Summary
Se presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobullos asociadas a diversos organismos fotosintéticos. La preparación exitosa de plastoglóbulos aislados es un primer paso crucial que precede a las investigaciones moleculares detalladas, como los análisis proteómicos y lipidómicos.
Abstract
Las gotitas lipídicas de plastoglobulo son un subcompartimento dinámico de cloroplastos vegetales y cianobacterias. Se encuentran ubicuamente entre las especies fotosintéticas, se cree que desempeñan un papel central en la adaptación y remodelación de la membrana tilacoide en condiciones ambientales que cambian rápidamente. La capacidad de aislar plastoglóbulos de alta pureza ha facilitado enormemente su estudio a través de metodologías proteómicas, lipidómicas y otras. Con plastoglóbulos de alta pureza y rendimiento, es posible investigar su composición lipídica y proteica, actividad enzimática y topología proteica, entre otras posibles características moleculares. Este artículo presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de plastoglóbulos de cloroplastos de tejido foliar vegetal y presenta variaciones metodológicas para el aislamiento de plastoglóbulos y estructuras de gotitas lipídicas relacionadas de hojas de maíz, el tejido foliar desecado de la planta de resurrección, Eragrostis nindensis, y la cianobacteria, Synechocystis PCC 6803. El aislamiento se basa en la baja densidad de estas partículas ricas en lípidos, lo que facilita su purificación por flotación por densidad de sacarosa. Esta metodología resultará valiosa en el estudio de plastoglóbulos de diversas especies.
Introduction
La comprensión actual de la composición y función de los plastoglobullos ha surgido a través de estudios proteómicos y lipidómicos detallados 1,2,3,4,5. Tales estudios han sido ayudados en gran medida por un método rápido y efectivo de aislamiento que se basa en su muy baja densidad para una separación eficiente utilizando gradientes de sacarosa. Los métodos iniciales de aislamiento de plastoglobullos se lograron a partir de especies como el haya (Fagus sylvatica), la escoba (Sarothamnus scoparius), la cebolla (Allium cepa), la espinaca (Spinacia oleracea), el pensamiento (Viola tricolor), la pimienta (Capsicum annuum) y el guisante (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Un método actualizado para aislar plastoglóbulos de cloroplastos de una manera más eficiente y de mejor rendimiento fue presentado posteriormente por Ytterberg et al.3,14. Aunque inicialmente se empleó para el estudio de los plastoglóbulos de los cloroplastos de hojas de Arabidopsis thaliana, hemos empleado con éxito este método actualizado para el tejido foliar sano de otras especies de plantas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, incluyendo maíz (Zea mays), tomate (Solanum lycopersicum), hierba del amor (Eragrostis nindensis), bromo falso púrpura (Brachypodium distachyon) y tabaco silvestre (Nicotiana benthamiana) ; resultados no publicados). Además, el método de aislamiento se ha adaptado con éxito a los plastoglóbulos de cianobacterias, incluyendo Synechocystis sp. PCC 6803 y Anabaena sp. PCC 712015, y el tejido foliar desecado de la planta de resurrección, E. nindensis.
Los plastoglóbulos de cloroplasto del tejido foliar sano están conectados físicamente a las membranas tilacoides16. A pesar de esta continuidad física, los dos subcompartimentos del cloroplasto mantienen distintas composiciones de lípidos y proteínas, aunque se ha propuesto el intercambio regulado de lípidos y proteínas entre los dos compartimentos 2,4,17,18,19. De hecho, recientemente se ha propuesto un interesante modelo de hemifusión para el tráfico de lípidos neutros entre cloroplastos y citosol19. Debido a la continuidad física de plastoglóbulos y tilacoides, el método de aislamiento con tejido foliar sano comienza con la recolección de una preparación de tilacoide crudo granulado, que posteriormente se sonica, para separar los plastoglóbulos de los tilacoides, lo que contrasta con los métodos utilizados para aislar gotas lipídicas citosólicas20 . La ultracentrifugación en un cojín de sacarosa hace flotar los plastoglóbulos de baja densidad a través de la sacarosa, separándolos efectivamente de los tilacoides, núcleos y otros materiales de alta densidad. En contraste, los plastoglóbulos en cianobacterias, así como los de tejido foliar desecado, evidentemente existen in vivo en forma flotante. Por lo tanto, su aislamiento implica flotar directamente en un gradiente de sacarosa. Este artículo demuestra el método de aislamiento del tejido foliar sano y además demuestra dos variaciones que se pueden utilizar para aislar plastoglóbulos de tejido foliar desecado o cultivos de cianobacterias, ampliando en gran medida la amplitud fisiológica y el contexto evolutivo en el que se pueden estudiar los plastoglobulos.
