Summary
Ici, nous décrivons une méthode de co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement à l’aide d’un ensemble de vecteurs compatibles, suivie des techniques conventionnelles de pulldown pour étudier les complexes protéiques qui ne peuvent pas s’assembler in vitro.
Abstract
Pulldown est un test d’interaction protéine-protéine facile et largement utilisé. Cependant, il a des limites dans l’étude des complexes protéiques qui ne s’assemblent pas efficacement in vitro. De tels complexes peuvent nécessiter un assemblage co-translationnel et la présence de chaperons moléculaires; Soit ils forment des oligomères stables qui ne peuvent pas se dissocier et se réassocier in vitro , soit ils sont instables sans partenaire liant. Pour surmonter ces problèmes, il est possible d’utiliser une méthode basée sur la co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement en utilisant un ensemble de vecteurs compatibles suivi des techniques conventionnelles de pulldown. Le flux de travail est plus rapide que le pulldown traditionnel, car il manque les étapes fastidieuses de purification séparée des protéines en interaction et de leur incubation ultérieure. Un autre avantage est une reproductibilité plus élevée en raison d’un nombre significativement plus petit d’étapes et d’une période de temps plus courte pendant laquelle les protéines qui existent dans l’environnement in vitro sont exposées à la protéolyse et à l’oxydation. La méthode a été appliquée avec succès pour étudier un certain nombre d’interactions protéine-protéine lorsque d’autres techniques in vitro se sont révélées inappropriées. La méthode peut être utilisée pour tester par lots les interactions protéine-protéine. Des résultats représentatifs sont présentés pour les études des interactions entre le domaine BTB et les protéines intrinsèquement désordonnées, et des hétérodimères des domaines associés aux doigts de zinc.
Introduction
Le pulldown conventionnel est largement utilisé pour étudier les interactions protéine-protéine1. Cependant, les protéines purifiées n’interagissent souvent pas efficacement in vitro2,3, et certaines d’entre elles sont insolubles sans leur partenaire de liaison 4,5. De telles protéines peuvent nécessiter un assemblage co-translationnel ou la présence de chaperons moléculaires 5,6,7,8,9. Une autre limitation du pulldown conventionnel est le test d’une activité d’hétéromultimérisation possible entre des domaines qui peuvent exister sous forme d’homo-oligomères stables assemblés co-translationnellement 8,10, car beaucoup d’entre eux ne peuvent pas se dissocier et se réassocier in vitro pendant le temps d’incubation. La co-expression s’est avérée utile pour surmonter ces problèmes 3,11. La co-expression utilisant des vecteurs compatibles chez les bactéries a été utilisée avec succès pour purifier de grands complexes macromoléculaires multi-sous-unités, y compris le complexe répressif polycomb PRC212, le module de tête de médiateur de l’ARN polymérase II13, la plaque de base du bactériophage T414, le module de déubiquitinylase du complexe SAGA 15,16 et la ferritine17. Les origines de réplication couramment utilisées pour la co-expression sont ColE1, p15A18, CloDF1319 et RSF20. Dans le système d’expression Duet disponible dans le commerce, ces origines sont combinées avec différents gènes de résistance aux antibiotiques et plusieurs sites de clonage pratiques pour produire des vecteurs polycistroniques, permettant l’expression de jusqu’à huit protéines. Ces origines ont des numéros de copie différents et peuvent être utilisées dans différentes combinaisons pour atteindre des niveaux d’expression équilibrés des protéines cibles21. Pour tester les interactions protéine-protéine, diverses étiquettes d’affinité sont utilisées; les plus courantes sont la 6xHistidine, la glutathion-S-transférase (GST) et la protéine de liaison au maltose (MBP), chacune ayant une affinité spécifique avec la résine correspondante. La GST et le MBP améliorent également la solubilité et la stabilité des protéines marquées22.
