Summary
Burada, bir dizi uyumlu vektör kullanarak diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntem açıklıyoruz, ardından in vitro olarak bir araya gelemeyen protein komplekslerini incelemek için geleneksel pulldown teknikleri izleniyor.
Abstract
Pulldown, kolay ve yaygın olarak kullanılan bir protein-protein etkileşim testidir. Bununla birlikte, in vitro olarak etkili bir şekilde bir araya gelmeyen protein komplekslerini incelemede sınırlamaları vardır. Bu tür kompleksler, ko-translasyonel montaj ve moleküler şaperonların varlığını gerektirebilir; ya in vitro olarak ayrışamayan ve yeniden birleşemeyen kararlı oligomerler oluştururlar ya da bağlayıcı bir partner olmadan kararsızdırlar. Bu sorunların üstesinden gelmek için, geleneksel pulldown tekniklerinin izlediği bir dizi uyumlu vektör kullanarak farklı şekilde etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonuna dayanan bir yöntem kullanmak mümkündür. İş akışı, geleneksel pulldown'a kıyasla daha zaman verimlidir, çünkü etkileşime giren proteinlerin ayrı ayrı saflaştırılması ve sonraki inkübasyonlarının zaman alıcı adımlarından yoksundur. Diğer bir avantaj, önemli ölçüde daha az sayıda adım ve in vitro ortamda bulunan proteinlerin proteoliz ve oksidasyona maruz kaldığı daha kısa bir süre nedeniyle daha yüksek bir tekrarlanabilirliktir. Yöntem, diğer in vitro tekniklerin uygun olmadığı tespit edildiğinde bir dizi protein-protein etkileşimini incelemek için başarıyla uygulandı. Yöntem, protein-protein etkileşimlerini toplu olarak test etmek için kullanılabilir. BTB alanı ile içsel olarak düzensiz proteinler arasındaki etkileşimlerin ve çinko-parmak ile ilişkili alanların heterodimerlerinin çalışmaları için temsili sonuçlar gösterilmiştir.
Introduction
Geleneksel pulldown, protein-protein etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak kullanılır1. Bununla birlikte, saflaştırılmış proteinler genellikle in vitro2,3 etkili bir şekilde etkileşime girmez ve bazılarıbağlanma ortakları 4,5 olmadan çözünmez. Bu tür proteinler ko-translasyonel montaj veya moleküler şaperonların varlığı gerektirebilir 5,6,7,8,9. Konvansiyonel pulldown'un bir başka sınırlaması, 8,10 ile birlikte translasyonelolarak bir araya getirilmiş kararlı homo-oligomerler olarak var olabilen alanlar arasındaki olası heteromultimerizasyon aktivitesinin test edilmesidir, çünkü birçoğu kuluçka süresi boyunca in vitro olarak ayrışamaz ve yeniden ilişkilendirilemez. Bu tür sorunların üstesinden gelmede birlikte ifade etmenin yararlı olduğu bulunmuştur 3,11. Bakterilerde uyumlu vektörler kullanılarak birlikte ekspresyon, polikomb baskılayıcı kompleks PRC2 12, RNA polimeraz II mediatör kafa modülü 13, bakteriyofaj T4 taban plakası14, SAGA kompleksi deubikitinilaz modülü 15,16 ve ferritin 17'yi içeren büyük çok alt birimli makromoleküler kompleksleri saflaştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Birlikte ifade için yaygın olarak kullanılan çoğaltma kaynakları ColE1, p15A18, CloDF1319 ve RSF20'dir. Ticari olarak temin edilebilen Duet ekspresyon sisteminde, bu kökenler farklı antibiyotik direnç genleri ve polisitronik vektörler üretmek için uygun çoklu klonlama bölgeleri ile birleştirilir ve sekiz proteine kadar ekspresyona izin verir. Bu kökenler farklı kopya numaralarına sahiptir ve hedef proteinlerin dengeli ekspresyon seviyelerini elde etmek için çeşitli kombinasyonlarda kullanılabilir21. Protein-protein etkileşimlerini test etmek için çeşitli afinite etiketleri kullanılır; en yaygın olanları 6xHistidin, glutatyon-S-transferaz (GST) ve maltoz bağlayıcı proteindir (MBP), bunların her biri karşılık gelen reçineye spesifik bir afiniteye sahiptir. GST ve MBP ayrıca etiketli proteinlerin çözünürlüğünü ve kararlılığını arttırır22.