Los plastoglóbulos aislados se pueden utilizar posteriormente para cualquier número de análisis posteriores para investigar las características moleculares. Se han utilizado los plastoglobullos aislados del tejido foliar de A. thaliana para un extenso análisis proteómico y lipidómico bajo diferentes condiciones ambientales o genotipos, demostrando la modificación selectiva de la composición proteica y lipídica en adaptación al estrés 2,4,21,22. Además, se han realizado ensayos de quinasa in vitro que demuestran actividad transfosforilación asociada a plastoglóbulos aislados 22, se han investigado los estados oligoméricos de los componentes proteicos mediante electroforesis en gel nativo 21 y se han realizado ensayos de afeitado de proteasa23.
El principal beneficio de este método es la velocidad relativa del procedimiento. En nuestra experiencia, los protocolos descritos a continuación se pueden completar completamente en aproximadamente 4 horas. Se ha descrito un método alternativo para aislar plastoglóbulos del tejido foliar, que permite el aislamiento simultáneo de otros subcompartimentos de cloroplastos24. Este método alternativo ofrece algunas ventajas claras cuando es necesaria o deseada una comparación cuantitativa con los otros subcompartimentos del cloroplasto. Sin embargo, este método alternativo también es más tedioso y proporcionará un rendimiento significativamente menor de plastoglóbulos aislados a partir de cantidades comparables de tejido foliar. Cuando el objetivo es un estudio centrado en los plastoglóbulos, la metodología descrita aquí es la opción óptima. No obstante, se pueden recolectar alícuotas totales de hoja y tilacoide crudo durante la preparación de la muestra, y se recomienda encarecidamente hacerlo, para tener muestras de referencia para su posterior comparación.
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Protocol
1. Aislamiento de plastoglóbulos crudos
- Extracción cruda de plastoglóbulo del tejido foliar de maíz no estresado
- Adquiera seis plántulas de maíz sanas de aproximadamente 3 semanas de edad y casi en la etapa de crecimiento V5, con un peso aproximado de 120 g.
- Recorte todas las hojas en la base del tallo, sumérjalas rápidamente en un baño de hielo y transpógrelas a la cámara frigorífica.
- Trabajando bajo una lámpara de seguridad verde, retire las hojas de maíz del baño de hielo y córtelas en trozos más pequeños (alrededor de 5 cm x 5 cm) con tijeras.
- Moler suavemente pero a fondo la mitad del tejido de la hoja recortada en una licuadora comercial en 350 ml de tampón de molienda (Tabla 1). Arranque-detenga la licuadora 5x-6x para asegurarse de que todas las hojas estén cortadas. No use más alto que el nivel 7 en la licuadora.
- Filtre el homogeneizado a través de una capa de tela de nylon de 25 μm en un embudo grande en cuatro botellas de centrífuga de 250 ml. A continuación, repita el paso 1.1.4 con la segunda mitad del tejido foliar recortado.
- Dividir uniformemente el filtrado entre las cuatro botellas y centrifugar durante 6 min a 1.840 x g a 4 °C. Retirar una alícuota del filtrado foliar y reservarla antes de la centrifugación para almacenarla como muestra representativa de la hoja total.
- Vierta el sobrenadante resultante y resuspenda suavemente el pellet en 12 ml de medio R 0.2 que contenga 0.2 M de sacarosa (Tabla 1) girando y resuspendiendo con movimientos suaves del cepillo. Después de resuspender cada pellet, lleve la suspensión a la siguiente botella y repita la resuspensión. Agrupe las suspensiones en una botella.
- Distribuir la suspensión agrupada entre seis tubos de ultracentrífuga de 3 mL, alcanzando un volumen máximo de 2,5 mL en cada tubo.
- Sonicar cada tubo 4x, durante 10 s cada vez, utilizando un sonicador de punta a una amplitud del 100%. Tenga cuidado de mantener la bocina del sonicador sumergida y lejos de la superficie del líquido para evitar la espuma.
- Mueva lentamente la bocina del sonicador hacia arriba y hacia abajo dentro de la suspensión durante cada ronda. Alterne entre los cuatro tubos, devolviendo cada tubo a un cubo de hielo después de cada sonicación para permitir que la muestra se enfríe.
