Summary
Een snel en efficiënt protocol wordt gepresenteerd voor de isolatie van plastoglobule lipidedruppels geassocieerd met verschillende fotosynthetische organismen. De succesvolle bereiding van geïsoleerde plastoglobulen is een cruciale eerste stap die voorafgaat aan gedetailleerde moleculaire onderzoeken zoals proteomische en lipidomische analyses.
Abstract
Plastoglobule lipidedruppels zijn een dynamisch subcompartiment van plantaardige chloroplasten en cyanobacteriën. Alomtegenwoordig gevonden onder fotosynthetische soorten, wordt aangenomen dat ze een centrale rol spelen bij de aanpassing en remodellering van het thylakoïde membraan onder snel veranderende omgevingsomstandigheden. Het vermogen om plastoglobulen van hoge zuiverheid te isoleren heeft hun studie aanzienlijk vergemakkelijkt door middel van proteomische, lipidomische en andere methodologieën. Met plastoglobulen van hoge zuiverheid en opbrengst is het mogelijk om hun lipide- en eiwitsamenstelling, enzymatische activiteit en eiwittopologie te onderzoeken, naast andere mogelijke moleculaire kenmerken. Dit artikel presenteert een snel en effectief protocol voor de isolatie van plastoglobulen uit chloroplasten van plantenbladweefsel en presenteert methodologische variaties voor de isolatie van plastoglobulen en gerelateerde lipidedruppelstructuren uit maïsbladeren, het uitgedroogde bladweefsel van de opstandingsplant, Eragrostis nindensis, en de cyanobacterium, Synechocystis SP. PCC 6803. Isolatie is afhankelijk van de lage dichtheid van deze lipiderijke deeltjes, wat hun zuivering door sucrosedichtheidsflotatie vergemakkelijkt. Deze methodologie zal waardevol blijken bij de studie van plastoglobulen van diverse soorten.
Introduction
Het huidige begrip van de samenstelling en functie van plastoglobule is naar voren gekomen door middel van gedetailleerde proteomische en lipidomische studies 1,2,3,4,5. Dergelijke studies zijn enorm geholpen door een snelle en effectieve isolatiemethode die afhankelijk is van hun zeer lage dichtheid voor efficiënte scheiding met behulp van sucrosegradiënten. De eerste methoden voor plastoglobule-isolatie werden bereikt van soorten zoals de beukenboom (Fagus sylvatica), schotse bezem (Sarothamnus scoparius), ui (Allium cepa), spinazie (Spinacia oleracea), viooltje (Viola tricolor), peper (Capsicum annuum) en erwt (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Een bijgewerkte methode om chloroplast plastoglobules op een efficiëntere en beter renderende manier te isoleren werd later gepresenteerd door Ytterberg et al.3,14. Hoewel we aanvankelijk werden gebruikt voor de studie van de plastoglobulen van Arabidopsis thaliana bladchloroplasten, hebben we deze bijgewerkte methode met succes gebruikt voor het gezonde bladweefsel van andere plantensoorten, zowel eenzaadlobbige als tweezaadlobbige, waaronder maïs (Zea mays), tomaat (Solanum lycopersicum), liefdesgras (Eragrostis nindensis), paars vals brome (Brachypodium distachyon) en wilde tabak (Nicotiana benthamiana ; niet-gepubliceerde resultaten). Bovendien is de isolatiemethode met succes aangepast aan de plastoglobulen van cyanobacteriën, waaronder Synechocystis sp. PCC 6803 en Anabaena sp. PCC 712015, en het uitgedroogde bladweefsel van de opstandingsplant, E. nindensis.
