Summary
يتم تقديم بروتوكول سريع وفعال لعزل قطرات الدهون plastoglobule المرتبطة بالكائنات الحية الضوئية المختلفة. يعد التحضير الناجح للبلازموغلوبولات المعزولة خطوة أولى حاسمة تسبق التحقيقات الجزيئية التفصيلية مثل التحليلات البروتينية والدهون.
Abstract
قطرات الدهون Plastoglobule هي مقصورة فرعية ديناميكية من البلاستيدات الخضراء النباتية والبكتيريا الزرقاء. توجد في كل مكان بين أنواع التمثيل الضوئي ، ويعتقد أنها تلعب دورا مركزيا في تكييف وإعادة تشكيل غشاء الثايلاكويد في ظل ظروف بيئية سريعة التغير. سهلت القدرة على عزل البلاستوغلوبولات عالية النقاء دراستها إلى حد كبير من خلال منهجيات البروتين والدهون وغيرها. مع البلاستوغلوبولات ذات النقاء العالي والعائد ، من الممكن التحقيق في تكوين الدهون والبروتين ، والنشاط الأنزيمي ، وطوبولوجيا البروتين ، من بين الخصائص الجزيئية المحتملة الأخرى. تقدم هذه المقالة بروتوكولا سريعا وفعالا لعزل البلاستوغلوبولات من البلاستوبلاستيدات الخضراء لأنسجة الأوراق النباتية وتقدم اختلافات منهجية لعزل البلاستوغلوبولات وهياكل قطرات الدهون ذات الصلة من أوراق الذرة ، وأنسجة الأوراق المجففة لنبات القيامة ، Eragrostis nindensis ، والبكتيريا الزرقاء ، Synechocystis س. PCC 6803. يعتمد العزل على الكثافة المنخفضة لهذه الجسيمات الغنية بالدهون ، مما يسهل تنقيتها عن طريق تعويم كثافة السكروز. ستثبت هذه المنهجية قيمتها في دراسة البلاستوغلوبولات من الأنواع المتنوعة.
Introduction
ظهر الفهم الحالي لتكوين البلاستوغلوبول ووظيفته من خلال الدراسات التفصيلية للبروتين والدهون1،2،3،4،5. وقد ساعدت مثل هذه الدراسات بشكل كبير من خلال طريقة سريعة وفعالة للعزل تعتمد على كثافتها المنخفضة جدا للفصل الفعال باستخدام تدرجات السكروز. تم تحقيق الطرق الأولية لعزل البلاستوغلوبول من أنواع مثل شجرة الزان (Fagus sylvatica) ، مكنسة سكوتش (Sarothamnus scoparius) ، البصل (Allium cepa) ، السبانخ (Spinacia oleracea) ، بانسي (فيولا الالوان الثلاثة) ، الفلفل (الفليفلة السنوية) ، والبازلاء (Pisum sativum)6،7،8،9،10،11 ، 12،13. تم تقديم طريقة محدثة لعزل البلاستوغلوبولات البلاستوبولية الخضراء بطريقة أكثر كفاءة وأفضل إنتاجية بواسطة Ytterberg et al.3,14. بينما تم توظيفنا في البداية لدراسة البلاستوغلوبولات في البلاستيدات الخضراء لأوراق أرابيدوبسيس ثاليانا ، فقد استخدمنا بنجاح هذه الطريقة المحدثة لأنسجة الأوراق السليمة لأنواع نباتية أخرى ، أحادية الفلقة وثنائية الفلقة ، بما في ذلك الذرة (Zea mays) ، والطماطم (Solanum lycopersicum) ، وعشب الحب (Eragrostis nindensis) ، والبروم الكاذب الأرجواني (Brachypodium distachyon) ، والتبغ البري (Nicotiana benthamiana ; النتائج غير المنشورة). علاوة على ذلك ، تم تكييف طريقة العزل بنجاح مع البلاستوغلوبولات من البكتيريا الزرقاء ، بما في ذلك Synechocystis sp. PCC 6803 و Anabaena sp. PCC 712015 ، وأنسجة الأوراق المجففة لنبات القيامة ، E. nindensis.
