadores de respuesta inmune parecían estar regulados a la baja en los peces tratados con saliva y α-Gal en comparación con el grupo control (Figura 6), pero no se encontraron diferencias significativas en la expresión génica en el intestino. Estudios previos sobre reacciones alérgicas a diferentes componentes de la saliva de garrapatas en el pez cebra mostraron resultados similares27. Además, como resultados representativos, el pez cebra tratado con saliva de garrapatas y α-Gal utilizando este protocolo desarrolló anticuerpos IgM contra α-Gal que mostraron niveles más altos que en los peces tratados con PBS (Figura 7), como se encontró en estudios previos27,30.
Figura 1: Diseño experimental para ensayo de pez cebra. Los peces se inyectan por vía intradérmica con α-Gal, saliva de garrapatas y PBS como control negativo. Las muestras se recogen después de que un pez muere o al final del experimento. Las muestras podrían utilizarse para el análisis de los niveles de IgM anti-α-Gal y la expresión de marcadores génicos de respuesta inmune seleccionados mediante qRT-PCR27. Los cambios de comportamiento o reacciones alérgicas se registran a lo largo del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Instalación experimental de pez cebra. El pez cebra se mantiene en un sistema de agua de flujo continuo a 27 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 14 h/10 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inyección de tratamiento con pez cebra. La inyección de tratamiento con pez cebra con una jeringa de 100 μL equipada con una aguja de 1 cm, 29 G se realiza por vía intradérmica a una distancia de 5 mm de la aleta caudal. Los peces son anestesiados y tratados uno por uno sobre una esponja sumergida en agua tibia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evidencia de reacciones hemorrágicas de tipo anafiláctico en pez cebra inyectado con saliva de garrapata y que murió el día 2 antes del cambio de alimentación. (A) Peces con reacciones alérgicas en el tanque después del tratamiento. (B) Peces muertos por reacciones anafilácticas hemorrágicas (tipo de reacción alérgica: decoloración y enrojecimiento de la piel. (C) Recolección de muestras. Las flechas rojas indican el intestino y los círculos rojos indican el riñón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Patrón de comportamiento observado en peces. Los patrones de comportamiento anormales consistían en nadar lentamente, pararse inmóvil en el fondo del tanque de agua y nadar en zigzag. Las flechas azules indican el tiempo de tratamiento, y la flecha roja indica el tiempo para cambiar de alimento para peces a alimento para perros. Los peces alimentados con comida para perros se compararon entre peces control tratados con saliva y tratados con PBS mediante una prueba ANOVA unidireccional (p = 0,05; N = 5 peces/grupo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Expresión de marcadores seleccionados de respuesta inmune en el riñón del pez cebra. Análisis de expresión génica por qRT-PCR en el riñón de pez cebra al final del experimento. Los valores de mRNA cT se normalizan contra D. rerio GAPDH, presentados como promedio ± DE, y se comparan entre peces tratados con saliva, α-Gal, y el grupo control tratado con PBS mediante una prueba t de Student con varianza desigual (*p < 0,05; N = 3-7). Esta cifra ha sido adoptada de27 y reproducida con autorización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Títulos de anticuerpos IgM. Los títulos de anticuerpos IgM del pez cebra contra α-Gal se determinan mediante ELISA, representado como el promedio ± SD O.D. a 450 nm y comparado entre peces tratados con saliva, α -Gal y el grupo control tratado con PBS mediante una prueba t de Student con varianza desigual (*p < 0,005; N = 3-7). Esta cifra ha sido adoptada de27 y reproducida con autorización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Lesiones y patrones de comportamiento evaluados. Categorización de variables cualitativas. Los parámetros que se evalúan cualitativamente son lesiones (en aletas y escamas), natación, alimentación y si la muerte de los peces es causada por la prueba o por la manipulación. Como consideración subjetiva, cada variable se clasifica de muy leve a grave Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Cebadores de oligonucleótidos y temperaturas de recocido para qRT-PCR. Esta tabla ha sido adoptada de30 y reproducida con autorización. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Cuadro 3: Resultados representativos. Los registros de alergias y muertes del pez cebra y la expresión de marcadores de respuesta inmune seleccionados se analizan mediante qRT-PCR en el riñón y el intestino del pez cebra. Los valores de mRNA cT se normalizan contra D. rerio GAPDH y se comparan entre peces tratados con saliva, α -Gal, y el grupo control tratado con PBS mediante una prueba t de Student con varianza desigual (*p < 0,05; N = 3-7). Esta tabla ha sido adoptada de 27,30 y reproducida con autorización. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Película 1: Peces anestesiados. El pez anestesiado no muestra movimiento ni nada, sino que continúa respirando. Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 2: Inyección del tratamiento en el pescado. Los peces se colocan anestesiados sobre una esponja húmeda y se inyectan en un ángulo de 45° con respecto a su cuerpo con el tratamiento indicado. Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 3: Recolección de suero de los vasos sanguíneos branquiales. El pescado se fija en una placa de parafina con alfileres y el suero se recoge de las branquias utilizando una jeringa de 0,5 ml equipada con una aguja de 1 cm, 29 G. Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 4: Recolección de intestino de un pez sacrificado. El pescado se corta sagitalmente con una cuchilla de bisturí y el intestino se recoge con pinzas. Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 5: Colección de riñón de un pez sacrificado. Se extirpa la vejiga natatoria y se recoge el riñón. Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 6: Aspectos representativos del comportamiento observado en el pez cebra tratado. Un pez mostró una natación lenta. Todos los peces del mismo grupo están en el mismo tanque, el video es un ejemplo para ilustrar este comportamiento, y varios peces pueden tener este comportamiento en diferentes momentos del día. Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 7: Aspectos representativos del comportamiento observado en el pez cebra tratado. Un pez se quedó en el fondo del tanque. Todos los peces del mismo grupo están en el mismo tanque, los videos son un ejemplo para ilustrar este comportamiento, y varios peces pueden tener este comportamiento en diferentes momentos del día. Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 8: Aspectos representativos del comportamiento observado en el pez cebra tratado. Un pez mostró natación vibratoria. Todos los peces del mismo grupo están en el mismo tanque, los videos son un ejemplo para ilustrar este comportamiento, y varios peces pueden tener este comportamiento en diferentes momentos del día. Haga clic aquí para descargar esta película.
