Summary
Ett snabbt och effektivt protokoll presenteras för isolering av plastoglobulelipiddroppar associerade med olika fotosyntetiska organismer. Den framgångsrika beredningen av isolerade plastoglobuler är ett avgörande första steg som föregår detaljerade molekylära undersökningar såsom proteomiska och lipidomiska analyser.
Abstract
Plastoglobule lipiddroppar är ett dynamiskt underfack av växtkloroplaster och cyanobakterier. De finns allestädes närvarande bland fotosyntetiska arter och tros tjäna en central roll i anpassningen och ombyggnaden av tylakoidmembranet under snabbt föränderliga miljöförhållanden. Förmågan att isolera plastoglobuler med hög renhet har i hög grad underlättat deras studier genom proteomiska, lipidomiska och andra metoder. Med plastoglobuler med hög renhet och utbyte är det möjligt att undersöka deras lipid- och proteinsammansättning, enzymatisk aktivitet och proteintopologi, bland andra möjliga molekylära egenskaper. Denna artikel presenterar ett snabbt och effektivt protokoll för isolering av plastoglobuler från kloroplaster av växtbladvävnad och presenterar metodologiska variationer för isolering av plastoglobuler och relaterade lipiddroppstrukturer från majsblad, den torkade bladvävnaden i uppståndelseväxten, Eragrostis nindensis och cyanobakterien, Synechocystis sp. PCC 6803. Isolering är beroende av den låga densiteten hos dessa lipidrika partiklar, vilket underlättar deras rening genom sackarosdensitetsflotation. Denna metod kommer att visa sig vara värdefull i studien av plastoglobuler från olika arter.
Introduction
Den nuvarande förståelsen av plastoglobulens sammansättning och funktion har framkommit genom detaljerade proteomiska och lipidomiska studier 1,2,3,4,5. Sådana studier har fått stor hjälp av en snabb och effektiv isoleringsmetod som förlitar sig på deras mycket låga densitet för effektiv separation med sackarosgradienter. Initiala metoder för plastoglobuleisolering uppnåddes från arter som bokträdet (Fagus sylvatica), skotsk kvast (Sarothamnus scoparius), lök (Allium cepa), spenat (Spinacia oleracea), pensé (Viola tricolor), peppar (Capsicum annuum) och ärter (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. En uppdaterad metod för att isolera kloroplastplastoglobuler på ett effektivare och bättre avkastande sätt presenterades senare av Ytterberg et al.3,14. Medan vi ursprungligen användes för studier av plastoglobuler av Arabidopsis thaliana bladkloroplaster, har vi framgångsrikt använt denna uppdaterade metod för frisk bladvävnad från andra växtarter, både monocot och dicot, inklusive majs (Zea mays), tomat (Solanum lycopersicum), lovegrass (Eragrostis nindensis), lila falsk brom (Brachypodium distachyon) och vild tobak (Nicotiana benthamiana ; opublicerade resultat). Dessutom har isoleringsmetoden framgångsrikt anpassats till plastoglobulerna av cyanobakterier, inklusive Synechocystis sp. PCC 6803 och Anabaena sp. PCC 712015, och den uttorkade bladvävnaden från uppståndelseväxten, E. nindensis.
Kloroplastplastoglobuler av frisk bladvävnad är fysiskt anslutna till tylakoidmembranen16. Trots denna fysiska kontinuitet upprätthåller de två kloroplastunderfacken distinkta lipid- och proteinkompositioner, även om det reglerade utbytet av lipid och protein mellan de två facken har föreslagits 2,4,17,18,19. Faktum är att en intressant hemifusionsmodell nyligen har föreslagits för handel med neutrala lipider mellan kloroplaster och cytosol19. På grund av den fysiska kontinuiteten hos plastoglobuler och tylakoider börjar isoleringsmetoden med frisk bladvävnad med uppsamlingen av ett pelleterat råtylakoidpreparat, som därefter ultraljudas för att separera plastoglobulerna från tylakoiderna, vilket står i kontrast till metoder som används för att isolera cytosoliska lipiddroppar20 . Ultracentrifugering på en sackaroskudde flyter sedan plastoglobulerna med låg densitet upp genom sackarosen och separerar dem effektivt från tylakoiderna, kärnorna och annat material med hög densitet. Däremot finns plastoglobuler i cyanobakterier, liksom de i torkad bladvävnad, uppenbarligen in vivo i en fritt flytande form. Därför innebär deras isolering direkt flytande på en sackarosgradient. Denna artikel visar isoleringsmetoden från frisk bladvävnad och visar vidare två variationer som kan användas för att isolera plastoglobuler från uttorkad bladvävnad eller cyanobakteriella kulturer, vilket kraftigt utökar den fysiologiska bredden och evolutionära sammanhanget där plastoglobuler kan studeras.