ترتبط البلاستيدات الخضراء في أنسجة الأوراق السليمة ماديا بأغشية الثايلاكويد16. على الرغم من هذه الاستمرارية الفيزيائية ، تحافظ المقصورتان الفرعيتان للبلاستيدات الخضراء على تركيبات دهنية وبروتينية مميزة ، على الرغم من اقتراح التبادل المنظم للدهون والبروتين بين الجزأين2،4،17،18،19. في الواقع ، تم اقتراح نموذج نصف نصفي مثير للاهتمام مؤخرا لتهريب الدهون المحايدة بين البلاستيدات الخضراء والسيتوسول19. نظرا للاستمرارية الفيزيائية للبلاستوغلوبولات والثايلاكويدات ، تبدأ طريقة العزل بأنسجة الأوراق السليمة بجمع مستحضر ثايلاكويد خام محبب ، والذي يتم صوتنة لاحقا لفصل البلاستوغلوبولات عن الثايلاكويدات ، وهو ما يتناقض مع الطرق المستخدمة لعزل قطرات الدهون الخلوية20 . ثم يقوم الطرد المركزي الفائق على وسادة السكروز بتعويم البلازموبوليات منخفضة الكثافة عبر السكروز ، مما يفصلها بشكل فعال عن الثايلاكويدات والنوى وغيرها من المواد عالية الكثافة. في المقابل ، من الواضح أن البلاستوغلوبولات في البكتيريا الزرقاء ، وكذلك تلك الموجودة في أنسجة الأوراق المجففة ، موجودة في الجسم الحي في شكل عائم حر. ومن ثم ، فإن عزلتهم تنطوي على الطفو مباشرة على تدرج السكروز. توضح هذه المقالة طريقة العزل عن أنسجة الأوراق السليمة وتوضح كذلك نوعين مختلفين يمكن استخدامهما لعزل البلاستوغلوبولات من أنسجة الأوراق المجففة أو مزارع البكتيريا الزرقاء ، مما يوسع بشكل كبير الاتساع الفسيولوجي والسياق التطوري الذي يمكن فيه دراسة البلاستوغلوبولات.
يمكن لاحقا استخدام البلاستوغلوبولات المعزولة لأي عدد من التحليلات النهائية للتحقيق في الخصائص الجزيئية. لقد استخدمنا البلاستوغلوبولات المعزولة من أنسجة أوراق A. thaliana لإجراء تحليل مكثف للبروتين والدهون في ظل ظروف بيئية أو أنماط وراثية مختلفة ، مما يدل على التعديل الانتقائي لتكوين البروتين والدهون في التكيف مع الإجهاد2،4،21،22. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء فحوصات كيناز في المختبر التي تظهر نشاط الفسفرة العابرة المرتبط بالبلازموغلوبولات المعزولة 22 ، وتم التحقيق في حالات قلة القسيمات لمكونات البروتين باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي الأصلي 21 ، وتم إجراء فحوصات حلاقة البروتياز23.
الفائدة الأساسية لهذه الطريقة هي السرعة النسبية للإجراء. في تجربتنا ، يمكن إكمال البروتوكولات الموضحة أدناه بالكامل في غضون 4 ساعات تقريبا. تم وصف طريقة بديلة لعزل البلاستوغلوبولات من أنسجة الأوراق ، والتي تسمح بالعزل المتزامن للأجزاء الفرعية الأخرى من البلاستيدات الخضراء24. تقدم هذه الطريقة البديلة بعض المزايا الواضحة عندما تكون المقارنة الكمية مع الأجزاء الفرعية الأخرى للبلاستيدات الخضراء ضرورية أو مرغوبة. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة البديلة هي أيضا أكثر مملة وستوفر عائدا أقل بكثير من plastoglobules المعزولة من كميات مماثلة من أنسجة الأوراق. عندما يكون الهدف هو إجراء دراسة مركزة للبلاستوغلوبولات ، فإن المنهجية الموضحة هنا هي الخيار الأمثل. ومع ذلك، يمكن جمع إجمالي حصص الأوراق والثايلاكويد الخام أثناء تحضير العينة، ويوصى بشدة بالقيام بذلك، للحصول على عينات مرجعية للمقارنة اللاحقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عزل البلاستوغلوبول الخام
- استخراج البلاستوغلوبول الخام من أنسجة أوراق الذرة غير المجهدة
- احصل على ست شتلات ذرة صحية يبلغ عمرها حوالي 3 أسابيع وفي مرحلة نمو V5 تقريبا ، وتزن حوالي 120 جم.
- قم بقص جميع الأوراق الموجودة في قاعدة الساق ، ثم اغمسها بسرعة في حمام جليدي ، وانقلها إلى الغرفة الباردة.
- العمل تحت مصباح أمان أخضر ، قم بإزالة أوراق الذرة من حمام الثلج وقصها إلى قطع أصغر (حوالي 5 سم × 5 سم) باستخدام المقص.
- قم بطحن نصف أنسجة الأوراق المقطوعة برفق ولكن بدقة في خلاط تجاري في 350 مل من محلول الطحن (الجدول 1). ابدأ الخلاط 5x-6x لضمان قطع جميع الأوراق. لا تستخدم أعلى من المستوى 7 على الخلاط.
- قم بتصفية التجانس من خلال طبقة واحدة من قماش النايلون 25 ميكرومتر على قمع كبير إلى أربع زجاجات طرد مركزي سعة 250 مل. ثم كرر الخطوة 1.1.4 مع النصف الثاني من نسيج الورقة المقطوع.
