Essai de pulldown couplé à une co-expression dans les cellules bactériennes en tant qu’outil rapide pour tester des interactions protéine-protéine difficiles

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode de co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement à l’aide d’un ensemble de vecteurs compatibles, suivie des techniques conventionnelles de pulldown pour étudier les complexes protéiques qui ne peuvent pas s’assembler in vitro.

Résumé

Pulldown est un test d’interaction protéine-protéine facile et largement utilisé. Cependant, il a des limites dans l’étude des complexes protéiques qui ne s’assemblent pas efficacement in vitro. De tels complexes peuvent nécessiter un assemblage co-translationnel et la présence de chaperons moléculaires; Soit ils forment des oligomères stables qui ne peuvent pas se dissocier et se réassocier in vitro , soit ils sont instables sans partenaire liant. Pour surmonter ces problèmes, il est possible d’utiliser une méthode basée sur la co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement en utilisant un ensemble de vecteurs compatibles suivi des techniques conventionnelles de pulldown. Le flux de travail est plus rapide que le pulldown traditionnel, car il manque les étapes fastidieuses de purification séparée des protéines en interaction et de leur incubation ultérieure. Un autre avantage est une reproductibilité plus élevée en raison d’un nombre significativement plus petit d’étapes et d’une période de temps plus courte pendant laquelle les protéines qui existent dans l’environnement in vitro sont exposées à la protéolyse et à l’oxydation. La méthode a été appliquée avec succès pour étudier un certain nombre d’interactions protéine-protéine lorsque d’autres techniques in vitro se sont révélées inappropriées. La méthode peut être utilisée pour tester par lots les interactions protéine-protéine. Des résultats représentatifs sont présentés pour les études des interactions entre le domaine BTB et les protéines intrinsèquement désordonnées, et des hétérodimères des domaines associés aux doigts de zinc.

Introduction

Le pulldown conventionnel est largement utilisé pour étudier les interactions protéine-protéine¹. Cependant, les protéines purifiées n’interagissent souvent pas efficacement in vitro^2,3, et certaines d’entre elles sont insolubles sans leur partenaire de liaison ^4,5. De telles protéines peuvent nécessiter un assemblage co-translationnel ou la présence de chaperons moléculaires 5,6,7,8,9.

Protocole

La représentation schématique du flux de travail de la méthode est illustrée à la figure 1.

1. Co-transformation d’E. coli

1. Préparer des vecteurs d’expression pour les protéines cibles à l’aide de méthodes de clonage standard.
   REMARQUE: En règle générale, un bon point de départ consiste à utiliser des vecteurs pGEX/pMAL conventionnels portant un gène de résistance à l’ampicilline et une origine ColE1 pour l’expression de protéines marquées GST/MBP et un vecteur compatible d’origine p15A ou RSF et de résistance à la kanamycine pour exprimer des protéines marquées 6xHis, dans....

Résultats

La méthode décrite a été utilisée couramment avec de nombreuses cibles différentes. Voici quelques résultats représentatifs qui ne peuvent probablement pas être obtenus en utilisant des techniques conventionnelles de pulldown. La première est l’étude de la dimérisation spécifique ZAD (Zinc-finger-associated domain)¹¹. Les ZAD forment des dimères stables et spécifiques, les hétérodimères n’étant possibles qu’entre des domaines étroitement liés au sein de groupes paralogues. Les dimères formés par c.......

Discussion

La méthode décrite permet de tester les interactions protéine-protéine qui ne peuvent pas être assemblées efficacement in vitro et nécessitent une co-expression. La méthode est l’une des rares approches appropriées pour étudier les protéines hétérodimérantes, qui sont également capables d’homodimérisation puisque, lorsqu’elles sont purifiées séparément, ces protéines forment des homodimères stables qui ne peuvent le plus souvent pas se dissocier et se réassocier au cours de l’expérience <.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sonde à 8 éléments	Sonics	630-0586	Sondes sonicatrices à 8 éléments à haut débit
Agar	AppliChem	A0949
Résine amylose	New England Biolabs	E8021	Résine pour la purification des protéines marquées MBP
Antibiotiques	AppliChem	A4789 (kanamycine) ; A0839 (ampicilline)
Bêta-mercaptoéthanol	AppliChem	A1108
BL21(DE3)  ;	Novagen	69450-M
CaCl2	AppliChem	A4689
Centrifugeuse	Eppendorf	5415R (Z605212)
Glutathion	AppliChem	A9782
Glutathion agarose	Pierce	16100	Résine pour la purification des protéines marquées GST
Glycérol	AppliChem	A2926
HEPES  ;	AppliChem	A3724
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose	Thermo Scientific	25214	Résine pour la purification de protéines 6xHis-marquées
Imidazole	AppliChem	A1378
IPTG	AppliChem	A4773
KCl	AppliChem	A2939
LB	AppliChem	414753
Maltose	AppliChem	A3891
MOPS	AppliChem	A2947
NaCl	AppliChem	A2942
NP40	Roche	11754599001
pACYCDuet-1	Sigma-Aldrich	71147	Vecteur de co-expression de protéines avec origine de réplication p15A
pCDFDuet-1	Sigma-Aldrich	71340	Vecteur de co-expression de protéines avec l’origine de réplication de CloDF13
PMSF	AppliChem	A0999
Inhibiteur de protéase Cocktail VII	Calbiochem	539138	Inhibiteur de protéase
Cocktail pRSFDuet-1	Sigma-Aldrich	71341	Vecteur de co-expression de protéines avec origine de réplication RSF
SDS  ;	AppliChem	A2263
Tris  ;	AppliChem	A2264
VC505 Sonicateur	Sonics	CV334	Processeur de liquide à ultrasons
ZnCl2	AppliChem	A6285