Chloroplast plastoglobulen van gezond bladweefsel zijn fysiek verbonden met de thylakoïde membranen16. Ondanks deze fysieke continuïteit behouden de twee chloroplast-subcompartimenten verschillende lipide- en eiwitsamenstellingen, hoewel de gereguleerde uitwisseling van lipide en eiwit tussen de twee compartimenten is voorgesteld 2,4,17,18,19. In feite is onlangs een interessant hemifusiemodel voorgesteld voor de handel in neutrale lipiden tussen chloroplasten en cytosol19. Vanwege de fysieke continuïteit van plastoglobulen en thylakoïden begint de isolatiemethode met gezond bladweefsel met het verzamelen van een gepelletiseerd ruw thylakoïdepreparaat, dat vervolgens wordt gesoniseerd om de plastoglobulen van de thylakoïden te scheiden, wat in tegenstelling is tot methoden die worden gebruikt voor het isoleren van cytosolische lipidedruppels20 . Ultracentrifugatie op een sucrosekussen drijft vervolgens de plastoglobulen met lage dichtheid omhoog door de sucrose, waardoor ze effectief worden gescheiden van de thylakoïden, kernen en ander materiaal met hoge dichtheid. Plastoglobulen in cyanobacteriën, evenals die van uitgedroogd bladweefsel, bestaan daarentegen blijkbaar in vivo in een vrij zwevende vorm. Vandaar dat hun isolatie direct op een sucrosegradiënt drijft. Dit artikel demonstreert de isolatiemethode van gezond bladweefsel en demonstreert verder twee variaties die kunnen worden gebruikt om plastoglobulen te isoleren uit uitgedroogd bladweefsel of cyanobacteriële culturen, waardoor de fysiologische breedte en evolutionaire context waarin plastoglobules kunnen worden bestudeerd, aanzienlijk wordt uitgebreid.
Geïsoleerde plastoglobulen kunnen vervolgens worden gebruikt voor een willekeurig aantal downstream-analyses om moleculaire kenmerken te onderzoeken. We hebben de geïsoleerde plastoglobulen uit A. thaliana bladweefsel gebruikt voor uitgebreide proteomische en lipidomische analyse onder verschillende omgevingsomstandigheden of genotypen, wat de selectieve modificatie van eiwit- en lipidesamenstelling in aanpassing aan stress 2,4,21,22 aantoont. Daarnaast zijn in vitro kinase-assays uitgevoerd die transfosforyleringsactiviteit geassocieerd met geïsoleerde plastoglobules aantonen22, zijn de oligomere toestanden van eiwitcomponenten onderzocht met behulp van native gel-elektroforese 21 en zijn protease-scheertests uitgevoerd23.
Het belangrijkste voordeel van deze methode is de relatieve snelheid van de procedure. Onze ervaring is dat de onderstaande protocollen binnen ongeveer 4 uur volledig kunnen worden voltooid. Er is een alternatieve methode beschreven om plastoglobulen uit bladweefsel te isoleren, waardoor de gelijktijdige isolatie van andere chloroplast-subcompartimentenmogelijk is 24. Deze alternatieve methode biedt een aantal duidelijke voordelen wanneer kwantitatieve vergelijking met de andere chloroplast subcompartimenten noodzakelijk of gewenst is. Deze alternatieve methode is echter ook vervelender en zal een aanzienlijk lagere opbrengst van geïsoleerde plastoglobulen uit vergelijkbare hoeveelheden bladweefsel opleveren. Wanneer een gerichte studie van plastoglobules het doel is, is de hier geschetste methodologie de optimale keuze. Niettemin kunnen tijdens de monstervoorbereiding totaal blad- en ruwe thylakoïde-aliquots worden verzameld, en het wordt ten zeerste aanbevolen om referentiemonsters te hebben voor latere vergelijking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ruwe plastoglobule isolatie
- Ruwe plastoglobule extractie uit niet-gestrest maïsbladweefsel
- Verkrijg zes gezonde maïszaailingen van ongeveer 3 weken oud en bijna in het V5-groeistadium, met een gewicht van ongeveer 120 g.
- Knip alle bladeren aan de basis van de stengel af, dompel ze snel in een ijsbad en transporteer ze naar de koelcel.
- Werk onder een groene veiligheidslamp, verwijder de maïsbladeren uit het ijsbad en knip ze in kleinere stukjes (ongeveer 5 cm x 5 cm) met een schaar.
- Maal voorzichtig maar grondig de helft van het geknipte bladweefsel in een commerciële blender in 350 ml maalbuffer (tabel 1). Start-stop de blender 5x-6x om ervoor te zorgen dat alle bladeren worden gesneden. Gebruik niet hoger dan niveau 7 op de blender.
