Summary
En rask og effektiv protokoll presenteres for isolering av plastoglobule lipiddråper assosiert med ulike fotosyntetiske organismer. Vellykket fremstilling av isolerte plastoglobuler er et avgjørende første skritt som går foran detaljerte molekylære undersøkelser som proteomiske og lipidomiske analyser.
Abstract
Plastoglobule lipiddråper er et dynamisk underrom av plantekloroplaster og cyanobakterier. Funnet allestedsnærværende blant fotosyntetiske arter, antas de å tjene en sentral rolle i tilpasning og ombygging av thylakoidmembranen under raskt skiftende miljøforhold. Kapasiteten til å isolere plastoglobuler med høy renhet har i stor grad lettet studien gjennom proteomiske, lipidomiske og andre metoder. Med plastoglobuler med høy renhet og utbytte er det mulig å undersøke deres lipid- og proteinsammensetning, enzymatisk aktivitet og proteintopologi, blant andre mulige molekylære egenskaper. Denne artikkelen presenterer en rask og effektiv protokoll for isolering av plastoglobuler fra kloroplaster av plantebladvev og presenterer metodologiske variasjoner for isolering av plastoglobuler og relaterte lipiddråpestrukturer fra maisblader, oppstandelsesplantens uttørkede bladvev, Eragrostis nindensis og cyanobakterien, Synechocystis. sp. PCC 6803. Isolasjon er avhengig av den lave tettheten av disse lipidrike partiklene, noe som letter rensingen ved sukrosedensitetsflotasjon. Denne metoden vil vise seg verdifull i studiet av plastoglobuler fra ulike arter.
Introduction
Den nåværende forståelsen av plastoglobule sammensetning og funksjon har dukket opp gjennom detaljerte proteomiske og lipidomiske studier 1,2,3,4,5. Slike studier har blitt sterkt hjulpet av en rask og effektiv isolasjonsmetode som er avhengig av deres svært lave tetthet for effektiv separasjon ved bruk av sukrosegradienter. Innledende metoder for plastoglobuleisolasjon ble oppnådd fra arter som bøketreet (Fagus sylvatica), scotch kost (Sarothamnus scoparius), løk (Allium cepa), spinat (Spinacia oleracea), stemorsblomst (Viola tricolor), pepper (Capsicum annuum) og ert (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. En oppdatert metode for å isolere kloroplastoglobuler på en mer effektiv og bedre avgivende måte ble senere presentert av Ytterberg et al.3,14. Mens vi opprinnelig ble ansatt for studiet av plastoglobulene til Arabidopsis thaliana bladkloroplaster, har vi med hell brukt denne oppdaterte metoden for det sunne bladvevet til andre plantearter, både monocot og dicot, inkludert mais (Zea mays), tomat (Solanum lycopersicum), lovegrass (Eragrostis nindensis), lilla falsk brom (Brachypodium distachyon) og vill tobakk (Nicotiana benthamiana ; upubliserte resultater). Videre har isolasjonsmetoden blitt vellykket tilpasset plastoglobulene til cyanobakterier, inkludert Synechocystis sp. PCC 6803 og Anabaena sp. PCC 712015, og det uttørkede bladvevet til oppstandelsesplanten, E. nindensis.
Kloroplast plastoglobuler av sunt bladvev er fysisk forbundet med thylakoidmembranene16. Til tross for denne fysiske kontinuiteten opprettholder de to kloroplastunderrommene distinkte lipid- og proteinsammensetninger, selv om den regulerte utvekslingen av lipid og protein mellom de to rommene er foreslått 2,4,17,18,19. Faktisk har en interessant hemifusjonsmodell nylig blitt foreslått for handel med nøytrale lipider mellom kloroplaster og cytosol19. På grunn av den fysiske kontinuiteten til plastoglobuler og thylakoider begynner isolasjonsmetoden med sunt bladvev med innsamling av et pelletert rå tylakoidpreparat, som deretter sonikeres for å skille plastoglobulene fra thylakoider, som er i motsetning til metoder som brukes til å isolere cytosoliske lipiddråper20 . Ultracentrifugering på en sukrosepute flyter deretter plastoglobulene med lav tetthet opp gjennom sukrose, og separerer dem effektivt fra thylakoider, kjerner og annet materiale med høy tetthet. I motsetning til dette eksisterer plastoglobuler i cyanobakterier, så vel som de av uttørket bladvev, tydeligvis in vivo i frittflytende form. Derfor innebærer deres isolasjon direkte flytende på en sukrosegradient. Denne artikkelen demonstrerer isolasjonsmetoden fra sunt bladvev og demonstrerer videre to variasjoner som kan brukes til å isolere plastoglobuler fra uttørket bladvev eller cyanobakterielle kulturer, og utvider den fysiologiske bredden og evolusjonær konteksten der plastoglobuler kan studeres.
