Summary
Un protocole rapide et efficace est présenté pour l’isolement des gouttelettes lipidiques plastoglobules associées à divers organismes photosynthétiques. La préparation réussie de plastoglobules isolés est une première étape cruciale qui précède les investigations moléculaires détaillées telles que les analyses protéomiques et lipidomiques.
Abstract
Les gouttelettes lipidiques de Plastoglobule sont un sous-compartiment dynamique des chloroplastes et des cyanobactéries des plantes. Présents partout parmi les espèces photosynthétiques, on pense qu’ils jouent un rôle central dans l’adaptation et le remodelage de la membrane thylakoïde dans des conditions environnementales en évolution rapide. La capacité d’isoler des plastoglobules de haute pureté a grandement facilité leur étude grâce à des méthodologies protéomiques, lipidomiques et autres. Avec des plastoglobules de grande pureté et de rendement, il est possible d’étudier leur composition lipidique et protéique, leur activité enzymatique et leur topologie protéique, entre autres caractéristiques moléculaires possibles. Cet article présente un protocole rapide et efficace pour l’isolement des plastoglobules à partir de chloroplastes de tissus foliaires végétaux et présente des variations méthodologiques pour l’isolement des plastoglobules et des structures de gouttelettes lipidiques apparentées à partir de feuilles de maïs, du tissu foliaire desséché de la plante de résurrection, Eragrostis nindensis, et de la cyanobactérie, Synechocystis . sp. PCC 6803. L’isolement repose sur la faible densité de ces particules riches en lipides, ce qui facilite leur purification par flottation de densité saccharose. Cette méthodologie s’avérera utile dans l’étude des plastoglobules de diverses espèces.
Introduction
La compréhension actuelle de la composition et de la fonction des plastoglobules a émergé grâce à des études protéomiques et lipidomiques détaillées 1,2,3,4,5. De telles études ont été grandement facilitées par une méthode d’isolement rapide et efficace qui repose sur leur très faible densité pour une séparation efficace à l’aide de gradients de saccharose. Les méthodes initiales d’isolement des plastoglobules ont été réalisées à partir d’espèces telles que le hêtre (Fagus sylvatica), le genêt à balais (Sarothamnus scoparius), l’oignon (Allium cepa), les épinards (Spinacia oleracea), la pensée (Viola tricolor), le poivre (Capsicum annuum) et le pois (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Une méthode mise à jour pour isoler les plastoglobules chloroplastiques d’une manière plus efficace et plus efficace a été présentée plus tard par Ytterberg et coll.3,14. Alors qu’initialement utilisé pour l’étude des plastoglobules des chloroplastes des feuilles d’Arabidopsis thaliana, nous avons utilisé avec succès cette méthode mise à jour pour les tissus foliaires sains d’autres espèces végétales, à la fois monocotylédones et dicotylédones, y compris le maïs (Zea mays), la tomate (Solanum lycopersicum), l’herbe d’amour (Eragrostis nindensis), le faux brome pourpre (Brachypodium distachyon) et le tabac sauvage (Nicotiana benthamiana ; résultats non publiés). De plus, la méthode d’isolement a été adaptée avec succès aux plastoglobules des cyanobactéries, y compris Synechocystis sp. PCC 6803 et Anabaena sp. PCC 712015, et au tissu foliaire desséché de la plante de résurrection, E. nindensis.