- Filtreer het homogenaat door een laag nylondoek van 25 μm op een grote trechter in vier centrifugeflessen van 250 ml. Herhaal vervolgens stap 1.1.4 met de tweede helft van het geknipte bladweefsel.
- Verdeel het filtraat gelijkmatig over de vier flessen en centrifugeer gedurende 6 minuten bij 1.840 x g bij 4 °C. Verwijder een aliquot van het bladfiltraat en leg het vóór de centrifugatie apart om te worden bewaard als een representatief totaal bladmonster.
- Giet het resulterende supernatant af en resuspendeer de pellet voorzichtig in 12 ml medium R 0,2 met 0,2 M sucrose (tabel 1) door te draaien en te resuspenderen met zachte bewegingen van de borstel. Nadat u elke pellet hebt geresuspendeerd, draagt u de suspensie naar de volgende fles en herhaalt u de resuspensie. Voeg de suspensies samen in één fles.
- Verdeel de gepoolde suspensie over zes ultracentrifugebuizen van 3 ml, waarbij een maximaal volume van 2,5 ml in elke buis wordt bereikt.
- Soniceer elke buis 4x, gedurende 10 s elke keer, met behulp van een tip sonicator met een amplitude van 100%. Zorg ervoor dat u de sonicatorhoorn ondergedompeld houdt en uit de buurt van het vloeibare oppervlak om schuimvorming te voorkomen.
- Beweeg de sonicatorhoorn langzaam op en neer in de ophanging tijdens elke ronde. Wissel af tussen de vier buizen en breng elke buis na elke ultrasoonapparaat terug naar een ijsemmer om het monster te laten afkoelen.
- Centrifugeer de gesonificeerde ruwe thylakoïdensuspensie bij 150.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Oogst de resulterende drijvende pad van ruwe plastoglobules van het oppervlak van het sucrosekussen (gemakkelijk gezien als een gele, olieachtige pad) met behulp van een spuit en een naald van 22 G door het oppervlak van het kussen af te schuimen met de opening van de naald, waarbij ongeveer 500 μL uit elke buis wordt teruggewonnen. Doe in een buis van 2,0 ml.
- Verzamel aliquots van de ruwe thylakoïde voor en na de ultrasoonapparaat en afgifte van plastoglobulen. Ga verder met stap 2.1. U kunt de ruwe plastoglobulen ook bewaren bij −80 °C en op een later tijdstip zuiveren.
- Ruwe plastoglobule extractie uit uitgedroogd E. nindensis bladweefsel
- Koop een pot (bestaande uit drie individuele planten per pot) van volledig uitgedroogde, 8-9 weken oude E. nindensis (bijna 40 g weefsel).
- Knip al het bladweefsel van de basis van de plant, net boven de grond, met een schaar af en dompel het weefsel onmiddellijk in een ijsbad. Transporteer het weefsel naar de koelcel.
- Werkend onder een groene veiligheidslamp, knip de E. nindensis bladeren in kleinere stukjes (ongeveer 5 cm x 5 cm) met een schaar.
- Maal de bladeren voorzichtig maar grondig met 100 ml maalbuffer (tabel 1) in een commerciële blender. Start-stop de blender meerdere keren om ervoor te zorgen dat alle bladeren worden gesneden. Gebruik niet hoger dan niveau 7 op de blender.
- Filtreer het homogenaat door een laag nylondoek van 25 μm op een grote trechter in een erlenmeyer van 250 ml. Verwijder een aliquot van het bladfiltraat en leg het vóór de centrifugatie apart om te worden bewaard als een representatief totaal bladmonster.
- Voeg de juiste hoeveelheid sucrose toe om tot een eindconcentratie van 0,5 M te brengen en verdeel de oplossing in centrifugebuizen van 250 ml.
OPMERKING: Een hogere concentratie sucrose in vergelijking met het Z. mays-preparaat wordt gebruikt om flotatie van de cytosolische lipidedruppels te garanderen voorafgaand aan de daaropvolgende ultrasoonapparaat / afgifte van de thylakoïde-gebonden plastoglobulen. - Centrifugeer de buizen bij 45.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Een mengsel van plastoglobulen en cytosolische lipidedruppels zal gemakkelijk worden gezien als een geel, olieachtig kussen op of nabij het oppervlak van het sucrosekussen (figuur 1B). Verzamel het zwevende materiaal met behulp van een spuit met een naald van 22 G door het oppervlak van het kussen af te schuimen met de opening van de naald en deponeer het in een buis.