Un certain nombre de méthodes impliquant la co-expression des protéines dans les cellules eucaryotes ont également été développées, dont la plus importante est le test à deux hybrides de levure (Y2H)23. Le test Y2H est bon marché, facile et permet de tester de multiples interactions; Cependant, son flux de travail prend plus de 1 semaine à compléter. Il existe également quelques essais à base de cellules de mammifères moins fréquemment utilisés, par exemple, le test fluorescent à deux hybrides (F2H)24 et le test d’interaction protéine-protéine (CAPPIA)25. Le test F2H est relativement rapide, permettant d’observer les interactions protéiques dans leur environnement cellulaire natif, mais implique l’utilisation d’équipements d’imagerie coûteux. Toutes ces méthodes ont un avantage sur l’expression procaryote fournissant la traduction eucaryote native et l’environnement de repliement; Cependant, ils détectent l’interaction indirectement, soit par activation transcriptionnelle, soit par transfert d’énergie fluorescente, ce qui produit souvent des artefacts. En outre, les cellules eucaryotes peuvent contenir d’autres partenaires d’interaction de protéines d’intérêt, ce qui peut interférer avec le test des interactions binaires entre les protéines des eucaryotes supérieurs.
La présente étude décrit une méthode de co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement suivie de techniques conventionnelles de pulldown. La méthode permet d’étudier les interactions entre les protéines cibles qui nécessitent une co-expression. Il est plus rapide que le pulldown traditionnel, permettant de tester par lots plusieurs cibles, ce qui le rend avantageux dans la plupart des cas. La co-expression utilisant des vecteurs compatibles est plus pratique que la co-expression polycistronique car elle ne nécessite pas d’étape de clonage laborieuse.
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Protocol
La représentation schématique du flux de travail de la méthode est illustrée à la figure 1.
1. Co-transformation d’E. coli
- Préparer des vecteurs d’expression pour les protéines cibles à l’aide de méthodes de clonage standard.
REMARQUE: En règle générale, un bon point de départ consiste à utiliser des vecteurs pGEX/pMAL conventionnels portant un gène de résistance à l’ampicilline et une origine ColE1 pour l’expression de protéines marquées GST/MBP et un vecteur compatible d’origine p15A ou RSF et de résistance à la kanamycine pour exprimer des protéines marquées 6xHis, dans certains cas combinées avec de la thiorédoxine ou du SUMO-tag pour augmenter la solubilité. Habituellement, plusieurs combinaisons d’étiquettes doivent être testées avant l’expérience. La méthode décrite elle-même est pratique pour tester par lots les conditions d’expression des protéines cibles. Il est important de noter que la plupart des souches de Rosetta contiennent déjà le plasmide d’origine p15A pour exprimer les ARNt pour les codons rares; donc si l’utilisation de telles souches est une option possible, les plasmides p15A doivent être évités. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails.- Cultiver des bactéries d’une souche appropriée dans un milieu Luria-Bertani (LB) à 37 °C jusqu’à une densité optique (DO) de 0,1 à 0,2. La souche BL21(DE3) a été utilisée à titre d’exemple dans cette étude.
NOTE: Il est recommandé d’utiliser des cellules compétentes fraîchement préparées pour obtenir une co-transformation efficace avec deux vecteurs. Si plus de deux vecteurs doivent être co-transformés, il est préférable de les transformer séquentiellement pour obtenir une bonne efficacité de transformation. L’électroporation est une bonne alternative. - Centrifuger 1,0 mL de la suspension bactérienne pendant 1 min à 9 000 x g à 4 °C et jeter le surnageant.
- Ajouter 0,5 mL de tampon de transformation (TB) glacé (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 et 15 mM CaCl2) et incuber pendant 10 min sur glace.
- Centrifuger pendant 30 s à 8 000 x g à 4 °C et jeter le surnageant.
- Ajouter 100 μL de tampon TB, ajouter 100 ng de chaque vecteur et incuber pendant 30 minutes sur de la glace. Transformez séparément des vecteurs uniques pour étudier le comportement des protéines sans co-expression. En outre, co-transformez les vecteurs d’expression par paires avec des vecteurs de co-expression vides pour les contrôles de liaison non spécifiques.
