Summary
Hier wordt zebravis (Danio rerio) gebruikt als een model om allergische reacties en immuunresponsen gerelateerd aan alfa-Gal-syndroom (AGS) te bestuderen door allergische reacties op tekenspeeksel en vleesconsumptie van zoogdieren te evalueren.
Abstract
Teken zijn geleedpotige vectoren die ziekte veroorzaken door overdracht van pathogenen en waarvan de beten verband kunnen houden met allergische reacties die de menselijke gezondheid wereldwijd beïnvloeden. Bij sommige personen zijn hoge niveaus van immunoglobuline E-antilichamen tegen de glycaan Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) geïnduceerd door tekenbeten. Anafylactische reacties gemedieerd door glycoproteïnen en glycolipiden die het glycaan α-Gal bevatten, aanwezig in tekenspeeksel, zijn gerelateerd aan alfa-Galsyndroom (AGS) of vleesallergie voor zoogdieren. Zebravis (Danio rerio) is een veel gebruikt gewerveld model geworden voor de studie van verschillende pathologieën. In deze studie werd zebravis gebruikt als model voor de studie van allergische reacties als reactie op de consumptie van α-Gal en zoogdiervlees, omdat ze, net als mensen, deze glycaan niet synthetiseren. Voor dit doel werden gedragspatronen en hemorragische anafylactische allergische reacties als reactie op Ixodes ricinus tekenspeeksel en vleesconsumptie van zoogdieren geëvalueerd. Deze experimentele aanpak maakt het mogelijk om geldige gegevens te verzamelen die het zebravisdiermodel ondersteunen voor de studie van door teken overgedragen allergieën, waaronder AGS.
Introduction
Teken zijn vectoren van ziekteverwekkers die ziekten veroorzaken en zijn ook de oorzaak van allergische reacties, die de gezondheid van mens en dier wereldwijd beïnvloeden 1,2. Tijdens tekenvoeding vergemakkelijken biomoleculen in tekenspeeksel, vooral eiwitten en lipiden, de voeding van deze ectoparasieten, waardoor de afweer van de gastheer wordt vermeden3. Sommige speekselbiomoleculen met glycaan Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modificaties leiden tot de productie van hoge anti-α-Gal IgE-antilichaamniveaus na de tekenbeet, alleen bij sommige personen, wat bekend staat als α-Gal Syndroom (AGS)4. Dit is een ziekte geassocieerd met IgE-gemedieerde allergie die kan leiden tot anafylaxie voor tekenbeten, vleesconsumptie van niet-primaten van zoogdieren en sommige geneesmiddelen zoals cetuximab5. Reacties op α-Gal zijn vaak ernstig en kunnen soms fataal zijn 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
De α-Gal wordt gevonden in alle zoogdieren, behalve apen, apen en mensen uit de Oude Wereld die niet het vermogen hebben om α-Gal13 te synthetiseren. Pathogenen zoals bacteriën en protozoa drukken deze glycaan echter op hun oppervlak uit, wat de productie van grote hoeveelheden anti-α-Gal IgM / IgG-antilichamen kan induceren en een beschermend mechanisme tegen deze pathogenen kan zijn16,17. De productie van anti-α-Gal-antilichamen verhoogt echter het risico op het ontwikkelen van IgE-gemedieerde anti-α-Gal-allergieën 7,13. Natuurlijke anti-α-Gal-antilichamen geproduceerd bij mensen, voornamelijk van de IgM / IgG-subtypen, kunnen worden geassocieerd met deze modificatie die aanwezig is in bacteriën uit de darmmicrobiota16. AGS kan een uitdagende klinische diagnose zijn, omdat de belangrijkste diagnostische methode op dit moment is gebaseerd op een klinische geschiedenis van vertraagde allergische reacties, vooral geassocieerd met voedselallergieën (d.w.z. pruritus, gelokaliseerde netelroos of terugkerend angio-oedeem tot anafylaxie, urticaria en gastro-intestinale symptomen) en de meting van IgE anti-α-Gal-antilichaamniveaus9. Huidige bevindingen suggereren dat tekenbeten een van de belangrijkste risico's vormen bij het verschijnen van AGS 18,19, een 20-voudige of grotere toename van IgE-niveaus tot α-Gal na een tekenbeet 19, een voorgeschiedenis van tekenbeten bij patiënten met AGS20,21,22, het bestaan van antilichamen die reageren op tekenantigenen bij AGS-patiënten 19, en dat anti-α-Gal IgE sterk gerelateerd zijn aan anti-teken IgE-niveaus19,23, maar verdere studies zijn nodig om te beoordelen welke biomoleculen daadwerkelijk betrokken zijn.
