Summary
Çeşitli fotosentetik organizmalarla ilişkili plastoglobül lipid damlacıklarının izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmaktadır. İzole plastoglobüllerin başarılı bir şekilde hazırlanması, proteomik ve lipidomik analizler gibi ayrıntılı moleküler araştırmalardan önce gelen çok önemli bir ilk adımdır.
Abstract
Plastoglobül lipit damlacıkları, bitki kloroplastlarının ve siyanobakterilerin dinamik bir alt bölmesidir. Fotosentetik türler arasında her yerde bulunan, hızla değişen çevresel koşullar altında tilakoid membranın adaptasyonunda ve yeniden şekillenmesinde merkezi bir rol oynadığına inanılmaktadır. Yüksek saflıktaki plastoglobülleri izole etme kapasitesi, proteomik, lipidomik ve diğer metodolojiler yoluyla çalışmalarını büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Yüksek saflık ve verime sahip plastoglobüllerle, diğer olası moleküler özelliklerin yanı sıra lipit ve protein bileşimlerini, enzimatik aktivitelerini ve protein topolojilerini araştırmak mümkündür. Bu makalede, plastoglobüllerin bitki yaprağı dokusunun kloroplastlarından izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmakta ve plastoglobüllerin ve ilgili lipit damlacık yapılarının mısır yapraklarından, diriliş bitkisinin kurutulmuş yaprak dokusundan, Eragrostis nindensis'ten ve siyanobakteri, Synechocystis'ten izolasyonu için metodolojik varyasyonlar sunulmaktadır. sp. PCC 6803. İzolasyon, bu lipit bakımından zengin parçacıkların düşük yoğunluğuna dayanır ve bu da sakkaroz yoğunluğu yüzdürme ile saflaştırmalarını kolaylaştırır. Bu metodoloji, çeşitli türlerden plastoglobüllerin incelenmesinde değerli olduğunu kanıtlayacaktır.
Introduction
Plastoglobül kompozisyonu ve fonksiyonunun güncel anlayışı ayrıntılı proteomik ve lipidomik çalışmalarla ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5. Bu tür çalışmalar, sakkaroz gradyanları kullanılarak verimli ayırma için çok düşük yoğunluklarına dayanan hızlı ve etkili bir izolasyon yöntemi ile büyük ölçüde desteklenmiştir. Plastoglobul izolasyonunun ilk yöntemleri, kayın ağacı (Fagus sylvatica), viski süpürgesi (Sarothamnus scoparius), soğan (Allium cepa), ıspanak (Spinacia oleracea), hercai menekşe (Viola tricolor), biber (Capsicum annuum) ve bezelye (Pisum sativum) 6,7,8,9,10,11 gibi türlerden elde edildi. ,12,13. Kloroplast plastoglobülleri daha verimli ve daha iyi verimli bir şekilde izole etmek için güncellenmiş bir yöntem daha sonra Ytterberg ve ark.3,14 tarafından sunulmuştur. Başlangıçta Arabidopsis thaliana yaprak kloroplastlarının plastoglobüllerinin incelenmesi için kullanılırken, bu güncellenmiş yöntemi, mısır (Zea mays), domates (Solanum lycopersicum), lovegrass (Eragrostis nindensis), mor sahte brom (Brachypodium distachyon) ve yabani tütün (Nicotiana benthamiana) dahil olmak üzere hem monokot hem de dikot gibi diğer bitki türlerinin sağlıklı yaprak dokusu için başarıyla kullandık. ; yayınlanmamış sonuçlar). Ayrıca, izolasyon yöntemi, Synechocystis sp. PCC 6803 ve Anabaena sp. PCC 712015 ve diriliş bitkisinin kurutulmuş yaprak dokusu E. nintensis dahil olmak üzere siyanobakterilerin plastoglobüllerine başarıyla uyarlanmıştır.