NOTE: Dans les exemples fournis dans cette étude, des vecteurs pGEX/pMAL avec des ADNc correspondants fusionnés à des ADNc GST/MBP ont été utilisés en combinaison avec des vecteurs compatibles dérivés de pACYC portant des domaines protéiques partenaires codant pour l’ADNc codant pour l’ADNc fusionné à l’ADNc de thiorédoxine. - Chauffer à 42 °C pendant 150 s, puis refroidir pendant 1 min sur glace.
- Ajouter 1 mL de milieu LB liquide sans antibiotiques et incuber à 37 °C pendant 90 min. Plaque sur des plaques de LB-agar contenant 0,5 % de glucose et les antibiotiques correspondants (les concentrations courantes sont les suivantes : 50 mg/L d’ampicilline; 20 mg/L de kanamycine; 50 mg/L de streptomycine; 35 mg/L de chloramphénicol). Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C.
- Cultiver des bactéries d’une souche appropriée dans un milieu Luria-Bertani (LB) à 37 °C jusqu’à une densité optique (DO) de 0,1 à 0,2. La souche BL21(DE3) a été utilisée à titre d’exemple dans cette étude.
2. Expression
- Rincer les cellules de la plaque avec 2 mL de milieu LB liquide dans 50 mL de milieu LB avec les antibiotiques correspondants (les concentrations courantes sont : 50 mg/L d’ampicilline; 20 mg/L de kanamycine; 50 mg/L de streptomycine; 35 mg/L de chloramphénicol). Ajouter des ions métalliques ou d’autres cofacteurs connus (dans les exemples fournis dans cette étude, 0,2 mM ZnCl2 a été ajouté au milieu). Conservez une partie aliquote contenant 20 % de glycérol à -70 °C pour une répétition ultérieure de l’expérience.
REMARQUE: Il est recommandé de rincer plusieurs colonies directement de la plaque pour exclure la possibilité d’une mauvaise expression dans un seul clone isolé en raison d’événements de recombinaison occasionnels entre deux plasmides. - Faire pousser les cellules avec une rotation constante de 220 tr/min à 37 °C jusqu’à une DO de 0,5 à 0,7, refroidir à température ambiante (RT) et ajouter l’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à 1 mM. Conserver une partie aliquote de 20 μL de suspension cellulaire comme témoin de l’échantillon non induit.
- Incuber les cellules avec une rotation constante de 220 rpm à 18 °C pendant la nuit.
REMARQUE: Le temps et la température optimaux d’incubation peuvent varier; 18 ° C pendant la nuit fonctionne mieux pour la plupart des protéines et il est conseillé d’être essayé par défaut. Réduire le temps d’incubation à 2-3 h si une forte liaison non spécifique est observée. - Divisez la suspension bactérienne en deux parties (ou plus si plus de deux étiquettes différentes ont été utilisées) et conservez une partie aliquote de 20 μL de la suspension cellulaire pour confirmer l’expression de la protéine. Centrifuger à 4 000 x g pendant 15 min.
REMARQUE: Point de pause: les granulés bactériens peuvent être conservés à -70 ° C pendant au moins 6 mois.
3. Essai de pulldown
REMARQUE: Les procédures détaillées sont décrites pour les protéines marquées avec 6xHis ou MBP / GST. Toutes les procédures sont effectuées à 4°C.
- Remettez en suspension les pastilles bactériennes dans 1 mL de tampon de lyse glacé avec des inhibiteurs de protéase et des agents réducteurs (voir ci-dessous) ajoutés immédiatement avant l’expérience. Évitez le dithiotreitol (DTT) lorsque vous utilisez des résines chélatantes des métaux, car il élimine les ions métalliques. Ajustez la composition tampon pour les protéines testées. Les recettes courantes de tampons de lyse qui conviennent à la plupart des protéines sont:
- 6xHis-pulldown : Mélanger 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazole, 0,1 % NP40, 10 % [p/p] glycérol, 5 mM bêta-mercaptoéthanol, 1 mM de phénylméthylsfulfonylfluorure (PMSF) et une dilution de 1:1 000 du cocktail inhibiteur de protéase (voir le tableau des matériaux).