Ökaryotik hücrelerde protein ko-ekspresyonunu içeren bir dizi yöntem de geliştirilmiştir, bunlardan en önemlisi maya iki hibrid tahlilidir (Y2H)23. Y2H testi ucuz, kolaydır ve çoklu etkileşimlerin test edilmesine izin verir; ancak, iş akışının tamamlanması 1 haftadan fazla sürer. Ayrıca, daha az sıklıkla kullanılan birkaç memeli hücre bazlı tahlil vardır, örneğin, floresan iki hibrid tahlil (F2H)24 ve hücre dizisi protein-protein etkileşim testi (CAPPIA)25. F2H testi nispeten hızlıdır ve doğal hücresel ortamlarında protein etkileşimlerini gözlemlemeye izin verir, ancak pahalı görüntüleme ekipmanlarının kullanılmasını içerir. Tüm bu yöntemler, doğal ökaryotik çeviri ve katlama ortamı sağlayan prokaryotik ifadeye göre avantajlıdır; Bununla birlikte, etkileşimi dolaylı olarak, transkripsiyonel aktivasyon veya genellikle eserler üreten floresan enerji transferi yoluyla tespit ederler. Ayrıca, ökaryotik hücreler, daha yüksek ökaryotların proteinleri arasındaki ikili etkileşimlerin test edilmesine müdahale edebilen, ilgilenilen proteinlerin diğer etkileşim ortaklarını içerebilir.
Bu çalışma, diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntemi ve ardından geleneksel pulldown tekniklerini açıklamaktadır. Yöntem, birlikte ekspresyon gerektiren hedef proteinler arasındaki etkileşimlerin incelenmesine izin verir. Geleneksel pulldown'a kıyasla daha zaman verimlidir ve birden fazla hedefin toplu olarak test edilmesine izin verir, bu da çoğu durumda avantajlı olmasını sağlar. Uyumlu vektörler kullanılarak birlikte ifade, zahmetli bir klonlama adımı gerektirmediğinden polisitronik birlikte ifadeden daha uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yöntem iş akışının şematik gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. E. coli'nin birlikte dönüşümü
- Standart klonlama yöntemlerini kullanarak hedef proteinler için ekspresyon vektörleri hazırlayın.
NOT: Tipik olarak, iyi bir başlangıç noktası, GST / MBP etiketli proteinlerin ekspresyonu için bir ampisilin direnç geni ve ColE1 orijinli geleneksel pGEX / pMAL vektörleri ve 6xHis etiketli proteinleri eksprese etmek için p15A veya RSF kökenli ve kanamisin direnci ile uyumlu bir vektör kullanmaktır. Genellikle, denemeden önce birkaç etiket kombinasyonunun test edilmesi gerekir. Açıklanan yöntemin kendisi, hedef proteinlerin ekspresyon koşullarını toplu olarak test etmek için uygundur. Çoğu Rosetta suşunun zaten nadir kodon için tRNA'ları eksprese etmek için p15A kökenli plazmid içerdiğine dikkat etmek önemlidir; Bu nedenle, bu tür suşların kullanılması olası bir seçenekse, p15A plazmidlerinden kaçınılmalıdır. Ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.- Luria-Bertani (LB) ortamında 37 ° C'de 0.1-0.2'lik bir optik yoğunluğa (OD) uygun bir suştaki bakterileri büyütün. Bu çalışmada örnek olarak BL21(DE3) suşu kullanılmıştır.