- قسم المرشح بالتساوي بين الزجاجات الأربع وأجهزة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق عند 1840 × جم عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة حصة من مرشح الأوراق وضعها جانبا قبل الطرد المركزي ليتم تخزينها كعينة تمثيلية إجمالية للأوراق.
- اسكب المادة الطافية الناتجة وأعد تعليق الحبيبات برفق في 12 مل من المتوسط R 0.2 الذي يحتوي على 0.2 متر سكروز (الجدول 1) عن طريق الدوران وإعادة التعليق بحركات لطيفة للفرشاة. بعد إعادة تعليق كل حبيبة ، احمل التعليق إلى الزجاجة التالية وكرر التعليق. ضع المعلقات في زجاجة واحدة.
- قم بتوزيع التعليق المجمع بين ستة أنابيب طرد مركزي فائقة سعة 3 مل ، ليصل الحد الأقصى لحجم 2.5 مل في كل أنبوب.
- سونيك كل أنبوب 4x ، لمدة 10 ثوان في كل مرة ، باستخدام صوتي طرف بسعة 100٪. احرص على إبقاء قرن الصوتنة مغمورا وبعيدا عن سطح السائل لمنع الزبد.
- حرك بوق الصوتنة ببطء لأعلى ولأسفل داخل التعليق خلال كل جولة. قم بالتناوب بين الأنابيب الأربعة ، وأعد كل أنبوب إلى دلو ثلج بعد كل صوتنة للسماح للعينة بالتبريد.
- جهاز طرد مركزي معلق الثايلاكويد الخام الصوتي عند 150000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. احصد الوسادة العائمة الناتجة من البلاستوغلوبولات الخام من سطح وسادة السكروز (التي يمكن رؤيتها بسهولة على أنها وسادة زيتية صفراء) باستخدام حقنة وإبرة 22 جم عن طريق قشط سطح الوسادة بفتحة الإبرة ، واستعادة ما يقرب من 500 ميكرولتر من كل أنبوب. أودع في أنبوب سعة 2.0 مل.
- جمع القسمة من الثايلاكويد الخام قبل وبعد صوتنة وإطلاق البلاستوغلوبولات. تابع إلى الخطوة 2.1. بدلا من ذلك ، قم بتخزين البلاستوغلوبولات الخام عند -80 درجة مئوية وتنقيتها في وقت لاحق.
- استخراج البلاستوغلوبول الخام من أنسجة أوراق E. nindensis المجففة
- احصل على وعاء (يتكون من ثلاثة نباتات فردية لكل وعاء) من E. nindensis المجفف بالكامل والبالغ من العمر 8-9 أسابيع (ما يقرب من 40 جم من الأنسجة).
- قم بقص جميع أنسجة الأوراق من قاعدة النبات ، فوق التربة مباشرة ، باستخدام المقص واغمس الأنسجة على الفور في حمام جليدي. نقل الأنسجة إلى الغرفة الباردة.
- العمل تحت مصباح أمان أخضر ، قص E. أوراق نيندينسيس إلى قطع أصغر (حوالي 5 سم × 5 سم) باستخدام المقص.
- قم بطحن الأوراق برفق ولكن بدقة باستخدام 100 مل من محلول الطحن (الجدول 1) في خلاط تجاري. ابدأ الخلاط عدة مرات للتأكد من قطع جميع الأوراق. لا تستخدم أعلى من المستوى 7 على الخلاط.
- قم بتصفية التجانس من خلال طبقة واحدة من قماش نايلون 25 ميكرومتر على قمع كبير في دورق مخروطي سعة 250 مل. قم بإزالة حصة من مرشح الأوراق وضعها جانبا قبل الطرد المركزي ليتم تخزينها كعينة تمثيلية إجمالية للأوراق.
- أضف الكمية المناسبة من السكروز ليصل تركيزها النهائي إلى 0.5 M ووزع المحلول على أنابيب طرد مركزي سعة 250 مل.
ملاحظة: يتم استخدام تركيز أعلى من السكروز مقارنة بمستحضر Z. mays لضمان تعويم قطرات الدهون الخلوية قبل الصوتنة / الإطلاق اللاحق للبلاستوغلوبولات المرتبطة بالثايلاكويد. - أجهزة الطرد المركزي للأنابيب عند 45000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يمكن بسهولة رؤية خليط من البلاستوغلوبولات وقطرات الدهون الخلوية على شكل وسادة زيتية صفراء على سطح وسادة السكروز أو بالقرب منه (الشكل 1 ب). اجمع المواد العائمة باستخدام حقنة بإبرة 22 جم عن طريق كشط سطح الوسادة بفتحة الإبرة ، وإيداعها في أنبوب.
- تخلص من المادة الطافية المتبقية بعد جمع خليط البلاستوغلوبول/القطيرات الدهنية العائم بحرية.