- GST ou MBP-pulldown: Mélanger 20 mM Tris (pH 7,5 à 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [p/p] glycérol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF et une dilution 1:1 000 du cocktail inhibiteur de protéase (voir le tableau des matériaux).
- Perturber les cellules par sonication sur glace. Conservez une partie aliquote de 20 μl pour l’électrophorèse.
REMARQUE: En règle générale, 20-25 impulsions de 5 s avec des intervalles de 15 s avec une puissance de sortie de 20 W sont nécessaires par échantillon. Le pouvoir de sonication approprié doit être ajusté pour chaque instrument afin d’éviter la surchauffe et d’assurer une perturbation totale des cellules. Pour obtenir de meilleures performances, il est fortement recommandé d’utiliser des sondes sonicatrices multi-pointes à haut débit. - Centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min. Prélever 20 μL du lysat clarifié pour une analyse ultérieure SDS-PAGE.
- Équilibrer la résine (50 μL pour chaque échantillon) avec 1 mL de tampon de lyse glacée pendant 10 min, centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant.
- Ajouter des lysats cellulaires (concentration totale en protéines : 20-50 mg/mL) à la résine, incuber pendant 10 min à une rotation constante de 15 tr/min, centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant. Prélever 20 μL de la fraction non liée pour l’analyse SDS-PAGE ultérieure.
- Ajouter 1 mL de tampon de lavage glacé et incuber pendant 1 min. Centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant. Les recettes courantes pour les tampons de lavage sont:
- 6xHis-pulldown: Mélanger 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazole, 0,1% NP40, 10% [p/p] glycérol et 5 mM bêta-mercaptoéthanol.
- GST ou MBP-pulldown: Mélanger 20 mM Tris (pH 7,5 à 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [p/p] glycérol et 5 mM DTT.
- Effectuer deux longs lavages : ajouter 1 mL de tampon de lavage à froid glacé, incuber pendant 10 à 30 min avec une rotation constante de 15 tr/min, centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant.
- Ajouter 1 mL de tampon de lavage glacé, incuber pendant 1 min, centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s et jeter le surnageant.
- Éluer les protéines liées avec 50 μL de tampon d’élution dans un agitateur à 1 200 tr/min pendant 10 min. Les recettes courantes de tampons d’élution sont:
- 6xHis-pulldown: Mélanger 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazole et 5 mM bêta-mercaptoéthanol.
- GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 à 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM de glutathion (ajusté à pH 7,5 avec Tris basique) et 5 mM de TNT.
- MBP-pulldown : Mélanger 20 mM de Tris (pH 7,5 à 25 °C), 150 mM de NaCl, 40 mM de maltose et 5 mM de TNT.
- Analysez les protéines éluées avec SDS-PAGE.
NOTE: Le pourcentage d’acrylamide doit être ajusté à la taille des protéines. Dans les exemples fournis dans cette étude, des gels d’acrylamide à 12 % ont été utilisés, fonctionnant dans un tampon tris-glycine-SDS (2 mM Tris, 250 mM Glycine, 0,1 % SDS) à tension constante de 180 V. Les gels ont été colorés par ébullition dans 0,2% de bleu de Coomassie R250, 10% d’acide acétique et 30% d’isopropanol, et décolorés par ébullition dans 10% d’acide acétique. La quantité de protéines chargées ne devrait pas être égale, car différentes quantités de protéines en interaction peuvent être tirées vers le bas dans différentes expériences.
