Summary
様々な光合成生物に関連するプラストグロビュール脂肪滴を単離するための迅速かつ効率的なプロトコルが提示されています。単離されたプラストグロビュールの調製を成功させることは、プロテオミクス解析やリピドミック解析などの詳細な分子調査に先立つ重要な第一歩です。
Abstract
プラストグロビュール脂肪滴は、植物の葉緑体とシアノバクテリアの動的なサブコンパートメントです。光合成種に遍在しており、急速に変化する環境条件下でのチラコイド膜の適応とリモデリングにおいて中心的な役割を果たすと考えられています。高純度のプラストグロビュールを単離する能力は、プロテオミクス、リピドミック、およびその他の方法論による研究を大幅に促進しました。高純度と高収率のプラストグロビュールを使用すると、脂質やタンパク質の組成、酵素活性、タンパク質トポロジーなどの分子特性を調べることができます。この記事では、植物の葉組織の葉緑体からプラストグロビュールを分離するための迅速かつ効果的なプロトコルを提示し、トウモロコシの葉、復活植物の乾燥葉組織、 エラグロスチスニンデンシス、およびシアノバクテリウム、 シネコシスティス からプラストグロビュールおよび関連する脂肪滴構造を単離するための方法論的バリエーションを提示します PCC 6803。単離は、これらの脂質に富む粒子の低密度に依存しており、スクロース密度浮遊選鉱による精製を容易にします。この方法論は、多様な種からのプラストグロビュールの研究において有用であることが証明されます。
Introduction
プラストグロビュールの組成と機能の現在の理解は、詳細なプロテオミクスおよびリピドミクス研究を通じて明らかになりました1,2,3,4,5。このような研究は、スクロース勾配を使用した効率的な分離のために非常に低い密度に依存する迅速かつ効果的な単離方法によって大いに助けられてきました。プラストグロビュールの分離の初期方法は、ブナの木(Fagus sylvatica)、スコッチほうき(Sarothamnus scoparius)、タマネギ(アリウムセパ)、ほうれん草(Spinacia oleracea)、パンジー(Viola tricolor)、コショウ(トウガラシ)、エンドウ豆(Pisum sativum)などの種から達成されました6,7,8,9,10,11 、12、13。葉緑体プラストグロビュールをより効率的かつより良い収量で単離するための更新された方法は、後にYtterbergらによって提示されました3,14。当初はシロイヌナズナの葉葉緑体のプラストグロビュールの研究に採用されていましたが、トウモロコシ(Zea mays)、トマト(Solanum lycopersicum)、ラブグラス(Eragrostis nindensis)、紫色の偽ブロム(Brachypodium distachyon)、野生のタバコ(Nicotiana benthamiana)など、単子葉植物と双子葉植物の両方の健康な葉組織にこの更新された方法を採用することに成功しました。;未発表の結果)。さらに、この分離法は、Synechocystis sp. PCC 6803およびAnabaena sp. PCC 712015を含むシアノバクテリアのプラスト小球、および復活植物E. nindensisの乾燥葉組織に適応することに成功しています。
健康な葉組織の葉緑体プラストグロビュールは、チラコイド膜16に物理的に接続されている。この物理的連続性にもかかわらず、2つの葉緑体サブコンパートメントは異なる脂質およびタンパク質組成を維持するが、2つのコンパートメント間の脂質およびタンパク質の調節された交換が提案されている2,4,17,18,19。実際、葉緑体と細胞質ゾルの間の中性脂質の輸送について、興味深い半融合モデルが最近提案されています19。プラストグロビュールおよびチラコイドの物理的連続性のために、健康な葉組織を有する単離方法は、ペレット化された粗チラコイド調製物の収集から始まり、その後、細胞質ゾル脂肪滴を単離するために使用される方法とは対照的に、チラコイドからプラストグロビュールを分離するために超音波処理される20.次に、スクロースクッション上での超遠心分離により、低密度プラストグロビュールがスクロースを通って浮遊し、チラコイド、核、およびその他の高密度材料から効果的に分離されます。対照的に、シアノバクテリアのプラストグロビュールは、乾燥した葉組織のプラストグロビュールと同様に、明らかに自由に浮遊する形で生体内に存在する。したがって、それらの単離は、スクロース勾配に直接浮遊することを含む。この記事では、健康な葉組織からの分離方法を示し、さらに、乾燥した葉組織またはシアノバクテリア培養物からプラストグロビュールを分離するために使用できる2つのバリエーションを示し、プラストグロビュールを研究できる生理学的幅と進化のコンテキストを大幅に拡大します。