Isolerade plastoglobuler kan därefter användas för valfritt antal nedströmsanalyser för att undersöka molekylära egenskaper. Vi har använt de isolerade plastoglobulerna från A. thaliana bladvävnad för omfattande proteomisk och lipidomisk analys under olika miljöförhållanden eller genotyper, vilket visar selektiv modifiering av protein- och lipidkomposition vid anpassning till stress 2,4,21,22. Dessutom har in vitro-kinasanalyser som visar transfosforyleringsaktivitet associerad med isolerade plastoglobuler utförts 22, de oligomera tillstånden för proteinkomponenter har undersökts med användning av inhemsk gelelektrofores 21 och proteas-rakningsanalyser har utförts23.
Den främsta fördelen med denna metod är procedurens relativa hastighet. Enligt vår erfarenhet kan protokollen som beskrivs nedan slutföras helt inom cirka 4 timmar. En alternativ metod för att isolera plastoglobuler från bladvävnad har beskrivits, vilket möjliggör samtidig isolering av andra kloroplastunderfack24. Denna alternativa metod erbjuder några tydliga fördelar när kvantitativ jämförelse med de andra kloroplastunderfacken är nödvändig eller önskad. Denna alternativa metod är emellertid också mer tråkig och kommer att ge ett signifikant lägre utbyte av isolerade plastoglobuler från jämförbara mängder bladvävnad. När en fokuserad studie av plastoglobuler är målet är den metod som beskrivs här det optimala valet. Icke desto mindre kan totala blad- och råtylakoidalikvoter samlas in under provberedningen, och det rekommenderas starkt att göra det för att ha referensprover för efterföljande jämförelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av rå plastoglobule
- Extraktion av råplastoglobulat från obelastad bladvävnad av majs
- Skaffa sex friska majsplantor som är cirka 3 veckor gamla och nästan i V5-tillväxtstadiet, väger cirka 120 g.
- Klipp av alla löv vid basen av stammen, doppa dem snabbt i ett isbad och transportera till kylrummet.
- Arbeta under en grön säkerhetslampa, ta bort majsbladen från isbadet och klipp dem i mindre bitar (cirka 5 cm x 5 cm) med sax.
- Mal försiktigt men noggrant hälften av den klippta bladvävnaden i en kommersiell mixer i 350 ml slipbuffert (tabell 1). Start-stoppa mixern 5x-6x för att säkerställa att alla löv skärs. Använd inte högre än nivå 7 på mixern.
- Filtrera homogenatet genom ett lager av 25 μm nylonduk på en stor tratt i fyra 250 ml centrifugflaskor. Upprepa sedan steg 1.1.4 med den andra halvan av den klippta bladvävnaden.
- Fördela filtratet jämnt mellan de fyra flaskorna och centrifugera i 6 minuter vid 1 840 x g vid 4 °C. Ta bort en alikvot av bladfiltratet och lägg det åt sidan före centrifugeringen för att förvaras som ett representativt totalt bladprov.
- Häll av den resulterande supernatanten och återsuspendera försiktigt pelleten i 12 ml medium R 0,2 innehållande 0,2 M sackaros (tabell 1) genom att virvla och återsuspendera med försiktiga rörelser av borsten. Efter att ha återsuspenderat varje pellet, bär suspensionen över till nästa flaska och upprepa resuspensionen. Slå ihop suspensionerna i en flaska.
- Fördela den poolade suspensionen mellan sex 3 ml ultracentrifugrör och nå en maximal volym på 2,5 ml i varje rör.
- Sonicate varje rör 4x, för 10 s varje gång, med hjälp av en tips sonicator vid en amplitud på 100%. Var noga med att hålla sonicator hornet nedsänkt och borta från vätskeytan för att förhindra skumning.