Isolerte plastoglobuler kan senere brukes til et hvilket som helst antall nedstrømsanalyser for å undersøke molekylære egenskaper. Vi har brukt de isolerte plastoglobulene fra A. thaliana bladvev for omfattende proteomisk og lipidomisk analyse under forskjellige miljøforhold eller genotyper, og demonstrerer selektiv modifisering av protein- og lipidsammensetning i tilpasning til stress 2,4,21,22. I tillegg er det utført in vitro-kinaseanalyser som viser transfosforyleringsaktivitet assosiert med isolerte plastoglobuler22, de oligomere tilstandene til proteinkomponenter er undersøkt ved hjelp av innfødt gelelektroforese 21, og proteasebarberingsanalyser er utført 23.
Den primære fordelen med denne metoden er den relative hastigheten på prosedyren. Etter vår erfaring kan protokollene som er skissert nedenfor, fullføres fullt ut innen ca. 4 timer. En alternativ metode for å isolere plastoglobuler fra bladvev er beskrevet, noe som muliggjør samtidig isolering av andre kloroplastunderrom24. Denne alternative metoden gir noen klare fordeler når kvantitativ sammenligning med de andre kloroplastunderrommene er nødvendig eller ønsket. Imidlertid er denne alternative metoden også mer kjedelig og vil gi et betydelig lavere utbytte av isolerte plastoglobuler fra sammenlignbare mengder bladvev. Når en fokusert studie av plastoglobuler er målet, er metodikken som er skissert her det optimale valget. Ikke desto mindre kan totalt blad og rå thylakoid aliquots samles under prøveprepareringen, og det anbefales sterkt å gjøre det, for å ha referanseprøver for senere sammenligning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolasjon av rå plastoglobule
- Rå plastoglobuleekstraksjon fra ustresset maisbladvev
- Oppnå seks sunne maisplanter ca 3 uker gamle og nesten på V5-vekststadiet, veier ca 120 g.
- Klipp av alle bladene ved foten av stammen, dunk dem raskt i et isbad og transport til kjølerommet.
- Arbeid under en grønn sikkerhetslampe, fjern maisbladene fra isbadet og klipp dem i mindre biter (rundt 5 cm x 5 cm) ved hjelp av saks.
- Slip forsiktig, men grundig halvparten av det klippede bladvevet i en kommersiell blender i 350 ml slipebuffer (tabell 1). Start-stopp blenderen 5x-6x for å sikre at alle bladene er kuttet. Ikke bruk høyere enn nivå 7 på blenderen.
- Filtrer homogenatet gjennom ett lag med 25 μm nylonduk på en stor trakt i fire 250 ml sentrifugeflasker. Gjenta deretter trinn 1.1.4 med andre halvdel av det klippede bladvevet.
- Del filtratet jevnt mellom de fire flaskene og sentrifugen i 6 minutter ved 1 840 x g ved 4 °C. Fjern en aliquot av bladfiltratet og sett den til side før sentrifugering som skal lagres som en representativ total bladprøve.
- Hell av den resulterende supernatanten og resuspender pelleten forsiktig i 12 ml medium R 0,2 som inneholder 0,2 M sukrose (tabell 1) ved å virvle og resuspendere med forsiktige bevegelser av børsten. Etter at hver pellet er resuspendert, bærer du suspensjonen over til neste flaske og gjentar resuspenderingen. Samle suspensjonene i en flaske.
- Fordel den samlede suspensjonen mellom seks 3 ml ultrasentrifugerør, og nå et maksimalt volum på 2,5 ml i hvert rør.
- Sonikere hvert rør 4x, for 10 s hver gang, ved hjelp av en spiss soniker ved en amplitude på 100%. Vær forsiktig med å holde sonikerhornet nedsenket og vekk fra væskeoverflaten for å forhindre skumming.