単離されたプラストグロビュールは、その後、分子特性を調査するための任意の数のダウンストリーム分析に使用できます。我々は、A. thaliana葉組織から単離されたプラストグロビュールを、異なる環境条件または遺伝子型の下での広範なプロテオミクスおよびリピドミクス解析に使用し、ストレスに適応したタンパク質および脂質組成の選択的修飾を実証しました2,4,21,22。さらに、単離されたプラストグロビュールに関連するトランスリン酸化活性を示すインビトロキナーゼアッセイが実施されており22、タンパク質成分のオリゴマー状態が天然ゲル電気泳動を使用して調査されており21、プロテアーゼシェービングアッセイが実施されています23。
この方法の主な利点は、手順の相対的な速度です。私たちの経験では、以下に概説するプロトコルは約4時間以内に完全に完了することができます。葉組織からプラストグロビュールを単離する代替方法が記載されており、これにより、他の葉緑体サブ区画の同時単離が可能になる24。この代替方法は、他の葉緑体サブコンパートメントとの定量的比較が必要または望ましい場合に、いくつかの明確な利点を提供します。しかしながら、この代替方法もまたより面倒であり、そして同量の葉組織から単離されたプラスト小球の有意に低い収量を提供するであろう。プラストグロビュースの焦点を絞った研究が目的である場合、ここで概説する方法論が最適な選択です。それにもかかわらず、全葉および粗チラコイドアリコートはサンプル調製中に収集することができ、その後の比較のために参照サンプルを用意することを強くお勧めします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.粗いプラストグロビュールの分離
- ストレスを受けていないトウモロコシ葉組織からの粗プラストグロビュール抽出
- 約3週齢で、ほぼV5の成長段階にあり、重さ約120gの健康なトウモロコシの苗6本を取得します。
- 茎の根元にあるすべての葉を切り取り、氷浴にすばやく浸して、冷蔵室に運びます。
- 緑色の安全ランプの下で作業し、氷浴からトウモロコシの葉を取り除き、はさみを使用してそれらをより小さな断片(約5 cm x 5 cm)に切り取ります。
- クリップされた葉組織の半分を市販のブレンダーで350 mLの粉砕バッファーで穏やかに、しかし徹底的に粉砕します(表1)。ブレンダー5x-6xを開始停止して、すべての葉がカットされていることを確認します。ブレンダーでレベル7より高いものを使用しないでください。
- ホモジネートを大きな漏斗上の25 μmナイロンクロスの1層を通して4本の250 mL遠心分離機ボトルにろ過します。次に、切り取られた葉組織の後半で手順1.1.4を繰り返します。
- ろ液を4本のボトルに均等に分け、4°Cで1,840 x g で6分間遠心分離します。 葉のろ液のアリコートを取り除き、遠心分離の前に取っておき、代表的な全葉サンプルとして保存します。
- 得られた上清を注ぎ、ブラシを穏やかに動かしながら旋回させて再懸濁することにより、0.2 Mスクロース(表1)を含む12 mLの培地R 0.2にペレットを静かに再懸濁します。各ペレットを再懸濁した後、懸濁液を次のボトルに運び、再懸濁を繰り返します。懸濁液を1本のボトルにプールします。
- プールされた懸濁液を6本の3 mL超遠心チューブに分配し、各チューブの最大容量2.5 mLに達します。
- 各チューブを4回超音波処理し、毎回10秒間、100%の振幅でチップ超音波処理器を使用します。泡立ちを防ぐために、超音波処理器ホーンを液面から沈め、離しておくように注意してください。
- 各ラウンド中にサスペンション内で超音波処理器ホーンをゆっくりと上下に動かします。4つのチューブを交互に使用し、各チューブを各超音波処理後にアイスバケットに戻し、サンプルを冷却します。