Les plastoglobules chloroplastiques du tissu foliaire sain sont physiquement connectés aux membranes thylakoïdes16. Malgré cette continuité physique, les deux sous-compartiments chloroplastiques conservent des compositions lipidiques et protéiques distinctes, bien que l’échange régulé de lipides et de protéines entre les deux compartiments ait été proposé 2,4,17,18,19. En fait, un modèle d’hémifusion intéressant a récemment été proposé pour le trafic de lipides neutres entre les chloroplastes et le cytosol19. En raison de la continuité physique des plastoglobules et des thylakoïdes, la méthode d’isolement avec du tissu foliaire sain commence par la collecte d’une préparation de thylakoïdes bruts en granulés, qui est ensuite soniquée pour séparer les plastoglobules des thylakoïdes, contrairement aux méthodes utilisées pour isoler les gouttelettes lipidiques cytosoliques20 . L’ultracentrifugation sur un coussin de saccharose fait ensuite flotter les plastoglobules de faible densité à travers le saccharose, les séparant efficacement des thylakoïdes, des noyaux et d’autres matériaux à haute densité. En revanche, les plastoglobules dans les cyanobactéries, ainsi que ceux des tissus foliaires desséchés, existent évidemment in vivo sous une forme flottante librement. Par conséquent, leur isolement implique de flotter directement sur un gradient de saccharose. Cet article démontre la méthode d’isolement à partir de tissus foliaires sains et démontre en outre deux variantes qui peuvent être utilisées pour isoler des plastoglobules à partir de tissus foliaires desséchés ou de cultures de cyanobactéries, élargissant considérablement l’étendue physiologique et le contexte évolutif dans lequel les plastoglobules peuvent être étudiés.
Les plastoglobules isolés peuvent ensuite être utilisés pour un certain nombre d’analyses en aval afin d’étudier les caractéristiques moléculaires. Nous avons utilisé les plastoglobules isolés du tissu foliaire d’A. thaliana pour une analyse protéomique et lipidomique approfondie dans différentes conditions environnementales ou génotypes, démontrant la modification sélective de la composition protéique et lipidique en adaptation au stress 2,4,21,22. En outre, des essais in vitro kinases démontrant une activité de transphosphorylation associée à des plastoglobules isolés ont été effectués22, les états oligomères des composants protéiques ont été étudiés à l’aide de l’électrophorèse sur gel natif 21 et des tests de rasage de protéase ont été effectués23.
Le principal avantage de cette méthode est la vitesse relative de la procédure. D’après notre expérience, les protocoles décrits ci-dessous peuvent être entièrement complétés en environ 4 heures. Une autre méthode pour isoler les plastoglobules du tissu foliaire a été décrite, ce qui permet l’isolement simultané d’autres sous-compartiments chloroplastiques24. Cette méthode alternative offre des avantages évidents lorsque la comparaison quantitative avec les autres sous-compartiments chloroplastiques est nécessaire ou souhaitée. Cependant, cette méthode alternative est également plus fastidieuse et fournira un rendement significativement plus faible de plastoglobules isolés à partir de quantités comparables de tissu foliaire. Lorsqu’une étude ciblée des plastoglobules est l’objectif, la méthodologie décrite ici est le choix optimal. Néanmoins, des aliquotes totales de feuilles et de thylakoïdes bruts peuvent être recueillies pendant la préparation de l’échantillon, et il est fortement recommandé de le faire, afin de disposer d’échantillons de référence pour une comparaison ultérieure.
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Protocol
1. Isolement brut de plastoglobules
- Extraction brute de plastoglobule à partir de tissus foliaires de maïs non stressés
- Acquérir six plants de maïs sains âgés d’environ 3 semaines et presque au stade de croissance V5, pesant environ 120 g.
- Coupez toutes les feuilles à la base de la tige, plongez-les rapidement dans un bain de glace et transportez-les dans la chambre froide.
- En travaillant sous une lampe de sécurité verte, retirez les feuilles de maïs du bain de glace et coupez-les en morceaux plus petits (environ 5 cm x 5 cm) à l’aide de ciseaux.
- Broyer délicatement mais soigneusement la moitié du tissu foliaire coupé dans un mélangeur commercial dans 350 ml de tampon de broyage (tableau 1). Démarrez-arrêtez le mélangeur 5x-6x pour vous assurer que toutes les feuilles sont coupées. N’utilisez pas de niveau supérieur au niveau 7 sur le mélangeur.
- Filtrer l’homogénat à travers une couche de tissu de nylon de 25 μm sur un grand entonnoir dans quatre bouteilles centrifugeuses de 250 mL. Ensuite, répétez l’étape 1.1.4 avec la seconde moitié du tissu foliaire coupé.