- Centrifugar la suspensión tilacoide cruda sonicada a 150.000 x g durante 30 min a 4 °C. Recolecte la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos crudos de la superficie del cojín de sacarosa (fácilmente visto como una almohadilla amarilla y aceitosa) usando una jeringa y una aguja de 22 G rozando la superficie del cojín con la abertura de la aguja, recuperando aproximadamente 500 μL de cada tubo. Depositar en un tubo de 2.0 mL.
- Recolectar alícuotas del tilacoide crudo antes y después de la sonicación y liberación de plastoglobulos. Continúe con el paso 2.1. Alternativamente, almacenar los plastoglóbulos crudos a -80 °C y purificar en un momento posterior.
- Extracción cruda de plastoglóbulo del tejido foliar desecado de E. nindensis
- Adquiera una maceta (compuesta por tres plantas individuales por maceta) de E. nindensis completamente desecada, de 8-9 semanas de edad (casi 40 g de tejido).
- Recorte todo el tejido de la hoja de la base de la planta, justo por encima del suelo, con tijeras e inmediatamente sumerja el tejido en un baño de hielo. Transporte el pañuelo a la cámara frigorífica.
- Trabajando bajo una lámpara de seguridad verde, corte la E. Nindensis hojas en trozos más pequeños (alrededor de 5 cm x 5 cm) usando tijeras.
- Moler suavemente pero bien las hojas con 100 ml de tampón de molienda (Tabla 1) en una licuadora comercial. Comience a detener la licuadora varias veces para asegurarse de que se corten todas las hojas. No use más alto que el nivel 7 en la licuadora.
- Filtrar el homogeneizado a través de una capa de tela de nylon de 25 μm en un embudo grande en un matraz cónico de 250 ml. Retirar una alícuota del filtrado foliar y reservarla antes de la centrifugación para almacenarla como muestra representativa de la hoja total.
- Añadir la cantidad adecuada de sacarosa para llegar a una concentración final de 0,5 M y distribuir la solución en tubos de centrífuga de 250 ml.
NOTA: Se utiliza una mayor concentración de sacarosa en comparación con la preparación de Z. mays para asegurar la flotación de las gotas de lípidos citosólicos antes de la posterior sonicación/liberación de los plastoglóbulos unidos al tilacoide. - Centrifugar los tubos a 45.000 x g durante 30 min a 4 °C. Una mezcla de plastoglóbulos y gotitas de lípidos citosólicos se verá fácilmente como una almohadilla amarilla y aceitosa en o cerca de la superficie del cojín de sacarosa (Figura 1B). Recoja el material flotante usando una jeringa con una aguja de 22 G rozando la superficie del cojín con la abertura de la aguja y deposite en un tubo.
- Deseche el sobrenadante restante después de recoger la mezcla de plastoglobulo/gota de lípidos que flota libremente.
- Para aislar los plastoglóbulos conectados al tilacoide residual, resuspender el pellet en 12 mL de medio R 0.2 girando y resuspendiendo con movimientos suaves del cepillo. Agrupe las suspensiones en una botella. Continúe con el paso 1.1.8.
- Extracción cruda de plastoglóbulos de cianobacterias
- Cultivar un cultivo de 50 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 a la fase estacionaria (aproximadamente 7-10 días) y ajustar la densidad celular a un OD750 de 2.0 usando un espectrofotómetro. Para condiciones de cultivo, utilizar medios BG-11 y cultivar en una incubadora a una intensidad de luz de fotones de 150 μmol/m 2/s,2% de CO2,32 °C, y con agitación continua a 150 rpm.
- Para eliminar los polisacáridos, lavar las células centrifugando el cultivo de 50 ml a 6.000 x g durante 45 min a 4 °C y posteriormente retirar el sobrenadante. Continuar lavando las células dos veces en 50 mL de tampón A (Tabla 1). Extraer una alícuota del homogeneizado celular y reservarla antes de la centrifugación para almacenarla como una muestra celular total representativa.
- Resuspenda el pellet lavado en 25 ml de tampón A y rompa las celdas usando una celda de presión francesa a 1,100 psi, repitiendo el proceso 3 veces (poner la muestra en hielo entre cada ciclo para evitar la desnaturalización de proteínas) hasta que el color lisado cambie de verde a rojo-azul-verde bajo luz blanca. Utilice una celda preenfriada y realice este paso en la cámara frigorífica.