- 超音波処理された粗チラコイド懸濁液を150,000 x g で4°Cで30分間遠心分離する。 得られた粗プラストグロビュールのフローティングパッドを、注射器と22 G針を使用して、針の開口部でクッションの表面をすくい取り、各チューブから約500 μLを回収することにより、スクロースクッション(黄色の油性パッドとして容易に見える)から回収します。2.0 mLチューブに注入します。
- プラストグロビュールの超音波処理および放出の前後に粗チラコイドのアリコートを収集する。ステップ 2.1 に進みます。あるいは、粗プラストグロビュールを-80°Cで保存し、後で精製します。
- 乾燥 E.ニンデンシス 葉組織からの粗プラストグロビュール抽出
- 完全に乾燥した8〜9週齢の E.ニンデンシス (約40 gの組織)のポット(ポットごとに3つの個々の植物で構成される)を取得します。
- はさみを使用して、土壌のすぐ上の植物の根元からすべての葉の組織を切り取り、すぐに氷浴で組織を浸します。ティッシュを冷蔵室に運びます。
- 緑色の安全ランプの下で作業し、 Eを切り取ります。 ニンデンシスは ハサミを使って小さな断片(約5 cm x 5 cm)に葉を出します。
- 市販のブレンダーで100 mLの粉砕バッファー(表1)で葉を穏やかに、しかし徹底的に粉砕します。ブレンダーを数回開始停止して、すべての葉がカットされていることを確認します。ブレンダーでレベル7より高いものを使用しないでください。
- ホモジネートを大きな漏斗上の25 μmナイロン布の1つの層を通して250 mLのコニカルフラスコにろ過します。葉のろ液のアリコートを取り除き、遠心分離の前に取っておき、代表的な全葉サンプルとして保存します。
- 適量のスクロースを加えて最終濃度を0.5 Mにし、溶液を250 mL遠沈管に分配します。
注: Z.メイズ 調製物と比較して高濃度のスクロースは、チラコイド結合プラストグロビュールのその後の超音波処理/放出の前に細胞質脂質液滴の浮遊選鉱を確実にするために使用されます。 - チューブを45,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。 プラストグロビュールと細胞質脂肪滴の混合物は、ショ糖クッションの表面またはその近くに黄色の油性パッドとして容易に見られます(図1B)。針の開口部でクッションの表面をすくい取って22G針を備えたシリンジを使用して浮遊物を収集し、チューブに堆積させます。
- 自由に浮遊するプラストグロビュール/脂肪滴混合物を収集した後、残りの上清を廃棄します。
- 残留チラコイドに接続されたプラストグロビュールを単離するには、ブラシを穏やかに動かして旋回させて再懸濁することにより、ペレットを12 mLの培地R 0.2に再懸濁します。懸濁液を1本のボトルにプールします。ステップ 1.1.8 に進みます。
- シアノバクテリアからの粗プラストグロビュール抽出
- シネコシスティスsp. PCC 6803の50 mL培養物を固定期(約7〜10日)に成長させ、分光光度計を使用して細胞密度をOD750 2.0に調整します。培養条件については、BG-11培地を使用し、インキュベーター内で150 μmol光子/m 2/s、2%CO2、32°Cの光強度で、150 rpmで連続的に振とうしながら増殖させます。
- 多糖類を除去するには、50 mL培養液を6,000 x g で4°Cで45分間遠心分離し、続いて上清を除去して細胞を洗浄します。引き続き、50 mLのバッファーAで細胞を2回洗浄します(表1)。細胞ホモジネートのアリコートを除去し、遠心分離前に取っておき、代表的な全細胞サンプルとして保存します。
- 洗浄したペレットを25 mLのバッファーAに再懸濁し、1,100 psiのフレンチ圧力セルを使用して細胞を破壊し、溶解した色が白色光の下で緑から赤青緑に変わるまで、このプロセスを3回繰り返します(タンパク質の変性を避けるために、各サイクルの間にサンプルを氷上に置きます)。予冷セルを使用して、冷蔵室でこの手順を実行します。
- 得られたホモジネートを、各チューブに最大2.5 mLまで充填した8本の3 mL超遠心チューブに分配し、400 μLの培地Rを注意深く重ねて、ステップグラジエントを生成します。