- Répartir uniformément le filtrat entre les quatre flacons et centrifuger pendant 6 min à 1 840 x g à 4 °C. Prélever une partie aliquote du filtrat de feuilles et la mettre de côté avant la centrifugation pour qu’elle soit conservée en tant qu’échantillon total représentatif de la feuille.
- Verser le surnageant résultant et remettre doucement en suspension la pastille dans 12 mL de milieu R 0,2 contenant 0,2 M de saccharose (tableau 1) en remuant et en remettant en suspension avec de doux mouvements de la brosse. Après avoir remis chaque pastille en suspension, portez la suspension sur le flacon suivant et répétez la remise en suspension. Regroupez les suspensions dans une seule bouteille.
- Répartir la suspension groupée entre six tubes à ultracentrifugeuses de 3 mL, en atteignant un volume maximal de 2,5 mL dans chaque tube.
- Soniquer chaque tube 4x, pendant 10 s à chaque fois, en utilisant un sonicateur à pointe à une amplitude de 100%. Veillez à garder la corne du sonicateur immergée et éloignée de la surface du liquide pour éviter la mousse.
- Déplacez lentement la corne du sonicateur de haut en bas dans la suspension pendant chaque tour. Alternez entre les quatre tubes, en retournant chaque tube dans un seau à glace après chaque sonication pour permettre à l’échantillon de refroidir.
- Centrifuger la suspension de thylakoïdes bruts soniqués à 150 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Récolter le tampon flottant résultant de plastoglobules bruts à la surface du coussin de saccharose (facilement considéré comme un tampon jaune huileux) à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de 22 G en écumant la surface du coussin avec l’ouverture de l’aiguille, récupérant environ 500 μL de chaque tube. Déposer dans un tube de 2,0 mL.
- Recueillir des aliquotes du thylakoïde brut avant et après la sonication et la libération de plastoglobules. Passez à l’étape 2.1. Vous pouvez également conserver les plastoglobules bruts à −80 °C et les purifier ultérieurement.
- Extraction brute de plastoglobule à partir de tissus foliaires d’E. nindensis desséchés
- Acquérir un pot (composé de trois plantes individuelles par pot) d’E. nindensis , âgé de 8 à 9 semaines (près de 40 g de tissu) entièrement desséché.
- Coupez tout le tissu foliaire de la base de la plante, juste au-dessus du sol, à l’aide de ciseaux et trempez immédiatement le tissu dans un bain de glace. Transportez le mouchoir en papier dans la chambre froide.
- En travaillant sous une lampe de sécurité verte, coupez le E. Les feuilles de Nindensis sont en morceaux plus petits (environ 5 cm x 5 cm) à l’aide de ciseaux.
- Broyer doucement mais soigneusement les feuilles avec 100 ml de tampon de broyage (tableau 1) dans un mélangeur commercial. Démarrez-arrêtez le mélangeur plusieurs fois pour vous assurer que toutes les feuilles sont coupées. N’utilisez pas de niveau supérieur au niveau 7 sur le mélangeur.
- Filtrer l’homogénat à travers une couche de tissu de nylon de 25 μm sur un grand entonnoir dans une fiole conique de 250 mL. Prélever une partie aliquote du filtrat de feuilles et la mettre de côté avant la centrifugation pour qu’elle soit conservée en tant qu’échantillon total représentatif de la feuille.
- Ajouter la quantité appropriée de saccharose pour porter à une concentration finale de 0,5 M et répartir la solution dans des tubes à centrifuger de 250 mL.
NOTE: Une concentration plus élevée de saccharose par rapport à la préparation de Z. mays est utilisée pour assurer la flottation des gouttelettes lipidiques cytosoliques avant la sonication / libération ultérieure des plastoglobules liés aux thylakoïdes. - Centrifuger les tubes à 45 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Un mélange de plastoglobules et de gouttelettes lipidiques cytosoliques sera facilement vu comme un tampon jaune huileux sur ou près de la surface du coussin de saccharose (Figure 1B). Recueillir le matériau flottant à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 22 G en écumant la surface du coussin avec l’ouverture de l’aiguille, et déposer dans un tube.