- Distribuir el homogeneizado resultante entre ocho tubos de ultracentrífuga de 3 ml llenos hasta un máximo de 2,5 ml en cada tubo y luego superponer cuidadosamente con 400 μL de medio R, produciendo un gradiente escalonado.
NOTA: Consulte Yang, et al. y Kelekar, et al. para descripciones detalladas de la preparación de gradiente de sacarosa25,26. - Equilibrar cuidadosamente los tubos añadiendo medio adicional R, según sea necesario, y centrifugar durante 30 min a 150.000 x g a 4 °C. El tilacoide y otros orgánulos más pesados (incluyendo cualquier cuerpo de polihidroxialcanoato) se granularán, mientras que los plastoglóbulos se verán fácilmente como una almohadilla amarilla y aceitosa en o cerca de la parte superior del gradiente de sacarosa (Figura 1C).
- Recolecte la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos crudos con una jeringa y una aguja 22G y deposite en un tubo de 2 ml. Raspe los plastoglóbulos del lado de la pared del tubo de la ultracentrífuga con la punta de la aguja si es necesario.
- Continúe con el paso 2.2. Alternativamente, almacenar plastoglóbulos crudos a -80 °C y purificar más tarde.
2. Recolección de plastoglóbulos puros
- Procesamiento de tejidos vegetales
- Producir gradientes de sacarosa en tubos de ultracentrífuga de 2,5 ml colocando primero capas con 500 μL de plastoglóbulos crudos del paso 1.1 o del paso 1.2 mezclados con 500 μL de medio R 0,7, para llevar a un volumen total de 1 ml, luego superponer con 400 μL de medio R 0,2, seguido de superposición con 400 μL de medio R.
NOTA: Consulte Yang et al. y Kelekar et al. para descripciones detalladas de la preparación de gradiente de sacarosa25,26. - Equilibre cuidadosamente los tubos agregando un exceso de R medio a la capa superior, según sea necesario. A continuación, centrifugar a 150.000 x g durante 1,5 h a 4 °C.
- Recolectar la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos puros (Figura 1A) con una jeringa y una aguja 22G y depositarla en un tubo de 2 ml. Raspe los plastoglóbulos de la parte superior de la pared del tubo de centrífuga con la punta de la aguja si es necesario.
- Alícuota los plastoglóbulos puros y congelar rápidamente en nitrógeno líquido. Conservar directamente a -80 °C o liofilizar hasta obtener un polvo seco.
- Producir gradientes de sacarosa en tubos de ultracentrífuga de 2,5 ml colocando primero capas con 500 μL de plastoglóbulos crudos del paso 1.1 o del paso 1.2 mezclados con 500 μL de medio R 0,7, para llevar a un volumen total de 1 ml, luego superponer con 400 μL de medio R 0,2, seguido de superposición con 400 μL de medio R.
- Procesamiento de cianobacterias
- Producir un gradiente de sacarosa en cuatro tubos de ultracentrífuga de 2,5 ml superpuestos primero con 500 μL de plastoglóbulos crudos del paso 1.3 mezclados con 750 μL de medio R 0,7, luego superpuestos con 750 μL de medio R 0,2.
NOTA: Consulte Yang et al. y Kelekar et al. para descripciones detalladas de la preparación de gradiente de sacarosa25,26. - Centrifugar el gradiente de sacarosa a 150.000 x g durante 90 min a 4 °C. Recoger los plastoglóbulos puros (Figura 1C) con una jeringa y una aguja de 22 G de la fase superior del gradiente de sacarosa y transferirlos a un tubo de 1,5 ml.
- Alícuota los plastoglóbulos puros y congelar rápidamente en nitrógeno líquido. Conservar directamente a -80 °C o liofilizar hasta obtener un polvo seco.
- Producir un gradiente de sacarosa en cuatro tubos de ultracentrífuga de 2,5 ml superpuestos primero con 500 μL de plastoglóbulos crudos del paso 1.3 mezclados con 750 μL de medio R 0,7, luego superpuestos con 750 μL de medio R 0,2.