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Representative Results
La méthode décrite a été utilisée couramment avec de nombreuses cibles différentes. Voici quelques résultats représentatifs qui ne peuvent probablement pas être obtenus en utilisant des techniques conventionnelles de pulldown. La première est l’étude de la dimérisation spécifique ZAD (Zinc-finger-associated domain)11. Les ZAD forment des dimères stables et spécifiques, les hétérodimères n’étant possibles qu’entre des domaines étroitement liés au sein de groupes paralogues. Les dimères formés par ces domaines sont stables et ne se dissocient pas pendant au moins quelques jours ; ainsi, le mélange de ZAD purifiés ne produit aucune liaison détectable. Dans le même temps, la co-expression des ZAD fusionnés MBP et Thiorédoxine-6xHis montre une activité homo-dimérisation bonne et reproductible (Figure 2A), apparaissant comme une bande supplémentaire dans les résultats SDS-PAGE du test MBP-pulldown. Une petite partie des hétérodimères peut être vue avec M1BP co-exprimé avec un autre domaine; cette interaction n’a pas été confirmée avec Y2A et est très probablement le résultat d’une association non spécifique due à une concentration élevée de protéines, car ces domaines sont riches en cystéine et extrêmement sujets à l’agrégation. Notamment, dans ce cas, 6xHis-pulldown est inapproprié car les ZAD sont des domaines de coordination des métaux qui se lient non spécifiquement à la résine chélatrice des métaux. Une telle activité doit être soigneusement examinée dans une expérience parallèle.
Un autre exemple est le test de compétition entre la protéine ENY2 et ses partenaires de liaison Sgf11 (1-83aa) et le domaine zinc-doigt (460-631 aa) de la protéine CTCF26. Lorsqu’elle est exprimée seule, la protéine ENY2 forme des dimères qui l’empêchent d’interagir avec ses partenaires de liaison natifs. Vraisemblablement, les protéines Sgf11 et CTCF se lient à la même surface moléculaire d’ENY2, ce qui rend leur interaction mutuellement exclusive. Dans le test de co-expression, ENY2 marqué 6xHis interagissait à la fois avec Sgf11 et MBP-CTCF marqués GST, mais aucun GST-Sgf11 n’était présent dans les pulldowns MBP et vice versa (Figure 2B). Ces résultats suggèrent qu’aucun complexe triple ne peut être formé et que les interactions s’excluent mutuellement. Ces données ont été confirmées indépendamment par d’autres tests et soutiennent les différents rôles fonctionnels d’ENY2 dans ces complexes. Il convient d’attirer l’attention sur le fait que les grandes étiquettes d’affinité peuvent à elles seules imposer des obstacles stériques, empêchant la formation de complexes; Par conséquent, la conclusion ne devrait pas être fondée uniquement sur des données de co-expression.
Une comparaison étape par étape des flux de travail des pulldowns de co-expression conventionnels et couplés est présentée à la figure 3A. Le pulldown couplé à co-expression est au moins deux fois plus rapide, même avec un petit nombre d’échantillons, et permet une bonne évolutivité. Les résultats de l’utilisation des deux techniques pour étudier la même interaction entre le domaine BTB de la protéine CP190 (1-126aa) et le domaine C-terminal marqué GST (610-818aa) de la protéine CTCF de la drosophile (dCTCF) sont présentés à la figure 3B. Les deux méthodes montrent une bonne efficacité et une bonne reproductibilité (des essais ont été effectués dans trois répétitions); dans ce cas, le pulldown couplé à co-expression a montré une liaison non spécifique plus faible, comme on peut le voir dans les échantillons témoins avec la protéine GST seule.