- Beveg sakte sonikerhornet opp og ned i suspensjonen under hver runde. Veksle mellom de fire rørene, og returner hvert rør til en isbøtte etter hver sonikering for å la prøven avkjøles.
- Sentrifuge den soniske rå thylakoidsuspensjonen ved 150 000 x g i 30 minutter ved 4 °C. Høst den resulterende flytende puten av rå plastoglobuler fra overflaten av sukroseputen (lett sett på som en gul, oljeaktig pute) ved hjelp av en sprøyte og 22 G nål ved å skumme overflaten av puten med åpningen av nålen, og gjenvinne ca. 500 μL fra hvert rør. Sett inn i et 2,0 ml rør.
- Samle aliquots av rå thylakoid før og etter sonikering og frigjøring av plastoglobuler. Gå videre til trinn 2.1. Alternativt kan du oppbevare plastoglobulene ved −80 °C og rense på et senere tidspunkt.
- Rå plastoglobule ekstraksjon fra uttørket E. nindensis bladvev
- Skaff deg en pott (bestående av tre individuelle planter per pott) av fullt uttørket, 8-9 uker gammel E. nindensis (nesten 40 g vev).
- Klipp av alt bladvevet fra plantens base, like over jorden, ved hjelp av saks og dunk umiddelbart vevet i et isbad. Transport vevet til kjølerommet.
- Arbeid under en grønn sikkerhetslampe, klipp E. nindensis blader i mindre biter (rundt 5 cm x 5 cm) ved hjelp av saks.
- Slip bladene forsiktig, men grundig med 100 ml slipebuffer (tabell 1) i en kommersiell blender. Start-stopp blenderen flere ganger for å sikre at alle bladene blir kuttet. Ikke bruk høyere enn nivå 7 på blenderen.
- Filtrer homogenatet gjennom ett lag med 25 μm nylonduk på en stor trakt i en 250 ml konisk kolbe. Fjern en aliquot av bladfiltratet og sett den til side før sentrifugering som skal lagres som en representativ total bladprøve.
- Tilsett riktig mengde sukrose for å bringe til en endelig konsentrasjon på 0,5 M og fordel løsningen i 250 ml sentrifugerør.
MERK: En høyere konsentrasjon av sukrose sammenlignet med Z. mays-preparatet brukes til å sikre flotasjon av cytosoliske lipiddråper før påfølgende sonikering / frigjøring av tylakoidbundne plastoglobuler. - Sentrifuge rørene ved 45 000 x g i 30 min ved 4 °C. En blanding av plastoglobuler og cytosoliske lipiddråper vil lett bli sett som en gul, oljeaktig pute på eller nær overflaten av sukroseputen (figur 1B). Samle det flytende materialet ved hjelp av en sprøyte med en 22 G nål ved å skumme overflaten av puten med åpningen av nålen, og sett inn i et rør.
- Kast den gjenværende supernatanten etter oppsamling av den frittflytende plastoglobule/lipiddråpeblandingen.
- For å isolere plastoglobulene som er koblet til gjenværende thylakoid, resuspenderer pelleten i 12 ml medium R 0,2 ved å virvle og resuspendere med forsiktige bevegelser av børsten. Samle suspensjonene i en flaske. Gå videre til trinn 1.1.8.
- Utvinning av rå plastoglobule fra cyanobakterier
- Dyrk en 50 ml kultur av Synechocystis sp. PCC 6803 til den stasjonære fasen (ca. 7-10 dager) og juster celletettheten til en OD750 på 2,0 ved hjelp av et spektrofotometer. For kulturforhold, bruk BG-11-medier og vokse i en inkubator med en lysintensitet på 150 μmol fotoner / m 2 / s, 2% CO2, 32 ° C og med kontinuerlig risting ved 150 o / min.
- For å fjerne polysakkaridene, vask cellene ved å sentrifugere 50 ml kulturen ved 6000 x g i 45 minutter ved 4 °C og deretter fjerne supernatanten. Fortsett med å vaske cellene to ganger i 50 ml buffer A (tabell 1). Fjern en aliquot av cellehomogenatet og sett det til side før sentrifugering som skal lagres som en representativ total celleprøve
- Resuspend den vasket pelleten i 25 ml buffer A og bryt cellene ved hjelp av en fransk trykkcelle ved 1,100 psi, gjenta prosessen 3x (legg prøven på is mellom hver syklus for å unngå proteindenaturering) til den lysede fargen endres fra grønn til rødblågrønn under hvitt lys. Bruk en forkjølt celle og utfør dette trinnet i kjølerommet.