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Representative Results
Al finalizar el paso 1 del protocolo, uno debería poder ver fácilmente una cantidad considerable de material de plastoglóbulo/gota de lípidos flotando sobre (o cerca) de la capa superior del cojín de sacarosa (Figura 1B-C). Otras fracciones también podrían ser recogidas en esta etapa. Por ejemplo, los tilacoides se granularán y se pueden volver a suspender con el medio R 0,2 para análisis posteriores. Después de la centrifugación posterior, se obtendrán plastoglóbulos purificados en o cerca de la superficie del gradiente de sacarosa, como se muestra en la Figura 1A, C. Se ha visto en ciertas circunstancias (por ejemplo, líneas genotípicas específicas o condiciones ambientales) que los plastoglóbulos se aislarán como dos subpoblaciones distintas que se separan en diferentes capas en el gradiente: una fracción de baja densidad en la superficie del gradiente y una segunda fracción más densa que se asienta en la interfaz entre las dos capas superiores del gradiente. Si bien no se ha realizado previamente un análisis comparativo cuidadoso de las fracciones de separación, parece probable que estas subpoblaciones representen plastoglóbulos de diferentes tamaños, en los que aquellos con un diámetro más pequeño (y, por lo tanto, una mayor relación área de superficie a volumen y una relación de proteína a lípido) se asentarán más abajo en el gradiente.
En un intento fallido, uno verá poco o ningún plastoglobulo visible en la superficie del cojín de sacarosa después de la primera ronda de centrifugación. El hecho de no aislar con éxito suficientes plastoglóbulos puede depender de varios factores que pueden necesitar ser optimizados. En particular, la técnica de sonicación (cuando se utiliza tejido lájo sano) puede tener un impacto significativo en el éxito. Además, la cantidad necesaria de material vegetal/cianobacteriano dependerá de la especie específica y su condición de estrés.
Después del aislamiento exitoso de plastoglobulos, es posible validar la pureza de los plastoglóbulos aislados utilizando inmunotransferencia de las proteínas marcadoras para plastoglóbulos y tilacoides (el compartimento contaminante primario). En la Figura 1D, se observan inmunoblots representativos utilizando anticuerpos elevados contra A. thaliana FBN1a, como marcador para plastoglóbulos2, y contra A. thaliana fotosistema II subunidad D1, como marcador de tilacoides27. Los homólogos FBN en Synechocystis sp. PCC 6803 se asocian principalmente con tilacoides en lugar de plastoglobulos.
También se debe considerar cuidadosamente la forma de almacenamiento, que puede depender de los estudios posteriores previstos. Especialmente para los análisis posteriores de lípidos pigmentarios prenil-lípidos, es crucial minimizar la exposición de las muestras a la luz directa para evitar daños en los compuestos fotolábiles. Los plastoglóbulos purificados se pueden utilizar para experimentos posteriores, como experimentos basados en lipidómica o proteómica. Los plastoglóbulos se caracterizan por una proporción muy baja de proteínas a lípidos, que se manifiesta en su baja densidad y capacidad para flotar en la sacarosa; Por lo tanto, una baja concentración de proteínas de las muestras de plastoglóbulos es normal. Por esta razón, es aconsejable eliminar los lípidos antes de la separación de proteínas por SDS-PAGE utilizando precipitación de proteína de acetona o extracción de cloroformo / metanol.
Figura 1: Aislamiento e inmunotransferencia de plastoglóbulos y tilacoides . (A) Una muestra representativa de plastoglóbulo purificado de Z. mays antes de la extracción del gradiente de sacarosa. (B) Una muestra representativa de plastoglóbulo crudo de E. nindensis desecado antes de la extracción del cojín de sacarosa. (C) Una muestra representativa de plastoglóbulos crudos (izquierda) y puros (derecha) de Synechocystis sp. PCC 6803, que muestra antes y después de la ultracentrifugación del cojín de sacarosa cargado y el gradiente, respectivamente. (D) Se utilizó el anticuerpo antifibrilina1a (α-FBN1a) para controlar la acumulación de fibrilina, una proteína marcador de plastoglóbulos en plantas superiores. El ortólogo de fibrilina se acumula predominantemente en los tilacoides aislados de cianobacterias (Synecho, Syenchocystis sp. PCC 6803). Se utilizó la subunidad D1 del antifotosistema II (α-PsbA) para validar el agotamiento de los tilacoides de los aislamientos de plastoglobulos. En cada carril se cargaron 5 μg de tilacoides y 10 μg de proteína plastoglobular. Abreviaturas: PG = plastoglobulos; Thy = tilacoides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Composiciones de búfer a | |
| Tampón de molienda | 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 100 mM de sorbitol | |
| 5 mM de ácido ascórbico b | |
| 5 mM de cisteína b reducida | |
| 0,05 % (p/v) BSA b | |
| Medio R | 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| Medio R 0.2 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0,2 M de sacarosa | |
| Medio R 0.7 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0,7 M de sacarosa | |
| Búfer A | 25 mM HEPES-KOH (pH 7.8) |
| 250 mM de sacarosa | |
| a Se proporcionan las concentraciones finales de cada componente tampón. | |
| b Debe agregarse fresco el día del aislamiento. Si bien los tampones se pueden preparar el día antes del aislamiento, estos ciertos ingredientes deben agregarse frescos el día del aislamiento, así como cualquier inhibidor de la fosfatasa y la proteasa. | |
Tabla 1: Recetas tampón para el aislamiento de plastoglóbulos a partir de tejido foliar vegetal o cianobacterias.