注:スクロース勾配調製の詳細な説明については、YangらおよびKelekarらを参照してください25,26。 - 必要に応じて培地Rを追加してチューブのバランスを慎重に取り、4°Cで150,000 x g で30分間遠心分離します。 チラコイドおよび他のより重い細胞小器官(ポリヒドロキシアルカノエート体を含む)はペレット状になり、プラスト小球はスクロース勾配の上部またはその近くにある黄色の油性パッドとして容易に見られます(図1C)。
- 得られた粗プラストグロビュールのフローティングパッドをシリンジと22G針で収穫し、2mLチューブに堆積させます。必要に応じて、針先で超遠心管壁の側面からプラストグロビュールをこすり落とします。
- ステップ 2.2 に進みます。あるいは、粗プラストグロビュールを-80°Cで保存し、後で精製します。
2.純粋なプラストグロビュールの収穫
- 植物組織処理
- 最初にステップ1.1またはステップ1.2から500 μLの粗プラストグロビュールを500 μLの培地R 0.7と混合して総容量1 mLにし、次に400 μLの培地R 0.2をオーバーレイし、次に400 μLの培地Rでオーバーレイすることにより、2.5 mL超遠心チューブでスクロースグラジエントを生成します。
注:スクロース勾配調製の詳細な説明については、YangらおよびKelekarらを参照してください25,26。 - 必要に応じて、余分な培地Rを最上層に追加して、チューブのバランスを慎重に取ります。その後、150,000 x g で 4 °C で 1.5 時間遠心分離します。
- 得られた純粋なプラストグロビュールのフローティングパッド(図1A)をシリンジと22G針で回収し、2 mLチューブに堆積させます。必要に応じて、遠心管の壁の上部からプラストグロビュールを針先でこすり落とします。
- 純粋なプラストグロビュールを分注し、液体窒素中で瞬間凍結します。-80°Cで直接保存するか、凍結乾燥して乾燥粉末にします。
- 最初にステップ1.1またはステップ1.2から500 μLの粗プラストグロビュールを500 μLの培地R 0.7と混合して総容量1 mLにし、次に400 μLの培地R 0.2をオーバーレイし、次に400 μLの培地Rでオーバーレイすることにより、2.5 mL超遠心チューブでスクロースグラジエントを生成します。
- シアノバクテリア処理
- 4本の2.5 mL超遠心チューブに、最初にステップ1.3の粗プラストグロビュール500 μLを750 μLの培地R 0.7と混合し、次に750 μLの培地R 0.2と重ね合わせたスクロース勾配を生成します。
注:スクロース勾配調製の詳細な説明については、YangらおよびKelekarらを参照してください25,26。 - スクロースグラジエントを150,000 x g で4°Cで90分間遠心分離します。 スクロース勾配の上相からシリンジと22 G針で純粋なプラストグロビュール(図1C)を収集し、1.5 mLチューブに移します。
- 純粋なプラストグロビュールを分注し、液体窒素でフラッシュフリーズします。-80°Cで直接保存するか、凍結乾燥して乾燥粉末にします。
- 4本の2.5 mL超遠心チューブに、最初にステップ1.3の粗プラストグロビュール500 μLを750 μLの培地R 0.7と混合し、次に750 μLの培地R 0.2と重ね合わせたスクロース勾配を生成します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
プロトコルのステップ1が完了すると、かなりの量のプラストグロビュール/脂質液滴物質がスクロースクッションの最上層(またはその近く)に浮かんでいるのを容易に見ることができるはずです(図1B-C)。この段階で他の画分も収集できます。例えば、チラコイドはペレット化され、その後の分析のために培地R 0.2で再懸濁することができる。その後の遠心分離後、図1A、Cに示すように、スクロース勾配の表面またはその近くで精製プラストグロビュールが得られます。特定の状況(特定の遺伝子型系統や環境条件など)では、プラストグロビュールが勾配の異なる層で分離する2つの異なる亜集団として分離することがわかっています:勾配表面の低密度画分と、上位2つの勾配層間の界面に沈降する2番目の高密度画分。分離画分の慎重な比較分析はこれまで行われていませんが、これらの亜集団は異なるサイズのプラストグロビュールを表している可能性があり、直径が小さい(したがって、表面積対体積比およびタンパク質対脂質比が大きい)ものは、勾配でより低く沈降します。