Daarnaast is een ander mogelijk scenario patiënten die sterke allergische reacties vertonen op tekenbeten en hoge niveaus van anti-α-Gal IgE-antilichamen, maar tolerant zijn voor de vleesconsumptie van zoogdieren12. Daarom kan vleesallergie voor zoogdieren een bepaald type tekenbeetgerelateerde allergie zijn. De belangrijkste tekensoorten geassocieerd met AGS zijn Amblyomma americanum (VS), Amblyomma sculptum (Brazilië), Amblyomma testudinarium en Haemaphysalis longicornis (Japan), Ixodes holocyclus ( Australië) en Ixodes ricinus (de belangrijkste vector van Lyme borreliose in Europa)11,24.
Het enige model dat is gebruikt om de IgE-productie gerelateerd aan tekenbeten te evalueren, is het muismodel dat genetisch is gemodificeerd met het gen voor α-1,3-galactosyltransferase knock-out (α-Gal KO) muizen25,26 omdat muizen, net als andere zoogdieren, ook α-Gal op eiwitten en lipiden uitdrukken en geen IgE produceren tot α-Gal. Zebravis (Danio rerio) is echter een nuttig model voor biomedisch onderzoek toegepast op zoogdieren omdat het veel anatomische overeenkomsten heeft met zoogdieren en, net als mensen, ook niet in staat is om α-Gal te synthetiseren. Omdat α-Gal niet van nature in zebravissen wordt geproduceerd, is het een betaalbaar model, gemakkelijk te manipuleren en maakt het een hoge steekproefomvang mogelijk voor de studie van α-Gal-gerelateerde allergische reacties.
In deze studie wordt zebravis gebruikt als een modelorganisme om lokale allergische reacties, gedragspatronen en de moleculaire mechanismen geassocieerd met respons op percutane sensibilisatie voor tekenspeeksel26,27 en de daaropvolgende vleesconsumptie van zoogdieren te karakteriseren en te beschrijven. Voor dit doel worden vissen blootgesteld aan tekenspeeksel door intradermale injectie en vervolgens gevoed met hondenvoer, dat van zoogdiervlees afgeleide producten bevat die geschikt zijn voor dierlijk gebruik en die α-Gal27 bevatten, waarna mogelijke gerelateerde allergische reacties worden geëvalueerd. Deze methode kan worden toegepast op de studie van andere biomoleculen die verband houden met allergische processen, met name die welke verband houden met AGS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierproeven van de Universiteit van Castilla La Mancha onder de studie "Evaluatie van de immuunrespons op geïnactiveerd M. bovis-vaccin en uitdaging met M. marinum in het zebravismodelnummer PR-2017-05-12."
Teken werden verkregen uit de laboratoriumkolonie, waar representatieve monsters van teken in de kolonie werden getest door PCR op veel voorkomende tekenpathogenen om de afwezigheid van pathogenen te bevestigen, en onderhouden in het Instituut voor Parasitologie, Biologiecentrum van de Tsjechische Academie van Wetenschappen (IP BC CAS), Tsjechië.Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de dierenbeschermingswet van de Tsjechische Republiek nr. 246/1992 Sb (ethische goedkeuring nr. 34/2018).
1. Zebravis behandeling
OPMERKING: De studie is ontworpen om allergische reacties en de immuunrespons te evalueren bij zebravissen die worden behandeld met tekenspeeksel als reactie op de vleesconsumptie van zoogdieren.
- Behandel de vis (zoals uitgelegd in rubriek 4) met tekenspeeksel, commercieel Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (zie materiaaltabel), gebruikt als positieve controle, met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) als negatieve controle. Volwassen zebravissen worden willekeurig verdeeld in drie genderevenwichtige groepen (figuur 1).
OPMERKING: Elke andere gewenste verbinding met betrekking tot AGS kan worden geëvalueerd met behulp van dit model.
2. Ixodes ricinus teken speeksel extractie
- Gebruik semi-gezwollen pathogeenvrije vrouwelijke teken die gedurende 6-7 dagen op cavia's worden gevoerd.
- Behandel de teek met 5 μL van een 2% (wt/vol) oplossing van pilocarpinehydrochloride in PBS (zie materiaaltabel) bij pH 7,4 in de hemocoel met behulp van een spuit van 50 μL met een naald van 0,33 mm zoals eerder beschreven28 om de productie van tekenspeeksel te induceren.
OPMERKING: Teken worden behandeld met behulp van een tang; Wees voorzichtig om niet te veel kracht toe te passen bij het vastpakken ervan. - Verzamel speeksel met behulp van een 10 μL tip gemonteerd op een micropipette.
- Introduceer de punt voorzichtig in de tekenhypostoom.
- Bewaar het speeksel in een tube van 1,5 ml op ijs, pool het en bewaar het bij -80 °C zoals eerder beschreven27.