- Jeter le surnageant restant après avoir recueilli le mélange de plastoglobules/gouttelettes lipidiques flottant librement.
- Pour isoler les plastoglobules reliés au thylakoïde résiduel, remettre la pastille en suspension dans 12 mL de milieu R 0,2 en remuant et en la remettant en suspension avec de doux mouvements de la brosse. Regroupez les suspensions dans une seule bouteille. Passez à l’étape 1.1.8.
- Extraction brute de plastoglobules à partir de cyanobactéries
- Cultiver une culture de 50 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 jusqu’à la phase stationnaire (environ 7-10 jours) et ajuster la densité cellulaire à une DO750 de 2,0 à l’aide d’un spectrophotomètre. Pour les conditions de culture, utiliser un milieu BG-11 et cultiver dans un incubateur à une intensité lumineuse de 150 μmol photons/m 2/s, 2% de CO2, 32 °C et avec agitation continue à 150 tr/min.
- Pour éliminer les polysaccharides, laver les cellules en centrifugeant la culture de 50 mL à 6 000 x g pendant 45 minutes à 4 °C, puis en retirant le surnageant. Continuez en lavant les cellules deux fois dans 50 mL de tampon A (tableau 1). Retirer une partie aliquote de l’homogénat cellulaire et la mettre de côté avant la centrifugation pour qu’elle soit stockée en tant qu’échantillon cellulaire total représentatif
- Remettez en suspension la pastille lavée dans 25 ml de tampon A et cassez les cellules à l’aide d’une cellule de pression française à 1 100 psi, en répétant le processus 3x (mettez l’échantillon sur de la glace entre chaque cycle pour éviter la dénaturation des protéines) jusqu’à ce que la couleur lysée passe du vert au rouge-bleu-vert sous lumière blanche. Utilisez une cellule pré-refroidie et effectuez cette étape dans la chambre froide.
- Répartir l’homogénat résultant entre huit tubes à ultracentrifugeuses de 3 mL remplis jusqu’à un maximum de 2,5 mL dans chaque tube, puis recouvrir soigneusement de 400 μL de milieu R, produisant un gradient progressif.
NOTA : Voir Yang, et al. et Kelekar, et al. pour des descriptions détaillées de la préparation du gradient de saccharose25,26. - Équilibrer soigneusement les tubes en ajoutant un milieu R supplémentaire, si nécessaire, et centrifuger pendant 30 min à 150 000 x g à 4 °C. Le thylakoïde et d’autres organites plus lourds (y compris les corps polyhydroxyalcanoates) granulent, tandis que les plastoglobules seront facilement vus comme un tampon jaune huileux sur ou près du sommet du gradient de saccharose (Figure 1C).
- Récolter le tampon flottant résultant de plastoglobules bruts avec une seringue et une aiguille 22G et déposer dans un tube de 2 mL. Grattez les plastoglobules du côté de la paroi du tube ultracentrifuge avec l’extrémité de l’aiguille si nécessaire.
- Passez à l’étape 2.2. Vous pouvez également conserver les plastoglobules bruts à -80 °C et les purifier plus tard.
2. Récolte de plastoglobules purs
- Traitement des tissus végétaux
- Produire des gradients de saccharose dans des tubes à ultracentrifugeuses de 2,5 mL en superposant d’abord 500 μL de plastoglobules bruts de l’étape 1.1 ou 1.2 mélangés à 500 μL de milieu R 0,7, pour porter à un volume total de 1 mL, puis superposer avec 400 μL de milieu R 0,2, puis superposer avec 400 μL de milieu R.
NOTA : Voir Yang et coll. et Kelekar et coll. pour une description détaillée de la préparation du gradient de saccharose25,26. - Équilibrez soigneusement les tubes en ajoutant l’excès de milieu R à la couche supérieure, si nécessaire. Puis centrifuger à 150 000 x g pendant 1,5 h à 4 °C.
