Summary
Представлен быстрый и эффективный протокол выделения пластоглобулы липидных капель, связанных с различными фотосинтезирующими организмами. Успешное получение изолированных пластоглобул является важным первым шагом, который предшествует подробным молекулярным исследованиям, таким как протеомный и липидомический анализы.
Abstract
Капли липидов пластоглобул являются динамическим субкомпоном растительных хлоропластов и цианобактерий. Считается, что они повсеместно встречаются среди фотосинтезирующих видов и играют центральную роль в адаптации и ремоделировании тилакоидной мембраны в быстро меняющихся условиях окружающей среды. Способность выделять пластоглобулы высокой чистоты значительно облегчила их изучение с помощью протеомных, липидомных и других методологий. С пластоглобулами высокой чистоты и выхода можно исследовать их липидный и белковый состав, ферментативную активность и топологию белка, среди других возможных молекулярных характеристик. В данной статье представлен быстрый и эффективный протокол выделения пластоглобул из хлоропластов ткани листьев растений и представлены методологические вариации выделения пластоглобул и связанных с ними липидных капельных структур из листьев кукурузы, высохшей листовой ткани воскрешающего растения Eragrostis nindensis и цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Изоляция зависит от низкой плотности этих богатых липидами частиц, что облегчает их очистку флотации плотности сахарозы. Эта методология окажется полезной при изучении пластоглобул различных видов.
Introduction
Современное понимание состава и функции пластоглобул появилось благодаря подробным протеомным и липидомическим исследованиям 1,2,3,4,5. Таким исследованиям в значительной степени способствовал быстрый и эффективный метод изоляции, который опирается на их очень низкую плотность для эффективного разделения с использованием градиентов сахарозы. Первоначальные методы выделения пластоглобул были достигнуты из таких видов, как буковое дерево (Fagus sylvatica), шотландский веник (Sarothamnus scoparius), лук (Allium cepa), шпинат (Spinacia oleracea), анютины глазки (Viola tricolor), перец (Capsicum annuum) и горох (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Обновленный метод выделения хлоропластобул более эффективным и лучшим способом получения урожая был позднее представлен Ytterberg et al.3,14. Хотя первоначально мы использовались для изучения пластоглобул хлоропластов листьев Arabidopsis thaliana, мы успешно использовали этот обновленный метод для здоровой листовой ткани других видов растений, как монокота, так и дикота, включая кукурузу (Zea mays), помидор (Solanum lycopersicum), лавграсс (Eragrostis nindensis), фиолетовый ложный бром (Brachypodium distachyon) и дикий табак (Nicotiana benthamiana). ; неопубликованные результаты). Кроме того, метод выделения был успешно адаптирован к пластоглобулам цианобактерий, включая Synechocystis sp. PCC 6803 и Anabaena sp. PCC 712015, а также к высохшей листовой ткани воскрешающего растения E. nindensis.
Хлоропластовые пластоглобулы здоровой ткани листа физически соединены с тилакоидными мембранами16. Несмотря на эту физическую непрерывность, два субкомпамента хлоропластов сохраняют различные липидные и белковые композиции, хотя регулируемый обмен липидами и белками между двумя компартментами был предложен 2,4,17,18,19. На самом деле, недавно была предложена интересная модель гемифузии для обмена нейтральными липидами между хлоропластами и цитозолом19. Из-за физической непрерывности пластоглобул и тилакоидов метод выделения со здоровой тканью листьев начинается со сбора гранулированного сырого тилакоидного препарата, который впоследствии обрабатывают ультразвуком для отделения пластоглобул от тилакоидов, что в отличие от методов, используемых для выделения цитозольных липидных капель20 . Ультрацентрифугирование на сахарозной подушке затем запускает пластоглобулы низкой плотности вверх через сахарозу, эффективно отделяя их от тилакоидов, ядер и другого материала высокой плотности. Напротив, пластоглобулы в цианобактериях, а также в высохшей ткани листа, очевидно, существуют in vivo в свободно плавающей форме. Следовательно, их изоляция включает в себя непосредственное плавание на градиенте сахарозы. Эта статья демонстрирует метод выделения из здоровой листовой ткани и дополнительно демонстрирует две вариации, которые могут быть использованы для выделения пластоглобул из высохшей листовой ткани или цианобактериальных культур, значительно расширяя физиологическую широту и эволюционный контекст, в котором пластоглобулы могут быть изучены.