- Bepaal de speekseleiwitconcentratie om de hoeveelheid eiwit vast te stellen die in de vis moet worden geïnjecteerd, zoals in eerdere onderzoeken27 met behulp van een BCA-eiwittestkit (zie materiaaltabel) volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
3. Onderhoud van zebravissen
- Houd zebravissen in een doorstroomwatersysteem op 27 °C met een licht/donkercyclus van 14 uur/10 uur (figuur 2).
- Voer de vissen tweemaal daags om 9.30 uur en 13.30 uur met droog visvoer (50-70 μg/vis) tot dag 2.
- Voer de vissen tweemaal daags om 9.30 uur en 13.30 uur met droog hondenvoer (50-70 μg/vis) vanaf dag 2 na de behandelingsinjectie tot het einde van het experiment
4. Zebravis injectie
- Selecteer 10 vissen per groep met een vergelijkbare verhouding van vrouwtjes/mannetjes en vergelijkbaar gewicht.
OPMERKING: Groep 1 bevat vis geïnjecteerd met PBS, groep 2 bevat vis geïnjecteerd met tekenspeeksel en groep 3 bevat vis geïnjecteerd met α-Gal. - Verdoof de vis kort door onderdompeling in 0,02% tricaïnemethaansulfonaat (MS-222) (film 1).
OPMERKING: Goed verdoofde vissen vertonen een normale ademhaling en geen zwemmen, terwijl ze op de bodem van het waterreservoir kunnen worden geplaatst of drijven. Elke vis moet individueel worden verdoofd om mogelijke fysiologische schade te voorkomen. - Vang de verdoofde vis met behulp van een visnet.
- Plaats de vis op zijn halve kant met een tang of handen voorzichtig, op een natte spons, met de staartvin aan de rechterkant om de verbindingen in dezelfde richting te injecteren om de laesies onder controle te houden.
- Injecteer groepen vissen intradermaal, zoals in eerdere studies26, in de spier op 5 mm ten opzichte van de staartvin en onder een hoek van 45° ten opzichte van het lichaam van de vis (film 2). Gebruik de juiste behandeling op dag 0, 3 en 8 zoals eerder beschreven 27 met een spuit van 100 μL uitgerust met een naald van 1 cm, 29 G met 1 μL (met 9 μg/μL eiwit) van I. ricinusspeeksel in 10 μL PBS (tekenspeeksel), 5 μg α-Gal in 10 μL PBS (α-Gal)27, en 10 μl PBS (figuur 3).
OPMERKING: Het hanteren moet snel en zorgvuldig worden gedaan om fysieke schade aan het dier te voorkomen.
Andere biomoleculen in tekenspeeksel kunnen volgens dit protocol worden geëvalueerd. - Plaats de behandelde vis terug in een zoetwatertank zonder verdoving voor herstel.
OPMERKING: Alle vissen van dezelfde groep kunnen in hetzelfde waterreservoir worden geplaatst voor herstel.
5. Zebravissen voeren
- Pureer het hondenvoer met een vijzel en stamper.
- Voer 50-70 μg/vis tweemaal daags om 9.30 uur en 13.30 uur met droog visvoer tot dag 2.
- Voer 50-70 μg/vis tweemaal daags om 9.30 uur en 13.30 uur met gepureerd hondenvoer vanaf dag 2 na de behandelingsinjectie tot het einde van het experiment op dag 8.
OPMERKING: Als immuniteitsmarkers of antilichaamtiters tegen α-Gal- of IgE-antilichamen als reactie op de behandelingen of het voer tijdens de verschillende inentingen moeten worden geëvalueerd, zou voeding nodig zijn tot het einde van het experiment.
6. Evaluatie van allergische reacties, laesies en gedrag bij zebravissen
- Onderzoek het hemorragische type allergische reacties (roodheid van de huid, verkleuring en bloeding) met behulp van een vergrootglas of stereomicroscoop voor nauwkeurigheid en geef de locatie van hun uiterlijk op de vis aan volgens de categorisatie in tabel 1 (figuur 4A).
OPMERKING: De allergische reacties in figuur 4 verschenen na de injectie van tekenspeeksel en de consumptie van diervoeders die rood vlees bevatten. Daarom zijn de beschreven reacties het type reacties geassocieerd met AGS, aangezien vergelijkbare reacties verschijnen in de klinische context.- Observeer of er een reactie optreedt na behandelingen en tijdens het toedienen van voedsel twee keer per dag terwijl de vissen zich in de watertank bevinden.
- Onderzoek het gedrag van de vis door de veranderingen27 in zwempatronen (mobiliteit, snelheid, onbeweeglijk op de bodem van de watertank staan en zigzagzwemmen) te evalueren volgens de categorisatie in tabel 1.
- Evalueer de geaccumuleerde sterfte en rapporteer het aantal dode vissen inclusief het tijdstip / de dag van overlijden (figuur 4B).