- لعزل البلاستوغلوبولات المتصلة بالثايلاكويد المتبقي ، أعد تعليق الحبيبات في 12 مل من R 0.2 المتوسط عن طريق الدوران وإعادة التعليق بحركات لطيفة للفرشاة. ضع المعلقات في زجاجة واحدة. تابع إلى الخطوة 1.1.8.
- استخراج البلاستوغلوبول الخام من البكتيريا الزرقاء
- قم بزراعة 50 مل من Synechocystis sp. PCC 6803 إلى المرحلة الثابتة (حوالي 7-10 أيام) واضبط كثافة الخلية على OD750 من 2.0 باستخدام مقياس الطيف الضوئي. بالنسبة لظروف الاستزراع ، استخدم وسائط BG-11 وتنمو في حاضنة بكثافة ضوء تبلغ 150 ميكرومول فوتونات / م 2 / ثانية ، 2٪ CO2 ، 32 درجة مئوية ، ومع اهتزاز مستمر عند 150 دورة في الدقيقة.
- لإزالة السكريات ، اغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمزرعة 50 مل عند 6000 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية ثم إزالة المادة الطافية. استمر في غسل الخلايا مرتين في 50 مل من المخزن المؤقت A (الجدول 1). قم بإزالة حصة من تجانس الخلية وضعها جانبا قبل الطرد المركزي ليتم تخزينها كعينة خلية إجمالية تمثيلية
- أعد تعليق الحبيبات المغسولة في 25 مل من المخزن المؤقت A وكسر الخلايا باستخدام خلية ضغط فرنسية عند 1100 رطل / بوصة مربعة ، مع تكرار العملية 3x (ضع العينة على الجليد بين كل دورة لتجنب تمسخ البروتين) حتى يتغير اللون المحلل من الأخضر إلى الأحمر والأزرق والأخضر تحت الضوء الأبيض. استخدم خلية مبردة مسبقا وقم بتنفيذ هذه الخطوة في الغرفة الباردة.
- قم بتوزيع التجانس الناتج بين ثمانية أنابيب طرد مركزي فائقة سعة 3 مل مملوءة بحد أقصى 2.5 مل في كل أنبوب ثم قم بالتراكب بعناية مع 400 ميكرولتر من R المتوسط ، مما ينتج عنه تدرج تدريجي.
ملاحظة: راجع Yang, et al. and Kelekar, et al. للحصول على أوصاف مفصلة لإعداد تدرج السكروز25,26. - قم بموازنة الأنابيب بعناية عن طريق إضافة وسيط R إضافي ، حسب الضرورة ، وأجهزة طرد مركزي لمدة 30 دقيقة عند 150000 × جم عند 4 درجات مئوية. سوف يحبيبات الثايلاكويد والعضيات الأثقل الأخرى (بما في ذلك أي أجسام متعددة هيدروكسي ألكانوات) ، بينما سينظر إلى البلاستوغلوبولات بسهولة على أنها وسادة زيتية صفراء على قمة تدرج السكروز أو بالقرب منه (الشكل 1 ج).
- احصد الوسادة العائمة الناتجة من البلاستوغلوبولات الخام باستخدام حقنة وإبرة 22 جيجا وترسب في أنبوب سعة 2 مل. اكشط البلاستوغلوبولات من جانب جدار أنبوب الطرد المركزي الفائق بطرف الإبرة إذا لزم الأمر.
- تابع إلى الخطوة 2.2. بدلا من ذلك ، قم بتخزين البلاستوغلوبولات الخام عند -80 درجة مئوية وتنقيتها لاحقا.
2. حصاد البلاستوغلوبولات النقية
- معالجة الأنسجة النباتية
- إنتاج تدرجات السكروز في أنابيب الطرد المركزي الفائق سعة 2.5 مل عن طريق وضع طبقات أولى مع 500 ميكرولتر من البلاستوغلوبولات الخام من الخطوة 1.1 أو الخطوة 1.2 الممزوجة ب 500 ميكرولتر من الوسط R 0.7 ، ليصل الحجم الإجمالي إلى 1 مل ، ثم التراكب مع 400 ميكرولتر من المتوسط R 0.2 ، متبوعا بالتراكب مع 400 ميكرولتر من R المتوسط.
ملاحظة: راجع Yang et al. و Kelekar et al. للحصول على أوصاف مفصلة لإعداد تدرج السكروز25,26. - قم بموازنة الأنابيب بعناية عن طريق إضافة وسيط R الزائد إلى الطبقة العليا ، حسب الضرورة. ثم أجهزة الطرد المركزي عند 150000 × جم لمدة 1.5 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- احصد الوسادة العائمة الناتجة من البلاستوغلوبولات النقية (الشكل 1 أ) باستخدام حقنة وإبرة 22 جيجا وترسب في أنبوب سعة 2 مل. اكشط البلاستوغلوبولات من أعلى جدار أنبوب الطرد المركزي بطرف الإبرة إذا لزم الأمر.