Изолированные пластоглобулы могут впоследствии использоваться для любого количества последующих анализов для исследования молекулярных характеристик. Мы использовали выделенные пластоглобулы из ткани листьев A. thaliana для обширного протеомного и липидомического анализа в различных условиях окружающей среды или генотипах, демонстрируя селективную модификацию белкового и липидного состава при адаптации к стрессу 2,4,21,22. Кроме того, были проведены анализы киназы in vitro, которые демонстрируют активность трансфосфорилирования, связанную с изолированными пластоглобулами, 22, олигомерные состояния белковых компонентов были исследованы с использованием нативного гелевого электрофореза 21 и протеазно-бритвенные анализы были выполнены23.
Основным преимуществом этого метода является относительная скорость процедуры. По нашему опыту, протоколы, описанные ниже, могут быть полностью завершены в течение примерно 4 часов. Описан альтернативный способ выделения пластоглобул из листовой ткани, который позволяет одновременно выделять другие подкомпоны24 хлоропласта. Этот альтернативный метод дает некоторые явные преимущества, когда количественное сравнение с другими подотсеками хлоропласта необходимо или желательно. Однако этот альтернативный метод также более утомителен и обеспечит значительно более низкий выход изолированных пластоглобул из сопоставимых количеств листовой ткани. Когда целью является целенаправленное изучение пластоглобул, методология, изложенная здесь, является оптимальным выбором. Тем не менее, общее количество листовых и сырых тилакоидных аликвот может быть собрано во время подготовки образца, и настоятельно рекомендуется сделать это, чтобы иметь эталонные образцы для последующего сравнения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение сырой пластоглобулы
- Извлечение сырой пластоглобулы из ненапряженной ткани листьев кукурузы
- Приобретите шесть здоровых саженцев кукурузы примерно в возрасте 3 недель и почти на стадии роста V5, весом около 120 г.
- Отрежьте все листья у основания стебля, быстро окуните их в ледяную ванну и транспортируйте в холодное помещение.
- Работая под зеленой лампой безопасности, извлеките листья кукурузы из ледяной ванны и разрежьте их на более мелкие кусочки (около 5 см х 5 см) с помощью ножниц.
- Аккуратно, но тщательно измельчите половину обрезанной ткани листа в коммерческом блендере в 350 мл измельчающего буфера (таблица 1). Запустите-остановите блендер 5x-6x, чтобы убедиться, что все листья срезаны. Не используйте выше уровня 7 на блендере.
- Отфильтруйте гомогенат через один слой нейлоновой ткани размером 25 мкм на большой воронке в четыре бутылки центрифуги объемом 250 мл. Затем повторите шаг 1.1.4 со второй половиной обрезанной ткани листа.
- Равномерно разделите фильтрат между четырьмя флаконами и центрифугой в течение 6 мин при 1,840 х г при 4 °C. Удалите аликвоту листового фильтрата и отложите ее перед центрифугированием для хранения в качестве репрезентативного общего образца листа.
- Вылейте полученный супернатант и осторожно повторно суспендируйте гранулу в 12 мл среды R 0,2, содержащей 0,2 М сахарозы (таблица 1), путем закручивания и повторного использования легкими движениями щетки. После повторного использования каждой гранулы перенесите суспензию в следующую бутылку и повторите повторное суспендирование. Сгруппируйте суспензии в одну бутылку.
- Распределите объединенную суспензию между шестью ультрацентрифугными трубками по 3 мл, достигнув максимального объема 2,5 мл в каждой трубке.
- Обрабатывайте каждую трубку 4 раза, в течение 10 с каждый раз, используя наконечник сиконикатора с амплитудой 100%. Будьте осторожны, чтобы держать звуковой рог под водой и подальше от поверхности жидкости, чтобы предотвратить вспенивание.
- Медленно перемещайте звуковой сигнал sonicator вверх и вниз внутри подвески во время каждого раунда. Чередуйте четыре трубки, возвращая каждую трубку в ведро со льдом после каждой обработки ультразвуком, чтобы дать образцу остыть.