NOT: İki vektörle verimli bir şekilde birlikte dönüşüm elde etmek için taze hazırlanmış yetkin hücrelerin kullanılması önerilir. İkiden fazla vektörün birlikte dönüştürülmesi gerekiyorsa, iyi bir dönüşüm verimliliği elde etmek için bunları sırayla dönüştürmek daha iyidir. Elektroporasyon iyi bir alternatiftir. - 4 °C'de 9.000 x g'de 1 dakika boyunca bakteriyel süspansiyonun 1.0 mL'sini santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
- 0,5 mL buz gibi soğuk tampon dönüşüm tamponu (TB) (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 ve 15 mM CaCl2) ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- 4 °C'de 8.000 x g'de 30 sn'lik santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
- 100 μL TB tampon ekleyin, her vektörden 100 ng ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. Birlikte ifade olmadan protein davranışını incelemek için tek vektörleri ayrı ayrı dönüştürün. Ek olarak, ifade vektörlerini, spesifik olmayan bağlama denetimleri için boş birlikte ifade vektörleriyle çiftler halinde birlikte dönüştürün.
NOT: Bu çalışmada verilen örneklerde, GST/MBP cDNA'lara kaynaşmış karşılık gelen cDNA'lara sahip pGEX/pMAL vektörleri, Thioredoxin cDNA'ya kaynaşmış cDNA kodlama ortağı protein alanlarını taşıyan uyumlu pASIC türevi vektörlerle birlikte kullanılmıştır. - 42 °C'de 150 s ısıtın, ardından buz üzerinde 1 dakika soğutun.
- Antibiyotiksiz 1 mL sıvı LB ortamı ekleyin ve 90 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. % 0.5 glikoz ve karşılık gelen antibiyotikler içeren LB-agar plakaları üzerindeki plaka (yaygın konsantrasyonlar: 50 mg / L ampisilin; 20 mg / L kanamisin; 50 mg / L streptomisin; 35 mg / L kloramfenikol). Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Luria-Bertani (LB) ortamında 37 ° C'de 0.1-0.2'lik bir optik yoğunluğa (OD) uygun bir suştaki bakterileri büyütün. Bu çalışmada örnek olarak BL21(DE3) suşu kullanılmıştır.
2. İfade
- Hücreleri plakadan 2 mL sıvı LB ortamı ile karşılık gelen antibiyotiklerle 50 mL LB ortamına yıkayın (yaygın konsantrasyonlar: 50mg / L ampisilin; 20 mg / L kanamisin; 50 mg / L streptomisin; 35 mg / L kloramfenikol). Metal iyonları veya diğer bilinen ko-faktörleri ekleyin (bu çalışmada verilen örneklerde, medyaya 0.2 mM ZnCl2 eklenmiştir). Deneyin daha sonraki bir tekrarı için -70 ° C'de% 20 gliserol içeren bir aliquot saklayın.
NOT: İki plazmid arasındaki ara sıra rekombinasyon olayları nedeniyle tek bir izole klonda kötü ekspresyon olasılığını dışlamak için birkaç koloninin doğrudan plakadan temizlenmesi önerilir. - Hücreleri 37 ° C'de 220 rpm'lik sabit bir dönüşle 0.5-0.7'lik bir OD'ye büyütün, oda sıcaklığına (RT) soğutun ve izopropil β-D-1-tiyogalaktopironosid (IPTG) 1 mM'ye ekleyin. İndüklenmemiş numunenin kontrolü olarak 20 μL'lik bir hücre süspansiyonu aliquot'u saklayın.
- Hücreleri gece boyunca 18 ° C'de 220 rpm'lik sabit bir dönüşle inkübe edin.