- Gooi het resterende supernatant weg na het verzamelen van het vrij zwevende plastoglobule / lipidedruppelmengsel.
- Om de plastoglobulen verbonden met resterende thylakoïde te isoleren, resuspendeert u de pellet in 12 ml medium R 0,2 door te draaien en te resuspenderen met zachte bewegingen van de borstel. Voeg de suspensies samen in één fles. Ga verder met stap 1.1.8.
- Ruwe plastoglobule extractie uit cyanobacteriën
- Kweek een 50 ml cultuur van Synechocystis sp. PCC 6803 naar de stationaire fase (ongeveer 7-10 dagen) en pas de celdichtheid aan op een OD750 van 2,0 met behulp van een spectrofotometer. Gebruik voor kweekomstandigheden BG-11-media en kweek in een incubator met een lichtintensiteit van 150 μmol fotonen / m2 / s, 2% CO2, 32 ° C en met continu schudden bij 150 tpm.
- Om de polysacchariden te verwijderen, wast u de cellen door de 50 ml cultuur te centrifugeren bij 6.000 x g gedurende 45 minuten bij 4 °C en vervolgens het supernatant te verwijderen. Ga verder met het tweemaal wassen van de cellen in 50 ml buffer A (tabel 1). Verwijder een aliquot van het celhomogenaat en zet het vóór de centrifugatie opzij om te worden bewaard als een representatief totaal celmonster
- Resuspendeer de gewassen pellet in 25 ml buffer A en breek de cellen met behulp van een Franse drukcel op 1.100 psi, waarbij het proces 3x wordt herhaald (zet het monster tussen elke cyclus in de ijskast om eiwitdenaturatie te voorkomen) totdat de gelyseerde kleur verandert van groen naar rood-blauw-groen onder wit licht. Gebruik een voorgekoelde cel en voer deze stap uit in de koelcel.
- Verdeel het resulterende homogenaat over acht ultracentrifugebuizen van 3 ml gevuld tot maximaal 2,5 ml in elke buis en leg vervolgens voorzichtig met 400 μL medium R, waardoor een stapgradiënt ontstaat.
OPMERKING: Refereer naar Yang, et al. en Kelekar, et al. voor gedetailleerde beschrijvingen van sucrose gradiënt bereiding25,26. - Balanceer de buizen zorgvuldig door indien nodig extra medium R toe te voegen en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 150.000 x g bij 4 °C. De thylakoïde en andere zwaardere organellen (inclusief polyhydroxyalkanoaatlichamen) zullen pelleteren, terwijl plastoglobulen gemakkelijk worden gezien als een gele, olieachtige pad op of nabij de bovenkant van de sucrosegradiënt (figuur 1C).
- Oogst de resulterende drijvende pad van ruwe plastoglobules met een spuit en 22G naald en deponeer in een buis van 2 ml. Schraap indien nodig plastoglobules van de zijkant van de ultracentrifugebuiswand met de naaldpunt.
- Ga verder met stap 2.2. U kunt ook ruwe plastoglobulen bewaren bij -80 °C en later zuiveren.
2. Pure plastoglobulen oogsten
- Verwerking van plantenweefsel
- Produceer sucrosegradiënten in ultracentrifugebuizen van 2,5 ml door eerst te gelaagd met 500 μL ruwe plastoglobulen uit stap 1.1 of stap 1.2 gemengd met 500 μL medium R 0,7, om een totaal volume van 1 ml te bereiken, vervolgens te bedekken met 400 μL medium R 0,2, gevolgd door overlay met 400 μL medium R.
OPMERKING: Zie Yang et al. en Kelekar et al. voor gedetailleerde beschrijvingen van sucrose gradiënt bereiding25,26. - Breng de buizen zorgvuldig in balans door indien nodig overtollig medium R aan de bovenste laag toe te voegen. Centrifugeer vervolgens bij 150.000 x g gedurende 1,5 uur bij 4 °C.