- Центрифугировать обработанную ультразвуком сырую суспензию тилакоида при 150 000 х г в течение 30 мин при 4 °C. Соберите полученную плавающую прокладку из сырых пластоглобул с поверхности подушки сахарозы (легко видимую как желтую маслянистую прокладку) с помощью шприца и иглы 22 г, скользя по поверхности подушки с открытием иглы, извлекая примерно 500 мкл из каждой трубки. Внесите в пробирку объемом 2,0 мл.
- Соберите аликвоты сырого тилакоида до и после обработки ультразвуком и высвобождения пластоглобул. Перейдите к шагу 2.1. Альтернативно, храните сырые пластоглобулы при -80 °C и очищайте в более позднее время.
- Извлечение сырой пластоглобулы из высушенной ткани листьев E. nindensis
- Приобретите горшок (состоящий из трех отдельных растений в горшке) с полностью высушенным, 8-9-недельным E. nindensis (почти 40 г ткани).
- Отрежьте всю ткань листа от основания растения, чуть выше почвы, ножницами и сразу же окуните ткань в ледяную ванну. Транспортируйте ткань в холодное помещение.
- Работая под зеленым фонарем безопасности, отрежьте E. nindensis листья на более мелкие кусочки (около 5 см х 5 см) с помощью ножниц.
- Аккуратно, но тщательно измельчите листья 100 мл измельчающего буфера (таблица 1) в коммерческом блендере. Запустите-остановите блендер несколько раз, чтобы убедиться, что все листья срезаются. Не используйте выше уровня 7 на блендере.
- Отфильтруйте гомогенат через один слой нейлоновой ткани размером 25 мкм на большой воронке в коническую колбу объемом 250 мл. Удалите аликвоту листового фильтрата и отложите ее перед центрифугированием для хранения в качестве репрезентативного общего образца листа.
- Добавляют соответствующее количество сахарозы довести до конечной концентрации 0,5 М и распределяют раствор по 250 мл центрифужных пробирок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая концентрация сахарозы по сравнению с препаратом Z. mays используется для обеспечения флотации цитозольных липидных капель перед последующей обработкой ультразвуком/высвобождением связанных с тилакоидом пластоглобул. - Центрифугируйте пробирки при 45 000 х г в течение 30 мин при 4 °C. Смесь пластоглобул и цитозольных липидных капель будет легко видна в виде желтой маслянистой прокладки на поверхности сахарозной подушки или вблизи нее (рисунок 1B). Соберите плавающий материал с помощью шприца с иглой весом 22 г, скользя по поверхности подушки с открытием иглы, и нанесите в трубку.
- Откажитесь от оставшегося супернатанта после сбора свободно плавающей смеси пластоглобулы/липидных капель.
- Чтобы выделить пластоглобулы, соединенные с остаточным тилакоидом, повторно суспендируют гранулу в 12 мл среды R0,2 путем закручивания и повторного использования легкими движениями щетки. Сгруппируйте суспензии в одну бутылку. Перейдите к шагу 1.1.8.
- Экстракция сырой пластоглобулы из цианобактерий
- Вырастите 50 мл культуры Synechocystis sp. PCC 6803 до стационарной фазы (около 7-10 дней) и отрегулируйте плотность клеток до OD750 2,0 с помощью спектрофотометра. Для условий культивирования используют среду БГ-11 и растут в инкубаторе при интенсивности света 150 мкмоль фотонов/м2/с, 2%СО2, 32 °С и с непрерывным встряхиванием при 150 об/мин.
- Чтобы удалить полисахариды, промывайте клетки путем центрифугирования культуры 50 мл при 6000 х г в течение 45 мин при 4 °C и последующего удаления супернатанта. Продолжайте промывку клеток дважды в 50 мл буфера А (таблица 1). Удалите аликвоту гомогената клетки и отложите ее перед центрифугированием для хранения в качестве репрезентативного общего образца клетки.
- Повторно суспендируйте промытую гранулу в 25 мл буфера А и разбейте клетки, используя французскую ячейку давления при 1 100 фунтов на квадратный дюйм, повторяя процесс 3x (помещайте образец на лед между каждым циклом, чтобы избежать денатурации белка), пока лизированный цвет не изменится с зеленого на красно-сине-зеленый при белом свете. Используйте предварительно охлажденную ячейку и выполните этот шаг в холодном помещении.