失敗した試みでは、最初の遠心分離ラウンド後にスクロースクッションの表面に目に見えるプラストグロビュールがほとんどまたはまったく見られません。十分なプラストグロビュールを正常に分離できないのは、最適化が必要ないくつかの要因に依存する可能性があります。特に、超音波処理技術(健康な葉の組織を使用する場合)は、成功に大きな影響を与える可能性があります。さらに、植物/シアノバクテリア材料の必要な量は、特定の種とそのストレス条件に依存します。
プラストグロビュールの単離に成功した後、プラストグロビュールおよびチラコイド(一次汚染コンパートメント)のマーカータンパク質のイムノブロッティングを使用して、単離されたプラストグロビュールの純度を検証することが可能です。図1Dでは、プラストグロビュール2のマーカーとしてA.タリアナFBN1aに対して、およびチラコイド27のマーカーとしてA.タリアナ光化学系IIサブユニットD1に対して産生された抗体を用いて、代表的なイムノブロットが見られます。Synechocystis sp. PCC 6803のFBNホモログは、主にプラストグロビュールではなくチラコイドと関連しています。
また、意図した下流の研究に依存する可能性のある保管方法も慎重に検討する必要があります。特にプレニル脂質色素脂質の下流分析では、光不安定化合物の損傷を避けるために、サンプルの直接光への曝露を最小限に抑えることが重要です。精製されたプラストグロビュールは、リピドミックまたはプロテオミクスベースの実験などのダウンストリーム実験に使用できます。プラストグロビュールは、タンパク質対脂質比が非常に低いことを特徴とし、これは、それらの低密度およびスクロース上に浮遊する能力として現れる。したがって、プラストグロビュールサンプルの低タンパク質濃度は正常です。このため、SDS-PAGEによるタンパク質分離の前に、アセトンタンパク質沈殿またはクロロホルム/メタノール抽出を使用して脂質を除去することをお勧めします。
図1:プラストグロビュールとチラコイドの単離とイムノブロッティング 。 (A)スクロース勾配からの抽出前の Z.mays からの代表的な精製プラストグロビュールサンプル。(B)スクロースクッションからの抽出前の乾燥 E.ニンデンシス からの代表的な粗プラストグロビュールサンプル。(C) Synechocystis sp. PCC 6803からの代表的な粗(左)および純粋な(右)プラストグロビュールサンプルを、ロードされたスクロースクッションおよび勾配の超遠心前後の両方をそれぞれ示す。(D)抗フィブリリン1a抗体(α-FBN1a)を用いて、高等植物におけるプラストグロビュールのマーカータンパク質であるフィブリリンの蓄積をモニターした。フィブリリンオルソログは、シアノバクテリアの単離されたチラコイドに主に蓄積します(Synecho、 Syenchocystis sp. PCC 6803)。抗光化学系IIサブユニットD1(α-PsbA)を使用して、プラストグロビュール単離からのチラコイドの枯渇を検証しました。各レーンに、5μgのチラコイドおよび10μgのプラストグロビュールタンパク質が装填された。略語:PG =プラストグロビュール;あなた=チラコイド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 緩衝 液組成物 | |
| 研削バッファー | 50 mM ヘペスコー (pH 8.0) |
| 5 mM マグネシウムCl2 | |
| 100 mMソルビトール | |
| 5 mM アスコルビン酸b | |
| 5 mM還元システイン b | |
| 0.05 % (w/v) BSA b | |
| ミディアムR | 50 mM ヘペスコー (pH 8.0) |
| 5 mM マグネシウムCl2 | |
| ミディアムR 0.2 | 50 mM ヘペスコー (pH 8.0) |
| 5 mM マグネシウムCl2 | |
| 0.2 M スクロース | |