| Inhibidor de la fosfatasa Cóctel b | |
| Inhibidor | Conc. Final (mM) |
| Fluoruro de Na. | 50 |
| β-glicerofosfato⋅2Na⋅5H2O | 25 |
| Na-OrtoVanadato | 1 |
| Na-pirofosfato⋅10H2O | 10 |
| b Los inhibidores de la fosfatasa deben añadirse frescos el día del aislamiento. | |
Tabla 2: Cóctel de inhibidores de la fosfatasa.
| Cóctel de inhibidores de la proteasa A | ||||
| Inhibidor | Stock (mg/ml) | Stock medio | Factor de dilución | Conc. final (mg/ml) |
| Antidolor⋅2HCl | 20 | Agua | 400x | 50 |
| Bestatina | 1 | 0,15 millones de NaCl | 25x | 40 |
| Quimostatina | 20 | DMSO | 2000x | 10 |
| E-64 | 20 | Agua | 2000x | 10 |
| Leupeptina (hemisulfato) | 20 | Agua | 4000x | 5 |
| P-ramidón⋅2Na | 20 | Agua | 2000x | 10 |
| AEBSF | 50 | Agua | 1000x | 50 |
| Aprotinina | 10 | Agua | 5000x | 2 |
| a Las soluciones madre de proteasa deberán almacenarse a -20 °C en pequeñas alícuotas para su almacenamiento a largo plazo. Descongele y agregue fresco al tampón apropiado inmediatamente antes del aislamiento. | ||||
Tabla 3: Cóctel de inhibidores de la proteasa.
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Discussion
Para minimizar los cambios fisiológicos/bioquímicos en el material y proteger ciertos pigmentos fotolípidos y termolábiles que son un componente rico en plastoglobulos, es fundamental realizar el aislamiento a 4 °C y protegido de la luz. Como se indicó anteriormente, los pasos iniciales se realizan en la cámara frigorífica bajo una lámpara de seguridad utilizando una bombilla emisora de color verde. Los pasos posteriores realizados en el laboratorio son bajo luces tenues y utilizan hielo o centrifugación refrigerada. Por razones similares, la inclusión de inhibidores frescos de la proteasa (e inhibidores de la fosfatasa si hay interés en estudiar la fosfo-regulación de las proteínas) es crítica (Tabla 2 y Tabla 3).
Mientras que otros métodos (por ejemplo, un homogeneizador de rebote, ciclos de congelación y descongelación) podrían, en principio, emplearse para liberar plastoglóbulos de tilacoides en cloroplastos de plantas superiores, se ha encontrado que la sonicación es muy superior para proporcionar el mejor rendimiento y pureza (resultados no publicados). La sonicación puede crear vesículas artificiales a partir de laminillas tilacoides o retículo endoplásmico; Sin embargo, estas vesículas serían muy ricas en proteínas y, por lo tanto, densas, lo que impediría su flotación en el gradiente de sacarosa.
Al extraer la almohadilla flotante de plastoglóbulos puros del gradiente de sacarosa, es beneficioso extraerlos en la menor cantidad de R medio posible. La adquisición de plastoglóbulos concentrados de esta manera facilita los estudios posteriores al minimizar los volúmenes necesarios de muestra. El uso de una jeringa y aguja de 22 G es la estrategia más eficaz para extraer los plastoglóbulos. Debido a su naturaleza hidrofóbica y rica en lípidos, son extremadamente pegajosos, y se debe evitar a toda costa el uso de puntas de pipeta o una espátula. Se ha encontrado que la pérdida de plastoglóbulos debido a la adherencia se minimiza mejor con una jeringa y una aguja, aunque no parece posible prevenir completamente alguna pérdida durante la extracción.
