Summary
En hurtig og effektiv protokol præsenteres til isolering af plastoglobulelipiddråber forbundet med forskellige fotosyntetiske organismer. Den vellykkede forberedelse af isolerede plastoglobuler er et afgørende første skridt, der går forud for detaljerede molekylære undersøgelser såsom proteomiske og lipidomiske analyser.
Abstract
Plastoglobulelipiddråber er et dynamisk underrum af plantekloroplaster og cyanobakterier. Fundet allestedsnærværende blandt fotosyntetiske arter, menes de at tjene en central rolle i tilpasningen og ombygningen af thylakoidmembranen under hurtigt skiftende miljøforhold. Kapaciteten til at isolere plastoglobuler af høj renhed har i høj grad lettet deres undersøgelse gennem proteomiske, lipidomiske og andre metoder. Med plastoglobuler med høj renhed og udbytte er det muligt at undersøge deres lipid- og proteinsammensætning, enzymatisk aktivitet og proteintopologi, blandt andre mulige molekylære egenskaber. Denne artikel præsenterer en hurtig og effektiv protokol til isolering af plastoglobuler fra kloroplaster af plantebladvæv og præsenterer metodologiske variationer til isolering af plastoglobuler og beslægtede lipiddråbestrukturer fra majsblade, det udtørrede bladvæv fra opstandelsesplanten, Eragrostis nindensis, og cyanobakterien, Synechocystis sp. PCC 6803. Isolering er afhængig af den lave densitet af disse lipidrige partikler, hvilket letter deres oprensning ved flotation af saccharosedensitet. Denne metode vil vise sig værdifuld i undersøgelsen af plastoglobuler fra forskellige arter.
Introduction
Den nuværende forståelse af plastoglobulesammensætning og funktion er fremkommet gennem detaljerede proteomiske og lipidomiske undersøgelser 1,2,3,4,5. Sådanne undersøgelser er i høj grad blevet hjulpet af en hurtig og effektiv isolationsmetode, der er afhængig af deres meget lave densitet for effektiv adskillelse ved hjælp af saccharosegradienter. Indledende metoder til plastoglobuleisolering blev opnået fra arter som bøgetræet (Fagus sylvatica), skotsk kost (Sarothamnus scoparius), løg (Allium cepa), spinat (Spinacia oleracea), stedmoderblomst (Viola tricolor), peber (Capsicum annuum) og ærter (Pisum sativum) 6,7,8,9,10,11 ,12,13. En opdateret metode til at isolere kloroplastplastplastlobuler på en mere effektiv og bedre eftergivende måde blev senere præsenteret af Ytterberg et al.3,14. Mens vi oprindeligt blev anvendt til undersøgelse af plastoglobuler af Arabidopsis thaliana bladkloroplaster, har vi med succes anvendt denne opdaterede metode til det sunde bladvæv fra andre plantearter, både monocot og dicot, herunder majs (Zea mays), tomat (Solanum lycopersicum), kærlighedsgræs (Eragrostis nindensis), lilla falsk brom (Brachypodium distachyon) og vild tobak (Nicotiana benthamiana ; ikke-offentliggjorte resultater). Desuden er isolationsmetoden med succes blevet tilpasset plastoglobulerne af cyanobakterier, herunder Synechocystis sp. PCC 6803 og Anabaena sp. PCC 712015, og det udtørrede bladvæv fra opstandelsesplanten, E. nindensis.
Chloroplast plastoglobuler af sundt bladvæv er fysisk forbundet med thylakoidmembranerne16. På trods af denne fysiske kontinuitet opretholder de to kloroplastunderrum forskellige lipid- og proteinsammensætninger, selvom den regulerede udveksling af lipid og protein mellem de to rum er blevet foreslået 2,4,17,18,19. Faktisk er der for nylig blevet foreslået en interessant hemifusionsmodel til handel med neutrale lipider mellem kloroplaster og cytosol19. På grund af den fysiske kontinuitet af plastoglobuler og thylakoider begynder isolationsmetoden med sundt bladvæv med opsamlingen af et pelleteret råt thylakoidpræparat, som efterfølgende sonikeres for at adskille plastoglobulerne fra thylakoiderne, hvilket er i modsætning til metoder, der anvendes til isolering af cytosoliske lipiddråber20 . Ultracentrifugering på en saccharosepude flyder derefter plastoglobulerne med lav densitet op gennem saccharose, hvilket effektivt adskiller dem fra thylakoiderne, kernerne og andet materiale med høj densitet. I modsætning hertil findes plastoglobuler i cyanobakterier såvel som i udtørret bladvæv åbenbart in vivo i en fritflydende form. Derfor involverer deres isolering direkte flydende på en saccharosegradient. Denne artikel demonstrerer isolationsmetoden fra sundt bladvæv og demonstrerer yderligere to variationer, der kan bruges til at isolere plastoglobuler fra udtørret bladvæv eller cyanobakterielle kulturer, hvilket i høj grad udvider den fysiologiske bredde og evolutionære kontekst, hvori plastoglobuler kan studeres.