- Fordel det resulterende homogenatet mellom åtte 3 ml ultracentrifugerør fylt til maksimalt 2,5 ml i hvert rør og deretter forsiktig overlegg med 400 μL medium R, og produsere en trinngradient.
MERK: Se Yang, et al. og Kelekar, et al. for detaljerte beskrivelser av sukrosegradientpreparering25,26. - Balanser rørene forsiktig ved å tilsette ekstra medium R, etter behov, og sentrifuge i 30 minutter ved 150 000 x g ved 4 °C. Thylakoid og andre tyngre organeller (inkludert eventuelle polyhydroksyalkanoatlegemer) vil pelletere, mens plastoglobuler lett vil bli sett som en gul, oljeaktig pute på eller nær toppen av sukrosegradienten (figur 1C).
- Høst den resulterende flytende puten av rå plastoglobuler med en sprøyte og 22G nål og sett inn i et 2 ml rør. Skrap plastoglobuler av siden av ultracentrifuge rørveggen med nålespissen om nødvendig.
- Fortsett til trinn 2.2. Alternativt kan du oppbevare rå plastoglobuler ved -80 °C og rense senere.
2. Høsting av rene plastoglobuler
- Behandling av plantevev
- Produser sukrosegradienter i 2,5 ml ultracentrifugerør ved første lagdeling med 500 μL råoljeplastoglobuler fra trinn 1,1 eller trinn 1,2 blandet med 500 μL medium R 0,7, for å bringe til et totalt volum på 1 ml, deretter overlegg med 400 μL medium R 0,2, etterfulgt av overlegg med 400 μL medium R.
MERK: Se Yang og medarbeidere og Kelekar og medarbeidere for detaljerte beskrivelser av sukrosegradientpreparat25,26. - Balanser rørene forsiktig ved å legge overflødig medium R til topplaget, etter behov. Sentrifuger deretter ved 150 000 x g i 1,5 timer ved 4 °C.
- Høst den resulterende flytende puten av rene plastoglobuler (figur 1A) med en sprøyte og 22G nål og sett inn i et 2 ml rør. Skrap plastoglobuler av toppen av sentrifugerørveggen med nålespissen om nødvendig.
- Aliquot de rene plastoglobules og flash fryse i flytende nitrogen. Oppbevares direkte ved -80 °C eller lyofiliseres til tørt pulver.
- Produser sukrosegradienter i 2,5 ml ultracentrifugerør ved første lagdeling med 500 μL råoljeplastoglobuler fra trinn 1,1 eller trinn 1,2 blandet med 500 μL medium R 0,7, for å bringe til et totalt volum på 1 ml, deretter overlegg med 400 μL medium R 0,2, etterfulgt av overlegg med 400 μL medium R.
- Cyanobakterier behandling
- Produser en sukrosegradient i fire 2,5 ml ultrasentrifugerør lagvis først med 500 μL av de rå plastoglobulene fra trinn 1,3 blandet med 750 μL medium R 0,7, deretter overlegg med 750 μL medium R 0,2.
MERK: Se Yang og medarbeidere og Kelekar og medarbeidere for detaljerte beskrivelser av sukrosegradientpreparat25,26. - Sentrifuge sukrosegradienten ved 150 000 x g i 90 minutter ved 4 °C. Samle de rene plastoglobulene (figur 1C) med en sprøyte og 22 G nål fra den øverste fasen av sukrosegradienten og overfør til et 1,5 ml rør.
- Aliquot de rene plastoglobules og flash-fryse i flytende nitrogen. Oppbevares direkte ved -80 °C eller lyofiliseres til et tørt pulver.