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Discussion
El pez cebra es un modelo rentable y fácil de manejar que también ha sido una herramienta muy factible para el estudio de los mecanismos moleculares de la respuesta inmune, enfermedades patógenas, pruebas de nuevos medicamentos y vacunación y protección contra infecciones33,34,35. El estudio sobre el comportamiento del pez cebra es útil ya que estudios previos han encontrado que algunas especies de peces permanecen inmóviles en el fondo del tanque cuando están estresadas, lo que afecta su consumo de alimentos, comiendo menos; Además, zigzaguear cuando se mueven también podría estar asociado con el estrés y la ansiedad de los peces36,37. La información generada a partir de estudios mediante la evaluación de estos parámetros en el pez cebra proporcionará una comprensión fundamental de las interacciones moleculares garrapata-huésped y los mecanismos involucrados en la respuesta inmune del huésped al α-Gal que pueden conducir al desarrollo de AGS, incluida la alergia al consumo de carne de mamíferos.
Para evitar reacciones falsas positivas a la molécula inyectada, es importante realizar una inyección intradérmica no muy profunda, paralela al cuerpo del pez cebra, y evaluar si el pez está dañado en el momento de la inyección. Un pez con lesiones resultantes de la manipulación o penetración de la aguja no debe incluirse en el análisis. Además, es muy recomendable que un profesional con conocimiento del pez cebra evalúe los cambios en el comportamiento como la natación y la alimentación para considerar los cambios de comportamiento en función de sus antecedentes y experiencia trabajando con este modelo38. Otra consideración importante es la anestesia; Una dosis adecuada es importante para el estado óptimo de las muestras recogidas. Además, durante el tratamiento de inyección, se evita una respuesta de estrés más pronunciada, lo que puede compensar posibles dificultades relacionadas con el diagnóstico de estrés29.
Los resultados mostraron que el modelo de pez cebra también podría avanzar en las posibilidades de evaluar los riesgos de desarrollar AGS después de una picadura de garrapata y otras reacciones alérgicas. Además, los objetivos para el diagnóstico, los tratamientos y la prevención de estas alergias se pueden aplicar a los humanos, ya que este método y los parámetros que se evalúan permiten una caracterización más precisa de las reacciones alérgicas en el pez cebra.
Este método podría permitir evaluar otras moléculas biogénicas salivales, responsables de reacciones alérgicas y presentes en la saliva de garrapatas. El contenido de α-Gal en la saliva de garrapatas se ha cuantificado previamente27, pero no se sabe qué otros compuestos pueden estar involucrados en el desarrollo de AGS. Se observaron reacciones alérgicas en los grupos tratados con saliva de garrapatas y α-Gal, pero no en los grupos de PBS (Tabla 3), sin embargo, el comportamiento se ve más afectado en el grupo tratado con saliva de garrapatas que en el grupo α-Gal (Figura 5). A partir de estos datos, nuestra hipótesis sería que otras biomoléculas en combinación con alfa-Gal están involucradas en AGS, por lo que otros experimentos adicionales deberían estudiar qué otras moléculas presentes en la saliva tienen una influencia en estos hallazgos. Además, los títulos de anticuerpos anti-alfa-gal fueron significativamente mayores en el pez cebra tratado con saliva de garrapata y alfa-gal, que, como en estudios previos26,29, mostró una respuesta inmune al alfa-gal presente en la saliva de la garrapata (Figura 7).
Finalmente, los marcadores de respuesta inmune aparecieron regulados a la baja en los grupos de pez cebra tratados con saliva de garrapata y alfa gal en comparación con el grupo tratado con PBS (Tabla 3 y Figura 6). Estos resultados son consistentes con los obtenidos en otros estudios en los que se probaron otras biomoléculas relacionadas con AGS27, pero a diferencia de estudios previos25 donde los ratones KO α-Gal en respuesta a las picaduras de garrapatas y el consumo de carne roja mostraron una respuesta de IgE y una expresión regulada al alza del receptor inflamatorio tipo Toll (TLR) y las vías de señalización de IL-1, lo que resultó en la activación del Akr2. Por lo tanto, se necesitan más estudios para comprender las vías de activación de estas respuestas a la saliva de garrapatas y otras biomoléculas en el pez cebra que podrían lograrse mediante la aplicación de esta metodología.
Entonces, esta metodología puede permitir el cribado de biomoléculas que solas o en combinación desencadenan reacciones alérgicas y que podrían afectar la respuesta inmune del huésped que conduce a enfermedades alérgicas como AGS y otras alergias transmitidas por garrapatas27.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Queremos agradecer a los miembros del grupo SaBio su colaboración en el diseño experimental y asistencia técnica con la instalación experimental de peces y a Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, España) por proporcionar pez cebra. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, España y EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras está financiada por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, España, subvención IJC2020-042710-I.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food - Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
References
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