Isolerede plastoglobuler kan efterfølgende anvendes til et vilkårligt antal downstream-analyser for at undersøge molekylære egenskaber. Vi har brugt de isolerede plastoglobuler fra A. thaliana bladvæv til omfattende proteomisk og lipidomisk analyse under forskellige miljøforhold eller genotyper, hvilket demonstrerer den selektive modifikation af protein- og lipidsammensætning i tilpasning til stress 2,4,21,22. Derudover er in vitro-kinaseassays, der demonstrerer transphosphoryleringsaktivitet forbundet med isolerede plastoglobuler, blevet udført22, de oligomere tilstande af proteinkomponenter er blevet undersøgt under anvendelse af native gelelektroforese 21, og proteasebarberingsassays er blevet udført23.
Den primære fordel ved denne metode er procedurens relative hastighed. Efter vores erfaring kan nedenstående protokoller være fuldt ud afsluttet inden for ca. 4 timer. En alternativ metode til isolering af plastoglobuler fra bladvæv er blevet beskrevet, hvilket muliggør samtidig isolering af andre chloroplastunderrum24. Denne alternative metode giver nogle klare fordele, når kvantitativ sammenligning med de andre kloroplastunderrum er nødvendig eller ønsket. Denne alternative metode er imidlertid også mere kedelig og vil give et signifikant lavere udbytte af isolerede plastoglobuler fra sammenlignelige mængder bladvæv. Når en fokuseret undersøgelse af plastoglobuler er målet, er den metode, der er skitseret her, det optimale valg. Ikke desto mindre kan der indsamles totale blad- og rå thylakoidalikvoter under prøveforberedelsen, og det anbefales stærkt at gøre det for at have referenceprøver til efterfølgende sammenligning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rå plastoglobuleisolering
- Ekstraktion af rå plastoglobule fra ubelastet majsbladvæv
- Anskaf seks sunde majsplanter, der er ca. 3 uger gamle og næsten på V5-vækststadiet, vejer ca. 120 g.
- Klip alle bladene i bunden af stilken af, dunk dem hurtigt i et isbad og transporter til det kolde rum.
- Fjern majsbladene fra isbadet under en grøn sikkerhedslampe, og klip dem i mindre stykker (ca. 5 cm x 5 cm) med en saks.
- Slip forsigtigt men grundigt halvdelen af det afklippede bladvæv i en kommerciel blender i 350 ml slibebuffer (tabel 1). Start-stop blenderen 5x-6x for at sikre, at alle blade skæres. Brug ikke højere end niveau 7 på blenderen.
- Filtrer homogenatet gennem et lag 25 μm nylonklud på en stor tragt i fire 250 ml centrifugeflasker. Gentag derefter trin 1.1.4 med den anden halvdel af det klippede bladvæv.
- Filtratet fordeles jævnt mellem de fire flasker og centrifugeres i 6 minutter ved 1.840 x g ved 4 °C. En delprøve af bladfiltratet fjernes, og inden centrifugeringen lægges den til side for at blive opbevaret som en repræsentativ samlet bladprøve.
- Den resulterende supernatant hældes af, og pelletsen resuspenderes forsigtigt i 12 ml medium R 0,2 indeholdende 0,2 M saccharose (tabel 1) ved hvirvling og opslæmning med blide bevægelser af børsten. Efter resuspendering af hver pellet overføres suspensionen til den næste flaske og gentages resuspensionen. Saml suspensionerne i en flaske.
- Den samlede suspension fordeles mellem seks 3 ml ultracentrifugeglas og når et maksimalt volumen på 2,5 ml i hvert rør.