Sağlıklı yaprak dokusunun kloroplast plastoglobülleri tilakoid membranlara fiziksel olarak bağlıdır16. Bu fiziksel sürekliliğe rağmen, iki kloroplast alt bölmesi farklı lipit ve protein bileşimlerini korur, ancak iki bölme arasındaki düzenlenmiş lipit ve protein değişimiönerilmiştir 2,4,17,18,19. Aslında, son zamanlarda kloroplastlar ve sitosol19 arasındaki nötr lipitlerin kaçakçılığı için ilginç bir hemifüzyon modeli önerilmiştir. Plastoglobüllerin ve tilakoidlerin fiziksel sürekliliği nedeniyle, sağlıklı yaprak dokusu ile izolasyon yöntemi, daha sonra plastoglobülleri tilakoidlerden ayırmak için sonikleştirilen peletlenmiş ham tilakoid preparatının toplanmasıyla başlar, bu da sitozolik lipit damlacıklarını izole etmek için kullanılan yöntemlerin aksinedir20 . Bir sakkaroz yastığı üzerindeki ultrasantrifüjleme daha sonra düşük yoğunluklu plastoglobülleri sakkaroz boyunca yüzdürür ve onları tilakoidlerden, çekirdeklerden ve diğer yüksek yoğunluklu malzemelerden etkili bir şekilde ayırır. Buna karşılık, siyanobakterilerdeki plastoglobüllerin yanı sıra kurutulmuş yaprak dokusundakiler, serbest yüzen bir formda in vivo olarak açıkça bulunur. Bu nedenle, izolasyonları doğrudan bir sakkaroz gradyanı üzerinde yüzmeyi içerir. Bu makale, sağlıklı yaprak dokusundan izolasyon yöntemini göstermektedir ve ayrıca plastoglobülleri kurutulmuş yaprak dokusundan veya siyanobakteriyel kültürlerden izole etmek için kullanılabilecek iki varyasyonu göstererek, plastoglobüllerin çalışılabileceği fizyolojik genişliği ve evrimsel bağlamı büyük ölçüde genişletmektedir.
İzole plastoglobüller daha sonra moleküler özellikleri araştırmak için herhangi bir sayıda aşağı akış analizi için kullanılabilir. A. thaliana yaprak dokusundan izole plastoglobülleri, farklı çevresel koşullar veya genotipler altında kapsamlı proteomik ve lipidomik analiz için kullandık ve stres 2,4,21,22'ye adaptasyonda protein ve lipit bileşiminin seçici modifikasyonunu gösterdik. Ek olarak, izole plastoglobüllerle ilişkili trans-fosforilasyon aktivitesini gösteren in vitro kinaz testleri22, protein bileşenlerinin oligomerik durumları doğal jel elektroforezi 21 kullanılarak araştırıldı ve proteaz tıraş testleri23 yapıldı.
Bu yöntemin birincil yararı, prosedürün göreceli hızıdır. Deneyimlerimize göre, aşağıda özetlenen protokoller yaklaşık 4 saat içinde tamamen tamamlanabilir. Plastoglobülleri yaprak dokusundan izole etmek için alternatif bir yöntem tanımlanmıştır, bu da diğer kloroplast alt bölmelerinin eşzamanlı izolasyonuna izin verir24. Bu alternatif yöntem, diğer kloroplast alt bölmeleriyle kantitatif karşılaştırma gerektiğinde veya istendiğinde bazı açık avantajlar sunar. Bununla birlikte, bu alternatif yöntem aynı zamanda daha sıkıcıdır ve karşılaştırılabilir miktarlarda yaprak dokusundan izole plastoglobüllerin önemli ölçüde daha düşük verimini sağlayacaktır. Plastoglobüllerin odaklanmış bir çalışması amaçlandığında, burada özetlenen metodoloji en uygun seçimdir. Bununla birlikte, numune hazırlama sırasında toplam yaprak ve ham tilakoid alikotlar toplanabilir ve daha sonraki karşılaştırmalar için referans numunelere sahip olmak için bunu yapmanız şiddetle tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ham plastoglobül izolasyonu
- Stressiz mısır yaprağı dokusundan ham plastoglobül ekstraksiyonu
- Yaklaşık 3 haftalık ve yaklaşık V5 büyüme aşamasında, yaklaşık 120 g ağırlığında altı sağlıklı mısır fidanı edinin.
- Sapın tabanındaki tüm yaprakları kesin, hızla bir buz banyosuna batırın ve soğuk odaya taşıyın.
- Yeşil bir güvenlik lambası altında çalışırken, mısır yapraklarını buz banyosundan çıkarın ve makas kullanarak daha küçük parçalara (yaklaşık 5 cm x 5 cm) ayırın.
- Kırpılmış yaprak dokusunun yarısını ticari bir karıştırıcıda 350 mL öğütme tamponunda nazikçe ama iyice öğütün (Tablo 1). Tüm yaprakların kesildiğinden emin olmak için karıştırıcıyı 5x-6x'i başlatın-durdurun. Karıştırıcıda seviye 7'den daha yüksek kullanmayın.