OPMERKING: Alle parameters worden direct na de behandeling of na de verandering van voer geëvalueerd en dagelijks gevolgd tot het einde van het experiment op dag 8, waarbij kwalitatieve variabelen worden gecategoriseerd (tabel 1). Als aanbeveling moet deze evaluatie worden uitgevoerd door een professional met kennis van zebravissen om gedragsveranderingen te overwegen op basis van hun achtergrond en ervaring met het werken met dit diermodel. - Bereken het aantal zebravissen per dag met gerapporteerde allergische reacties, abnormaal gedrag en voedingsveranderingen in elke groep en vergelijk tussen groepen door een eenrichtings ANOVA-test.
7. Monsterverzameling
- Euthanaseer de vis door onderdompeling in 0,04% MS-222 op dag 8.
OPMERKING: Verzamel ook de monsters van de vissen die sterven aan allergische reacties tijdens het onderzoek. - Bevestig de vis met spelden op een paraffineplaat.
- Verzamel serum uit de kieuwbloedvaten 29 van de vissen onmiddellijk na euthanasie, wanneer de kieuwen nog steeds worden geïrrigeerd met bloed, met behulp van een spuit van 0,5 ml uitgerust met een naald van 1 cm,29 G. Bewaar het in een tube van 1,5 ml bij -20 °C tot gebruik (film 3).
- Snijd de vis sagittaal met een scalpelmes en evalueer de inwendige laesies (hemorragische laesies of granulomen)27,30 als ze verschijnen.
OPMERKING: Laesies verschijnen niet noodzakelijkerwijs, maar moeten worden geregistreerd als ze dat wel doen. - Verzamel de darm (film 4) en de nier (film 5) van elke vis in afzonderlijke lege buisjes van 1,5 ml, zoals eerder beschreven31, en bewaar ze bij -80 C (figuur 4C).
- Extraheer totaal RNA uit de darm- en niermonsters van de zebravis met behulp van een RNA-zuiveringskit (zie tabel met materialen).
- Analyseer de expressie van genen gerelateerd aan immuunrespons zoals eerder beschreven30,32 (zie tabel 2 voor primersequenties) in zebravissen, waarbij een kwantitatieve reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-qPCR) wordt uitgevoerd met behulp van een omgekeerde transcriptiemix voor RT-qPCR (zie materiaaltabel), volgens de instructies van de fabrikant. Normaliseer de mRNA cT-waarden tegen D. rerio GAPDH en vergelijk tussen groepen (vissen behandeld met speeksel, α-Gal en de PBS-behandelde groepen) met behulp van een Student t-test met ongelijke variantie.
- Bepaal IgM-antilichaamtiters die α-Gal in zebravissen herkennen in serummonsters door ELISA zoals eerder beschreven27,30. Noteer de antilichaamtiters als O.D.450 nm-waarden met behulp van een plaatlezer en vergelijk tussen groepen (vissen behandeld met speeksel, α-Gal en de PBS-behandelde groepen) met behulp van een Student t-test met ongelijke variantie.
OPMERKING: Bepaling van IgM-antilichaamtiters en expressiegenanalyse is optioneel en wordt alleen uitgevoerd als immunologische informatie vereist is. RT-qPCR-mix is een eerstestrengs cDNA-synthesekit voor genexpressieanalyse met behulp van real-time qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op verschillende aspecten van eerder gepubliceerde experimenten27,30 en resultaten uitgevoerd in ons laboratorium waar het zebravismodel is vastgesteld en gevalideerd voor de studie van AGS en de immuunrespons op α-Gal omdat zowel mensen als zebravissen dit molecuul niet synthetiseren13. Dit model maakt de karakterisering en evaluatie mogelijk van een verscheidenheid aan allergische reacties als gevolg van de gastheerrespons op tekenspeeksel (figuur 4) en hun implicatie in AGS. Bovendien worden gedragsveranderingen zoals langzaam zwemmen (film 6), op de bodem van de tank liggen (film 7) en niet eten, trillen of zigzaggende bewegingen (film 8) waargenomen in de vis als reactie op een behandeling met tekenspeeksel die niet wordt waargenomen bij de controlevissen; Deze bevindingen zijn bijzonder significant na toediening van hondenvoer op dag 2. Op dit punt waren de vissen al gesensibiliseerd met alfa-gal en tekenspeeksel en begon de toediening van rood vlees via het voer. Ten slotte wordt een significante incidentie van allergische reacties waargenomen bij vissen die werden behandeld met tekenspeeksel (figuur 4A, B en tabel 3), alleen zebravissen die waren blootgesteld aan tekenspeeksel ontwikkelden allergische reacties, die een snelle desensibilisatie en tolerantie vertoonden. Aan de andere kant ontwikkelden zebravissen gevoed met visvoer in eerdere studies geen zichtbare laesie of reactie27. De gedragsverandering was meer uitgesproken bij de met tekenspeeksel behandelde vissen dan bij alleen α-Gal (figuur 5). Aanvullende analyse van de expressie van de meest representatieve immuunresponsmakers (IFN, TLR 2, IL1 β en AKR2) werd uitgevoerd door RT-PCR (tabel 3), om verschillende immuunresponsen op de behandelingen te bestuderen. De resultaten toonden verschillen tussen zebravisgroepen in de nier, waar de meeste immuunresponsmarkers gedownreguleerd leken te zijn bij vissen behandeld met speeksel en α-Gal in vergelijking met de controlegroep (figuur 6), maar er werden geen significante verschillen gevonden in genexpressie in de darm. Eerdere studies over allergische reacties op verschillende tekenspeekselcomponenten in zebravissen toonden vergelijkbare resultaten27. Bovendien, als representatieve resultaten, ontwikkelden zebravissen behandeld met tekenspeeksel en α-Gal met behulp van dit protocol IgM-antilichamen tegen α-Gal die hogere niveaus vertoonden dan bij vissen behandeld met PBS (figuur 7), zoals werd gevonden in eerdere studies27,30.