- Sonikere hvert rør 4x, for 10 s hver gang, ved hjælp af en spids sonikator ved en amplitude på 100%. Vær omhyggelig med at holde sonikatorhornet nedsænket og væk fra væskeoverfladen for at forhindre skumning.
- Bevæg langsomt sonikatorhornet op og ned i suspensionen under hver runde. Skift mellem de fire rør, og returner hvert rør til en isspand efter hver sonikering for at lade prøven afkøle.
- Centrifuger den sonikerede rå thylakoid suspension ved 150.000 x g i 30 minutter ved 4 °C. Den resulterende flydende pude af rå plastoglobuler høstes fra overfladen af saccharosepuden (let synlig som en gul, olieagtig pude) ved hjælp af en sprøjte og 22 G kanyle ved at skumme overfladen af puden med kanylens åbning og genvinde ca. 500 μL fra hvert rør. Deponering i et 2,0 ml rør.
- Saml alikvoter af den rå thylakoid før og efter sonikering og frigivelse af plastoglobuler. Fortsæt til trin 2.1. Alternativt opbevares de rå plastoglobuler ved -80 °C og renses på et senere tidspunkt.
- Ekstraktion af rå plastoglobule fra udtørret E. nindensis bladvæv
- Anskaf en potte (bestående af tre individuelle planter pr. potte) med fuldt udtørret, 8-9 uger gammel E. nindensis (næsten 40 g væv).
- Klip alt bladvæv fra bunden af planten, lige over jorden, ved hjælp af en saks og dunk straks vævet i et isbad. Transport vævet til kølerummet.
- Arbejd under en grøn sikkerhedslampe, klip E. Nindensis blade i mindre stykker (ca. 5 cm x 5 cm) ved hjælp af en saks.
- Mal forsigtigt men grundigt bladene med 100 ml slibebuffer (tabel 1) i en kommerciel blender. Start-stop blenderen flere gange for at sikre, at alle blade skæres. Brug ikke højere end niveau 7 på blenderen.
- Homogenatet filtreres gennem et lag 25 μm nylonklud på en stor tragt i en 250 ml konisk kolbe. En delprøve af bladfiltratet fjernes, og inden centrifugeringen lægges den til side for at blive opbevaret som en repræsentativ samlet bladprøve.
- Der tilsættes en passende mængde saccharose for at nå frem til en slutkoncentration på 0,5 M, og opløsningen fordeles i 250 ml centrifugeglas.
BEMÆRK: En højere koncentration af saccharose sammenlignet med Z. mays-præparatet anvendes til at sikre flotation af de cytosoliske lipiddråber inden den efterfølgende sonikering / frigivelse af de thylakoidbundne plastoglobuler. - Centrifuger glassene ved 45.000 x g i 30 minutter ved 4 °C. En blanding af plastoglobuler og cytosoliske lipiddråber ses let som en gul, olieagtig pude på eller nær overfladen af saccharosepuden (figur 1B). Det flydende materiale opsamles ved hjælp af en sprøjte med en 22 G nål ved at skumme overfladen af puden med kanylens åbning og deponeres i et rør.
- Den resterende supernatant kasseres efter opsamling af den fritflydende blanding af plastoglobule/lipiddråber.
- For at isolere plastoglobulerne forbundet med resterende thylakoid resuspenderes pelleten i 12 ml medium R 0,2 ved hvirvlende og resuspendering med blide bevægelser af børsten. Saml suspensionerne i en flaske. Fortsæt til trin 1.1.8.
- Ekstraktion af rå plastoglobule fra cyanobakterier
- Dyrk en 50 ml kultur af Synechocystis sp. PCC 6803 til den stationære fase (ca. 7-10 dage) og juster celletætheden til en OD750 på 2,0 ved hjælp af et spektrofotometer. Til dyrkningsbetingelser skal du bruge BG-11-medier og vokse i en inkubator ved en lysintensitet på 150 μmol fotoner / m 2 / s, 2% CO2, 32 ° C og med kontinuerlig omrystning ved 150 o / min.