NOT: Optimum inkübasyon süresi ve sıcaklığı değişebilir; Gece boyunca 18 ° C çoğu protein için en iyi şekilde çalışır ve varsayılan olarak denenmesi önerilir. Spesifik olmayan güçlü bir bağlanma gözlenirse kuluçka süresini 2-3 saate düşürün. - Bakteriyel süspansiyonu iki parçaya bölün (veya ikiden fazla farklı etiket kullanılıyorsa daha fazla) ve protein ekspresyonunu doğrulamak için hücre süspansiyonunun 20 μL'lik bir alikotunu saklayın. 15 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüj.
NOT: Duraklama noktası: Bakteriyel peletler -70 °C'de en az 6 ay saklanabilir.
3. Pulldown testi
NOT: 6xHis veya MBP/GST ile etiketlenmiş proteinler için ayrıntılı prosedürler açıklanmıştır. Tüm prosedürler 4 ° C'de gerçekleştirilir.
- Bakteriyel peletleri, deneyden hemen önce eklenen proteaz inhibitörleri ve indirgeyici ajanlar (aşağıya bakınız) ile 1 mL buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden askıya alın. Metal yonlarını sıyırdığı için metal şelatlama reçineleri kullanırken ditiotreitolden (DTT) kaçının. Test edilen proteinler için tampon bileşimini ayarlayın. Çoğu protein için uygun bulunan lizis tamponlarının yaygın tarifleri şunlardır:
- 6xHis-pulldown: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazol, %0.1 NP40, %10 [w/w] gliserol, 5 mM beta-merkaptoetanol, 1 mM fenilmetilsülfonilflorür (PMSF) ve proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1.000 seyreltilmesini karıştırın (bkz.
- GST veya MBP pulldown: 20 mM Tris (25 °C'de pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, %0,1 NP40, %10 [w/w] gliserol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF ve proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1.000 seyreltilmesini karıştırın (bkz.
- Buz üzerinde sonikasyon ile hücreleri bozun. Elektroforez için 20 μl'lik bir aliquot saklayın.
NOT: Tipik olarak, numune başına 20 W çıkış gücüne sahip 15 s aralıklarla 5 sn'lik 20-25 darbe gerekir. Aşırı ısınmayı önlemek ve toplam hücre bozulmasını sağlamak için her cihaz için uygun sonikasyon gücü ayarlanmalıdır. Daha iyi performans elde etmek için, yüksek verimli çok uçlu sonikatör problarının kullanılması şiddetle tavsiye edilir. - 30 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüj. Sonraki SDS-PAGE analizi için 20 μL berraklaştırılmış lizat toplayın.
- Reçineyi (her numune için 50 μL) 10 dakika boyunca 1 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ile dengeleyin, 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
- Reçineye hücre lizatları (toplam protein konsantrasyonu: 20-50 mg / mL) ekleyin, 15 rpm'lik sabit bir rotasyonda 10 dakika boyunca inkübe edin, 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Sonraki SDS-PAGE analizi için ilişkisiz fraksiyonun 20 μL'sini toplayın.
- 1 mL buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin ve 1 dakika kuluçkaya yatırın. 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Yıkama tamponları için yaygın tarifler şunlardır:
- 6xHis-pulldown: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazol, %0.1 NP40, %10 [w/w] gliserol ve 5 mM beta-merkaptoetanol karıştırın.
- GST veya MBP pulldown: 20 mM Tris (25 °C'de pH 7,5), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, %0,1 NP40, %10 [w/w] gliserol ve 5 mM DTT karıştırın.
- İki uzun yıkama gerçekleştirin: 1 mL buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin, 15 rpm'lik sabit bir dönüşle 10-30 dakika inkübe edin, 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
- 1 mL buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin, 1 dakika kuluçkaya yatırın, 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
- Bağlı proteinleri, 50 μL elüsyon tamponu ile 10 dakika boyunca 1.200 rpm'de bir çalkalayıcıda süzün. Elüsyon tamponlarının yaygın tarifleri şunlardır:
- 6xHis-pulldown: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazol ve 5 mM beta-merkaptoetanol karıştırın.