Si no se ve una capa fácilmente visible de plastoglóbulos de color amarillo cremoso flotando sobre o cerca de la superficie del gradiente de sacarosa, es posible que no se haya utilizado suficiente material vegetal/cianobacteriano para el aislamiento. Se ha encontrado que las monocotiledóneas dan mayores rendimientos de plastoglóbulos que las dicotiledóneas de cantidades comparables de tejido vegetal (resultados no publicados). Si bien se indican cantidades adecuadas de material biológico inicial para los aislamientos específicos ejemplificados en este artículo, las cantidades necesarias de tejido para una extracción eficiente deben determinarse empíricamente en función de la especie, el tejido y las condiciones ambientales del organismo. En general, el tejido foliar estresado (pero no necrótico) o los cultivos de cianobacterias darán mayores rendimientos de plastoglobulos. Cuando se utiliza tejido foliar de A. thaliana, dos plantas planas de A. thaliana (casi 140 plantas individuales) de la etapa vegetativa media son típicamente suficientes para el aislamiento de plastoglóbulos, especialmente cuando el material vegetal está ligeramente estresado, por ejemplo, por un tratamiento de estrés ligero 2,4. Como explicación alternativa para los rendimientos pobres, la homogeneización inicial del tejido foliar con la licuadora puede haber sido demasiado vigorosa y haber separado los plastoglóbulos de los tilacoides prematuramente, o la sonicación del material tilacoide crudo puede haber sido insuficientemente vigorosa para liberar efectivamente los plastoglóbulos antes de la flotación (estos puntos no son un problema cuando se extrae de cianobacterias, que flotan libremente in situ).
Es importante tener en cuenta que el aislamiento de plastoglóbulos representará la población masiva de plastoglóbulos de una muestra de tejido. Por lo tanto, cualquier posible heterogeneidad en lípidos, proteínas o función no sería discernible a partir de estudios posteriores. Debido a esta limitación, no ha sido posible medir cuánta heterogeneidad puede existir entre las gotas lipídicas individuales de plastoglobulos. Sin embargo, las micrografías electrónicas de transmisión del tejido foliar de múltiples organismos revelan patrones de tinción diferenciales entre plastoglobulos, incluso dentro del mismo cloroplasto 28,29,30,31. Esto sugiere fuertemente heterogeneidad en el contenido de lípidos, aunque la naturaleza o el propósito de esto sigue sin estar claro. Significativamente, las micrografías electrónicas de plastoglóbulos aislados de A. thaliana demuestran que este método de aislamiento no está sesgado para el aislamiento de plastoglóbulos más grandes o más pequeños2.
El aislamiento de plastoglóbulos puros representa el paso inicial hacia su caracterización molecular detallada. Posteriormente, se pueden llevar a cabo numerosas solicitudes posteriores en función de los intereses específicos y el propósito del investigador. Por ejemplo, para investigar la composición lipídica o proteica, la muestra aislada es fácilmente susceptible de estudios proteómicos o lipidómicos. El enfoque de digestión en gel se ve favorecido para estudios proteómicos ascendentes de muestras de plastoglobulos. Sin embargo, debido a que los lípidos son en gran exceso en relación con la proteína, el lípido puede interferir con la separación SDS-PAGE. La precipitación inicial de proteínas utilizando acetona, con posterior resuspensión en tampón de solubilización de Laemmli, elimina la mayoría de los lípidos, permitiendo así una separación eficiente de la proteína en el gel separador SDS-PAGE. La resuspensión inicial del pellet de proteína en tampón tris-HCl de 100 mM y SDS al 2% permite una determinación precisa del contenido de proteína por el método de ácido bicinchonínico antes de la adición de reductor, colorante y glicerol. Del mismo modo, la purificación de lípidos utilizando métodos de separación de fase líquido-líquido, como el método de Bligh y Dyer, es adecuada para análisis lipidómicos aguas abajo32.
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Disclosures
No hay conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
La investigación en el grupo de laboratorio de Lundquist está respaldada por subvenciones de la NSF (MCB-2034631) y USDA (MICL08607) a P.K.L. Los autores agradecen a la Dra. Carrie Hiser (MSU) por su apoyo en el desarrollo del método de aislamiento de plastoglóbulos cianobacterianos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
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