- Flytta långsamt sonicatorhornet upp och ner i upphängningen under varje omgång. Växla mellan de fyra rören, återför varje rör till en ishink efter varje ultraljudsbehandling så att provet kan svalna.
- Centrifugera den sonikerade råa tylakoidsuspensionen vid 150 000 x g i 30 minuter vid 4 °C. Skörda den resulterande flytande dynan av råa plastoglobuler från sackaroskuddens yta (lätt att se som en gul, oljig dyna) med hjälp av en spruta och 22 G nål genom att skumma kuddens yta med nålens öppning och återvinna cirka 500 μl från varje rör. Sätt in i ett 2,0 ml rör.
- Samla alikvoter av rå tylakoid före och efter ultraljudsbehandling och frisättning av plastoglobuler. Fortsätt till steg 2.1. Alternativt kan du förvara de råa plastoglobulerna vid −80 °C och rena vid ett senare tillfälle.
- Rå plastoglobule extraktion från torkad E. nindensis bladvävnad
- Skaffa en kruka (bestående av tre enskilda växter per kruka) av helt torkad, 8-9 veckor gammal E. nindensis (nästan 40 g vävnad).
- Klipp av all bladvävnad från plantans botten, strax ovanför jorden, med sax och dunka omedelbart vävnaden i ett isbad. Transportera vävnaden till kylrummet.
- Arbeta under en grön säkerhetslampa, klipp E. nindensis lämnar i mindre bitar (cirka 5 cm x 5 cm) med sax.
- Mal försiktigt men noggrant bladen med 100 ml slipbuffert (tabell 1) i en kommersiell mixer. Start-stoppa mixern flera gånger för att säkerställa att alla löv skärs. Använd inte högre än nivå 7 på mixern.
- Filtrera homogenatet genom ett lager 25 μm nylonduk på en stor tratt till en 250 ml E-kolv. Ta bort en alikvot av bladfiltratet och lägg det åt sidan före centrifugeringen för att förvaras som ett representativt totalt bladprov.
- Tillsätt lämplig mängd sackaros för att få till en slutlig koncentration av 0,5 M och fördela lösningen i 250 ml centrifugrör.
OBS: En högre koncentration av sackaros jämfört med Z. mays preparatet används för att säkerställa flotation av cytosoliska lipiddroppar före efterföljande ultraljudsbehandling / frisättning av tylakoid-bundna plastoglobuler. - Centrifugera rören vid 45 000 x g i 30 minuter vid 4 °C. En blandning av plastoglobuler och cytosoliska lipiddroppar kommer lätt att ses som en gul, oljig dyna på eller nära ytan av sackaroskudden (figur 1B). Samla det flytande materialet med en spruta med en 22 G nål genom att skumma kuddens yta med nålens öppning och deponera i ett rör.
- Kassera den återstående supernatanten efter att ha samlat upp den fritt flytande plastoglobule/lipiddroppsblandningen.
- För att isolera plastoglobulerna anslutna till kvarvarande tylakoid, suspendera pelleten i 12 ml medium R 0.2 genom att virvla och återuppta med mjuka rörelser av borsten. Slå ihop suspensionerna i en flaska. Fortsätt till steg 1.1.8.
- Extraktion av råplastoglobulat från cyanobakterier
- Odla en 50 ml kultur av Synechocystis sp. PCC 6803 till den stationära fasen (ca 7-10 dagar) och justera celldensiteten till en OD750 av 2,0 med hjälp av en spektrofotometer. För odlingsförhållanden, använd BG-11-media och växa i en inkubator med en ljusintensitet på 150 μmolfotoner/m 2/s,2% CO2,32 °C och med kontinuerlig skakning vid 150 rpm.
- För att avlägsna polysackarider, tvätta cellerna genom att centrifugera 50 ml odling vid 6 000 x g i 45 minuter vid 4 °C och därefter avlägsna supernatanten. Fortsätt genom att tvätta cellerna två gånger i 50 ml buffert A (tabell 1). Ta bort en alikvot av cellhomogenatet och lägg det åt sidan före centrifugeringen för att lagras som ett representativt totalt cellprov
- Återsuspendera den tvättade pelleten i 25 ml buffert A och bryt cellerna med en fransk tryckcell vid 1 100 psi, upprepa processen 3x (lägg provet på is mellan varje cykel för att undvika proteindenaturering) tills den lyserade färgen ändras från grönt till rödblågrönt under vitt ljus. Använd en förkyld cell och utför detta steg i kylrummet.