- For at fjerne polysacchariderne vaskes cellerne ved centrifugering af 50 ml kulturen ved 6.000 x g i 45 minutter ved 4 °C og derefter fjernelse af supernatanten. Fortsæt med at vaske cellerne to gange i 50 ml buffer A (tabel 1). En prøve af cellehomogenatet udtages, og den sættes til side inden centrifugering for at blive opbevaret som en repræsentativ samlet celleprøve
- Resuspender den vaskede pellet i 25 ml buffer A og bryd cellerne ved hjælp af en fransk trykcelle ved 1.100 psi, gentag processen 3x (læg prøven på is mellem hver cyklus for at undgå proteindenaturering), indtil den lyserede farve skifter fra grøn til rødblågrøn under hvidt lys. Brug en forkølet celle og udfør dette trin i kølerummet.
- Det resulterende homogenat fordeles mellem otte 3 ml ultracentrifugeglas fyldt til maksimalt 2,5 ml i hvert rør, og derefter forsigtigt overlejres med 400 μL medium R, hvilket giver en tringradient.
BEMÆRK: Se Yang, et al. og Kelekar, et al. for detaljerede beskrivelser af saccharosegradientpræparat25,26. - Reagensglassene afbalanceres forsigtigt ved om nødvendigt at tilsætte yderligere medium R, og centrifugeres i 30 minutter ved 150.000 x g ved 4 °C. Thylakoid og andre tungere organeller (herunder eventuelle polyhydroxyalkanoatlegemer) vil pellet, mens plastoglobuler let ses som en gul, olieagtig pude på eller nær toppen af saccharosegradienten (figur 1C).
- Høst den resulterende flydende pude af rå plastoglobuler med en sprøjte og 22G nål og deponer i et 2 ml rør. Skrab plastoglobuler af siden af ultracentrifugerørets væg med nålespidsen, hvis det er nødvendigt.
- Fortsæt til trin 2.2. Alternativt opbevares rå plastoglobuler ved -80 °C og renses senere.
2. Høstning af rene plastoglobuler
- Behandling af plantevæv
- Der fremstilles saccharosegradienter i 2,5 ml ultracentrifugeglas ved først lagdeling med 500 μL rå plastoglobuler fra trin 1.1 eller trin 1.2 blandet med 500 μL medium R 0,7 for at bringe et samlet volumen på 1 ml og derefter overlejres med 400 μL medium R 0,2 efterfulgt af overlejring med 400 μL medium R.
BEMÆRK: Se Yang et al. og Kelekar et al. for detaljerede beskrivelser af saccharosegradientpræparat25,26. - Afbalancer forsigtigt rørene ved at tilføje overskydende medium R til det øverste lag efter behov. Derefter centrifugeres ved 150.000 x g i 1,5 timer ved 4 °C.
- Høst den resulterende flydende pude af rene plastoglobuler (figur 1A) med en sprøjte og 22G nål og deponer i et 2 ml rør. Skrab om nødvendigt plastoglobuler af toppen af centrifugerørets væg med nålespidsen.
- Aliquot de rene plastoglobuler og flash fryse i flydende nitrogen. Opbevares direkte ved -80 °C eller frysetørres til et tørt pulver.
- Der fremstilles saccharosegradienter i 2,5 ml ultracentrifugeglas ved først lagdeling med 500 μL rå plastoglobuler fra trin 1.1 eller trin 1.2 blandet med 500 μL medium R 0,7 for at bringe et samlet volumen på 1 ml og derefter overlejres med 400 μL medium R 0,2 efterfulgt af overlejring med 400 μL medium R.
- Behandling af cyanobakterier
- Der fremkommer en saccharosegradient i fire 2,5 ml ultracentrifugeglas, der først lægges i lag med 500 μL af de rå plastoglobuler fra trin 1.3 blandet med 750 μL medium R 0,7, derefter overlejres med 750 μL medium R 0,2.
BEMÆRK: Se Yang et al. og Kelekar et al. for detaljerede beskrivelser af saccharosegradientpræparat25,26. - Saccharosegradienten centrifugeres ved 150 000 x g i 90 minutter ved 4 °C. De rene plastoglobuler (figur 1C) opsamles med en sprøjte og en 22 G kanyle fra den øverste fase af saccharosegradienten og overføres til et 1,5 ml glas.
- Aliquot de rene plastoglobuler og lynfrysning i flydende nitrogen. Opbevares direkte ved -80 °C eller frysetørres til et tørt pulver.