| ミディアムR 0.7 | 50 mM ヘペスコー (pH 8.0) |
| 5 mM マグネシウムCl2 | |
| 0.7 M スクロース | |
| バッファ A | 25 mM ヘペスコー (pH 7.8) |
| 250 mMショ糖 | |
| 各 緩衝成分の最終濃度が提供されます。 | |
| b 隔離当日に新鮮に追加する必要があります。バッファーは単離の前日に調製できますが、これらの特定の成分は、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤と同様に、分離の日に新鮮に添加する必要があります。 | |
表1:植物の葉組織またはシアノバクテリアからのプラストグロビュール単離のためのバッファーレシピ。
| ホスファターゼ阻害剤カクテル b | |
| 阻害 剤 | 最終計算 (mM) |
| Na-フルオリド | 50 |
| β-グリセロリン酸⋅2Na⋅5H2O | 25 |
| Na-オルトバナジン酸塩 | 1 |
| ピロリン酸Na・10H2O | 10 |
| b ホスファターゼ阻害剤は、単離当日に新たに添加する必要があります。 | |
表2:ホスファターゼ阻害剤カクテル。
| プロテアーゼ阻害剤カクテルA | ||||
| 阻害 剤 | 在庫 (ミリグラム/ミリリットル) | ストックミディアム | 希釈係数 | 最終濃度 (mg/mL) |
| 抗疼痛・2塩酸 | 20 | 水 | 400倍 | 50 |
| ベスタチン | 1 | 0.15 M 塩化ナトリウム | 25倍速 | 40 |
| キモスタチン | 20 | ティッカー | 2000倍 | 10 |
| E-64 | 20 | 水 | 2000倍 | 10 |
| ロイペプチン(硫酸ヘミ) | 20 | 水 | 4000倍 | 5 |
| P-ラミドン⋅2Na | 20 | 水 | 2000倍 | 10 |
| AEBSF | 50 | 水 | 1000倍 | 50 |
| アプロチニン | 10 | 水 | 5000倍 | 2 |
| a プロテアーゼストック溶液は、長期保存のために少量のアリコートで-20°Cで保存する必要があります。解凍し、単離する直前に適切なバッファーに新鮮に加えます。 | ||||
表3:プロテアーゼ阻害剤カクテル。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
材料に対する生理学的/生化学的変化を最小限に抑え、プラストグロビュールの豊富な成分である特定の光および熱に不安定なプレニル脂質色素を保護するには、4°Cで光から保護するために分離を行うことが重要です。上記のように、最初のステップは、緑色に発光する電球を使用して、安全ランプの下の冷蔵室で実行されます。実験室で行われる後続のステップは、薄暗い照明の下で行われ、氷または冷蔵遠心分離を使用します。同様の理由から、新鮮なプロテアーゼ阻害剤(およびタンパク質のリン酸化調節の研究に関心がある場合はホスファターゼ阻害剤)を含めることが重要です(表2 および 表3)。
他の方法(例えば、Dounceホモジナイザー、凍結融解サイクル)は、原則として、高等植物葉緑体のチラコイドからプラストグロビュールを放出するために採用することができるが、超音波処理は、最高の収量および純度を提供する上ではるかに優れていることが見出されている(未発表の結果)。超音波処理は、チラコイドラメラまたは小胞体から人工小胞を作成することがあります。ただし、これらの小胞は非常にタンパク質が豊富であるため、密度が高く、スクロース勾配での浮遊選鉱が妨げられます。
スクロース勾配から純粋なプラストグロビュールのフローティングパッドを抽出する場合、それらを可能な限り最小量の培地Rで抽出することが有益である。この方法で濃縮プラストグロビュールを取得すると、必要なサンプル量を最小限に抑えることで、下流の研究が容易になります。注射器と22 G針の使用は、プラストグロビュールを抽出するための最も効果的な戦略です。それらの疎水性、脂質が豊富な性質のために、それらは非常に粘着性であり、そしてピペットチップまたはへらの使用は絶対に避けるべきである。固着によるプラストグロビュールの損失は、注射器と針で最小限に抑えるのが最善であることがわかっていますが、抽出中の損失を完全に防ぐことは不可能であるように思われます。