- Prélever le tampon flottant de plastoglobules purs (figure 1A) obtenu à l’aide d’une seringue et d’une aiguille 22G et le déposer dans un tube de 2 mL. Grattez les plastoglobules du haut de la paroi du tube de centrifugation avec l’extrémité de l’aiguille si nécessaire.
- Aliquote les plastoglobules purs et la congélation flash dans l’azote liquide. Conserver directement à -80 °C ou lyophiliser en poudre sèche.
- Produire des gradients de saccharose dans des tubes à ultracentrifugeuses de 2,5 mL en superposant d’abord 500 μL de plastoglobules bruts de l’étape 1.1 ou 1.2 mélangés à 500 μL de milieu R 0,7, pour porter à un volume total de 1 mL, puis superposer avec 400 μL de milieu R 0,2, puis superposer avec 400 μL de milieu R.
- Traitement des cyanobactéries
- Produire un gradient de saccharose dans quatre tubes ultracentrifuges de 2,5 mL superposés d’abord avec 500 μL de plastoglobules bruts de l’étape 1,3 mélangés à 750 μL de milieu R 0,7, puis superposés avec 750 μL de milieu R 0,2.
NOTA : Voir Yang et coll. et Kelekar et coll. pour une description détaillée de la préparation du gradient de saccharose25,26. - Centrifuger le gradient de saccharose à 150 000 x g pendant 90 min à 4 °C. Prélever les plastoglobules purs (figure 1C) à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de 22 G dans la phase supérieure du gradient de saccharose et transférer dans un tube de 1,5 mL.
- Aliquote les plastoglobules purs et surgélation instantanée dans de l’azote liquide. Conserver directement à −80 °C ou lyophiliser en poudre sèche.
- Produire un gradient de saccharose dans quatre tubes ultracentrifuges de 2,5 mL superposés d’abord avec 500 μL de plastoglobules bruts de l’étape 1,3 mélangés à 750 μL de milieu R 0,7, puis superposés avec 750 μL de milieu R 0,2.
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Representative Results
À la fin de l’étape 1 du protocole, on devrait être en mesure de voir facilement une quantité considérable de plastoglobules/gouttelettes lipidiques flottant sur (ou à proximité) de la couche supérieure du coussin de saccharose (figure 1B-C). D’autres fractions pourraient également être collectées à ce stade. Par exemple, les thylakoïdes seront granulés et pourront être remis en suspension avec un milieu R 0,2 pour des analyses ultérieures. Après centrifugation ultérieure, des plastoglobules purifiés seront obtenus à la surface ou près de la surface du gradient de saccharose, comme le montre la figure 1A,C. On a vu dans certaines circonstances (p. ex. des raies génotypiques spécifiques ou des conditions environnementales) que les plastoglobules s’isoleront en deux sous-populations distinctes se séparant à différentes couches du gradient : une fraction de faible densité sur la surface du gradient et une deuxième fraction plus dense qui se dépose à l’interface entre les deux couches supérieures du gradient. Bien qu’une analyse comparative minutieuse des fractions séparatrices n’ait pas été effectuée auparavant, il semble probable que ces sous-populations représentent des plastoglobules de tailles différentes, dans lesquels celles ayant un diamètre plus petit (et donc un rapport surface/volume et protéine/lipide plus élevés) s’installeront plus bas dans le gradient.
Dans une tentative infructueuse, on verra peu ou pas de plastoglobules visibles à la surface du coussin de saccharose après le premier cycle de centrifugation. L’incapacité à isoler suffisamment de plastoglobules peut dépendre de plusieurs facteurs qui peuvent avoir besoin d’être optimisés. En particulier, la technique de sonication (lors de l’utilisation de tissus foliaires sains) peut avoir un impact significatif sur le succès. De plus, la quantité nécessaire de matériel végétal / cyanobactérien dépendra de l’espèce spécifique et de ses conditions de stress.