- Homojenatı büyük bir huni üzerindeki bir kat 25 μm naylon bezden dört adet 250 mL santrifüj şişesine filtreleyin. Ardından, kırpılmış yaprak dokusunun ikinci yarısı ile adım 1.1.4'ü tekrarlayın.
- Filtrazı dört şişe arasında eşit olarak bölün ve 4 ° C'de 1.840 x g'de 6 dakika boyunca santrifüj yapın. Yaprak filtrasyonunun bir alikotunu çıkarın ve temsili bir toplam yaprak örneği olarak saklanmak üzere santrifüjlemeden önce bir kenara koyun.
- Elde edilen süpernatantı dökün ve peleti, fırçanın nazik hareketleriyle döndürerek ve sulandırarak 0.2 M sakkaroz içeren 12 mL orta R 0.2'de (Tablo 1) yavaşça yeniden askıya alın. Her peleti yeniden askıya aldıktan sonra, süspansiyonu bir sonraki şişeye taşıyın ve yeniden süspansiyonu tekrarlayın. Süspansiyonları bir şişede toplayın.
- Havuzlanmış süspansiyonu altı adet 3 mL ultrasantrifüj tüp arasında dağıtın ve her tüpte maksimum 2,5 mL hacme ulaşın.
- Her tüpü 4x, her seferinde 10 s için,% 100 genlikte bir uç sonikatör kullanarak sonikleştirin. Köpüğü önlemek için sonicator kornasını suya batırılmış ve sıvı yüzeyden uzak tutmaya dikkat edin.
- Her tur boyunca sonicator kornasını süspansiyon içinde yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin. Dört tüp arasında geçiş yapın, numunenin soğumasına izin vermek için her tüpü her sonikasyondan sonra bir buz kovasına geri döndürün.
- Sonik ham thylakoid süspansiyonunu 150.000 x g'de 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüj edin. Elde edilen ham plastoglobüllerin yüzer pedini, bir şırınga ve 22 G iğne kullanarak, yastığın yüzeyini iğnenin açılmasıyla sıyırarak, her tüpten yaklaşık 500 μL geri kazanarak, sakkaroz yastığının yüzeyinden (kolayca sarı, yağlı bir ped olarak görülür) toplayın. 2,0 mL'lik bir tüpe koyun.
- Plastoglobüllerin sonikasyonundan ve salınımından önce ve sonra ham tilakoidin alikotlarını toplayın. Adım 2.1'e geçin. Alternatif olarak, ham plastoglobülleri -80 ° C'de saklayın ve daha sonra saflaştırın.
- Kurutulmuş E. nindensis yaprak dokusundan ham plastoglobül ekstraksiyonu
- Tamamen kurutulmuş, 8-9 haftalık E. nindensis'ten (yaklaşık 40 g doku) oluşan bir saksı (saksı başına üç ayrı bitkiden oluşan) edinin.
- Tüm yaprak dokusunu bitkinin tabanından, toprağın hemen üstünden, makas kullanarak kesin ve derhal bir buz banyosuna batırın. Dokuyu soğuk odaya taşıyın.
- Yeşil bir emniyet lambası altında çalışırken, E'yi kırpın. nindensis, makas kullanarak daha küçük parçalara (yaklaşık 5 cm x 5 cm) ayrılır.
- Yaprakları ticari bir karıştırıcıda 100 mL öğütme tamponu (Tablo 1) ile nazikçe ama iyice öğütün. Tüm yaprakların kesildiğinden emin olmak için karıştırıcıyı birkaç kez başlatın-durdurun. Karıştırıcıda seviye 7'den daha yüksek kullanmayın.
- Homojenatı büyük bir huni üzerindeki 25 μm naylon bezden bir tabaka boyunca 250 mL konik şişeye süzün. Yaprak filtrasyonunun bir alikotunu çıkarın ve temsili bir toplam yaprak örneği olarak saklanmak üzere santrifüjlemeden önce bir kenara koyun.
- 0,5 M'lik son konsantrasyona getirmek için uygun miktarda sakkaroz ekleyin ve çözeltiyi 250 mL santrifüj tüplerine dağıtın.