- Aliquot البلاستوغلوبولات النقية وتجميد فلاش في النيتروجين السائل. يحفظ مباشرة في درجة حرارة -80 درجة مئوية أو يجفف إلى مسحوق جاف.
- إنتاج تدرجات السكروز في أنابيب الطرد المركزي الفائق سعة 2.5 مل عن طريق وضع طبقات أولى مع 500 ميكرولتر من البلاستوغلوبولات الخام من الخطوة 1.1 أو الخطوة 1.2 الممزوجة ب 500 ميكرولتر من الوسط R 0.7 ، ليصل الحجم الإجمالي إلى 1 مل ، ثم التراكب مع 400 ميكرولتر من المتوسط R 0.2 ، متبوعا بالتراكب مع 400 ميكرولتر من R المتوسط.
- معالجة البكتيريا الزرقاء
- أنتج تدرج السكروز في أربعة أنابيب طرد مركزي فائقة سعة 2.5 مل في طبقات أولا مع 500 ميكرولتر من البلاستوغلوبولات الخام من الخطوة 1.3 مختلطة مع 750 ميكرولتر من الوسط R 0.7 ، ثم تراكب مع 750 ميكرولتر من الوسط R 0.2.
ملاحظة: راجع Yang et al. و Kelekar et al. للحصول على أوصاف مفصلة لإعداد تدرج السكروز25,26. - جهاز طرد مركزي لتدرج السكروز عند 150000 × جم لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع البلاستوغلوبولات النقية (الشكل 1C) باستخدام حقنة وإبرة 22 جم من المرحلة العليا من تدرج السكروز وانقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
- Aliquot البلاستوغلوبولات النقية وتجميد فلاش في النيتروجين السائل. يحفظ مباشرة في درجة حرارة -80 درجة مئوية أو يجفف إلى مسحوق جاف.
- أنتج تدرج السكروز في أربعة أنابيب طرد مركزي فائقة سعة 2.5 مل في طبقات أولا مع 500 ميكرولتر من البلاستوغلوبولات الخام من الخطوة 1.3 مختلطة مع 750 ميكرولتر من الوسط R 0.7 ، ثم تراكب مع 750 ميكرولتر من الوسط R 0.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عند الانتهاء من الخطوة 1 من البروتوكول ، يجب أن يكون المرء قادرا على رؤية كمية كبيرة من مادة البلاستوغلوبول / قطرات الدهون تطفو على (أو بالقرب من) الطبقة العليا من وسادة السكروز (الشكل 1B-C). يمكن أيضا جمع كسور أخرى في هذه المرحلة. على سبيل المثال ، سيتم تكوير الثايلاكويدات ويمكن إعادة تعليقها بمتوسط R 0.2 للتحليلات اللاحقة. بعد الطرد المركزي اللاحق ، سيتم الحصول على البلاستوغلوبولات المنقاة عند أو بالقرب من سطح تدرج السكروز ، كما هو موضح في الشكل 1A ، C. لقد لوحظ في ظروف معينة (على سبيل المثال ، خطوط وراثية محددة أو ظروف بيئية) أن البلاستوغلوبولات ستعزل كمجموعتين فرعيتين متميزتين تنفصلان في طبقات مختلفة في التدرج: جزء منخفض الكثافة على سطح التدرج وجزء ثان أكثر كثافة يستقر عند الواجهة بين أعلى طبقتين متدرجتين. في حين لم يتم إجراء تحليل مقارن دقيق للكسور المنفصلة من قبل ، يبدو من المحتمل أن هذه المجموعات الفرعية تمثل بلاستوغلوبولات مختلفة الحجم ، حيث تستقر تلك ذات القطر الأصغر (وبالتالي مساحة السطح الأكبر إلى نسبة الحجم ونسبة البروتين إلى الدهون) أقل في التدرج.
في محاولة فاشلة ، سيرى المرء القليل من البلاستوغلوبولات المرئية أو لا يرى أي منها على سطح وسادة السكروز بعد الجولة الأولى من الطرد المركزي. يمكن أن يعتمد الفشل في عزل ما يكفي من البلاستوغلوبولات بنجاح على عدة عوامل قد تحتاج إلى التحسين. على وجه الخصوص ، يمكن أن يكون لتقنية صوتنة (عند استخدام أنسجة الأوراق السليمة) تأثير كبير على النجاح. بالإضافة إلى ذلك ، ستعتمد الكمية اللازمة من المواد النباتية / البكتيريا الزرقاء على الأنواع المحددة وحالة الإجهاد الخاصة بها.