ショ糖勾配の表面またはその近くに、見やすい黄色のクリーミーなプラストグロビュールの層が浮かんでいるのが見られない場合は、分離に不十分な植物/シアノバクテリア材料が使用されている可能性があります。単子葉植物は、同等の量の植物組織から双子葉植物よりも高いプラストグロビュール収量を与えることがわかっています(未発表の結果)。この記事で例示されている特定の単離については、適切な量の出発生物材料が示されていますが、効率的な抽出に必要な組織の量は、生物の種、組織、および環境条件に基づいて経験的に決定する必要があります。一般に、ストレスを受けた(壊死ではない)葉組織またはシアノバクテリア培養物は、プラストグロビュールのより高い収量を与えるであろう。A. thaliana葉組織を使用する場合、栄養成長中期からのA. thaliana植物の2つのフラット(約140の個々の植物)は、特に植物材料が軽度のストレス処理によって、例えば軽いストレス処理によって軽度のストレスを受けている場合、プラスト小球の単離に典型的に十分である2,4。低収率の代替説明として、ブレンダーによる葉組織の初期均質化が活発すぎて、プラストグロビュールをチラコイドから時期尚早に分離したか、または粗チラコイド材料の超音波処理が十分に活発でなかった可能性があり、浮遊選鉱前にプラストグロビューを効果的に放出することはできません(これらの点は、シアノバクテリアから抽出する場合の問題ではありません。 その場で自由に浮かんでいます)。
プラストグロビュールの分離は、組織サンプルからのプラストグロビュールの大部分を表すことを覚えておくことが重要です。したがって、脂質、タンパク質、または機能における可能性のある不均一性は、その後の研究から識別できません。この制限のために、個々のプラストグロビュール脂肪滴の間にどれだけの不均一性が存在するかを測定することは不可能であった。しかし、複数の生物からの植物の葉組織の透過電子顕微鏡写真は、同じ葉緑体内でも、プラストグロビュール間で異なる染色パターンを明らかにします28,29,30,31。これは脂質含有量の不均一性を強く示唆しているが、その性質や目的は不明のままである。重要なことに、単離されたA. thalianaプラストグロビュールの電子顕微鏡写真は、この単離方法がより大きなまたはより小さなプラストグロビュールの単離に偏っていないことを示しています2。
純粋なプラストグロビュールの単離は、それらの詳細な分子特性評価に向けた最初のステップを表しています。その後、治験責任医師の特定の関心および目的に応じて、多数の下流出願を実施することができる。例えば、脂質またはタンパク質組成を調べるために、単離されたサンプルは、プロテオミクスまたはリピドミック研究に容易に従順である。ゲル内消化アプローチは、プラストグロビュールサンプルのボトムアッププロテオミクス研究に好まれています。ただし、脂質はタンパク質に比べて非常に過剰であるため、脂質はSDS-PAGE分離を妨げる可能性があります。アセトンを使用したタンパク質の最初の沈殿と、その後のLaemmli可溶化バッファーへの再懸濁により、ほとんどの脂質が除去され、SDS-PAGE分離ゲル中のタンパク質の効率的な分離が可能になります。タンパク質ペレットを100 mM tris-HClバッファーおよび2% SDSに初期再懸濁することで、還元剤、色素、およびグリセロールを添加する前に、ビシンコニン酸法によりタンパク質含有量を正確に測定できます。同様に、ブライ・アンド・ダイアー法などの液液相分離法を用いた脂質精製は、下流のリピドミック分析に適している32。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
ルンドキスト研究室グループの研究は、NSF(MCB-2034631)およびUSDA(MICL08607)からP.K.L.への助成金によってサポートされています。著者らは、シアノバクテリアプラストグロビュール分離法の開発を支援してくれたキャリー・ハイザー博士(MSU)に感謝の意を表します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K.
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