Figuur 1: Experimenteel ontwerp voor zebravisproef. Vissen worden intradermaal geïnjecteerd met α-Gal, tekenspeeksel en PBS als negatieve controle. Monsters worden verzameld nadat een vis sterft of aan het einde van het experiment. Monsters kunnen worden gebruikt voor analyse van anti-α-Gal IgM-niveaus en de expressie van geselecteerde immuunresponsgenmarkers door qRT-PCR27. Gedragsveranderingen of allergische reacties worden gedurende het hele experiment geregistreerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Zebravis experimentele faciliteit. De zebravissen worden gehouden in een doorstroomwatersysteem bij 27 °C met een licht/donker cyclus van 14 h/10 h. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Zebravis behandeling injectie. Zebravisbehandelingsinjectie met een 100 μL-spuit uitgerust met een naald van 1 cm, 29 G wordt intradermaal uitgevoerd op een afstand van 5 mm van de staartvin. De vissen worden verdoofd en één voor één behandeld boven een spons gedompeld in warm water. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Bewijs van anafylactische hemorragische reacties bij zebravissen geïnjecteerd met tekenspeeksel en die stierven op dag 2 voorafgaand aan de voedingsverandering. (A) Vissen met allergische reacties in de tank na de behandeling. (B) Vissen die dood zijn aan hemorragische anafylactische reacties (type allergische reactie: verkleuring en roodheid van de huid. (C) Monsterneming. Rode pijlen geven de darm aan en rode cirkels geven de nier aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Gedragspatroon waargenomen bij vissen. Abnormale gedragspatronen bestonden uit langzaam zwemmen, stilstaan op de bodem van de watertank en zigzagzwemmen. Blauwe pijlen geven de tijd van de behandeling aan en de rode pijl geeft de tijd aan om over te schakelen van visvoer naar hondenvoer. Vissen gevoed met hondenvoer werden vergeleken tussen met speeksel behandelde en met PBS behandelde controlevissen door een eenrichtings ANOVA-test (p = 0,05; N = 5 vissen/groep). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Expressie van geselecteerde immuunresponsmarkersin zebravisnieren. Genexpressieanalyse door qRT-PCR in de nier van zebravissen aan het einde van het experiment. De mRNA cT-waarden worden genormaliseerd tegen D. rerio GAPDH, gepresenteerd als gemiddelde ± SD, en vergeleken tussen vissen behandeld met speeksel, α-Gal, en de PBS-behandelde controlegroep door een Student t-test met ongelijke variantie (*p < 0,05; N = 3-7). Dit cijfer is overgenomen van27 en met toestemming gereproduceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: IgM-antilichaamtiters. De IgM-antilichaamtiters van zebravissen tegen α-Gal worden bepaald door ELISA, weergegeven als de gemiddelde ± SD O.D. bij 450 nm en vergeleken tussen vissen behandeld met speeksel, α -Gal, en de PBS-behandelde controlegroep door een Student t-test met ongelijke variantie (*p < 0,005; N = 3-7). Dit cijfer is overgenomen van27 en met toestemming gereproduceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Laesies en gedragspatronen geëvalueerd. Categorisatie van kwalitatieve variabelen. De parameters die kwalitatief worden geëvalueerd zijn verwondingen (op vinnen en schubben), zwemmen, voeren en of de dood van de vis wordt veroorzaakt door de test of door hantering. Als subjectieve overweging is elke variabele gecategoriseerd van zeer mild tot ernstig Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Oligonucleotide primers en gloeitemperaturen voor qRT-PCR. Deze tabel is overgenomen van30 en met toestemming overgenomen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Representatieve resultaten. Records van zebravisallergieën en sterfgevallen en expressie van geselecteerde immuunresponsmarkers worden geanalyseerd door qRT-PCR in de nier en darm van zebravissen. De mRNA cT-waarden worden genormaliseerd tegen D. rerio GAPDH en vergeleken tussen vissen behandeld met speeksel, α -Gal, en de PBS-behandelde controlegroep door een Student t-test met ongelijke variantie (*p < 0,05; N = 3-7). Deze tabel is aangenomen vanaf27,30 en met toestemming overgenomen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Film 1: Verdoofde vis. De verdoofde vis vertoont geen beweging of zwemt niet, maar blijft ademen. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 2: Injectie van de behandeling in de vis. De vissen worden verdoofd op een natte spons geplaatst en in een hoek van 45° ten opzichte van hun lichaam geïnjecteerd met de aangegeven behandeling. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 3: Serumverzameling uit de kieuwbloedvaten. De vis wordt gefixeerd op een paraffineplaat met pinnen en serum wordt verzameld uit de kieuwen met behulp van een spuit van 0,5 ml uitgerust met een naald van 1 cm, 29 G. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 4: Darmverzameling van een geëuthanaseerde vis. De vis wordt sagittaal gesneden met behulp van een scalpelmes en de darm wordt verzameld met een pincet. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 5: Nierverzameling van een geëuthanaseerde vis. De zwemblaas wordt verwijderd en de nier wordt verzameld. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 6: Representatieve gedragsaspecten waargenomen bij behandelde zebravissen. Eén vis liet langzaam zwemmen zien. Alle vissen uit dezelfde groep zitten in dezelfde bak, De video is een voorbeeld om dit gedrag te illustreren, en meerdere vissen kunnen dit gedrag op verschillende momenten van de dag hebben. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 7: Representatieve gedragsaspecten waargenomen bij behandelde zebravissen. Eén vis bleef op de bodem van de tank. Alle vissen uit dezelfde groep zitten in dezelfde bak, De video's zijn een voorbeeld om dit gedrag te illustreren, en meerdere vissen kunnen dit gedrag op verschillende momenten van de dag hebben. Klik hier om deze film te downloaden.
Film 8: Representatieve gedragsaspecten waargenomen bij behandelde zebravissen. Eén vis liet trillend zwemmen zien. Alle vissen uit dezelfde groep zitten in dezelfde bak, De video's zijn een voorbeeld om dit gedrag te illustreren, en meerdere vissen kunnen dit gedrag op verschillende momenten van de dag hebben. Klik hier om deze film te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebravis is een kosteneffectief en gemakkelijk te hanteren model dat ook een zeer haalbaar hulpmiddel is geweest voor de studie van moleculaire mechanismen van de immuunrespons, pathogene ziekten, nieuwe medicijntests en vaccinatie en bescherming tegen infecties33,34,35. De studie over het gedrag van zebravissen is nuttig omdat eerdere studies hebben aangetoond dat sommige vissoorten onbeweeglijk op de bodem van de tank blijven als ze gestrest zijn, wat hun voedselconsumptie beïnvloedt en minder eet; Bovendien kan zigzaggen wanneer ze bewegen ook worden geassocieerd met visstress en angst36,37. De informatie die wordt gegenereerd uit studies door deze parameters in zebravissen te evalueren, zal een fundamenteel begrip bieden van de moleculaire interacties en mechanismen van de teek en gastheer die betrokken zijn bij de immuunrespons van de gastheer op α-Gal die kan leiden tot de ontwikkeling van AGS, inclusief allergie voor de vleesconsumptie van zoogdieren.
Om vals-positieve reacties op het geïnjecteerde molecuul te voorkomen, is het belangrijk om een intradermale injectie niet erg diep uit te voeren, parallel aan het lichaam van de zebravis, en om te evalueren of de vis beschadigd is op het moment van injectie. Een vis met letsel als gevolg van hantering of naaldpenetratie mag niet in de analyse worden opgenomen. Bovendien wordt het ten zeerste aanbevolen dat een professional met kennis van zebravissen gedragsveranderingen zoals zwemmen en voeden evalueert om gedragsveranderingen te overwegen op basis van hun achtergrond en ervaring met het werken met dit model38. Een andere belangrijke overweging is anesthesie; Een adequate dosis is belangrijk voor de optimale conditie van de verzamelde monsters. Bovendien wordt tijdens de injectiebehandeling een meer uitgesproken stressrespons vermeden, wat mogelijke problemen in verband met stressdiagnose kan compenseren29.