بعد العزلة الناجحة للبلازموغلوبولات ، من الممكن التحقق من نقاء البلاستوغلوبولات المعزولة باستخدام النشاف المناعي لبروتينات العلامة للبلاستوغلوبول والثايلاكويدات (حجرة التلوث الأولية). في الشكل 1 د، تظهر البقع المناعية التمثيلية باستخدام الأجسام المضادة المرفوعة ضد A. thaliana FBN1a، كعلامة للبلاستوغلوبولات2، وضد الوحدة الفرعية D1 للنظام الضوئي A. thaliana II، كعلامة على الثايلاكويدات27. ترتبط متجانسات FBN في Synechocystis sp. PCC 6803 بشكل أساسي بالثايلاكويدات بدلا من البلاستوغلوبولات.
ينبغي للمرء أيضا أن ينظر بعناية في طريقة التخزين ، والتي قد تعتمد على الدراسات النهائية المقصودة. خاصة بالنسبة للتحليلات النهائية للدهون الصبغية الدهني للبرينيل ، من الأهمية بمكان تقليل تعرض العينات للضوء المباشر لتجنب تلف المركبات الضوئية. يمكن استخدام البلاستوغلوبولات المنقاة في التجارب النهائية مثل التجارب القائمة على الدهون أو البروتينات. تتميز Plastoglobules بنسبة منخفضة جدا من البروتين إلى الدهون ، والتي تتجلى في كثافتها المنخفضة وقدرتها على الطفو على السكروز. وبالتالي ، فإن تركيز البروتين المنخفض لعينات البلاستوغلوبول أمر طبيعي. لهذا السبب ، ينصح بإزالة الدهون قبل فصل البروتين بواسطة SDS-PAGE باستخدام ترسيب بروتين الأسيتون أو استخراج الكلوروفورم / الميثانول.
الشكل 1: عزل البلاستوغلوبولات والثايلاكويدات والتنشيف المناعي لها . (أ) عينة بلاستوغلوبول تمثيلية منقاة من Z. mays قبل الاستخلاص من تدرج السكروز. (ب) عينة بلاستوغلوبول خام تمثيلية من E. nindensis المجففة قبل الاستخلاص من وسادة السكروز. (ج) عينة تمثيلية خام (يسار) ونقية (يمين) من Synechocystis sp. PCC 6803 ، تظهر قبل وبعد الطرد المركزي الفائق لوسادة السكروز المحملة والتدرج ، على التوالي. (د) تم استخدام الجسم المضاد للفيبريلين 1a (α-FBN1a) لمراقبة تراكم الفيبريلين ، وهو بروتين علامة من البلاستوغلوبولات في النباتات العليا. يتراكم أورثولوج الفيبريلين في الغالب في الثايلاكويدات المعزولة للبكتيريا الزرقاء (Synecho ، Syenchocystis sp. PCC 6803). تم استخدام الوحدة الفرعية D1 المضادة للنظام الضوئي II (α-PsbA) للتحقق من استنفاد الثايلاكويدات من عزلات البلاستوغلوبول. في كل حارة ، تم تحميل 5 ميكروغرام من الثايلاكويدات و 10 ميكروغرام من بروتين البلاستوغلوبول. الاختصارات: PG = البلاستوغلوبولات. لديك = الثايلاكويدات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| التراكيب العازلة أ | |
| طحن العازلة | 50 ملليمتر HEPES-KOH (درجة الحموضة 8.0) |
| 5 مللي متر MgCl2 | |
| 100 مللي متر سوربيتول | |
| 5 مليمتر حمض الأسكوربيك ب | |
| 5 ملليمتر من السيستين المختزل ب | |
| 0.05٪ (وزن / حجم) BSA ب | |
| متوسط R | 50 ملليمتر HEPES-KOH (درجة الحموضة 8.0) |
| 5 مللي متر MgCl2 | |
| متوسط R 0.2 | 50 ملليمتر HEPES-KOH (درجة الحموضة 8.0) |
| 5 مللي متر MgCl2 | |
| 0.2 م سكروز | |
| متوسط R 0.7 | 50 ملليمتر HEPES-KOH (درجة الحموضة 8.0) |
| 5 مللي متر MgCl2 | |
| 0.7 م سكروز | |
| المخزن المؤقت أ | 25 مليمتر هيبس كوه (درجة الحموضة 7.8) |
| 250 مليمتر سكروز | |
| (أ ) ترد التركيزات النهائية لكل عنصر من مكونات المواد العازلة. | |
| ب يجب أن تضاف طازجة في يوم العزل. بينما يمكن تحضير المخازن المؤقتة في اليوم السابق للعزل ، يجب إضافة هذه المكونات المعينة طازجة في يوم العزل ، بالإضافة إلى أي مثبطات للفوسفاتيز والأنزيم البروتيني. | |
الجدول 1: وصفات عازلة لعزل البلاستوغلوبول من أنسجة أوراق النبات أو البكتيريا الزرقاء.