- Fördela det resulterande homogenatet mellan åtta 3 ml ultracentrifugrör fyllda till maximalt 2,5 ml i varje rör och lägg sedan försiktigt över med 400 μl medium R, vilket ger en steggradient.
OBS: Se Yang, et al. och Kelekar, et al. för detaljerade beskrivningar av sackarosgradientberedning25,26. - Balansera rören försiktigt genom att vid behov tillsätta ytterligare medium R och centrifugera i 30 minuter vid 150 000 x g vid 4 °C. Thylakoiden och andra tyngre organeller (inklusive alla polyhydroxialkanoatkroppar) kommer att pelletera, medan plastoglobuler lätt kommer att ses som en gul, oljig dyna på eller nära toppen av sackarosgradienten (figur 1C).
- Skörda den resulterande flytande dynan av råa plastoglobuler med en spruta och 22G-nål och sätt in i ett 2 ml rör. Skrapa plastoglobuler från sidan av ultracentrifugrörväggen med nålspetsen om det behövs.
- Fortsätt till steg 2.2. Alternativt kan du förvara råa plastoglobuler vid -80 °C och rena senare.
2. Skörda rena plastoglobuler
- Bearbetning av växtvävnad
- Producera sackarosgradienter i 2,5 ml ultracentrifugrör genom att först skikta med 500 μl råa plastoglobuler från steg 1.1 eller steg 1.2 blandat med 500 μl medium R 0,7, för att få en total volym på 1 ml, sedan överlägg med 400 μl medium R 0,2, följt av överlagring med 400 μl medium R.
OBS: Se Yang m.fl. och Kelekar m.fl. för detaljerade beskrivningar av sackarosgradientberedning25,26. - Balansera rören försiktigt genom att tillsätta överskott av medium R till toppskiktet, efter behov. Centrifugera sedan vid 150 000 x g i 1,5 timmar vid 4 °C.
- Skörda den resulterande flytande dynan av rena plastoglobuler (figur 1A) med en spruta och 22G-nål och sätt in i ett 2 ml rör. Skrapa bort plastoglobuler från toppen av centrifugrörsväggen med nålspetsen om det behövs.
- Alikvotera de rena plastoglobulerna och blixtfrysning i flytande kväve. Förvaras direkt vid -80 °C eller frystorkas till torrt pulver.
- Producera sackarosgradienter i 2,5 ml ultracentrifugrör genom att först skikta med 500 μl råa plastoglobuler från steg 1.1 eller steg 1.2 blandat med 500 μl medium R 0,7, för att få en total volym på 1 ml, sedan överlägg med 400 μl medium R 0,2, följt av överlagring med 400 μl medium R.
- Cyanobakterier bearbetning
- Producera en sackarosgradient i fyra 2,5 ml ultracentrifugrör skiktade först med 500 μL av de råa plastoglobulerna från steg 1.3 blandat med 750 μL medium R 0.7 och lägg sedan över med 750 μL medium R 0.2.
OBS: Se Yang m.fl. och Kelekar m.fl. för detaljerade beskrivningar av sackarosgradientberedning25,26. - Centrifugera sackarosgradienten vid 150 000 x g i 90 minuter vid 4 °C. Samla de rena plastoglobulerna (figur 1C) med en spruta och 22 G nål från den övre fasen av sackarosgradienten och överför till ett 1,5 ml rör.
- Alikvotera de rena plastoglobulerna och blixtfrysning i flytande kväve. Förvara direkt vid −80 °C eller frystorkas till torrt pulver.