- Produser en sukrosegradient i fire 2,5 ml ultrasentrifugerør lagvis først med 500 μL av de rå plastoglobulene fra trinn 1,3 blandet med 750 μL medium R 0,7, deretter overlegg med 750 μL medium R 0,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når trinn 1 i protokollen er fullført, bør man lett kunne se en betydelig mengde plastoglobul/lipiddråpemateriale som flyter på (eller i nærheten av) det øverste laget av sukroseputen (figur 1B-C). Andre fraksjoner kan også samles på dette stadiet. For eksempel vil thylakoidene bli pelletert og kan suspenderes på nytt med medium R 0,2 for påfølgende analyser. Etter påfølgende sentrifugering vil rensede plastoglobuler oppnås ved eller nær overflaten av sukrosegradienten, som vist i figur 1A, C. Det har blitt sett under visse omstendigheter (f.eks. spesifikke genotypiske linjer eller miljøforhold) at plastoglobulene vil isolere som to forskjellige underpopulasjoner som skiller seg ved forskjellige lag i gradienten: en fraksjon med lav tetthet på gradientoverflaten og en andre, tettere fraksjon som legger seg ved grensesnittet mellom de to øverste gradientlagene. Mens en nøye komparativ analyse av separeringsfraksjonene ikke tidligere har blitt utført, virker det sannsynlig at disse delpopulasjonene representerer plastoglobuler av forskjellig størrelse, hvor de med mindre diameter (og dermed større overflateareal / volumforhold og protein til lipidforhold) vil bosette seg lavere i gradienten.
I et mislykket forsøk vil man se lite eller ingen synlige plastoglobuler på overflaten av sukroseputen etter den første runden med sentrifugering. Unnlatelse av å isolere nok plastoglobuler kan avhenge av flere faktorer som kanskje må optimaliseres. Spesielt kan sonikeringsteknikken (ved bruk av sunt bladvev) ha en betydelig innvirkning på suksessen. I tillegg vil den nødvendige mengden plante-/cyanobakterielt materiale være avhengig av den spesifikke arten og dens stresstilstand.
Etter vellykket isolering av plastoglobuler er det mulig å validere renheten til de isolerte plastoglobulene ved hjelp av immunoblotting av markørproteinene for plastoglobuler og thylakoider (det primære forurensningsrommet). I figur 1D ses representative immunbloter ved bruk av antistoffer hevet mot A. thaliana FBN1a, som markør for plastoglobuler2, og mot A. thaliana fotosystem II underenhet D1, som markør for thylakoider27. FBN-homologene i Synechocystis sp. PCC 6803 assosierer primært med thylakoider i stedet for plastoglobuler.
Man bør også nøye vurdere lagringsmåten, som kan avhenge av de tiltenkte nedstrømsstudiene. Spesielt for nedstrømsanalyser av prenyl-lipidpigmentlipider er det avgjørende å minimere eksponeringen av prøvene for direkte lys for å unngå skade på foto-labile forbindelser. Rensede plastoglobuler kan brukes til nedstrøms eksperimenter som lipidomiske eller proteomiske baserte eksperimenter. Plastoglobuler er preget av et meget lavt protein til lipidforhold, noe som manifesterer seg i deres lave tetthet og evne til å flyte på sukrose; Dermed er en lav proteinkonsentrasjon av plastoglobuleprøvene normal. Av denne grunn er det tilrådelig å fjerne lipider før proteinseparasjon ved SDS-PAGE ved bruk av acetonproteinutfelling eller kloroform / metanolekstraksjon.
Figur 1: Isolering og immunblotting av plastoglobuler og thylakoider . (A) En representativ renset plastoglobuleprøve fra Z. mays før ekstraksjon fra sukrosegradienten. (B) En representativ rå plastoglobuleprøve fra uttørket E. nindensis før ekstraksjon fra sukroseputen. (C) En representativ rå (venstre) og ren (høyre) plastoglobuleprøve fra Synechocystis sp. PCC 6803, som viser både før og etter ultrasentrifugering av henholdsvis lastet sukrosepute og gradient. (D) Anti-fibrillin1a antistoff (α-FBN1a) ble brukt til å overvåke akkumulering av fibrillin, et markørprotein av plastoglobuler i høyere planter. Fibrillin ortholog akkumuleres hovedsakelig i de isolerte thylakoider av cyanobakterier (Synecho, Syenchocystis sp. PCC 6803). Antifotosystem II-underenhet D1 (α-PsbA) ble brukt til å validere uttømming av thylakoider fra plastoglobuleisolasjoner. I hver bane ble 5 μg thylakoider og 10 μg plastoglobuleprotein lastet. Forkortelser: PG = plastoglobules; Din = thylakoider. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Buffer komposisjoner en | |
| Sliping Buffer | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 100 mM sorbitol | |
| 5 mM askorbinsyre b | |
| 5 mM redusert cystein b | |
| 0,05 % (m/v) BSA b | |
| Middels R | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| Middels R 0,2 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0,2 M sukrose | |
| Middels R 0,7 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0,7 M sukrose | |
| Buffer A | 25 mM HEPES-KOH (pH 7,8) |
| 250 mM sukrose | |
| a Endelige konsentrasjoner av hver bufferkomponent er gitt. | |
| b Må tilsettes frisk på isolasjonsdagen. Mens buffere kan tilberedes dagen før isolasjonen, må disse bestemte ingrediensene tilsettes friske på isolasjonsdagen, samt eventuelle fosfatase- og proteasehemmere. | |
Tabell 1: Bufferoppskrifter for plastoglobuleisolasjon fra plantebladvev eller cyanobakterier.