- Oogst het resulterende drijvende pad van pure plastoglobules (figuur 1A) met een spuit en een naald van 22 G en deponeer in een buis van 2 ml. Schraap indien nodig plastoglobulen van de bovenkant van de centrifugebuiswand met de naaldpunt.
- Aliquot de zuivere plastoglobules en flash freeze in vloeibare stikstof. Direct bewaren bij -80 °C of lyofiliseren tot een droog poeder.
- Produceer sucrosegradiënten in ultracentrifugebuizen van 2,5 ml door eerst te gelaagd met 500 μL ruwe plastoglobulen uit stap 1.1 of stap 1.2 gemengd met 500 μL medium R 0,7, om een totaal volume van 1 ml te bereiken, vervolgens te bedekken met 400 μL medium R 0,2, gevolgd door overlay met 400 μL medium R.
- Verwerking van cyanobacteriën
- Produceer een sucrosegradiënt in vier ultracentrifugebuizen van 2,5 ml, eerst gelaagd met 500 μL van de ruwe plastoglobulen uit stap 1.3 gemengd met 750 μL medium R 0,7, en vervolgens bedekt met 750 μL medium R 0,2.
OPMERKING: Zie Yang et al. en Kelekar et al. voor gedetailleerde beschrijvingen van sucrose gradiënt bereiding25,26. - Centrifugeer de sucrosegradiënt bij 150.000 x g gedurende 90 min bij 4 °C. Verzamel de zuivere plastoglobulen (figuur 1C) met een spuit en een naald van 22 G uit de bovenste fase van de sucrosegradiënt en breng over in een buis van 1,5 ml.
- Aliquot de zuivere plastoglobules en flash-freeze in vloeibare stikstof. Direct bewaren bij −80 °C of lyofiliseren tot een droog poeder.
- Produceer een sucrosegradiënt in vier ultracentrifugebuizen van 2,5 ml, eerst gelaagd met 500 μL van de ruwe plastoglobulen uit stap 1.3 gemengd met 750 μL medium R 0,7, en vervolgens bedekt met 750 μL medium R 0,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na voltooiing van stap 1 van het protocol moet men gemakkelijk een aanzienlijke hoeveelheid plastoglobule / lipidedruppelmateriaal kunnen zien drijven op (of in de buurt van) de bovenste laag van het sucrosekussen (figuur 1B-C). In dit stadium kunnen ook andere fracties worden verzameld. De thylakoïden worden bijvoorbeeld gepelletiseerd en kunnen opnieuw worden gesuspendeerd met medium R 0,2 voor latere analyses. Na daaropvolgende centrifugatie worden gezuiverde plastoglobulen verkregen op of nabij het oppervlak van de sucrosegradiënt, zoals weergegeven in figuur 1A,C. In bepaalde omstandigheden (bijvoorbeeld specifieke genotypische lijnen of omgevingsomstandigheden) is waargenomen dat de plastoglobulen zich zullen isoleren als twee verschillende subpopulaties die zich op verschillende lagen in de gradiënt scheiden: een fractie met lage dichtheid op het gradiëntoppervlak en een tweede, dichtere fractie die zich nestelt op het grensvlak tussen de bovenste twee gradiëntlagen. Hoewel een zorgvuldige vergelijkende analyse van de scheidende fracties niet eerder is uitgevoerd, lijkt het waarschijnlijk dat deze subpopulaties plastoglobulen van verschillende grootte vertegenwoordigen, waarbij die met een kleinere diameter (en dus een grotere oppervlakte-volumeverhouding en eiwit-lipideverhouding) lager in de gradiënt zullen bezinken.
In een mislukte poging zal men weinig of geen zichtbare plastoglobulen op het oppervlak van het sucrosekussen zien na de eerste ronde van centrifugatie. Het niet succesvol isoleren van voldoende plastoglobules kan afhankelijk zijn van verschillende factoren die mogelijk moeten worden geoptimaliseerd. Met name de ultrasoonapparaattechniek (bij gebruik van gezond bladweefsel) kan een aanzienlijke invloed hebben op het succes. Bovendien zal de benodigde hoeveelheid plantaardig/cyanobacterisch materiaal afhankelijk zijn van de specifieke soort en de stressconditie.