De resultaten toonden aan dat het zebravismodel ook de mogelijkheden kon vergroten voor het evalueren van de risico's van het ontwikkelen van AGS na een tekenbeet en andere allergische reacties. Verder kunnen doelen voor de diagnose, behandelingen en preventie van deze allergieën op mensen worden toegepast, omdat deze methode en de parameters die worden geëvalueerd een nauwkeurigere karakterisering van allergische reacties bij zebravissen mogelijk maken.
Met deze methode kunnen andere biogene speekselmoleculen worden geëvalueerd, die verantwoordelijk zijn voor allergische reacties en aanwezig zijn in tekenspeeksel. Het α-Gal-gehalte in tekenspeeksel is eerder gekwantificeerd27, maar het is niet bekend welke andere verbindingen betrokken kunnen zijn bij de ontwikkeling van AGS. Allergische reacties werden waargenomen in groepen die werden behandeld met tekenspeeksel en α-Gal, maar niet in PBS-groepen (tabel 3), maar het gedrag wordt meer beïnvloed in de met tekenspeeksel behandelde groep dan in de α-Gal-groep (figuur 5). Op basis van deze gegevens zou onze hypothese zijn dat andere biomoleculen in combinatie met alfa-Gal betrokken zijn bij AGS, dus verdere experimenten zouden moeten bestuderen welke andere moleculen in speeksel een invloed hebben op deze bevindingen. Bovendien waren anti-alfa-gal-antilichaamtiters significant hoger bij zebravissen behandeld met tekenspeeksel en alfa-gal, die, net als in eerdere studies26,29, een immuunrespons vertoonden op de alfa-gal aanwezig in tekenspeeksel (figuur 7).
Ten slotte bleken immuunresponsmarkers gedownreguleerd in zebravisgroepen behandeld met tekenspeeksel en alfa-gal in vergelijking met met PBS behandelde groep (tabel 3 en figuur 6). Deze resultaten komen overeen met die verkregen in andere studies waar andere AGS-gerelateerde biomoleculen werden getest27, maar in tegenstelling tot eerdere studies25 waar α-Gal KO-muizen in reactie op tekenbeten en roodvleesconsumptie een IgE-respons vertoonden en een upregulated expressie van inflammatoire Toll-like receptor (TLR) en IL-1-signaleringsroutes, wat resulteerde in de activering van de Akr2. Daarom zijn verdere studies nodig om de activeringsroutes van deze reacties op tekenspeeksel en andere biomoleculen in zebravissen te begrijpen die kunnen worden bereikt door de toepassing van deze methodologie.
Vervolgens kan deze methodologie screening mogelijk maken op biomoleculen die alleen of in combinatie allergische reacties veroorzaken en die de immuunrespons van de gastheer kunnen beïnvloeden, wat kan leiden tot allergische ziekten zoals AGS en andere door teken overgedragen allergieën27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen de leden van de SaBio-groep bedanken voor hun samenwerking bij het experimentele ontwerp en de technische assistentie met de visexperimentele faciliteit en Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Spanje) voor het leveren van zebravissen. Dit werk werd ondersteund door Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Spanje en EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras wordt gefinancierd door het Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanje, subsidie IJC2020-042710-I.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food - Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
References
- de la Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13 (18), 6938-6946 (2008).
- de la Fuente, J., et al. Tick-pathogen interactions and vector competence: identification of molecular drivers for tick-borne diseases. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 114 (2017).
- Villar, M., et al. Characterization of tick salivary gland and saliva alphagalactome reveals candidate alpha-gal syndrome disease biomarkers. Expert Review of Proteomics. 18 (12), 1099-1116 (2021).
- Chmelař, J., Kotál, J., Kovaříková, A., Kotsyfakis, M. The use of tick salivary proteins as novel therapeutics. Frontiers in Physiology. 10, 812 (2019).
- Chung, C. H., et al. Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The New England Journal of Medicine. 358 (11), 1109-1117 (2008).
- Van Nunen, S. A., O'Connor, K. S., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans. The Medical Journal of Australia. 190 (9), 510-511 (2009).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Environmental and molecular drivers of the α-Gal syndrome. Frontiers in Immunology. 10, 1210 (2019).
- de la Fuente, J., Pacheco, I., Villar, M., Cabezas-Cruz, A. The alpha-Gal syndrome: new insights into the tick-host conflict and cooperation. Parasites & Vectors. 12 (1), 154 (2019).
- Platts-Mills, T. A. E., et al. On the cause and consequences of IgE to galactose-α-1,3-galactose: A report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases workshop on understanding IgE-mediated mammalian meat allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (4), 1061-1071 (2020).
- Commins, S. P., et al. Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (2), 426-433 (2009).
- Platts-Mills, T. A. E., Schuyler, A. J., Tripathi, A., Commins, S. P. Anaphylaxis to the carbohydrate side chain alpha-gal. Immunology and Allergy Clinics of North America. 35 (2), 247-260 (2015).