- GST-pulldown: 20 mM Tris (25 °C'de pH 7.5), 150 mM NaCl, 50 mM Glutatyon (bazik Tris ile pH 7.5'e ayarlanır) ve 5 mM DTT.
- MBP-pulldown: 20 mM Tris (25 °C'de pH 7,5), 150 mM NaCl, 40 mM maltoz ve 5 mM DTT'yi karıştırın.
- Salınan proteinleri SDS-PAGE ile analiz edin.
NOT: Akrilamid yüzdesi, proteinlerin boyutuna göre ayarlanmalıdır. Bu çalışmada verilen örneklerde, tris-glisin-SDS tamponunda (2 mM Tris, 250 mM Glisin,% 0.1 SDS) 180 V'luk sabit voltajda çalışan% 12 akrilamid jelleri kullanılmıştır. jeller% 0.2 Coomassie mavi R250,% 10 asetik asit ve% 30 izopropanol içinde kaynatılarak boyanmış ve% 10 asetik asit içinde kaynatılarak boyanmıştır. Yüklü protein miktarı eşit olmamalıdır, çünkü farklı deneylerde çeşitli miktarlarda etkileşime giren proteinler aşağı çekilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan yöntem birçok farklı hedefle rutin olarak kullanılmıştır. Burada, geleneksel pulldown teknikleri kullanılarak elde edilemeyen bazı temsili sonuçlar sunulmaktadır. Birincisi, spesifik ZAD (Çinko-parmak ile ilişkili alan) dimerizasyonunun incelenmesidir11. ZAD'ler stabil ve spesifik dimerler oluşturur, heterodimerler sadece paralog gruplar içindeki yakından ilişkili alanlar arasında mümkündür. Bu alanlar tarafından oluşturulan dimerler kararlıdır ve en az birkaç gün boyunca ayrışmazlar; Bu nedenle, saflaştırılmış ZAD'lerin karıştırılması tespit edilebilir herhangi bir bağlanma üretmez. Aynı zamanda, MBP ve Thioredoxin-6xHis-kaynaşmış ZAD'lerin birlikte ekspresyonu, MBP-pulldown testinin SDS-PAGE sonuçlarında ek bir bant olarak görünen, iyi ve tekrarlanabilir homo-dimerizasyon aktivitesi göstermektedir (Şekil 2A). Heterodimerlerin küçük bir kısmı, başka bir alanla birlikte eksprese edilen M1BP ile görülebilir; Bu etkileşim Y2A ile doğrulanmamıştır ve büyük olasılıkla yüksek protein konsantrasyonu nedeniyle spesifik olmayan bir ilişkinin sonucudur, çünkü bu alanlar sistein bakımından zengin ve aşırı derecede agregasyona eğilimlidir. Özellikle, bu durumda, ZAD'ler metal şelatlama reçinesine spesifik olarak bağlanmayan metal koordinasyon alanları olduğu için 6xHis-pulldown uygun değildir. Bu tür bir aktivite paralel bir deneyde dikkatlice incelenmelidir.
Başka bir örnek, ENY2 proteini ve bağlayıcı ortakları Sgf11 (1-83aa) ve CTCF proteini26'nın çinko-parmak alanı (460-631 aa) arasındaki rekabet testidir. Tek başına ifade edildiğinde, ENY2 proteini, doğal bağlanma ortaklarıyla etkileşime girmesini engelleyen dimerler oluşturur. Muhtemelen, hem Sgf11 hem de CTCF proteinleri, ENY2'nin aynı moleküler yüzeyine bağlanır ve etkileşimlerini karşılıklı olarak münhasır kılar. Ortak ifade testinde, 6xHis-etiketli ENY2 hem GST etiketli Sgf11 hem de MBP-CTCF ile etkileşime girdi, ancak MBP pulldown'larında GST-Sgf11 yoktu ve bunun tersi de geçerliydi (Şekil 2B). Bu sonuçlar, üçlü kompleksin oluşamayacağını ve etkileşimlerin birbirini dışladığını göstermektedir. Bu veriler diğer tahlillerle bağımsız olarak doğrulandı ve ENY2'nin bu komplekslerdeki farklı fonksiyonel rollerini destekledi. Büyük afinite etiketlerinin kendi başlarına sterik engeller getirebileceğine ve karmaşık oluşumu önleyebileceğine dikkat edilmelidir; bu nedenle, sonuç yalnızca birlikte ifade verilerine dayanmamalıdır.