- Der fremkommer en saccharosegradient i fire 2,5 ml ultracentrifugeglas, der først lægges i lag med 500 μL af de rå plastoglobuler fra trin 1.3 blandet med 750 μL medium R 0,7, derefter overlejres med 750 μL medium R 0,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter afslutningen af trin 1 i protokollen skal man let kunne se en betydelig mængde plastoglobule / lipiddråbemateriale flyde på (eller nær) det øverste lag af saccharosepuden (figur 1B-C). Andre fraktioner kunne også indsamles på dette stadium. For eksempel vil thylakoiderne blive pelleteret og kan resuspenderes med medium R 0,2 til efterfølgende analyser. Efter efterfølgende centrifugering opnås rensede plastoglobuler på eller nær overfladen af saccharosegradienten som vist i figur 1A,C. Det er under visse omstændigheder set (f.eks. specifikke genotypiske linjer eller miljøforhold), at plastoglobulerne isolerer sig som to forskellige underpopulationer, der adskiller sig i forskellige lag i gradienten: en fraktion med lav densitet på gradientoverfladen og en anden, tættere fraktion, der sætter sig ved grænsefladen mellem de to øverste gradientlag. Mens en omhyggelig komparativ analyse af de adskillende fraktioner ikke tidligere er blevet udført, forekommer det sandsynligt, at disse underpopulationer repræsenterer plastoglobuler af forskellig størrelse, hvor de med mindre diameter (og dermed større overfladeareal til volumenforhold og protein til lipidforhold) vil slå sig lavere ned i gradienten.
I et mislykket forsøg vil man se lidt eller ingen synlige plastoglobuler på overfladen af saccharosepuden efter den første centrifugeringsrunde. Manglende vellykket isolering af nok plastoglobuler kan afhænge af flere faktorer, der muligvis skal optimeres. Især sonikeringsteknikken (ved brug af sundt bladvæv) kan have en betydelig indvirkning på succesen. Derudover vil den nødvendige mængde plante-/cyanobakteriemateriale være afhængig af den specifikke art og dens stresstilstand.
Efter den vellykkede isolering af plastoglobuler er det muligt at validere renheden af de isolerede plastoglobuler ved anvendelse af immunoblotting af markørproteinerne til plastoglobuler og thylakoider (det primære forurenende rum). I figur 1D ses repræsentative immunblots ved anvendelse af antistoffer hævet mod A. thaliana FBN1a, som markør for plastoglobuler2, og mod A. thaliana fotosystem II underenhed D1, som markør for thylakoider27. FBN-homologerne i Synechocystis sp. PCC 6803 associerer primært med thylakoider snarere end plastoglobuler.
Man bør også nøje overveje opbevaringsmetoden, som kan afhænge af de påtænkte downstream-undersøgelser. Især til downstream-analyser af prenyllipidpigmentlipider er det afgørende at minimere eksponeringen af prøverne for direkte lys for at undgå beskadigelse af de fotolabile forbindelser. Oprensede plastoglobuler kan anvendes til downstream-eksperimenter såsom lipidomiske eller proteomiske baserede eksperimenter. Plastoglobuler er kendetegnet ved et meget lavt protein til lipidforhold, hvilket manifesterer sig i deres lave densitet og evne til at flyde på saccharose; Således er en lav proteinkoncentration af plastoglobulusprøverne normal. Af denne grund anbefales det at fjerne lipider inden proteinseparation ved SDS-PAGE ved hjælp af acetoneproteinudfældning eller chloroform / methanolekstraktion.
Figur 1: Isolering og immunblotting af plastoglobuler og thylakoider . A) En repræsentativ renset plastoglobulusprøve fra Z. mays før ekstraktion fra saccharosegradienten. B) En repræsentativ rå plastoglobulusprøve fra udtørret E. nindensis inden ekstraktion fra saccharosepuden. C) En repræsentativ rå (venstre) og ren (højre) plastoglobuleprøve fra Synechocystis sp. PCC 6803, der viser både før og efter ultracentrifugering af henholdsvis den fyldte saccharosepude og gradient. (D) Anti-fibrillin1a-antistof (α-FBN1a) blev anvendt til at overvåge akkumuleringen af fibrillin, et markørprotein af plastoglobuler i højere planter. Fibrillinortologen akkumuleres overvejende i de isolerede thylakoider af cyanobakterier (Synecho, Syenchocystis sp. PCC 6803). Anti-fotosystem II underenhed D1 (α-PsbA) blev brugt til at validere udtømningen af thylakoider fra plastoglobuleisoleringer. I hver bane blev 5 μg thylakoider og 10 μg plastoglobuleprotein indlæst. Forkortelser: PG = plastoglobuler; Din = thylakoider. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Buffersammensætninger a | |
| Slibebuffer | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 100 mM sorbitol | |
| 5 mM ascorbinsyre b | |
| 5 mM reduceret cystein b | |
| 0,05 % (w/v) BSA b | |
| Mellem R | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| Mellem R 0,2 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0,2 M saccharose | |
| Mellem R 0,7 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0,7 M saccharose | |
| Buffer A | 25 mM HEPES-KOH (pH 7,8) |
| 250 mM saccharose | |
| Der oplyses endelige koncentrationer af hver bufferkomponent. | |
| b Skal tilsættes frisk på isolationsdagen. Mens buffere kan fremstilles dagen før isoleringen, skal disse visse ingredienser tilsættes friske på isoleringsdagen såvel som eventuelle fosfatase- og proteasehæmmere. | |
Tabel 1: Bufferopskrifter til plastoglobuleisolering fra plantebladvæv eller cyanobakterier.