| كوكتيل مثبط الفوسفاتيز ب | |
| المانع | المطابقة النهائية (mM) |
| نا فلوريد | 50 |
| β-غليسيروفوسفات ⋅2Na⋅5H2O | 25 |
| نا-أورثوفاناديت | 1 |
| Na-بيروفوسفات ⋅10H2O | 10 |
| (ب) يجب إضافة مثبطات الفوسفاتيز طازجة في يوم العزل. | |
الجدول 2: كوكتيل مثبط الفوسفاتيز.
| كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني أ | ||||
| المانع | المخزون (ملغم / مل) | الأسهم المتوسطة | عامل التخفيف | المخروط النهائي (ملغم / مل) |
| مضاد للألم ⋅ 2HCl | 20 | الماء | 400 أضعاف | 50 |
| بيستاتين | 1 | 0.15 م كلوريد الصوديوم | 25 ضعفا | 40 |
| كيموستاتين | 20 | دمسو | 2000x | 10 |
| إي-64 | 20 | الماء | 2000x | 10 |
| ليوببتين (هيميسلفات) | 20 | الماء | 4000x | 5 |
| ف-راميدون⋅2نا | 20 | الماء | 2000x | 10 |
| إي بي إس إف | 50 | الماء | 1000x | 50 |
| أبروتينين | 10 | الماء | 5000x | 2 |
| (أ ) يجب تخزين محاليل مخزون الأنزيم البروتيني عند درجة حرارة -20 س في حصص صغيرة لتخزينها على المدى الطويل. قم بإذابة الثلج وأضفه طازجا إلى المخزن المؤقت المناسب مباشرة قبل العزل. | ||||
الجدول 3: كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لتقليل التغيرات الفسيولوجية / الكيميائية الحيوية في المادة وحماية بعض أصباغ الدهون الضوئية والحرارية التي تعد مكونا غنيا في البلاستوغلوبولات ، من الأهمية بمكان إجراء العزل عند 4 درجات مئوية ومحمي من الضوء. كما هو موضح أعلاه ، يتم تنفيذ الخطوات الأولية في الغرفة الباردة تحت مصباح أمان باستخدام مصباح كهربائي ينبعث منه اللون الأخضر. الخطوات اللاحقة التي يتم إجراؤها في المختبر تحت أضواء خافتة وتستخدم الثلج أو الطرد المركزي المبرد. لأسباب مماثلة ، فإن إدراج مثبطات الأنزيم البروتيني الطازجة (ومثبطات الفوسفاتيز إذا كان هناك اهتمام بدراسة تنظيم الفوسفو للبروتينات) أمر بالغ الأهمية (الجدول 2 والجدول 3).
في حين أن الطرق الأخرى (على سبيل المثال ، خالط Dounce ، دورات التجميد والذوبان) يمكن ، من حيث المبدأ ، استخدامها لإطلاق البلاستوغلوبولات من الثايلاكويدات في البلاستيدات الخضراء النباتية الأعلى ، فقد وجد أن الصوتنة أفضل بكثير في توفير أفضل عائد ونقاء (نتائج غير منشورة). قد يخلق Sonication حويصلات اصطناعية من صفائح الثايلاكويد أو الشبكة الإندوبلازمية. ومع ذلك ، فإن هذه الحويصلات ستكون غنية جدا بالبروتين ، وبالتالي فهي كثيفة ، مما يحول دون تعويمها على تدرج السكروز.
عند استخراج الوسادة العائمة من البلاستوغلوبولات النقية من تدرج السكروز ، من المفيد استخراجها بأقل كمية ممكنة من R المتوسطة. إن الحصول على البلاستوغلوبولات المركزة بهذه الطريقة يسهل الدراسات النهائية عن طريق تقليل الأحجام اللازمة من العينة. استخدام حقنة وإبرة 22 غرام هو الاستراتيجية الأكثر فعالية لاستخراج البلاستوغلوبولات. نظرا لطبيعتها الكارهة للماء والغنية بالدهون ، فهي لزجة للغاية ، ويجب تجنب استخدام أطراف الماصة أو الملعقة بأي ثمن. لقد وجد أنه من الأفضل تقليل فقدان البلاستوغلوبولات بسبب الالتصاق باستخدام حقنة وإبرة ، على الرغم من أنه لا يبدو من الممكن منع بعض الخسارة تماما أثناء الاستخراج.