- Mateos-Hernández, L., et al. Tick-host conflict: immunoglobulin E antibodies to tick proteins in patients with anaphylaxis to tick bite. Oncotarget. 8 (13), 20630-20644 (2017).
- Galili, U. Evolution in primates by "Catastrophic-selection" interplay between enveloped virus epidemics, mutated genes of enzymes synthesizing carbohydrate antigens, and natural anti-carbohydrate antibodies. American Journal of Physical Anthropology. 168 (2), 352-363 (2019).
- Hilger, C., Fischer, J., Wölbing, F., Biedermann, T. Role and mechanism of galactose-alpha-1,3-galactose in the elicitation of delayed anaphylactic reactions to red meat. Current Allergy and Asthma Reports. 19 (1), 3 (2019).
- Cabezas-Cruz, A., Valdés, J., de la Fuente, J. Cancer research meets tick vectors for infectious diseases. The Lancet. Infectious Diseases. 14 (10), 916-917 (2014).
- Yilmaz, B., et al. Gut microbiota elicits a protective immune response against malaria transmission. Cell. 159 (6), 1277-1289 (2014).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Regulation of the immune response to α-Gal and vector-borne diseases. Trends in Parasitology. 31 (10), 470-476 (2015).
- Weins, A. B., Eberlein, B., Biedermann, T. Diagnostics of alpha-gal syndrome: Current standards, pitfalls and perspectives. Der Hautarzt; Zeitschrift Fur Dermatologie, Venerologie, Und Verwandte Gebiete. 70 (1), 36-43 (2019).
- Commins, S. P., et al. The relevance of tick bites to the production of IgE antibodies to the mammalian oligosaccharide galactose-α-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1286-1293 (2011).
- Fischer, J., Yazdi, A. S., Biedermann, T. Clinical spectrum of α-Gal syndrome: from immediate-type to delayed immediate-type reactions to mammalian innards and meat. Allergo Journal International. 25 (2), 55-62 (2016).
- Hodžić, A., et al. Infection with Toxocara canis inhibits the production of IgE antibodies to α-Gal in humans: towards a conceptual framework of the hygiene hypothesis. Vaccines. 8 (2), 167 (2020).
- Kiewiet, M. B. G., et al. Clinical and serological characterization of the α-Gal syndrome-importance of atopy for symptom severity in a European cohort. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. In Practice. 8 (6), 2027-2034 (2020).
- Steinke, J. W., Platts-Mills, T. A. E., Commins, S. P. The alpha-gal story: lessons learned from connecting the dots. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 589-596 (2015).
- Hashizume, H., et al. Repeated Amblyomma testudinarium tick bites are associated with increased galactose-α-1,3-galactose carbohydrate IgE antibody levels: A retrospective cohort study in a single institution. Journal of the American Academy of Dermatology. 78 (6), 1135-1141 (2018).
- Chandrasekhar, J. L., et al. Cutaneous exposure to clinically relevant lone star ticks promotes IgE production and hypersensitivity through CD4+ T cell- and MyD88-dependent pathways in mice. Journal of Immunology. 203 (4), 813-824 (2019).
- Araujo, R. N., et al. Amblyomma sculptum tick saliva: α-Gal identification, antibody response and possible association with red meat allergy in Brazil. International Journal for Parasitology. 46 (3), 213-220 (2016).
- Contreras, M., et al. Allergic reactions and immunity in response to tick salivary biogenic substances and red meat consumption in the zebrafish model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 78 (2020).
- Poole, N. M., Mamidanna, G., Smith, R. A., Coons, L. B., Cole, J. A. Prostaglandin E(2) in tick saliva regulates macrophage cell migration and cytokine profile. Parasites & Vectors. 6 (2), 261 (2013).
- Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. Blood will tell: what hematological analyses can reveal about fish welfare. Frontiers in Veterinary Science. 8, 616955 (2021).
- Pacheco, I., et al. Vaccination with alpha-gal protects against mycobacterial infection in the zebrafish model of tuberculosis. Vaccines. 8 (2), 195 (2020).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), e1717 (2010).
- Lu, M. -W., et al. The interferon response is involved in nervous necrosis virus acute and persistent infection in zebrafish infection model. Molecular Immunology. 45 (4), 1146-1152 (2008).
- Saralahti, A., et al. Adult zebrafish model for pneumococcal pathogenesis. Developmental and Comparative Immunology. 42 (2), 345-353 (2014).
- Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 7 (3), 312 (2018).
- Katoch, S., Patial, V. Zebrafish: An emerging model system to study liver diseases and related drug discovery. Journal of Applied Toxicology. 41 (1), 33-51 (2021).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Xin, N., Jiang, Y., Liu, S., Zhou, Y., Cheng, Y. Effects of prednisolone on behavior and hypothalamic-pituitary-interrenal axis activity in zebrafish. Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103325 (2020).
- Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2020).