- Producera en sackarosgradient i fyra 2,5 ml ultracentrifugrör skiktade först med 500 μL av de råa plastoglobulerna från steg 1.3 blandat med 750 μL medium R 0.7 och lägg sedan över med 750 μL medium R 0.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter avslutad steg 1 i protokollet bör man lätt kunna se en betydande mängd plastoglobule / lipiddroppmaterial som flyter på (eller nära) det övre lagret av sackaroskudden (figur 1B-C). Andra fraktioner kan också samlas in i detta skede. Till exempel kommer tylakoiderna att pelleteras och kan suspenderas på nytt med medium R 0,2 för efterföljande analyser. Efter efterföljande centrifugering erhålls renade plastoglobuler vid eller nära sackarosgradientens yta, såsom visas i figur 1A,C. Det har setts under vissa omständigheter (t.ex. specifika genotypiska linjer eller miljöförhållanden) att plastoglobulerna kommer att isoleras som två distinkta delpopulationer som separeras vid olika lager i gradienten: en fraktion med låg densitet på gradientytan och en andra, tätare fraktion som sätter sig vid gränssnittet mellan de två översta gradientskikten. Även om en noggrann jämförande analys av separeringsfraktionerna inte tidigare har utförts, verkar det troligt att dessa delpopulationer representerar plastoglobuler av olika storlek, där de med mindre diameter (och därmed större ytarea till volymförhållande och protein till lipidförhållande) kommer att sätta sig lägre i gradienten.
I ett misslyckat försök kommer man att se små eller inga synliga plastoglobuler på ytan av sackaroskudden efter den första centrifugeringsomgången. Underlåtenhet att framgångsrikt isolera tillräckligt med plastoglobuler kan bero på flera faktorer som kan behöva optimeras. I synnerhet kan ultraljudsbehandling teknik (vid användning av frisk bladvävnad) ha en betydande inverkan på framgången. Dessutom kommer den nödvändiga mängden växt- / cyanobakteriellt material att vara beroende av den specifika arten och dess stresstillstånd.
Efter den framgångsrika isoleringen av plastoglobuler är det möjligt att validera renheten hos de isolerade plastoglobulerna med användning av immunoblotting av markörproteinerna för plastoglobuler och tylakoider (det primära förorenande facket). I figur 1D ses representativa immunobloter med antikroppar upphöjda mot A. thaliana FBN1a, som en markör för plastoglobuler2, och mot A. thaliana fotosystem II subenhet D1, som en markör för tylakoider27. FBN-homologerna i Synechocystis sp. PCC 6803 associerar främst med tylakoider snarare än plastoglobuler.
Man bör också noga överväga lagringssättet, vilket kan bero på de avsedda nedströmsstudierna. Speciellt för nedströmsanalyser av prenyl-lipidpigmentlipider är det viktigt att minimera exponeringen av proverna för direkt ljus för att undvika skador på de foto-labila föreningarna. Renade plastoglobuler kan användas för nedströmsexperiment såsom lipidomiska eller proteomiska baserade experiment. Plastoglobuler kännetecknas av ett mycket lågt förhållande mellan protein och lipid, vilket manifesteras i deras låga densitet och förmåga att flyta på sackarosen; Således är en låg proteinkoncentration av plastoglobuleproverna normal. Av denna anledning är det lämpligt att avlägsna lipider före proteinseparation med SDS-PAGE med hjälp av acetonproteinutfällning eller kloroform / metanolextraktion.
Figur 1: Isolering och immunoblotting av plastoglobuler och tylakoider . (A) Ett representativt renat plastoglobulprov från Z. mays före extraktion från sackarosgradienten. B) Ett representativt råplastoglobulprov från uttorkad E. nindens före extraktion från sackaroskudden. (C) Ett representativt råplastoglobulprov (vänster) och rent (höger) från Synechocystis sp. PCC 6803, som visar både före och efter ultracentrifugering av den laddade sackaroskudden respektive lutningen. (D) Anti-fibrillin1a-antikropp (α-FBN1a) användes för att övervaka ackumuleringen av fibrillin, ett markörprotein av plastoglobuler i högre växter. Fibrillinortologen ackumuleras huvudsakligen i de isolerade tylakoiderna av cyanobakterier (Synecho, Syenchocystis sp. PCC 6803). Anti-fotosystem II-underenhet D1 (α-PsbA) användes för att validera utarmningen av tylakoider från plastoglobuliisoleringar. I varje körfält laddades 5 μg tylakoider och 10 μg plastoglobuleprotein. Förkortningar: PG = plastoglobuler; Thy = tylakoider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffertkompositioner a | |
| Slipning buffert | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 100 mM sorbitol | |
| 5 mM askorbinsyra b | |
| 5 mM reducerad cystein b | |
| 0,05 % (vikt/volym) BSA b | |
| Medium R | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| Medel R 0,2 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0,2 M sackaros | |
| Medel R 0,7 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0,7 M sackaros | |
| Buffert A | 25 mM HEPES-KOH (pH 7,8) |
| 250 mM sackaros | |
| a Slutliga koncentrationer av varje buffertkomponent tillhandahålls. | |
| b Måste tillsättas färskt på isoleringsdagen. Medan buffertar kan beredas dagen före isoleringen, måste dessa vissa ingredienser tillsättas färska på isoleringsdagen, liksom eventuella fosfatas- och proteashämmare. | |
Tabell 1: Buffertrecept för plastoglobuleisolering från växtbladvävnad eller cyanobakterier.