Figure 1 : Représentation schématique du protocole. Le schéma montre le flux de travail de la méthode utilisée dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Résultats représentatifs. (A) Etude de l’homodimérisation du domaine associé aux doigts de zinc (ZAD) dans les essais MBP- et 6xHis-pulldown. Les ZAD fusionnés avec du MBP (40 kDa) ou avec de la 6xHis-Thiorédoxine (20 kDa) ont été co-exprimés dans des cellules bactériennes et affinés purifiés avec de la résine d’amylose (lie les protéines marquées MBP) ou avec de la résine Ni-NTA (lie 6xHis-tagged proteins). Les protéines co-purifiées ont été visualisées avec SDS-PAGE suivi d’une coloration de Coomassie. Les résultats MBP-pulldown sont affichés dans les panneaux supérieurs, les résultats 6xHis-pulldown sont dans les panneaux inférieurs (utilisés uniquement comme contrôle de l’expression des protéines puisque de nombreux ZAD se lient non spécifiquement au Ni-NTA). (B) Etude des interactions mutuellement exclusives entre les protéines ENY2 et Sgf11/CTCF. Les protéines Sgf11 (1-81aa) marquées à la GST, le domaine à doigts de zinc CTCF marqué MBP (460-631aa) et les protéines ENY2 marquées 6xHis ont été co-exprimées dans diverses combinaisons et affinités purifiées avec de la résine d’amylose, de la résine de glutathion (se lie aux protéines marquées GST) ou avec de la résine Ni-NTA. Les protéines co-purifiées ont été visualisées avec SDS-PAGE suivi d’une coloration de Coomassie. La figure des panneaux A et B a été modifiée avec la permission de Bonchuk et al.11 et Bonchuk et al.26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Comparaison des flux de travail des tests pulldown de co-expression conventionnels et couplés. (A) Comparaison étape par étape des intervalles de temps requis dans le flux de travail du test de pulldown conventionnel par rapport au pulldown couplé à la co-expression. (B) Comparaison de deux techniques différentes de pulldown dans l’étude de l’interaction entre le domaine C-terminal dCTCF (610-818aa) et le domaine BTB de la protéine CP190 (1-126aa) dans les essais GST-pulldown. Les dCTCF (610-818aa) fusionnés avec GST (25kDa) ou GST seuls ont été soit co-exprimés dans des cellules bactériennes, soit incubés in vitro avec du BTB CP190 marqué à la thiorédoxine-6xHis et affinité purifiée avec de la résine de glutathion. Trois répétitions indépendantes de chaque essai sont présentées. Les protéines co-purifiées ont été visualisées avec SDS-PAGE suivi d’une coloration de Coomassie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode décrite permet de tester les interactions protéine-protéine qui ne peuvent pas être assemblées efficacement in vitro et nécessitent une co-expression. La méthode est l’une des rares approches appropriées pour étudier les protéines hétérodimérantes, qui sont également capables d’homodimérisation puisque, lorsqu’elles sont purifiées séparément, ces protéines forment des homodimères stables qui ne peuvent le plus souvent pas se dissocier et se réassocier au cours de l’expérience 3,11.
Le flux de travail de la méthode décrite est plus rapide que le pulldown traditionnel, car il manque les étapes fastidieuses de purification séparée des protéines en interaction et de leur incubation ultérieure. Un autre avantage est une reproductibilité plus élevée, en raison d’un nombre d’étapes significativement plus petit et d’une période de temps plus courte pendant laquelle les protéines existent dans un environnement artificiel in vitro tout en étant exposées à la protéolyse et à l’oxydation. La méthode a été appliquée avec succès pour étudier plusieurs interactions protéine-protéine lorsque d’autres techniques in vitro se sont révélées inappropriées 3,11,27. La co-précipitation parallèle avec différentes étiquettes d’affinité permet de contrôler le niveau d’expression des protéines. Comme la méthode est plus facile et plus rapide que le pulldown conventionnel, elle peut être utilisée à sa place, même si la co-expression n’est pas absolument nécessaire. La vitesse de perturbation cellulaire est un goulot d’étranglement non évident qui peut augmenter considérablement le temps total et peut entraîner un écart dans les résultats, en raison du temps variable entre le premier et le dernier échantillon exposé à des conditions in vitro et la protéolyse. Ainsi, l’utilisation de sondes sonicatrices multi-pointes à haut débit est fortement recommandée; voir le tableau des matériaux pour des exemples.
L’utilisation de billes magnétiques pourrait diminuer la liaison non spécifique et accélérer davantage la méthode, réduisant ainsi le temps nécessaire aux étapes de lavage. L’utilisation de vecteurs d’origines compatibles présente un avantage par rapport à l’expression polycistronique car ils fournissent une approche combinatoire pratique pour tester plusieurs interactions protéiques avec la même cible et ne nécessitent pas la production d’un nouveau vecteur pour chaque combinaison.