Après l’isolement réussi des plastoglobules, il est possible de valider la pureté des plastoglobules isolés en utilisant l’immunoblot des protéines marqueurs pour les plastoglobules et les thylakoïdes (le compartiment contaminant primaire). Dans la figure 1D, des immunotransferts représentatifs sont observés en utilisant des anticorps élevés contre A. thaliana FBN1a, comme marqueur des plastoglobules2, et contre la sous-unité D1 du photosystème II d’A. thaliana, comme marqueur des thylakoïdes27. Les homologues FBN chez Synechocystis sp. PCC 6803 s’associent principalement aux thylakoïdes plutôt qu’aux plastoglobules.
Il convient également d’examiner attentivement le mode de stockage, qui peut dépendre des études en aval prévues. En particulier pour les analyses en aval des lipides pigmentaires prényl-lipidiques, il est crucial de minimiser l’exposition des échantillons à la lumière directe pour éviter d’endommager les composés photolabiles. Les plastoglobules purifiés peuvent être utilisés pour des expériences en aval telles que des expériences lipidomiques ou protéomiques. Les plastoglobules sont caractérisés par un très faible rapport protéines / lipides, ce qui se manifeste par leur faible densité et leur capacité à flotter sur le saccharose; Ainsi, une faible concentration en protéines des échantillons de plastoglobules est normale. Pour cette raison, il est conseillé d’éliminer les lipides avant la séparation des protéines par SDS-PAGE en utilisant la précipitation des protéines d’acétone ou l’extraction au chloroforme/méthanol.
Figure 1 : Isolement et immunoblot des plastoglobules et des thylakoïdes. (A) Un échantillon représentatif de plastoglobule purifié de Z. mays avant extraction du gradient de saccharose. (B) Un échantillon brut représentatif de plastoglobule provenant d’E. nindensis desséché avant extraction du coussin de saccharose. (C) Un échantillon représentatif de plastoglobule brut (à gauche) et pur (à droite) de Synechocystis sp. PCC 6803, montrant à la fois avant et après l’ultracentrifugation du coussin de saccharose chargé et du gradient, respectivement. (D) L’anticorps anti-fibrilline1a (α-FBN1a) a été utilisé pour surveiller l’accumulation de fibrilline, une protéine marqueur des plastoglobules chez les plantes supérieures. L’orthologue de la fibrilline s’accumule principalement dans les thylakoïdes isolés des cyanobactéries (Synecho, Syenchocystis sp. PCC 6803). La sous-unité D1 (α-PsbA) de l’anti-photosystème II a été utilisée pour valider la déplétion des thylakoïdes à partir d’isolements plastoglobulés. Dans chaque voie, 5 μg de thylakoïdes et 10 μg de protéines plastoglobules ont été chargés. Abréviations : PG = plastoglobules; Thy = thylakoïdes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Compositions tampons a | |
| Tampon de broyage | 50 mM HEPES-KOH (PH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 100 mM de sorbitol | |
| 5 mM d’acide ascorbique b | |
| 5 mM de cystéine b réduite | |
| 0,05 % (p/v) BSA b | |
| Moyen R | 50 mM HEPES-KOH (PH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| Moyen R 0,2 | 50 mM HEPES-KOH (PH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0,2 M saccharose | |
| Moyenne R 0,7 | 50 mM HEPES-KOH (PH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0,7 M de saccharose | |
| Tampon A | 25 mM HEPES-KOH (PH 7,8) |
| 250 mM de saccharose | |
| a Les concentrations finales de chaque composant tampon sont fournies. | |
| b Doit être ajouté frais le jour de l’isolement. Bien que des tampons puissent être préparés la veille de l’isolement, ces ingrédients doivent être ajoutés frais le jour de l’isolement, ainsi que les inhibiteurs de phosphatase et de protéase. | |
Tableau 1 : Recettes tampons pour l’isolement des plastoglobules à partir de tissus foliaires végétaux ou de cyanobactéries.