| Fosfatashämmare Cocktail b | |
| Hämmare | Slutlig konkludering (mM) |
| Na-fluorid | 50 |
| β-glycerofosfat⋅2Na⋅5H2O | 25 |
| Na-OrthoVanadat | 1 |
| Na-pyrofosfat⋅10H2O | 10 |
| b Fosfatashämmare måste tillsättas färska dagen för isoleringen. | |
Tabell 2: Cocktail av fosfatashämmare.
| Proteashämmare Cocktail a | ||||
| Hämmare | Lager (mg/ml) | Lager medium | Utspädningsfaktorn | Slutlig konkludering (mg/ml) |
| Antipain⋅2HCl | 20 | Vatten | 400 gånger | 50 |
| Bestatin | 1 | 0,15 m NaCl | 25x | 40 |
| Chymostatin | 20 | DMSO | 2000 år | 10 |
| E-64 | 20 | Vatten | 2000 år | 10 |
| Leupeptin (hemisulfat) | 20 | Vatten | 4000 exemplar | 5 |
| P-ramidon⋅2Na | 20 | Vatten | 2000 år | 10 |
| AEBSF | 50 | Vatten | 1000 exemplar | 50 |
| Aprotinin | 10 | Vatten | 5000 exemplar | 2 |
| a Stamlösningarna för proteas skall förvaras vid -20 °C i små alikvoter för långtidsförvaring. Tina och tillsätt färskt till lämplig buffert omedelbart före isoleringen. | ||||
Tabell 3: Proteashämmare cocktail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att minimera fysiologiska/biokemiska förändringar i materialet och skydda vissa foto- och termolabila prenyllipidpigment som är en rik komponent i plastoglobuler är det viktigt att utföra isoleringen vid 4 °C och skyddas mot ljus. Som angivits ovan utförs de första stegen i kylrummet under en säkerhetslampa med en grönemitterande glödlampa. De efterföljande stegen som utförs i laboratoriet är under nedtonade ljus och använder is eller kyld centrifugering. Av liknande skäl är införandet av färska proteashämmare (och fosfatashämmare om det finns intresse för att studera fosforeglering av proteiner) avgörande (tabell 2 och tabell 3).
Medan andra metoder (t.ex. en Dounce homogenisator, frys-tina cykler) kan, i princip, användas för att frigöra plastoglobuler från tylakoider i högre växt kloroplaster, ultraljudsbehandling har visat sig vara mycket överlägsen för att ge bästa utbyte och renhet (opublicerade resultat). Ultraljudsbehandling kan skapa konstgjorda vesiklar från tylakoid lameller eller endoplasmatisk retikulum; emellertid skulle dessa vesiklar vara mycket proteinrika och därmed täta, vilket utesluter deras flotation på sackarosgradienten.
Vid extraktion av den flytande dynan av rena plastoglobuler från sackarosgradienten är det fördelaktigt att extrahera dem i minsta möjliga mängd medium R. Att förvärva koncentrerade plastoglobuler på detta sätt underlättar nedströmsstudier genom att minimera de nödvändiga provvolymerna. Användningen av en spruta och 22 G nål är den mest effektiva strategin för att extrahera plastoglobulerna. På grund av sin hydrofoba, lipidrika natur är de extremt klibbiga, och användningen av pipettspetsar eller en spatel bör undvikas till varje pris. Det har visat sig att förlusten av plastoglobuler på grund av klibbning bäst minimeras med en spruta och nål, även om det inte verkar möjligt att helt förhindra viss förlust under extraktionen.