Geleneksel ve birleştirilmiş birlikte ifade pulldown'larının iş akışlarının adım adım karşılaştırılması Şekil 3A'da gösterilmiştir. Birlikte ifade birleştirilmiş açılır menü, az sayıda numuneyle bile en az iki kat daha fazla zaman tasarrufu sağlar ve iyi ölçeklenebilirlik sağlar. CP190 proteininin BTB alanı (1-126aa) ile Drosophila CTCF proteininin (dCTCF) GST etiketli C-terminal alanı (610-818aa) arasındaki aynı etkileşimi incelemek için her iki tekniğin de kullanılmasının sonuçları Şekil 3B'de gösterilmiştir. Her iki yöntem de iyi verimlilik ve tekrarlanabilirlik gösterir (testler üç kopyada gerçekleştirilmiştir); Bu durumda, ko-ekspresyon kuplajlı pulldown, yalnızca GST proteini içeren kontrol örneklerinde görülebileceği gibi, daha düşük spesifik olmayan bağlanma göstermiştir.
Şekil 1: Protokolün şematik gösterimi. Şematik, bu çalışmada kullanılan yöntem iş akışını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Temsili sonuçlar . (A) MBP ve 6xHis-pulldown testlerinde Çinko-parmak ilişkili etki alanı (ZAD) homodimerizasyonunun incelenmesi. MBP (40 kDa) veya 6xHis-Thioredoxin (20 kDa) ile kaynaşmış ZAD'ler, bakteri hücrelerinde birlikte eksprese edildi ve amiloz reçinesi (MBP etiketli proteinleri bağlar) veya Ni-NTA reçinesi (6xHis-etiketli proteinleri bağlar) ile saflaştırılan afinite. Birlikte saflaştırılmış proteinler SDS-PAGE ile görselleştirildi ve ardından Coomassie boyama yapıldı. MBP-pulldown sonuçları üst panellerde gösterilir, 6xHis-pulldown sonuçları alt panellerdedir (birçok ZAD spesifik olmayan bir şekilde Ni-NTA'ya bağlandığından sadece protein ekspresyon kontrolü olarak kullanılır). (B) ENY2 ve Sgf11/CTCF proteinleri arasındaki birbirini dışlayan etkileşimlerin incelenmesi. GST etiketli Sgf11 (1-81aa), MBP etiketli CTCF çinko-parmak alanı (460-631aa) ve 6xHis-etiketli ENY2 proteinleri, amiloz reçinesi, glutatyon reçinesi (GST etiketli proteinleri bağlar) veya Ni-NTA reçinesi ile saflaştırılan çeşitli kombinasyonlarda ve afinitede birlikte eksprese edildi. Birlikte saflaştırılmış proteinler SDS-PAGE ile görselleştirildi ve ardından Coomassie boyama yapıldı. A ve B panellerindeki şekil Bonchuk ve ark.11 ve Bonchuk ve ark.26'nın izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Geleneksel ve birleştirilmiş ortak ifade pulldown tahlillerinin iş akışlarının karşılaştırılması. (A) Geleneksel pulldown testinin iş akışında gerekli zaman aralıklarının, birlikte ifadeye bağlı pulldown'a kıyasla adım adım karşılaştırılması. (B) GST-pulldown tahlillerinde dCTCF C-terminal alanı (610-818aa) ile CP190 proteininin BTB alanı (1-126aa) arasındaki etkileşimi incelemede iki farklı pulldown tekniğinin karşılaştırılması. GST (25kDa) veya GST ile tek başına kaynaştırılan dCTCF (610-818aa) ya bakteri hücrelerinde birlikte eksprese edildi ya da Thioredoxin-6xHis-etiketli CP190 BTB ile in vitro olarak inkübe edildi ve glutatyon reçinesi ile saflaştırıldı. Her tahlilin üç bağımsız kopyası gösterilmiştir. Birlikte saflaştırılmış proteinler SDS-PAGE ile görselleştirildi ve ardından Coomassie boyama yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tarif edilen yöntem, in vitro olarak verimli bir şekilde monte edilemeyen ve birlikte ekspresyon gerektiren protein-protein etkileşimlerinin test edilmesine izin verir. Bu yöntem, homodimerizasyon yeteneğine sahip heterodimerize edici proteinleri incelemek için birkaç uygun yaklaşımdan biridir, çünkü ayrı ayrı saflaştırıldığında, bu tür proteinler deney sırasında çoğu zaman ayrışamayan ve yeniden birleşemeyen kararlı homodimerler oluşturur 3,11.