- Распределите полученный гомогенат между восемью ультрацентрифугными трубками 3 мл, заполненными максимум до 2,5 мл в каждой трубке, а затем аккуратно наложите 400 мкл среды R, получив градиент шага.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Yang, et al. и Kelekar, et al. для подробного описания препарата градиента сахарозы25,26. - Тщательно балансируйте трубки, добавляя дополнительную среду R, по мере необходимости, и центрифугу в течение 30 мин при 150 000 х г при 4 °C. Тилакоид и другие более тяжелые органеллы (включая любые полигидроксиалканоатные тела) будут гранулироваться, в то время как пластоглобулы будут легко рассматриваться как желтая маслянистая прокладка на вершине градиента сахарозы или рядом с ней (рисунок 1C).
- Соберите полученную плавающую прокладку из сырых пластоглобул с помощью шприца и иглы 22G и нанесите в трубку объемом 2 мл. При необходимости соскоблите пластоглобулы со стороны стенки ультрацентрифужной трубки кончиком иглы.
- Перейдите к шагу 2.2. В качестве альтернативы храните сырые пластоглобулы при -80 °C и очищайте позже.
2. Сбор чистых пластоглобул
- Переработка растительных тканей
- Получают градиенты сахарозы в ультрацентрифужных пробирках объемом 2,5 мл путем сначала наслоения 500 мкл сырых пластоглобул со стадии 1,1 или стадии 1,2, смешанной с 500 мкл среды R 0,7, доведения до общего объема 1 мл, затем наложения 400 мкл среды R 0,2 с последующим наложением 400 мкл среды R.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Yang et al. и Kelekar et al. для получения подробных описаний препарата градиента сахарозы25,26. - Тщательно балансируйте трубки, добавляя избыточную среду R к верхнему слою, по мере необходимости. Затем центрифугу при 150 000 х г в течение 1,5 ч при 4 °C.
- Соберите полученную плавающую прокладку из чистых пластоглобул (рисунок 1А) с помощью шприца и иглы 22G и нанесите в трубку объемом 2 мл. При необходимости соскоблите пластоглобулы с верхней части стенки трубки центрифуги кончиком иглы.
- Аликвотирует чистые пластоглобулы и мгновенно замораживается в жидком азоте. Хранить непосредственно при -80 °C или лиофилизировать до сухого порошка.
- Получают градиенты сахарозы в ультрацентрифужных пробирках объемом 2,5 мл путем сначала наслоения 500 мкл сырых пластоглобул со стадии 1,1 или стадии 1,2, смешанной с 500 мкл среды R 0,7, доведения до общего объема 1 мл, затем наложения 400 мкл среды R 0,2 с последующим наложением 400 мкл среды R.
- Обработка цианобактерий
- Получают градиент сахарозы в четырех ультрацентрифужных пробирках объемом 2,5 мл, покрытых сначала 500 мкл сырых пластоглобул со стадии 1,3, смешанных с 750 мкл среды R 0,7, затем наложенных 750 мкл среды R 0,2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Yang et al. и Kelekar et al. для получения подробных описаний препарата градиента сахарозы25,26. - Центрифугирование градиента сахарозы при 150 000 х г в течение 90 мин при 4 °C. Соберите чистые пластоглобулы (рисунок 1С) шприцем и иглой 22 г из верхней фазы градиента сахарозы и переведите в трубку объемом 1,5 мл.
- Аликвотирует чистые пластоглобулы и мгновенно замораживается в жидком азоте. Хранить непосредственно при температуре −80 °C или лиофилизировать до сухого порошка.