Un inconvénient de la méthode est la probabilité relativement élevée de résultats faussement positifs, car les protéines sont co-exprimées dans les bactéries à des concentrations élevées. Ainsi, les interactions inattendues découvertes par cette méthode doivent être traitées avec prudence et testées avec un test indépendant, tel que les techniques Y2A ou cellulaires24, qui utilisent également la co-expression 3,11,28. Des approches bioinformatiques à haut débit peuvent également être utilisées pour analyser et valider des réseaux complexes d’interaction protéine-protéine29. Un autre obstacle particulier est que les complexes protéiques peuvent avoir des propriétés biochimiques complètement différentes de celles des protéines séparées; Le complexe peut être insoluble tant que ses composants sont présents dans la solution. Ce problème peut généralement être résolu en fusionnant les protéines à l’étiquette de solubilité appropriée. MBP est le plus efficace, tandis que NusA est une autre bonne alternativeglobale 22. L’étiquette GST s’est avérée efficace avec de nombreux domaines coordonnant le zinc, bien qu’étant donné qu’elle est dimérique, elle devrait être évitée lorsque l’on travaille avec des domaines oligomères. Au contraire, les petits domaines monomères tels que la thiorédoxine et le SUMO fonctionnent bien avec les domaines protéiques multimères.
Les étapes critiques de la méthode décrite sont le moment approprié de l’expression des protéines (un temps plus court est nécessaire si une liaison non spécifique est observée, tandis que des temps d’incubation plus longs peuvent être nécessaires pour améliorer la mauvaise expression des protéines), la perturbation cellulaire rapide, le choix approprié des tampons et le maintien de la température constante pendant le protocole. Des temps d’incubation excessifs après l’induction peuvent entraîner une agrégation des protéines dans les bactéries, conduisant à des résultats faussement positifs. D’autre part, certaines protéines nécessitent plus de temps pour être exprimées en quantité suffisante. Les fluctuations de température pendant les étapes de sonication et de lavage peuvent entraîner des modifications du pH tampon et de la précipitation des protéines. Un mauvais choix de tampon peut également entraîner une agrégation de protéines non spécifique.
En cas de mauvaise expression des protéines, différentes étiquettes de solubilité doivent être tentées, ainsi qu’un temps d’incubation accru après l’induction. Si une forte association non spécifique est observée, tous les contrôles négatifs nécessaires doivent être effectués pour déterminer l’association non spécifique possible des protéines avec la résine ou l’étiquette d’affinité. Dans le cas où les contrôles ne fonctionnent pas, différentes combinaisons de balises d’affinité doivent être essayées et différentes mémoires tampons utilisées. De nombreuses protéines ont tendance à se lier de manière non spécifique aux ZAD de type résine chélatant les métaux mentionnées dans cet article; dans de tels cas, le MBP/GST-pulldown, en général, serait suffisant sans une expérience réciproque qui ne peut être utilisée que pour le contrôle de l’expression des protéines. Si les témoins négatifs fonctionnent bien, le temps d’expression des protéines doit être diminué, et le système tampon et l’agent réducteur modifiés ou la concentration de l’agent réducteur augmente, en particulier lorsque vous travaillez avec des protéines riches en cystéine. En cas de mauvaise reproductibilité des résultats, il convient de prêter attention à l’étape de perturbation cellulaire, qui doit être effectuée rapidement mais sans surchauffe. La température doit être surveillée tout au long de l’expérience.
Cette méthode peut être facilement modifiée pour étudier les complexes multiprotéiques ou les ribonucléoprotéines. Une autre application possible est l’essai par lots de l’expression du complexe protéique et des conditions de purification pour les études ultérieures.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par les projets 19-74-30026 (développement et validation de méthodes) et 19-74-10099 (essais d’interaction protéine-protéine); et par le ministère de la Science et de l’Enseignement supérieur de la Fédération de Russie-subvention 075-15-2019-1661 (analyse des interactions protéine-protéine représentatives).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
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