| Fosfatase Inhibitor Cocktail b | |
| Inhibitor | Endelig Conc. (mM) |
| Na-fluor | 50 |
| β-Glycerophosphate⋅2Na⋅5H2O | 25 |
| Na-OrthoVanadate | 1 |
| Na-pyrofosfat⋅10H2O | 10 |
| b Fosfatasehemmere må tilsettes friske dagen for isolasjonen. | |
Tabell 2: Fosfatasehemmercocktail.
| Proteaseinhibitor Cocktail en | ||||
| Inhibitor | Lager (mg/ml) | Lager medium | Fortynningsfaktor | Endelig konk. (mg/ml) |
| Antipain⋅2HCl | 20 | Vann | 400x | 50 |
| Bestatin | 1 | 0,15 m NaCl | 25x | 40 |
| Chymostatin | 20 | DMSO | 2000 ganger | 10 |
| E-64 | 20 | Vann | 2000 ganger | 10 |
| Leupeptin (hemisulfat) | 20 | Vann | 4000x | 5 |
| P-ramidon⋅2Na | 20 | Vann | 2000 ganger | 10 |
| AEBSF | 50 | Vann | 1000x | 50 |
| Aprotinin | 10 | Vann | 5000x | 2 |
| a Proteaseløsningene må oppbevares ved -20 °C i små aliquots for langtidsoppbevaring. Tine og tilsett frisk til passende buffer umiddelbart før isolering. | ||||
Tabell 3: Proteaseinhibitorcocktail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å minimere fysiologiske/biokjemiske endringer i materialet og beskytte visse foto- og termolabile prenyl-lipidpigmenter som er en rik komponent i plastoglobuler, er det avgjørende å utføre isolasjonen ved 4 °C og beskyttet mot lys. Som angitt ovenfor utføres de første trinnene i kjølerommet under en sikkerhetslampe ved hjelp av en grønnemitterende lyspære. De påfølgende trinnene som utføres i laboratoriet er under dimmede lys og bruker is eller nedkjølt sentrifugering. Av lignende grunner er inkludering av ferske proteasehemmere (og fosfatasehemmere hvis det er interesse for å studere fosforeguleringen av proteiner) kritisk (tabell 2 og tabell 3).
Mens andre metoder (f.eks. En Dounce homogenisator, fryse-tine sykluser) i prinsippet kunne brukes til å frigjøre plastoglobuler fra thylakoider i høyere plantekloroplaster, har sonikering vist seg å være langt overlegen i å gi det beste utbyttet og renheten (upubliserte resultater). Sonikering kan skape kunstige vesikler fra thylakoid lameller eller endoplasmatisk retikulum; Imidlertid vil disse vesiklene være svært proteinrike og dermed tette, og utelukke deres flotasjon på sukrosegradienten.
Når du trekker ut den flytende puten av rene plastoglobuler fra sukrosegradienten, er det gunstig å trekke dem ut i den minste mengden medium R som mulig. Anskaffelse av konsentrerte plastoglobuler på denne måten letter nedstrømsstudier ved å minimere de nødvendige prøvevolumene. Bruk av sprøyte og 22 G nål er den mest effektive strategien for å trekke ut plastoglobulene. På grunn av deres hydrofobe, lipidrike natur er de ekstremt klissete, og bruk av pipettespisser eller en slikkepott bør unngås for enhver pris. Det har blitt funnet at tapet av plastoglobuler på grunn av å stikke er best minimert med en sprøyte og nål, selv om det ikke virker mulig å helt forhindre noe tap under ekstraksjon.