- Получают градиент сахарозы в четырех ультрацентрифужных пробирках объемом 2,5 мл, покрытых сначала 500 мкл сырых пластоглобул со стадии 1,3, смешанных с 750 мкл среды R 0,7, затем наложенных 750 мкл среды R 0,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
По завершении этапа 1 протокола следует легко увидеть значительное количество пластоглобулы/липидного капельного материала, плавающего на верхнем слое сахарозной подушки (или рядом с ним) (рис. 1В-С). Другие фракции также могут быть собраны на этом этапе. Например, тилакоиды будут гранулированы и могут быть повторно суспендированы со средой R 0,2 для последующих анализов. После последующего центрифугирования очищенные пластоглобулы будут получены на поверхности градиента сахарозы или вблизи нее, как показано на фиг.1A,C. В определенных обстоятельствах (например, в конкретных генотипических линиях или условиях окружающей среды) было замечено, что пластоглобулы будут изолироваться как две отдельные субпопуляции, разделяющиеся в разных слоях градиента: фракция низкой плотности на градиентной поверхности и вторая, более плотная фракция, которая оседает на границе между двумя верхними слоями градиента. Хотя тщательный сравнительный анализ разделяющих фракций ранее не проводился, представляется вероятным, что эти субпопуляции представляют собой пластоглобулы разного размера, в которых те, которые имеют меньший диаметр (и, следовательно, большее отношение площади поверхности к объему и отношение белка к липидам), будут оседать ниже в градиенте.
В неудачной попытке можно увидеть мало или вообще не увидеть видимых пластоглобул на поверхности сахарозной подушки после первого раунда центрифугирования. Неспособность успешно изолировать достаточное количество пластоглобул может зависеть от нескольких факторов, которые, возможно, потребуется оптимизировать. В частности, техника обработки ультразвуком (при использовании здоровой листовой ткани) может оказать существенное влияние на успех. Кроме того, необходимое количество растительного / цианобактериального материала будет зависеть от конкретного вида и его стрессового состояния.
После успешного выделения пластоглобул можно проверить чистоту выделенных пластоглобул с помощью иммуноблоттинга маркерных белков для пластоглобул и тилакоидов (первичный загрязняющий компартмент). На рисунке 1D репрезентативные иммуноблоты показаны с использованием антител, поднятых против A. thaliana FBN1a, в качестве маркера для пластоглобул2, и против субъединицы фотосистемы A. thaliana II D1 в качестве маркера тилакоидов27. Гомологи FBN в Synechocystis sp. PCC 6803 ассоциируются в основном с тилакоидами, а не с пластоглобулами.
Следует также тщательно рассмотреть способ хранения, который может зависеть от предполагаемых последующих исследований. Особенно для последующего анализа пренил-липидных пигментных липидов крайне важно свести к минимуму воздействие на образцы прямого света, чтобы избежать повреждения фотолабильных соединений. Очищенные пластоглобулы могут быть использованы для последующих экспериментов, таких как липидомические или протеомные эксперименты. Пластоглобулы характеризуются очень низким соотношением белка к липидам, что проявляется в их низкой плотности и способности плавать на сахарозе; таким образом, низкая концентрация белка в образцах пластоглобул является нормальной. По этой причине целесообразно удалять липиды перед разделением белка SDS-PAGE с использованием осаждения ацетонового белка или экстракции хлороформа / метанола.
Рисунок 1: Выделение и иммуноблоттинг пластоглобул и тилакоидов. (А) Репрезентативный очищенный образец пластоглобулы из Z. mays до извлечения из градиента сахарозы. (B) Репрезентативный сырой образец пластоглобулы из высушенного E. nindensis до извлечения из подушки сахарозы. (C) Репрезентативный образец сырой (слева) и чистый (справа) пластоглобулы из Synechocystis sp. PCC 6803, показывающий как до, так и после ультрацентрифугирования загруженной сахарозной подушки и градиента, соответственно. (D) Антитело к фибриллин1а (α-FBN1a) использовалось для мониторинга накопления фибриллина, маркерного белка пластоглобул в высших растениях. Фибриллин ортолог накапливается преимущественно в изолированных тилакоидах цианобактерий (Synecho, Syenchocystis sp. PCC 6803). Антифотосистема II субъединицы D1 (α-PsbA) использовалась для проверки истощения тилакоидов из изоляций пластоглобул. В каждую полосу было загружено 5 мкг тилакоидов и 10 мкг белка пластоглобулы. Сокращения: PG = пластоглобулы; Thy = тилакоиды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Буферные композиции a | |
| Шлифовальный буфер | 50 мМ HEPES-KOH (рН 8,0) |
| 5 мМ MgCl2 | |
| 100 мМ сорбитол | |
| 5 мМ аскорбиновой кислоты b | |
| 5 мМ восстановленный цистеин b | |
| 0,05 % (по весу) BSA b | |
| Средний R | 50 мМ HEPES-KOH (рН 8,0) |
| 5 мМ MgCl2 | |
| Средний R 0.2 | 50 мМ HEPES-KOH (рН 8,0) |
| 5 мМ MgCl2 | |
| 0,2 М сахарозы | |
| Средний R 0.7 | 50 мМ HEPES-KOH (рН 8,0) |
| 5 мМ MgCl2 | |
| 0,7 М сахарозы | |
| Буфер A | 25 мМ HEPES-KOH (рН 7,8) |
| 250 мМ сахарозы | |
| a Представлены окончательные концентрации каждого буферного компонента. | |
| b Необходимо добавить свежим в день изоляции. Хотя буферы могут быть приготовлены за день до выделения, эти определенные ингредиенты должны быть добавлены свежими в день выделения, а также любые ингибиторы фосфатазы и протеазы. | |
Таблица 1: Буферные рецепты выделения пластоглобул из ткани листьев растений или цианобактерий.