NOT: Z. mays preparatına kıyasla daha yüksek bir sakkaroz konsantrasyonu, tilakoid bağlı plastoglobüllerin sonraki sonikasyonundan / salınımından önce sitozolik lipit damlacıklarının yüzdürülmesini sağlamak için kullanılır. - Tüpleri 4 ° C'de 30 dakika boyunca 45.000 x g'de santrifüj yapın. Plastoglobüllerin ve sitozolik lipit damlacıklarının bir karışımı, sakkaroz yastığının yüzeyinde veya yakınında sarı, yağlı bir ped olarak kolayca görülecektir (Şekil 1B). Yastığın yüzeyini iğnenin açılmasıyla sıyırarak 22 G'lik bir iğne ile bir şırınga kullanarak yüzen malzemeyi toplayın ve bir tüpe koyun.
- Serbest yüzen plastoglobül / lipit damlacık karışımını topladıktan sonra kalan süpernatantı atın.
- Artık tilakoide bağlı plastoglobülleri izole etmek için, peleti fırçanın nazik hareketleriyle döndürerek ve sulandırarak 12 mL orta R 0.2'de yeniden askıya alın. Süspansiyonları bir şişede toplayın. 1.1.8 adımına geçin.
- Siyanobakterilerden ham plastoglobül ekstraksiyonu
- 50 mL'lik bir Synechocystis sp. PCC 6803 kültürünü sabit faza (yaklaşık 7-10 gün) büyütün ve bir spektrofotometre kullanarak hücre yoğunluğunu OD750 / 2.0'a ayarlayın. Kültür koşulları için, BG-11 ortamını kullanın ve bir inkübatörde 150 μmol foton / m 2 / s, %2 CO 2,32 ° C ışık yoğunluğunda ve 150 rpm'de sürekli sallanarak büyüyün.
- Polisakaritleri çıkarmak için, 50 mL kültürü 6.000 x g'de 4 ° C'de 45 dakika boyunca santrifüj ederek ve daha sonra süpernatanı çıkararak hücreleri yıkayın. Hücreleri 50 mL tampon A'da iki kez yıkayarak devam edin (Tablo 1). Hücre homojenatının bir alikotunu çıkarın ve temsili bir toplam hücre örneği olarak saklanmak üzere santrifüjlemeden önce bir kenara koyun
- Yıkanmış peleti 25 mL Tampon A'da yeniden askıya alın ve 1.100 psi'de bir Fransız basınç hücresi kullanarak hücreleri kırın, lized rengi beyaz ışık altında yeşilden kırmızı-mavi-yeşile değişene kadar işlemi 3x tekrarlayın (protein denatürasyonunu önlemek için numuneyi her döngü arasında buz üzerine koyun). Önceden soğutulmuş bir hücre kullanın ve bu adımı soğuk odada gerçekleştirin.
- Elde edilen homojenatı her tüpte maksimum 2,5 mL'ye kadar doldurulmuş sekiz adet 3 mL ultrasantrifüj tüpü arasında dağıtın ve ardından 400 μL orta R ile dikkatlice kaplayarak bir adım gradyanı üretin.
NOT: Sakkaroz gradyan preparatı25,26'nın ayrıntılı açıklamaları için Yang, et al. ve Kelekar, et al. - Gerektiğinde ilave orta R ekleyerek tüpleri dikkatlice dengeleyin ve 4 ° C'de 150.000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın. Tilakoid ve diğer ağır organeller (herhangi bir polihidroksiyalkanoat cismi dahil) pelet olurken, plastoglobüller sakkaroz gradyanının üstünde veya yakınında sarı, yağlı bir ped olarak kolayca görülecektir (Şekil 1C).
- Elde edilen ham plastoglobüllerin yüzer pedini bir şırınga ve 22G iğne ile hasat edin ve 2 mL'lik bir tüpe koyun. Plastoglobülleri ultrasantrifüj tüp duvarının yan tarafından gerekirse iğne ucu ile kazıyın.
- Adım 2.2'ye geçin. Alternatif olarak, ham plastoglobülleri -80 ° C'de saklayın ve daha sonra saflaştırın.
2. Saf plastoglobüllerin toplanması
- Bitki dokusu işleme
- Toplam 1 mL hacme ulaşmak için adım 1.1 veya adım 1.2'den 500 μL ham plastoglobüllerle 500 μL ham plastoglobüllerle katmanlanarak 2.5 mL ultrasantrifüj tüplerinde sakkaroz gradyanları üretin, toplam 1 mL'lik bir hacme getirin, ardından 400 μL orta R 0.2 ile örtün, ardından 400 μL orta R ile üst üste bindirildi.
NOT: Sakkaroz gradyan preparatı25,26'nın ayrıntılı açıklamaları için Yang ve ark. ve Kelekar ve ark.'ya bakınız. - Gerektiğinde üst katmana fazla orta R ekleyerek tüpleri dikkatlice dengeleyin. Daha sonra 4 ° C'de 1,5 saat boyunca 150.000 x g'de santrifüj yapın.