إذا لم يتم رؤية طبقة كريمية صفراء سهلة الرؤية من البلاستوغلوبولات تطفو على سطح تدرج السكروز أو بالقرب منه ، فربما تم استخدام مادة نباتية / بكتيرية زرقاء غير كافية للعزل. لقد وجد أن أحاديات الفلقة تعطي غلة بلاستوغلوبول أعلى من ثنائيات الفلقة من كميات مماثلة من الأنسجة النباتية (نتائج غير منشورة). بينما يشار إلى الكميات المناسبة من المواد البيولوجية الأولية للعزلات المحددة الموضحة في هذه المقالة ، يجب تحديد الكميات اللازمة من الأنسجة للاستخراج الفعال تجريبيا بناء على الأنواع والأنسجة والظروف البيئية للكائن الحي. بشكل عام ، فإن أنسجة الأوراق المجهدة (ولكن ليست النخرية) أو الثقافات البكتيرية الزرقاء ستعطي غلات أعلى من البلاستوغلوبولات. عند استخدام أنسجة أوراق A. thaliana ، عادة ما تكون شقتان من نباتات A. thaliana (ما يقرب من 140 نباتا فرديا) من مرحلة النمو الخضري المتوسطة كافية لعزل البلاستوغلوبولات ، خاصة عندما تكون المادة النباتية مجهدة بشكل معتدل ، على سبيل المثال ، عن طريق علاج الإجهاد الخفيف 2,4. كتفسير بديل لضعف الغلة ، قد يكون التجانس الأولي لأنسجة الأوراق مع الخلاط قويا جدا ويفصل البلاستوغلوبولات عن الثايلاكويدات قبل الأوان ، أو قد يكون صوتنة مادة الثايلاكويد الخام غير قوية بما يكفي لإطلاق البلاستوغلوبولات بشكل فعال قبل التعويم (هذه النقاط ليست مشكلة عند الاستخراج من البكتيريا الزرقاء ، التي تطفو بحرية في الموقع).
من المهم أن تضع في اعتبارك أن عزل البلاستوغلوبول سيمثل الجزء الأكبر من البلاستوغلوبولات من عينة الأنسجة. وبالتالي ، فإن أي عدم تجانس محتمل في الدهون أو البروتين أو الوظيفة لن يكون واضحا من الدراسات اللاحقة. بسبب هذا القيد ، لم يكن من الممكن قياس مقدار عدم التجانس الذي قد يكون موجودا بين قطرات الدهون البلاستوغلوبولية الفردية. ومع ذلك ، فإن الصور المجهرية الإلكترونية النفاذة لأنسجة أوراق النبات من كائنات متعددة تكشف عن أنماط تلطيخ تفاضلية بين البلاستوغلوبولات ، حتى داخل نفس البلاستيدة الخضراء28،29،30،31. هذا يشير بقوة إلى عدم التجانس في محتوى الدهون ، على الرغم من أن طبيعة أو الغرض من ذلك لا يزال غير واضح. بشكل ملحوظ ، تظهر الصور المجهرية الإلكترونية ل A. thaliana plastoglobules المعزولة أن طريقة العزل هذه ليست متحيزة لعزل البلاستوغلوبولات الأكبر أو الأصغر2.
يمثل عزل البلاستوغلوبولات النقية الخطوة الأولى نحو توصيفها الجزيئي المفصل. يمكن بعد ذلك تنفيذ العديد من التطبيقات النهائية اعتمادا على المصالح والغرض المحدد للمحقق. على سبيل المثال ، للتحقيق في تكوين الدهون أو البروتين ، تكون العينة المعزولة قابلة بسهولة للدراسات البروتينية أو الدهون. يفضل نهج الهضم داخل الهلام لدراسات البروتينات من أسفل إلى أعلى لعينات البلاستوغلوبولات. ومع ذلك ، نظرا لأن الدهون في فائض كبير بالنسبة للبروتين ، يمكن أن تتداخل الدهون مع فصل SDS-PAGE. الترسيب الأولي للبروتين باستخدام الأسيتون ، مع إعادة التعليق اللاحق في محلول الذوبان Laemmli ، يزيل معظم الدهون ، مما يسمح بفصل فعال للبروتين في هلام الفصل SDS-PAGE. تسمح إعادة التعليق الأولي لحبيبات البروتين في محلول 100 mM tris-HCl و 2٪ SDS بتحديد دقيق لمحتوى البروتين بطريقة حمض البيسينتشونينيك قبل إضافة المختزل والصبغة والجلسرين. وبالمثل ، فإن تنقية الدهون باستخدام طرق فصل الطور السائل والسائل ، مثل طريقة Bligh و Dyer ، مناسبة لتحليلات الدهون النهائية32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يوجد تضارب في المصالح للإعلان.
Acknowledgments
يتم دعم البحث في مجموعة مختبر Lundquist بمنح من NSF (MCB-2034631) ووزارة الزراعة الأمريكية (MICL08607) إلى P.K.L. يشكر المؤلفون الدكتورة كاري هيزر (جامعة ولاية ميشيغان) على دعمها في تطوير طريقة عزل البلاستوغلوبول البكتيري الأزرق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K.
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