| Cocktail inhibiteur de phosphatase b | |
| Inhibiteur | Conc. finale (mM) |
| Na-fluorure | 50 |
| β-Glycérophosphate⋅2Na⋅5H2O | 25 |
| Na-OrthoVanadate | 1 |
| Na-pyrophosphate⋅10H2O | 10 |
| b Les inhibiteurs de la phosphatase doivent être ajoutés frais le jour de l’isolement. | |
Tableau 2 : Cocktail d’inhibiteurs de phosphatase.
| Cocktail d’inhibiteurs de protéase a | ||||
| Inhibiteur | Stock (mg/mL) | Support stock | Facteur de dilution | Conc. finale (mg/mL) |
| Antidouleur⋅2HCl | 20 | Eau | 400x | 50 |
| Béstatine | 1 | 0,15 M NaCl | 25x | 40 |
| Chymostatine | 20 | DMSO | 2020: | 10 |
| E-64 | 20 | Eau | 2020: | 10 |
| Leupeptin (hémisulfate) | 20 | Eau | 4000x | 5 |
| P-ramidon⋅2Na | 20 | Eau | 2020: | 10 |
| AEBSF | 50 | Eau | 1000x | 50 |
| Aprotinine | 10 | Eau | 5000x | 2 |
| a Les solutions mères de protéase doivent être conservées à -20 °C dans de petites aliquotes en vue d’un stockage à long terme. Décongeler et ajouter frais au tampon approprié immédiatement avant l’isolement. | ||||
Tableau 3 : Cocktail d’inhibiteurs de protéase.
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Discussion
Pour minimiser les changements physiologiques / biochimiques du matériau et protéger certains pigments prényl-lipidiques photo- et thermo-labiles qui sont un composant riche des plastoglobules, il est essentiel d’effectuer l’isolement à 4 ° C et à l’abri de la lumière. Comme indiqué ci-dessus, les étapes initiales sont effectuées en chambre froide sous une lampe de sécurité à l’aide d’une ampoule à émission verte. Les étapes suivantes effectuées en laboratoire sont sous des lumières tamisées et utilisent de la glace ou une centrifugation réfrigérée. Pour des raisons similaires, l’inclusion d’inhibiteurs de protéase frais (et d’inhibiteurs de phosphatase s’il existe un intérêt pour l’étude de la phosphorégulation des protéines) est essentielle (tableaux 2 et 3).
Alors que d’autres méthodes (par exemple, un homogénéisateur de Dounce, des cycles de gel-dégel) pourraient, en principe, être utilisées pour libérer des plastoglobules des thylakoïdes dans les chloroplastes végétaux supérieurs, la sonication s’est avérée de loin supérieure pour fournir le meilleur rendement et la meilleure pureté (résultats non publiés). La sonication peut créer des vésicules artificielles à partir de lamelles thylakoïdes ou de réticulum endoplasmique; Cependant, ces vésicules seraient très riches en protéines et, par conséquent, denses, empêchant leur flottation sur le gradient de saccharose.
Lors de l’extraction du tampon flottant de plastoglobules purs du gradient de saccharose, il est avantageux de les extraire dans la plus petite quantité possible de milieu R. L’acquisition de plastoglobules concentrés de cette manière facilite les études en aval en minimisant les volumes d’échantillons nécessaires. L’utilisation d’une seringue et d’une aiguille de 22 G est la stratégie la plus efficace pour extraire les plastoglobules. En raison de leur nature hydrophobe et riche en lipides, ils sont extrêmement collants et l’utilisation d’embouts de pipettes ou d’une spatule doit être évitée à tout prix. Il a été constaté que la perte de plastoglobules due au collage est mieux minimisée avec une seringue et une aiguille, bien qu’il ne semble pas possible d’empêcher complètement certaines pertes lors de l’extraction.