- Elde edilen yüzer saf plastoglobüllerin (Şekil 1A) pedini bir şırınga ve 22G iğne ile toplayın ve 2 mL'lik bir tüpe koyun. Plastoglobülleri gerekirse iğne ucu ile santrifüj tüpü duvarının üstünden kazıyın.
- Aliquot saf plastoglobüller ve flaş sıvı azot içinde donar. Doğrudan -80 ° C'de saklayın veya kuru bir toza liyofilize edin.
- Toplam 1 mL hacme ulaşmak için adım 1.1 veya adım 1.2'den 500 μL ham plastoglobüllerle 500 μL ham plastoglobüllerle katmanlanarak 2.5 mL ultrasantrifüj tüplerinde sakkaroz gradyanları üretin, toplam 1 mL'lik bir hacme getirin, ardından 400 μL orta R 0.2 ile örtün, ardından 400 μL orta R ile üst üste bindirildi.
- Siyanobakterilerin işlenmesi
- İlk önce 1.3. adımdan itibaren ham plastoglobüllerin 500 μL'si ile katmanlanmış dört adet 2.5 mL ultrasantrifüj tüpünde bir sakkaroz gradyanı üretin, ardından 750 μL orta R 0.2 ile örtün.
NOT: Sakkaroz gradyan preparatı25,26'nın ayrıntılı açıklamaları için Yang ve ark. ve Kelekar ve ark.'ya bakınız. - Sakkaroz gradyanını 4 ° C'de 90 dakika boyunca 150.000 x g'de santrifüj yapın. Saf plastoglobülleri (Şekil 1C) bir şırınga ve 22 G iğne ile sakkaroz gradyanının üst fazından toplayın ve 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Saf plastoglobülleri aliquot ve sıvı azotta flaş-dondurun. Doğrudan -80 ° C'de saklayın veya kuru bir toza liyofilize edin.
- İlk önce 1.3. adımdan itibaren ham plastoglobüllerin 500 μL'si ile katmanlanmış dört adet 2.5 mL ultrasantrifüj tüpünde bir sakkaroz gradyanı üretin, ardından 750 μL orta R 0.2 ile örtün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolün 1. adımının tamamlanmasının ardından, sakkaroz yastığının üst tabakası üzerinde (veya yakınında) yüzen önemli miktarda plastoglobül/lipit damlacık materyali kolayca görülebilmelidir (Şekil 1B-C). Bu aşamada diğer fraksiyonlar da toplanabilir. Örneğin, tilakoidler peletlenecek ve sonraki analizler için orta R 0.2 ile yeniden askıya alınabilir. Sonraki santrifüjlemeden sonra, Şekil 1A, C'de gösterildiği gibi, saflaştırılmış plastoglobüller sakkaroz gradyanının yüzeyinde veya yakınında elde edilecektir. Bazı durumlarda (örneğin, spesifik genotipik çizgiler veya çevresel koşullar), plastoglobüllerin gradyandaki farklı katmanlarda ayrılan iki ayrı alt popülasyon olarak izole edileceği görülmüştür: gradyan yüzeyinde düşük yoğunluklu bir fraksiyon ve üst iki gradyan katmanı arasındaki arayüze yerleşen ikinci, daha yoğun bir fraksiyon. Ayırıcı fraksiyonların dikkatli bir karşılaştırmalı analizi daha önce yapılmamış olsa da, bu alt popülasyonların, daha küçük çapa sahip olanların (ve dolayısıyla daha büyük yüzey alanı-hacim oranı ve protein-lipit oranı) gradyanda daha düşük yerleşeceği farklı büyüklükteki plastoglobülleri temsil etmesi muhtemel görünmektedir.
Başarısız bir girişimde, ilk santrifüj turundan sonra sakkaroz yastığının yüzeyinde çok az veya hiç görünür plastoglobül görülecektir. Yeterli plastoglobülün başarılı bir şekilde izole edilememesi, optimize edilmesi gerekebilecek çeşitli faktörlere bağlı olabilir. Özellikle, sonikasyon tekniği (sağlıklı yaprak dokusu kullanıldığında) başarı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Ek olarak, gerekli miktarda bitki / siyanobakteriyel materyal, spesifik türlere ve stres durumuna bağlı olacaktır.