Om ett lätt synligt, gulkrämigt lager av plastoglobuler inte ses flyta på eller nära ytan av sackarosgradienten, kan otillräckligt växt- / cyanobakteriematerial ha använts för isoleringen. Det har visat sig att monocots ger högre plastoglobule-utbyten än dikoter från jämförbara mängder växtvävnad (opublicerade resultat). Medan korrekta mängder av utgångsbiologiskt material indikeras för de specifika isoleringar som exemplifieras i denna artikel, måste de nödvändiga mängderna vävnad för effektiv extraktion bestämmas empiriskt baserat på organismens art, vävnad och miljöförhållanden. I allmänhet kommer stressad (men inte nekrotisk) bladvävnad eller cyanobakteriella kulturer att ge högre utbyten av plastoglobuler. Vid användning av A. thaliana bladvävnad är två lägenheter av A. thaliana-växter (nästan 140 enskilda växter) från mitten av vegetativt tillväxtstadium vanligtvis tillräckliga för isolering av plastoglobuler, särskilt när växtmaterialet är lätt stressat, till exempel av en lätt stressbehandling 2,4. Som en alternativ förklaring till dåliga utbyten kan den initiala homogeniseringen av bladvävnaden med mixern ha varit för kraftig och separerat plastoglobulerna från tylakoiderna i förtid, eller ultraljudsbehandling av det råa tylakoidmaterialet kan ha varit otillräckligt kraftfullt för att effektivt frigöra plastoglobulerna före flotation (dessa punkter är inte ett problem vid extraktion från cyanobakterier, som är fritt flytande på plats).
Det är viktigt att komma ihåg att plastoglobuleisolering kommer att representera bulkpopulationen av plastoglobuler från ett vävnadsprov. Därför skulle eventuell heterogenitet i lipid, protein eller funktion inte urskiljas från efterföljande studier. På grund av denna begränsning har det inte varit möjligt att mäta hur mycket heterogenitet som kan finnas bland enskilda plastoglobullipiddroppar. Överföringselektronmikrografer av växtbladvävnad från flera organismer avslöjar emellertid differentiella färgningsmönster bland plastoglobuler, även inom samma kloroplast 28,29,30,31. Detta tyder starkt på heterogenitet i lipidinnehållet, även om arten eller syftet med detta fortfarande är oklart. Signifikant visar elektronmikrografer av isolerade A. thaliana plastoglobuler att denna isoleringsmetod inte är partisk för isolering av större eller mindre plastoglobuler2.
Isoleringen av rena plastoglobuler representerar det första steget mot deras detaljerade molekylära karakterisering. Många nedströmsapplikationer kan därefter utföras beroende på utredarens specifika intressen och syfte. Till exempel, för att undersöka lipid- eller proteinkompositionen, är det isolerade provet lätt mottagligt för proteomiska eller lipidomiska studier. In-gel-matsmältningsmetoden är gynnad för bottom-up-proteomikstudier av plastoglobulerprover. Men eftersom lipider är i stort överskott i förhållande till protein kan lipiden störa SDS-PAGE-separationen. Den initiala utfällningen av protein med användning av aceton, med efterföljande resuspension i Laemmli solubiliseringsbuffert, eliminerar de flesta lipider, vilket möjliggör en effektiv separation av protein i SDS-PAGE-separeringsgelén. Initial resuspension av proteinpelleten i 100 mM tris-HCl-buffert och 2% SDS möjliggör noggrann bestämning av proteininnehållet med bicinchoninsyrametoden före tillsats av reduktant, färgämne och glycerol. På samma sätt är lipidrening med hjälp av vätske-vätskefasseparationsmetoder, såsom Bligh and Dyer-metoden, lämplig för nedströms lipidomiska analyser32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Forskningen i Lundquists labbgrupp stöds av anslag från NSF (MCB-2034631) och USDA (MICL08607) till P.K.L. Författarna tackar Dr. Carrie Hiser (MSU) för stöd i utvecklingen av den cyanobakteriella plastoglobuleisoleringsmetoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K.
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