Na de succesvolle isolatie van plastoglobulen is het mogelijk om de zuiverheid van de geïsoleerde plastoglobulen te valideren met behulp van immunoblotting van de markereiwitten voor plastoglobulen en thylakoïden (het primaire verontreinigende compartiment). In figuur 1D worden representatieve immunoblots gezien met antilichamen tegen A. thaliana FBN1a, als marker voor plastoglobules2, en tegen A. thaliana fotosysteem II subeenheid D1, als marker van thylakoïden27. De FBN-homologen in Synechocystis sp. PCC 6803 associëren voornamelijk met thylakoïden in plaats van plastoglobulen.
Men moet ook zorgvuldig nadenken over de manier van opslag, die kan afhangen van de beoogde downstream-studies. Vooral voor downstream-analyses van prenyl-lipide pigmentlipiden is het cruciaal om de blootstelling van de monsters te minimaliseren om licht te richten om schade aan de fotolabiele verbindingen te voorkomen. Gezuiverde plastoglobulen kunnen worden gebruikt voor downstream-experimenten zoals lipidomische of proteomische experimenten. Plastoglobulen worden gekenmerkt door een zeer lage eiwit-lipideverhouding, die zich manifesteert in hun lage dichtheid en vermogen om op de sucrose te drijven; daarom is een lage eiwitconcentratie van de plastoglobulemonsters normaal. Om deze reden is het raadzaam om lipiden te verwijderen voorafgaand aan eiwitscheiding door SDS-PAGE met behulp van acetoneiwitprecipitatie of chloroform / methanolextractie.
Figuur 1: Isolatie en immunoblotting van plastoglobulen en thylakoïden. (A) Een representatief gezuiverd plastoglobulemonster uit Z. mays voorafgaand aan extractie uit de sucrosegradiënt. B) Een representatief ruw plastoglobubulemonster van uitgedroogde E. nindensis voorafgaand aan extractie uit het sacharosekussen. (C) Een representatief ruw (links) en zuiver (rechts) plastoglobulemonster van Synechocystis sp. PCC 6803, dat zowel voor als na ultracentrifugatie van respectievelijk het geladen sacharosekussen en de gradiënt laat zien. (D) Anti-fibrillin1a-antilichaam (α-FBN1a) werd gebruikt om de accumulatie van fibrilline, een markereiwit van plastoglobulen in hogere planten, te controleren. De fibrillin ortholoog hoopt zich voornamelijk op in de geïsoleerde thylakoïden van cyanobacteriën (Synecho, Syenchocystis sp. PCC 6803). Anti-fotosysteem II subeenheid D1 (α-PsbA) werd gebruikt om de uitputting van thylakoïden uit plastoglobule isolaties te valideren. In elke baan werd 5 μg thylakoïden en 10 μg plastoglobule-eiwit geladen. Afkortingen: PG = plastoglobules; Thy = thylakoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Buffersamenstellingen a | |
| Slijpbuffer | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 100 mM sorbitol | |
| 5 mM ascorbinezuur b | |
| 5 mM gereduceerde cysteïne b | |
| 0,05 % (m/v) BSA b | |
| Gemiddeld R | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| Gemiddeld R 0,2 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0.2 M sucrose | |
| Gemiddeld R 0,7 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0.7 M sucrose | |
| Buffer A | 25 mM HEPES-KOH (pH 7,8) |
| 250m sucrose | |
| een eindconcentratie van elke buffercomponent wordt verstrekt. | |
| b Moet vers worden toegevoegd op de dag van de isolatie. Hoewel buffers de dag voor de isolatie kunnen worden bereid, moeten deze bepaalde ingrediënten op de dag van de isolatie vers worden toegevoegd, evenals eventuele fosfatase- en proteaseremmers. | |
Tabel 1: Bufferrecepten voor plastoglobule-isolatie van plantenbladweefsel of cyanobacteriën.
| Fosfataseremmer Cocktail b | |
| Inhibitor | Finale Conc. (mM) |
| Na-fluoride | 50 |
| β-Glycerofosfaat⋅2Na⋅5H2O | 25 |
| Na-OrthoVanadate | 1 |
| Na-pyrofosfaat⋅10H2O | 10 |
| b Fosfataseremmers moeten op de dag van de isolatie vers worden toegevoegd. | |
Tabel 2: Fosfataseremmer cocktail.