Plastoglobüllerin başarılı bir şekilde izole edilmesinden sonra, plastoglobüller ve tilakoidler (birincil kirletici bölme) için işaretleyici proteinlerin immünoblotasyonunu kullanarak izole plastoglobüllerin saflığını doğrulamak mümkündür. Şekil 1D'de, plastoglobüller2 için bir belirteç olarak A. thaliana FBN1a'ya karşı ve A. thaliana fotosistem II alt birimi D1'e karşı, tilakoidlerin27 belirteci olarak yükseltilmiş antikorlar kullanılarak temsili immünoblotlar görülmektedir. Synechocystis sp. PCC 6803'teki FBN homologları, öncelikle plastoglobüllerden ziyade tilakoidlerle ilişkilidir.
Ayrıca, amaçlanan aşağı akış çalışmalarına bağlı olabilecek depolama şekli de dikkatlice düşünülmelidir. Özellikle prenil-lipid pigment lipitlerinin aşağı akış analizleri için, foto-kararsız bileşiklerin zarar görmesini önlemek için numunelerin ışığı yönlendirmeye maruz kalmasını en aza indirmek çok önemlidir. Saflaştırılmış plastoglobüller, lipidomik veya proteomik tabanlı deneyler gibi aşağı akış deneyleri için kullanılabilir. Plastoglobüller, düşük yoğunluklarında ve sakkaroz üzerinde yüzebilme kapasitelerinde kendini gösteren çok düşük bir protein-lipit oranı ile karakterize edilir; Bu nedenle, plastoglobül örneklerinin düşük protein konsantrasyonu normaldir. Bu nedenle, aseton protein çökeltmesi veya kloroform / metanol ekstraksiyonu kullanılarak SDS-PAGE ile protein ayrılmasından önce lipitlerin çıkarılması önerilir.
Şekil 1: Plastoglobüllerin ve tilakoidlerin izolasyonu ve immünoblotasyonu . (A) Sakkaroz gradyanından ekstraksiyondan önce Z. mays'tan temsili saflaştırılmış plastoglobul örneği. (B) Sakkaroz yastığından ekstraksiyondan önce kurutulmuş E. nindensis'ten temsili ham plastoglobül örneği. (C) Synechocystis sp. PCC 6803'ten, sırasıyla yüklü sakkaroz yastığının ve gradyanının ultrasantrifüjlenmesinden önce ve sonra gösterilen, temsili ham (sol) ve saf (sağ) plastoglobule örneği. (D) Anti-fibrilin1a antikoru (α-FBN1a), yüksek bitkilerde plastoglobüllerin bir belirteç proteini olan fibrilin birikimini izlemek için kullanıldı. Fibrilin ortolog ağırlıklı olarak siyanobakterilerin izole tilakoidlerinde birikir (Synecho, Syenchocystis sp. PCC 6803). Anti-fotosistem II alt birimi D1 (α-PsbA), plastoglobul izolasyonlarından tilakoidlerin tükenmesini doğrulamak için kullanıldı. Her şeritte, 5 μg tilakoid ve 10 μg plastoglobule proteini yüklendi. Kısaltmalar: PG = plastoglobüller; Thy = thylakoids. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tampon bileşimleri a | |
| Taşlama Tamponu | 50 mM HEPES-KOH (PH 8.0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 100 mM sorbitol | |
| 5 mM askorbik asit b | |
| 5 mM indirgenmiş sistein b | |
| % 0,05 (w/d) BSA b | |
| Orta R | 50 mM HEPES-KOH (PH 8.0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| Orta R 0.2 | 50 mM HEPES-KOH (PH 8.0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0,2 milyon sakkaroz | |
| Orta R 0.7 | 50 mM HEPES-KOH (PH 8.0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0.7 milyon sakkaroz | |
| Arabellek A | 25 mM HEPES-KOH (PH 7.8) |
| 250 mM sakkaroz | |
| a Her tampon bileşeninin nihai konsantrasyonları sağlanır. | |
| b İzolasyon gününde taze olarak eklenmelidir. Tamponlar izolasyondan bir gün önce hazırlanabilirken, bu belirli bileşenler izolasyon gününde taze olarak eklenmeli ve ayrıca herhangi bir fosfataz ve proteaz inhibitörü. | |
Tablo 1: Bitki yaprağı dokusundan veya siyanobakterilerden plastoglobül izolasyonu için tampon tarifleri.