| Fosfatasehæmmer Cocktail b | |
| Hæmmer | Endelig konc. (mM) |
| Na-fluorid | 50 |
| β-glycerophosphat⋅2Na⋅5H2O | 25 |
| Na-OrthoVanadate | 1 |
| Na-pyrophosphat⋅10H2O | 10 |
| b Fosfatasehæmmere skal tilsættes friske på isolationsdagen. | |
Tabel 2: Fosfatasehæmmer cocktail.
| Proteasehæmmer Cocktail a | ||||
| Hæmmer | Lager (mg/ml) | Lager medium | Fortyndingsfaktor | Endelig konc. (mg/ml) |
| Antipain⋅2HCl | 20 | Vand | 400x | 50 |
| Bestatin | 1 | 0,15 m NaCl | 25x | 40 |
| Chymostatin | 20 | DMSO | 2000x | 10 |
| E-64 | 20 | Vand | 2000x | 10 |
| Leupeptin (hemisulfat) | 20 | Vand | 4000x | 5 |
| P-ramidon⋅2Na | 20 | Vand | 2000x | 10 |
| AEBSF | 50 | Vand | 1000x | 50 |
| Aprotinin | 10 | Vand | 5000x | 2 |
| a Proteasestamopløsningerne skal opbevares ved -20 °C i små delprøver til langtidsopbevaring. Optø og tilsæt frisk til passende buffer umiddelbart før isolering. | ||||
Tabel 3: Proteasehæmmer cocktail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at minimere fysiologiske/biokemiske ændringer i materialet og beskytte visse foto- og termolabile prenyllipidpigmenter, der er en rig bestanddel af plastoglobuler, er det afgørende at udføre isoleringen ved 4 °C og beskyttet mod lys. Som angivet ovenfor udføres de indledende trin i kølerummet under en sikkerhedslampe ved hjælp af en grøn emitterende pære. De efterfølgende trin, der udføres i laboratoriet, er under dæmpet lys og bruger is eller kølet centrifugering. Af lignende årsager er inkluderingen af friske proteasehæmmere (og fosfatasehæmmere, hvis der er interesse for at studere fosforreguleringen af proteiner) kritisk (tabel 2 og tabel 3).
Mens andre metoder (fx en Dounce homogenisator, fryse-optøningscyklusser) i princippet kunne anvendes til at frigive plastoglobuler fra thylakoider i højere plantekloroplaster, har sonikering vist sig at være langt overlegen i at give det bedste udbytte og renhed (upublicerede resultater). Sonikering kan skabe kunstige vesikler fra thylakoid lameller eller endoplasmatisk retikulum; Disse vesikler ville imidlertid være meget proteinrige og dermed tætte, hvilket udelukker deres flotation på saccharosegradienten.
Ved ekstraktion af den flydende pude af rene plastoglobuler fra saccharosegradienten er det fordelagtigt at ekstrahere dem i den mindste mængde medium R som muligt. Erhvervelse af koncentrerede plastoglobuler på denne måde letter downstream-undersøgelser ved at minimere de nødvendige mængder prøve. Brug af en sprøjte og 22 G nål er den mest effektive strategi til ekstraktion af plastoglobulerne. På grund af deres hydrofobe, lipidrige natur er de ekstremt klæbrige, og brugen af pipettespidser eller en spatel bør undgås for enhver pris. Det har vist sig, at tabet af plastoglobuler på grund af klæbning bedst minimeres med en sprøjte og nål, selvom det ikke synes muligt fuldstændigt at forhindre noget tab under ekstraktion.