Tarif edilen yöntemin iş akışı, geleneksel pulldown'a kıyasla daha zaman verimlidir, çünkü etkileşime giren proteinlerin ayrı ayrı saflaştırılması ve sonraki inkübasyonlarının zaman alıcı adımlarından yoksundur. Diğer bir avantaj, proteoliz ve oksidasyona maruz kalırken proteinlerin yapay bir in vitro ortamda bulunduğu daha kısa bir süre ve önemli ölçüde daha az sayıda adım ve daha kısa bir süre nedeniyle daha yüksek bir tekrarlanabilirliktir. Yöntem, diğer in vitro tekniklerin uygun olmadığı tespit edildiğinde çeşitli protein-protein etkileşimlerini incelemek için başarıyla uygulandı 3,11,27. Farklı afinite etiketleri ile paralel birlikte çökeltme, protein ekspresyon seviyesi kontrolü sağlar. Yöntem, geleneksel pulldown'dan daha kolay ve hızlı olduğundan, birlikte ifade kesinlikle gerekli olmasa bile, bunun yerine kullanılabilir. Hücre bozulmasının hızı, toplam süreyi önemli ölçüde artırabilen ve in vitro koşullara ve proteolize maruz kalan ilk ve son numuneler arasındaki çeşitli süreler nedeniyle sonuçlarda bir sapmaya yol açabilen belirgin olmayan bir darboğazdır. Bu nedenle, yüksek verimli çok uçlu sonikatör probların kullanılması şiddetle tavsiye edilir; örnekler için Malzeme Tablosu'na bakın.
Manyetik boncukların kullanılması, spesifik olmayan bağlanmayı azaltabilir ve yöntemi daha da hızlandırarak yıkama adımları için gereken süreyi azaltabilir. Uyumlu kökenlere sahip vektörlerin kullanılması, aynı hedefle çoklu protein etkileşimlerini test etmek için uygun bir kombinatoryal yaklaşım sağladıkları ve her kombinasyon için yeni bir vektör üretilmesini gerektirmedikleri için polisitronik ekspresyona göre bir avantaja sahiptir.
Yöntemin bir dezavantajı, proteinler bakterilerde yüksek konsantrasyonlarda birlikte eksprese edildiğinden, yanlış pozitif sonuçların nispeten yüksek olasılığıdır. Bu nedenle, bu yöntemle keşfedilen beklenmedik etkileşimler dikkatle ele alınmalı ve Y2A veya hücresel teknikler24 gibi bağımsız bir tahlille test edilmelidir, bu da 3,11,28 ortak ekspresyonunu kullanır. Yüksek verimli biyoinformatik yaklaşımlar, karmaşık protein-protein etkileşim ağlarını analiz etmek ve doğrulamak için de kullanılabilir29. Bir başka tuhaf engel, protein komplekslerinin ayrı proteinlere kıyasla tamamen farklı biyokimyasal özelliklere sahip olabileceğidir; kompleks, bileşenleri çözeltide mevcutken çözünmez olabilir. Bu problem tipik olarak proteinlerin uygun çözünürlük etiketine kaynaştırılmasıyla çözülebilir. MBP en etkili olanıdır, NusA ise bir başka iyi çok yönlü alternatif22'dir. GST etiketinin birçok çinko koordine edici etki alanı ile verimli olduğu bulunmuştur, ancak dimerik olduğu için oligomerik alanlarla çalışırken kaçınılmalıdır. Aksine, Thioredoxin ve SUMO gibi küçük monomerik alanlar, multimerik protein alanlarıyla iyi çalışır.