| Fosfataz İnhibitörü Kokteyli b | |
| Inhibitörü | Son Sözleşme (mM) |
| Na-Florür | 50 |
| β-Gliserofosfat⋅2Na⋅5H2O | 25 |
| Na-OrtoVanadat | 1 |
| Na-Pirofosfat⋅10H2O | 10 |
| b Fosfataz inhibitörleri izolasyon günü taze olarak eklenmelidir. | |
Tablo 2: Fosfataz inhibitörü kokteyli.
| Proteaz İnhibitörü Kokteyl a | ||||
| Inhibitörü | Stok (mg/mL) | Stok ortamı | Seyreltme faktörü | Son sonuç (mg/mL) |
| Antiağrı⋅2HCl | 20 | Su | 400x | 50 |
| Bestatin | 1 | 0,15 milyon NaCl | 25x | 40 |
| Şimostatin | 20 | cesaret | 2000x | 10 |
| E-64 Serisi | 20 | Su | 2000x | 10 |
| Leupeptin (hemisülfat) | 20 | Su | 4000x | 5 |
| P-ramidon⋅2Na | 20 | Su | 2000x | 10 |
| AEBSF | 50 | Su | 1000x | 50 |
| Aprotinin | 10 | Su | 5000x | 2 |
| a Proteaz stok çözeltileri, uzun süreli depolama için -20 ° C'de küçük alikotlarda saklanmalıdır. İzolasyondan hemen önce uygun tampona çözün ve taze ekleyin. | ||||
Tablo 3: Proteaz inhibitörü kokteyli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Malzemedeki fizyolojik / biyokimyasal değişiklikleri en aza indirmek ve plastoglobüllerin zengin bir bileşeni olan bazı foto-ve termo-kararsız prenil-lipid pigmentlerini korumak için, izolasyonun 4 ° C'de yapılması ve ışıktan korunması kritik öneme sahiptir. Yukarıda belirtildiği gibi, ilk adımlar soğuk odada yeşil yayan bir ampul kullanılarak bir güvenlik lambasının altında gerçekleştirilir. Laboratuvarda gerçekleştirilen sonraki adımlar soluk ışıklar altındadır ve buz veya soğutulmuş santrifüjleme kullanır. Benzer nedenlerden dolayı, taze proteaz inhibitörlerinin (ve proteinlerin fosfo-regülasyonunu incelemeye ilgi duyuyorsa fosfataz inhibitörlerinin) dahil edilmesi kritik öneme sahiptir (Tablo 2 ve Tablo 3).
Diğer yöntemler (örneğin, bir Dounce homojenizatörü, donma-çözülme döngüleri), prensip olarak, plastoglobülleri daha yüksek bitki kloroplastlarında tilakoidlerden serbest bırakmak için kullanılabilirken, sonikasyonun en iyi verim ve saflığı sağlamada çok daha üstün olduğu bulunmuştur (yayınlanmamış sonuçlar). Sonikasyon, tilakoid lamellerden veya endoplazmik retikulumdan yapay veziküller oluşturabilir; Bununla birlikte, bu veziküller çok protein bakımından zengin ve dolayısıyla yoğundur ve sakkaroz gradyanı üzerinde yüzdürülmelerini önler.
Saf plastoglobüllerin yüzer pedini sakkaroz gradyanından çıkarırken, bunları mümkün olduğunca en az miktarda orta R'de çıkarmak faydalıdır. Bu şekilde konsantre plastoglobüllerin elde edilmesi, gerekli numune hacimlerini en aza indirerek aşağı akış çalışmalarını kolaylaştırır. Bir şırınga ve 22 G iğne kullanımı, plastoglobülleri çıkarmak için en etkili stratejidir. Hidrofobik, lipit bakımından zengin doğaları nedeniyle, son derece yapışkandırlar ve pipet uçlarının veya spatula kullanımından ne pahasına olursa olsun kaçınılmalıdır. Yapışmaya bağlı plastoglobül kaybının en iyi şekilde bir şırınga ve iğne ile en aza indirildiği bulunmuştur, ancak ekstraksiyon sırasında bazı kayıpları tamamen önlemek mümkün görünmemektedir.