| Коктейль ингибитора фосфатазы b | |
| Ингибитор | Окончательный конспект (мМ) |
| Na-фторид | 50 |
| β-глицерофосфат⋅2Na⋅5H2O | 25 |
| На-ОртоВанадат | 1 |
| Na-пирофосфат⋅10H2O | 10 |
| b Ингибиторы фосфатазы необходимо добавлять свежими в день выделения. | |
Таблица 2: Коктейль ингибитора фосфатазы.
| Коктейль ингибитора протеазы a | ||||
| Ингибитор | Запас (мг/мл) | Складской носитель | Коэффициент разбавления | Окончательный конв. (мг/мл) |
| Антипазин⋅2HCl | 20 | Вода | в 400 раз | 50 |
| Бестатин | 1 | 0,15 м NaCl | в 25 раз | 40 |
| Химостатин | 20 | ДМСО | в 2000х | 10 |
| Е-64 | 20 | Вода | в 2000х | 10 |
| Лейпептин (гемизульфат) | 20 | Вода | в 4000х | 5 |
| -рамидон⋅2На | 20 | Вода | в 2000х | 10 |
| АЕБСФ | 50 | Вода | в 1000х | 50 |
| Апротинин | 10 | Вода | в 5000х | 2 |
| a Растворы протеазы должны храниться при температуре -20°С в небольших аликвотах для длительного хранения. Разморозить и добавить свежий в соответствующий буфер непосредственно перед выделением. | ||||
Таблица 3: Коктейль ингибитора протеазы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чтобы свести к минимуму физиологические/биохимические изменения материала и защитить определенные фото- и термолабильные прениллипидные пигменты, которые являются богатым компонентом пластоглобул, крайне важно выполнить изоляцию при 4 °C и защитить от света. Как указано выше, начальные этапы выполняются в холодном помещении под предохранительной лампой с использованием зеленой лампочки. Последующие этапы, выполняемые в лаборатории, проходят при приглушенном освещении и используют лед или охлажденную центрифугирование. По аналогичным причинам включение свежих ингибиторов протеазы (и ингибиторов фосфатазы при наличии интереса к изучению фосфорегуляции белков) имеет решающее значение (таблица 2 и таблица 3).
В то время как другие методы (например, гомогенизатор Dounce, циклы замораживания-оттаивания) в принципе могут быть использованы для высвобождения пластоглобул из тилакоидов в хлоропластах высших растений, было обнаружено, что обработка ультразвуком намного превосходит в обеспечении наилучшего выхода и чистоты (неопубликованные результаты). Обработка ультразвуком может создавать искусственные везикулы из тилакоидных ламелей или эндоплазматического ретикулума; однако эти везикулы были бы очень богатыми белком и, следовательно, плотными, что исключало бы их флотацию на градиенте сахарозы.