Si une couche de plastoglobules jaune-crémeux facilement visible n’est pas visible flottant sur ou près de la surface du gradient de saccharose, il se peut que le matériel végétal ou cyanobactérien ait été insuffisant pour l’isolement. Il a été constaté que les monocotylédones donnent des rendements en plastoglobules plus élevés que les dicotylédones à partir de quantités comparables de tissus végétaux (résultats non publiés). Bien que des quantités appropriées de matériel biologique de départ soient indiquées pour les isolements spécifiques illustrés dans cet article, les quantités nécessaires de tissu pour une extraction efficace doivent être déterminées empiriquement en fonction de l’espèce, des tissus et des conditions environnementales de l’organisme. En général, les cultures de tissus foliaires stressés (mais non nécrotiques) ou de cyanobactéries donneront des rendements plus élevés en plastoglobules. Lors de l’utilisation de tissus foliaires d’A. thaliana, deux plates de plantes d’A. thaliana (près de 140 plantes individuelles) du stade de croissance végétative moyen sont généralement suffisantes pour isoler les plastoglobules, en particulier lorsque le matériel végétal est légèrement stressé, par exemple, par un traitement de stress léger 2,4. Comme autre explication des faibles rendements, l’homogénéisation initiale du tissu foliaire avec le mélangeur peut avoir été trop vigoureuse et séparer prématurément les plastoglobules des thylakoïdes, ou la sonication du matériau brut des thylakoïdes peut avoir été insuffisamment vigoureuse pour libérer efficacement les plastoglobules avant la flottation (ces points ne sont pas un problème lors de l’extraction de cyanobactéries, qui flottent librement in situ).
Il est important de garder à l’esprit que l’isolement des plastoglobules représentera la population globale de plastoglobules provenant d’un échantillon de tissu. Par conséquent, toute hétérogénéité possible dans les lipides, les protéines ou la fonction ne serait pas discernable à partir d’études ultérieures. En raison de cette limitation, il n’a pas été possible d’évaluer le degré d’hétérogénéité qui peut exister entre les gouttelettes lipidiques de plastoglobules individuelles. Cependant, les micrographies électroniques à transmission du tissu foliaire végétal de plusieurs organismes révèlent des modèles de coloration différentiels entre les plastoglobules, même dans le même chloroplaste 28,29,30,31. Cela suggère fortement une hétérogénéité dans la teneur en lipides, bien que la nature ou le but de celle-ci reste incertain. De manière significative, les micrographies électroniques de plastoglobules isolés d’A. thaliana démontrent que cette méthode d’isolement n’est pas biaisée pour l’isolement de plastoglobules plus ou moins grands2.
L’isolement des plastoglobules purs représente la première étape vers leur caractérisation moléculaire détaillée. De nombreuses applications en aval peuvent ensuite être réalisées en fonction des intérêts spécifiques et de la finalité de l’investigateur. Par exemple, pour étudier la composition lipidique ou protéique, l’échantillon isolé se prête facilement à des études protéomiques ou lipidomiques. L’approche de digestion en gel est privilégiée pour les études protéomiques ascendantes d’échantillons de plastoglobules. Cependant, parce que les lipides sont en grande quantité par rapport aux protéines, le lipide peut interférer avec la séparation SDS-PAGE. La précipitation initiale des protéines à l’aide d’acétone, avec remise en suspension ultérieure dans le tampon de solubilisation Laemmli, élimine la plupart des lipides, permettant ainsi une séparation efficace des protéines dans le gel de séparation SDS-PAGE. La remise en suspension initiale de la pastille de protéine dans un tampon tris-HCl de 100 mM et un SDS à 2% permet une détermination précise de la teneur en protéines par la méthode de l’acide bicinchoninique avant l’ajout de réducteur, de colorant et de glycérol. De même, la purification lipidique par des méthodes de séparation en phase liquide-liquide, telles que la méthode Bligh et Dyer, convient aux analyses lipidomiques en aval32.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
La recherche dans le groupe de laboratoire Lundquist est soutenue par des subventions de la NSF (MCB-2034631) et de l’USDA (MICL08607) à P.K.L. Les auteurs remercient la Dre Carrie Hiser (MSU) pour son soutien dans le développement de la méthode d’isolement des plastoglobules cyanobactériens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
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