Sakkaroz gradyanının yüzeyinde veya yakınında yüzen kolayca görülebilen, sarı-kremsi bir plastoglobül tabakası görülmezse, izolasyon için yetersiz bitki / siyanobakteriyel materyal kullanılmış olabilir. Monokotların, karşılaştırılabilir miktarda bitki dokusundan elde edilen dikotlardan daha yüksek plastoglobül verimi verdiği bulunmuştur (yayınlanmamış sonuçlar). Bu makalede örneklenen spesifik izolasyonlar için uygun miktarlarda başlangıç biyolojik materyali belirtilirken, etkili ekstraksiyon için gerekli doku miktarları, organizmanın türüne, dokusuna ve çevresel koşullarına bağlı olarak ampirik olarak belirlenmelidir. Genel olarak, gerilmiş (ancak nekrotik olmayan) yaprak dokusu veya siyanobakteriyel kültürler daha yüksek plastoglobül verimi verecektir. A. thaliana yaprak dokusu kullanıldığında, orta vejetatif büyüme aşamasından iki düz A. thaliana bitkisi (yaklaşık 140 bireysel bitki), özellikle bitki materyali hafif bir şekilde gerildiğinde, örneğin hafif bir stres işlemi ile plastoglobüllerin izolasyonu için tipik olarak yeterlidir 2,4. Düşük verimler için alternatif bir açıklama olarak, yaprak dokusunun blender ile ilk homojenizasyonu çok güçlü olabilir ve plastoglobülleri tilakoidlerden erken ayırmış olabilir veya ham tilakoid materyalin sonikasyonu, yüzdürmeden önce plastoglobülleri etkili bir şekilde serbest bırakmak için yeterince güçlü olmayabilir (bu noktalar siyanobakterilerden ekstrakte edilirken bir sorun değildir, serbest yüzen in situ olan).
Plastoglobül izolasyonunun, bir doku örneğinden plastoglobüllerin toplu popülasyonunu temsil edeceğini akılda tutmak önemlidir. Bu nedenle, lipit, protein veya fonksiyondaki olası herhangi bir heterojenlik, sonraki çalışmalardan ayırt edilemez. Bu sınırlama nedeniyle, bireysel plastoglobül lipid damlacıkları arasında ne kadar heterojenlik olabileceğini ölçmek mümkün olmamıştır. Bununla birlikte, birden fazla organizmadan gelen bitki yaprağı dokusunun iletim elektron mikrografları, aynı kloroplast28,29,30,31 içinde bile, plastoglobüller arasında diferansiyel boyama modellerini ortaya koymaktadır. Bu, lipit içeriğindeki heterojenliği güçlü bir şekilde düşündürmektedir, ancak bunun doğası veya amacı belirsizliğini korumaktadır. Önemli bir şekilde, izole A. thaliana plastoglobüllerinin elektron mikrografları, bu izolasyon yönteminin daha büyük veya daha küçük plastoglobüllerin izolasyonu için önyargılı olmadığını göstermektedir2.
Saf plastoglobüllerin izolasyonu, ayrıntılı moleküler karakterizasyonlarına doğru ilk adımı temsil eder. Çok sayıda aşağı akış uygulaması, araştırmacının özel çıkarlarına ve amacına bağlı olarak daha sonra gerçekleştirilebilir. Örneğin, lipid veya protein bileşimini araştırmak için, izole edilmiş numune proteomik veya lipidomik çalışmalara kolayca uygundur. Jel içi sindirim yaklaşımı, plastoglobül örneklerinin aşağıdan yukarıya proteomik çalışmaları için tercih edilmektedir. Bununla birlikte, lipitler proteine göre çok fazla olduğu için, lipit SDS-PAGE ayrımına müdahale edebilir. Aseton kullanılarak proteinin ilk çökeltilmesi, ardından Laemmli çözündürme tamponunda yeniden süspansiyon, çoğu lipiti ortadan kaldırır, böylece SDS-PAGE ayırma jelinde proteinin verimli bir şekilde ayrılmasını sağlar. Protein peletinin 100 mM tris-HCl tamponunda ve% 2 SDS'de ilk kez yeniden süspansiyonu, indirgeyici, boya ve gliserol ilavesinden önce bibinkoninik asit yöntemi ile protein içeriğinin doğru bir şekilde belirlenmesini sağlar. Benzer şekilde, Bligh ve Dyer yöntemi gibi sıvı-sıvı faz ayırma yöntemlerini kullanarak lipit saflaştırma, aşağı akış lipidomik analizler için uygundur32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Beyan edilecek çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Lundquist laboratuvar grubundaki araştırmalar, NSF (MCB-2034631) ve USDA'dan (MICL08607) P.K.L.'ye verilen hibelerle desteklenmektedir. Yazarlar, siyanobakteriyel plastoglobül izolasyon yönteminin geliştirilmesindeki desteği için Dr. Carrie Hiser'e (MSU) teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K.
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