Tarif edilen yöntemin kritik adımları, protein ekspresyonunun uygun zamanı (spesifik olmayan bağlanma gözlenirse daha kısa bir süre gerekirken, zayıf protein ekspresyonunu iyileştirmek için daha uzun inkübasyon süreleri gerekebilir), hızlı hücre bozulması, uygun tampon seçimi ve protokol sırasında sabit sıcaklığın korunmasıdır. İndüksiyondan sonra aşırı inkübasyon süreleri, bakterilerde protein agregasyonuna neden olabilir ve bu da yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. Öte yandan, bazı proteinlerin yeterli miktarlarda ifade edilmesi için daha fazla zamana ihtiyaç duyar. Sonikasyon ve yıkama adımları sırasında sıcaklık dalgalanmaları, tampon pH ve protein çökelmesinde değişikliklere neden olabilir. Uygun olmayan tampon seçimi de spesifik olmayan protein agregasyonuna neden olabilir.
Zayıf protein ekspresyonu durumunda, farklı çözünürlük etiketleri denenmeli ve indüksiyondan sonra inkübasyon süresi artmalıdır. Spesifik olmayan güçlü bir ilişki gözlenirse, proteinlerin reçine veya afinite etiketi ile olası spesifik olmayan ilişkisini belirlemek için gerekli tüm negatif kontroller yapılmalıdır. Denetimlerin çalışmaması durumunda, benzeşim etiketlerinin farklı kombinasyonları denenmeli ve farklı arabellekler kullanılmalıdır. Birçok protein, bu makalede bahsedilen metal şelatlama reçinesi benzeri ZAD'lere spesifik olmayan bir şekilde bağlanma eğilimindedir; Bu gibi durumlarda, MBP / GST-pulldown, genel olarak, yalnızca protein ekspresyon kontrolü için kullanılabilecek karşılıklı bir deney olmadan yeterli olacaktır. Negatif kontroller iyi çalışırsa, protein ekspresyon süresi azaltılmalı ve tampon sistemi ve indirgeyici ajan değişmeli veya indirgeyici ajan konsantrasyonu artmalıdır, özellikle sistein bakımından zengin proteinlerle çalışırken. Sonuçların zayıf tekrarlanabilirliği durumunda, hızlı ancak aşırı ısınmadan gerçekleştirilmesi gereken hücre bozulma adımına dikkat edilmelidir. Sıcaklık tüm deney boyunca izlenmelidir.
Bu yöntem, multiprotein komplekslerini veya ribonükleoproteinleri incelemek için kolayca değiştirilebilir. Bir diğer olası uygulama, sonraki çalışmalar için protein kompleks ekspresyonu ve saflaştırma koşullarının toplu olarak test edilmesidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Rus Bilim Vakfı'nın 19-74-30026 (yöntem geliştirme ve doğrulama) ve 19-74-10099 (protein-protein etkileşim tahlilleri) projeleri tarafından desteklenmiştir; ve Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Öğretim Bakanlığı tarafından 075-15-2019-1661 (temsili protein-protein etkileşimlerinin analizi) hibesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S.
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
- Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
- Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
- Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
- Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G.
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
- Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
- Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
- Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
- Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
- Lariviere, L., et al.
- Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
- Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
- Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
- Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
- Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
- Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
- Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
- Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
- Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
- Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
- Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
- Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
- Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
- Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
- Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
- Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).