Hvis der ikke ses et let synligt, gulcremet lag af plastoglobuler flydende på eller nær overfladen af saccharosegradienten, kan der være anvendt utilstrækkeligt plante-/cyanobakterielt materiale til isoleringen. Det har vist sig, at monocots giver højere plastoglobuleudbytter end dicots fra sammenlignelige mængder plantevæv (upublicerede resultater). Mens passende mængder udgangsbiologisk materiale er angivet for de specifikke isolationer, der er eksemplificeret i denne artikel, skal de nødvendige mængder væv til effektiv ekstraktion bestemmes empirisk baseret på organismens art, væv og miljøforhold. Generelt vil stressede (men ikke nekrotiske) bladvæv eller cyanobakterielle kulturer give højere udbytter af plastoglobuler. Ved anvendelse af A. thaliana bladvæv er to flader af A. thaliana planter (næsten 140 individuelle planter) fra det midtvegetative vækststadium typisk tilstrækkelige til isolering af plastoglobuler, især når plantematerialet er let stresset, for eksempel ved en let stressbehandling 2,4. Som en alternativ forklaring på dårlige udbytter kan den oprindelige homogenisering af bladvævet med blenderen have været for kraftig og adskilt plastoglobulerne fra thylakoiderne for tidligt, eller sonikeringen af det rå thylakoidmateriale kan have været utilstrækkelig kraftig til effektivt at frigive plastoglobulerne før flotation (disse punkter er ikke et problem ved ekstraktion fra cyanobakterier, som er fritsvævende in situ).
Det er vigtigt at huske på, at plastoglobuleisolering vil repræsentere bulkpopulationen af plastoglobuler fra en vævsprøve. Derfor ville enhver mulig heterogenitet i lipid, protein eller funktion ikke kunne skelnes fra efterfølgende undersøgelser. På grund af denne begrænsning har det ikke været muligt at måle, hvor meget heterogenitet der kan eksistere blandt individuelle plastoglobulelipiddråber. Imidlertid afslører transmissionselektronmikrografier af plantebladvæv fra flere organismer differentielle farvningsmønstre blandt plastoglobuler, selv inden for samme kloroplast 28,29,30,31. Dette tyder stærkt på heterogenitet i lipidindholdet, selvom arten eller formålet med dette forbliver uklart. Signifikant viser elektronmikrografier af isolerede A. thaliana plastoglobuler, at denne isoleringsmetode ikke er forudindtaget til isolering af større eller mindre plastoglobuler2.
Isoleringen af rene plastoglobuler repræsenterer det første skridt mod deres detaljerede molekylære karakterisering. Talrige downstream-applikationer kan efterfølgende udføres afhængigt af investigators specifikke interesser og formål. For eksempel for at undersøge lipid- eller proteinsammensætningen er den isolerede prøve let modtagelig for proteomiske eller lipidomiske undersøgelser. In-gel fordøjelsesmetoden foretrækkes til bottom-up proteomics undersøgelser af plastoglobules prøver. Men fordi lipider er i stort overskud i forhold til protein, kan lipidet forstyrre SDS-PAGE-adskillelsen. Den indledende udfældning af protein ved anvendelse af acetone, med efterfølgende resuspension i Laemmli opløselighedsbuffer, eliminerer de fleste lipider, hvilket muliggør en effektiv adskillelse af protein i SDS-PAGE separeringsgelen. Indledende resuspension af proteinpillen i 100 mM tris-HCl buffer og 2% SDS muliggør nøjagtig bestemmelse af proteinindholdet ved bicinchoninsyremetoden før tilsætning af reduktionsmiddel, farvestof og glycerol. På samme måde er lipidoprensning ved hjælp af væske-væskefaseseparationsmetoder, såsom Bligh- og Dyer-metoden, velegnet til nedstrøms lipidomiske analyser32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Forskningen i laboratoriegruppen Lundquist er støttet af bevillinger fra NSF (MCB-2034631) og USDA (MICL08607) til P.K.L. Forfatterne takker Dr. Carrie Hiser (MSU) for støtte i udviklingen af den cyanobakterielle plastoglobule isolationsmetode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K.
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