Hvis et lett synlig, gulkremet lag av plastoglobuler ikke ses flytende på eller nær overflaten av sukrosegradienten, kan det ikke ha blitt brukt tilstrekkelig plante-/cyanobakterielt materiale for isolasjonen. Det har blitt funnet at monocots gir høyere plastoglobule utbytter enn dicots fra sammenlignbare mengder plantevev (upubliserte resultater). Mens riktige mengder biologisk utgangsmateriale er indikert for de spesifikke isolasjonene som er eksemplifisert i denne artikkelen, må de nødvendige mengdene vev for effektiv ekstraksjon bestemmes empirisk basert på organismens arter, vev og miljøforhold. Generelt vil stresset (men ikke nekrotisk) bladvev eller cyanobakterielle kulturer gi høyere utbytter av plastoglobuler. Ved bruk av A. thaliana bladvev er to leiligheter av A. thaliana-planter (nesten 140 individuelle planter) fra midten av vegetativt vekststadium vanligvis tilstrekkelig for isolering av plastoglobuler, spesielt når plantematerialet er mildt stresset, for eksempel ved en lett stressbehandling 2,4. Som en alternativ forklaring på dårlige utbytter kan den første homogeniseringen av bladvevet med blenderen ha vært for kraftig og separert plastoglobulene fra thylakoidene for tidlig, eller sonikering av det rå thylakoidmaterialet kan ha vært utilstrekkelig kraftig til effektivt å frigjøre plastoglobulene før flotasjon (disse punktene er ikke et problem når man ekstraherer fra cyanobakterier, som er frittflytende in situ).
Det er viktig å huske på at plastoglobule isolasjon vil representere bulkpopulasjonen av plastoglobuler fra en vevsprøve. Derfor vil enhver mulig heterogenitet i lipid, protein eller funksjon ikke være merkbar fra påfølgende studier. På grunn av denne begrensningen har det ikke vært mulig å måle hvor mye heterogenitet som kan eksistere blant individuelle plastoglobule lipiddråper. Imidlertid avslører transmisjonselektronmikrografer av plantebladvev fra flere organismer differensielle fargemønstre blant plastoglobuler, selv innenfor samme kloroplast 28,29,30,31. Dette tyder sterkt på heterogenitet i lipidinnholdet, selv om arten eller formålet med dette fortsatt er uklart. Signifikant viser elektronmikrografier av isolerte A. thaliana plastoglobuler at denne isolasjonsmetoden ikke er partisk for isolering av større eller mindre plastoglobuler2.
Isoleringen av rene plastoglobuler representerer det første skrittet mot deres detaljerte molekylære karakterisering. Tallrike nedstrøms applikasjoner kan deretter utføres avhengig av etterforskerens spesifikke interesser og formål. For eksempel, for å undersøke lipid- eller proteinsammensetningen, er den isolerte prøven lett egnet til proteomiske eller lipidomiske studier. In-gel fordøyelsesmetoden er foretrukket for bottom-up proteomikkstudier av plastoglobulesprøver. Men fordi lipider er i stort overskudd i forhold til protein, kan lipidet forstyrre SDS-PAGE-separasjonen. Den første utfellingen av protein ved bruk av aceton, med påfølgende resuspendering i Laemmli solubiliseringsbuffer, eliminerer de fleste lipider, og tillater dermed en effektiv separasjon av protein i SDS-PAGE separeringsgelen. Initial resuspendering av proteinpelleten i 100 mM tris-HCl-buffer og 2% SDS tillater nøyaktig bestemmelse av proteininnholdet ved bicinkoninsyremetoden før tilsetning av reduksjonsmiddel, fargestoff og glyserol. På samme måte er lipidrensing ved bruk av væske-væskefaseseparasjonsmetoder, som Bligh og Dyer-metoden, egnet for nedstrøms lipidomiske analyser32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Forskning i Lundquist lab-gruppen støttes av tilskudd fra NSF (MCB-2034631) og USDA (MICL08607) til P.K.L. Forfatterne takker Dr. Carrie Hiser (MSU) for støtte i utviklingen av cyanobakteriell plastoglobule isolasjonsmetode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K.
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