| Proteaseremmer Cocktail a | ||||
| Inhibitor | Voorraad (mg/ml) | Voorraadmedium | Verdunningsfactor | Eindconc. (mg/ml) |
| Antipaïne⋅2HCl | 20 | Water | 400x | 50 |
| Bestatin | 1 | 0,15 m NaCl | 25x | 40 |
| Chymostatine | 20 | DMSO | 2000x | 10 |
| E-64 | 20 | Water | 2000x | 10 |
| Leupeptine (hemisulfaat) | 20 | Water | 4000x | 5 |
| P-Ramidon⋅2Na | 20 | Water | 2000x | 10 |
| AEBSF | 50 | Water | 1000x | 50 |
| Aprotinine | 10 | Water | 5000x | 2 |
| a De oplossingen voor proteasevoorraden moeten bij -20 °C in kleine aliquots worden bewaard voor langdurige opslag. Ontdooi en voeg onmiddellijk voorafgaand aan de isolatie vers toe aan de juiste buffer. | ||||
Tabel 3: Proteaseremmer cocktail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om fysiologische /biochemische veranderingen in het materiaal te minimaliseren en bepaalde foto- en thermolabiele prenyllipidepigmenten te beschermen die een rijk bestanddeel van plastoglobulen vormen, is het van cruciaal belang om de isolatie uit te voeren bij 4 °C en beschermd tegen licht. Zoals hierboven aangegeven, worden de eerste stappen uitgevoerd in de koelcel onder een veiligheidslamp met behulp van een groenuitstralende gloeilamp. De volgende stappen die in het laboratorium worden uitgevoerd, zijn onder gedimd licht en maken gebruik van ijs of gekoelde centrifugatie. Om vergelijkbare redenen is de opname van verse proteaseremmers (en fosfataseremmers als er interesse is in het bestuderen van de fosfo-regulatie van eiwitten) van cruciaal belang (tabel 2 en tabel 3).
Terwijl andere methoden (bijvoorbeeld een Dounce-homogenisator, vries-dooicycli) in principe kunnen worden gebruikt om plastoglobulen uit thylakoïden vrij te maken in chloroplasten van hogere planten, is gebleken dat ultrasoonapparaat veel beter is in het leveren van de beste opbrengst en zuiverheid (ongepubliceerde resultaten). Sonicatie kan kunstmatige blaasjes maken van thylakoïde lamellen of endoplasmatisch reticulum; deze blaasjes zouden echter zeer eiwitrijk en dus dicht zijn, waardoor hun flotatie op de sucrosegradiënt wordt uitgesloten.
Bij het extraheren van de drijvende pad van pure plastoglobules uit de sucrosegradiënt, is het gunstig om ze in de kleinst mogelijke hoeveelheid medium R te extraheren. Het verkrijgen van geconcentreerde plastoglobulen op deze manier vergemakkelijkt downstream studies door het minimaliseren van de benodigde volumes van het monster. Het gebruik van een spuit en een naald van 22 G is de meest effectieve strategie om de plastoglobules te extraheren. Vanwege hun hydrofobe, lipiderijke aard zijn ze extreem plakkerig en het gebruik van pipetpunten of een spatel moet ten koste van alles worden vermeden. Het is gebleken dat het verlies van plastoglobulen als gevolg van plakken het beste kan worden geminimaliseerd met een spuit en naald, hoewel het niet mogelijk lijkt om enig verlies tijdens de extractie volledig te voorkomen.