При извлечении плавающей прокладки из чистых пластоглобул из градиента сахарозы полезно извлекать их в наименьшем количестве среды R, насколько это возможно. Получение концентрированных пластоглобул таким образом облегчает последующие исследования за счет минимизации необходимых объемов пробы. Использование шприца и иглы 22 г является наиболее эффективной стратегией извлечения пластоглобул. Из-за их гидрофобной, богатой липидами природы, они чрезвычайно липкие, и следует избегать использования наконечников пипеток или шпателя любой ценой. Было обнаружено, что потерю пластоглобул из-за прилипания лучше всего минимизировать с помощью шприца и иглы, хотя полностью предотвратить некоторые потери во время экстракции не представляется возможным.
Если хорошо видимый желто-кремовый слой пластоглобул не виден плавающим на поверхности градиента сахарозы или вблизи нее, для выделения может быть использован недостаточный растительный / цианобактериальный материал. Было обнаружено, что монокоты дают более высокие выходы пластоглобул, чем дикоты из сопоставимых количеств растительной ткани (неопубликованные результаты). В то время как надлежащие количества исходного биологического материала указаны для конкретных выделений, приведенных в этой статье, необходимые количества ткани для эффективной экстракции должны быть определены эмпирически на основе видов, тканей и условий окружающей среды организма. В целом, напряженная (но не некротическая) ткань листьев или цианобактериальные культуры дадут более высокие урожаи пластоглобул. При использовании листовой ткани A. thaliana двух плоских растений A. thaliana (около 140 отдельных растений) из средней вегетативной стадии роста обычно достаточно для выделения пластоглобул, особенно когда растительный материал слегка напряжен, например, при легкой стрессовой обработке 2,4. В качестве альтернативного объяснения плохих урожаев первоначальная гомогенизация ткани листа блендером, возможно, была слишком энергичной и преждевременно отделяла пластоглобулы от тилакоидов, или обработка ультразвуком сырого тилакоидного материала могла быть недостаточно энергичной, чтобы эффективно высвобождать пластоглобулы перед флотацией (эти точки не являются проблемой при извлечении из цианобактерий, которые свободно плавают in situ).
Важно иметь в виду, что изоляция пластоглобул будет представлять собой основную популяцию пластоглобул из образца ткани. Следовательно, любая возможная гетерогенность в липидах, белках или функциях не будет заметна из последующих исследований. Из-за этого ограничения не удалось оценить, насколько гетерогенность может существовать среди отдельных пластоглобул липидных капель. Однако просвечивающие электронные микроснимки ткани листьев растений от нескольких организмов показывают дифференциальные паттерны окрашивания среди пластоглобул, даже в пределах одного и того же хлоропласта 28,29,30,31. Это убедительно свидетельствует о неоднородности содержания липидов, хотя природа или цель этого остается неясной. Примечательно, что электронные микроснимки изолированных пластоглобул A. thaliana демонстрируют, что этот метод выделения не смещен для выделения больших или меньших пластоглобул2.
Выделение чистых пластоглобул представляет собой начальный шаг к их детальной молекулярной характеристике. Многочисленные последующие заявки могут быть впоследствии выполнены в зависимости от конкретных интересов и целей исследователя. Например, для исследования липидного или белкового состава изолированный образец легко поддается протеомным или липидомным исследованиям. Подход к внутригелевому пищеварению является предпочтительным для исследований протеомики снизу вверх образцов пластоглобул. Однако, поскольку липиды находятся в огромном избытке по сравнению с белком, липиды могут мешать разделению SDS-PAGE. Первоначальное осаждение белка с использованием ацетона с последующей ресуспензией в буфере солюбилизации Laemmli устраняет большинство липидов, тем самым позволяя эффективно разделять белок в разделительном геле SDS-PAGE. Первоначальная ресуспензия белковой гранулы в буфере трис-HCl 100 мМ и 2% SDS позволяет точно определить содержание белка методом бицинхониновой кислоты до добавления восстановителя, красителя и глицерина. Аналогичным образом, очистка липидов с использованием методов разделения жидкой фазы, таких как метод Блая и Дайера, подходит для последующего липидомного анализа32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никаких конфликтов интересов для декларирования.
Acknowledgments
Исследования в лабораторной группе Лундквиста поддерживаются грантами NSF (MCB-2034631) и USDA (MICL08607) P.K.L. Авторы благодарят доктора Кэрри Хизер (МГУ) за поддержку в разработке метода выделения цианобактериальных пластоглобул.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K.
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