Als een gemakkelijk zichtbare, geel-romige laag plastoglobulen niet op of nabij het oppervlak van de sucrosegradiënt wordt gezien, kan onvoldoende plantaardig/cyanobacterisch materiaal zijn gebruikt voor de isolatie. Het is gebleken dat monocots hogere plastoglobule-opbrengsten geven dan tweezaadlobbigen uit vergelijkbare hoeveelheden plantenweefsel (ongepubliceerde resultaten). Hoewel de juiste hoeveelheden biologisch uitgangsmateriaal zijn aangegeven voor de specifieke isolaties die in dit artikel worden geïllustreerd, moeten de benodigde hoeveelheden weefsel voor efficiënte extractie empirisch worden bepaald op basis van de soort, het weefsel en de omgevingsomstandigheden van het organisme. Over het algemeen zullen gestreste (maar niet necrotische) bladweefsel- of cyanobacteriële culturen hogere opbrengsten van plastoglobulen geven. Bij gebruik van A. thaliana-bladweefsel zijn twee platte A. thaliana-planten (bijna 140 individuele planten) uit het midden van de vegetatieve groeifase doorgaans voldoende voor de isolatie van plastoglobulen, vooral wanneer het plantmateriaal licht wordt belast, bijvoorbeeld door een lichte stressbehandeling 2,4. Als een alternatieve verklaring voor slechte opbrengsten, kan de initiële homogenisatie van het bladweefsel met de blender te krachtig zijn geweest en de plastoglobulen voortijdig van de thylakoïden hebben gescheiden, of de sonicatie van het ruwe thylakoïde materiaal kan onvoldoende krachtig zijn geweest om de plastoglobules effectief vrij te geven vóór flotatie (deze punten zijn geen probleem bij het extraheren uit cyanobacteriën, die vrij zwevend zijn in situ).
Het is belangrijk om in gedachten te houden dat plastoglobule-isolatie de bulkpopulatie van plastoglobulen uit een weefselmonster vertegenwoordigt. Vandaar dat eventuele heterogeniteit in lipide, eiwit of functie niet waarneembaar zou zijn uit latere studies. Vanwege deze beperking was het niet mogelijk om te meten hoeveel heterogeniteit er kan bestaan tussen individuele plastoglobule lipidedruppels. Transmissie-elektronenmicrografieën van plantenbladweefsel van meerdere organismen onthullen echter differentiële kleuringspatronen tussen plastoglobulen, zelfs binnen dezelfde chloroplast 28,29,30,31. Dit suggereert sterk heterogeniteit in het lipidengehalte, hoewel de aard of het doel hiervan onduidelijk blijft. Het is veelzeggend dat elektronenmicrografieën van geïsoleerde A. thaliana plastoglobules aantonen dat deze isolatiemethode niet bevooroordeeld is voor de isolatie van grotere of kleinere plastoglobulen2.
De isolatie van zuivere plastoglobulen vertegenwoordigt de eerste stap naar hun gedetailleerde moleculaire karakterisering. Tal van downstream-toepassingen kunnen vervolgens worden uitgevoerd, afhankelijk van de specifieke interesses en het doel van de onderzoeker. Om bijvoorbeeld de lipide- of eiwitsamenstelling te onderzoeken, is het geïsoleerde monster gemakkelijk vatbaar voor proteomische of lipidomische studies. De in-gel verteringsbenadering heeft de voorkeur voor bottom-up proteomics-studies van plastoglobules-monsters. Omdat lipiden echter een enorme overmaat hebben ten opzichte van eiwitten, kan het lipide interfereren met de SDS-PAGE-scheiding. De initiële precipitatie van eiwit met behulp van aceton, met daaropvolgende resuspensie in Laemmli-oplosbuffer, elimineert de meeste lipiden, waardoor een efficiënte scheiding van eiwit in de SDS-PAGE-scheidingsgel mogelijk is. Initiële resuspensie van de eiwitpellet in 100 mM tris-HCl-buffer en 2% SDS maakt nauwkeurige bepaling van het eiwitgehalte mogelijk door de bicinchonininezuurmethode vóór de toevoeging van reductiemiddel, kleurstof en glycerol. Evenzo is lipidenzuivering met behulp van vloeistof-vloeistoffasescheidingsmethoden, zoals de Bligh and Dyer-methode, geschikt voor downstream lipidomische analyses32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten aan te geven.
Acknowledgments
Onderzoek in de Lundquist labgroep wordt ondersteund door subsidies van de NSF (MCB-2034631) en USDA (MICL08607) aan P.K.L. De auteurs bedanken Dr. Carrie Hiser (MSU) voor de steun bij de ontwikkeling van de cyanobacteriële plastoglobule isolatiemethode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K.
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
