Summary
هنا ، نصف طريقة للتعبير البكتيري المشترك للبروتينات الموسومة تفاضليا باستخدام مجموعة من النواقل المتوافقة ، تليها تقنيات السحب التقليدية لدراسة مجمعات البروتين التي لا يمكن أن تتجمع في المختبر.
Abstract
Pulldown هو اختبار تفاعل البروتين والبروتين سهل الاستخدام ويستخدم على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن لها قيودا في دراسة مجمعات البروتين التي لا تتجمع بشكل فعال في المختبر. قد تتطلب هذه المجمعات تجميعا متعديا مشتركا ووجود مرافقين جزيئيين ؛ إما أنها تشكل أوليغومرات مستقرة لا يمكنها الانفصال وإعادة الارتباط في المختبر أو تكون غير مستقرة بدون شريك ملزم. للتغلب على هذه المشاكل ، من الممكن استخدام طريقة تعتمد على التعبير المشترك البكتيري للبروتينات الموسومة بشكل تفاضلي باستخدام مجموعة من النواقل المتوافقة متبوعة بتقنيات السحب التقليدية. يعد سير العمل أكثر كفاءة من حيث الوقت مقارنة بالقائمة المنسدلة التقليدية لأنه يفتقر إلى الخطوات التي تستغرق وقتا طويلا للتنقية المنفصلة للبروتينات المتفاعلة وحضانتها التالية. ميزة أخرى هي قابلية استنساخ أعلى بسبب عدد أقل بكثير من الخطوات وفترة زمنية أقصر تتعرض فيها البروتينات الموجودة في البيئة في المختبر للتحلل البروتيني والأكسدة. تم تطبيق الطريقة بنجاح لدراسة عدد من تفاعلات البروتين والبروتين عندما وجد أن التقنيات الأخرى في المختبر غير مناسبة. يمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار تفاعلات البروتين والبروتين على دفعات. تظهر النتائج التمثيلية لدراسات التفاعلات بين مجال BTB والبروتينات المضطربة جوهريا ، و heterodimers من المجالات المرتبطة بإصبع الزنك.
Introduction
يستخدم السحب التقليدي على نطاق واسع لدراسة تفاعلات البروتينوالبروتين 1. ومع ذلك ، غالبا ما لا تتفاعل البروتينات النقية بشكل فعال في المختبر2,3 ، وبعضها غير قابل للذوبان بدون شريكهاالملزم 4,5. قد تتطلب هذه البروتينات تجميعا متعديا مشتركا أو وجود مرافقين جزيئيين5،6،7،8،9. هناك قيد آخر للسحب التقليدي وهو اختبار نشاط التعدد غير المتجانس المحتمل بين المجالات التي يمكن أن توجد كمتجانسات متجانسة مستقرة مجمعة بشكل مشترك8،10 ، حيث لا يمكن للعديد منها الانفصال وإعادة الارتباط في المختبر خلال وقت الحضانة. وجد أن التعبير المشترك مفيد في التغلب على مثل هذه المشاكل 3,11. تم استخدام التعبير المشترك باستخدام النواقل المتوافقة في البكتيريا بنجاح لتنقية المجمعات الجزيئية الكبيرة متعددة الوحدات الفرعية ، بما في ذلك المركب القمعي متعدد المشبك PRC2 12 ، وحدة رأس وسيط RNA polymeraseII 13 ، صفيحة الأساس للبكتيريا T414 ، وحدة deubiquitinylase المعقدة SAGA15،16 ، والفيريتين17. أصول النسخ المتماثل المستخدمة بشكل شائع للتعبير المشترك هي ColE1 و p15A18 و CloDF1319 و RSF20. في نظام التعبير Duet المتاح تجاريا ، يتم دمج هذه الأصول مع جينات مقاومة مختلفة للمضادات الحيوية ومواقع استنساخ متعددة ملائمة لإنتاج ناقلات polycistronic ، مما يسمح بالتعبير عن ما يصل إلى ثمانية بروتينات. هذه الأصول لها أرقام نسخ مختلفة ويمكن استخدامها في مجموعات مختلفة لتحقيق مستويات تعبير متوازنة للبروتينات المستهدفة21. لاختبار تفاعلات البروتين والبروتين ، يتم استخدام علامات تقارب مختلفة ؛ الأكثر شيوعا هي 6xHistidine و glutathione-S-transferase (GST) وبروتين ربط المالتوز (MBP) ، ولكل منها تقارب محدد مع الراتنج المقابل. تعمل GST و MBP أيضا على تعزيز قابلية ذوبان واستقرار البروتينات الموسومة22.
كما تم تطوير عدد من الطرق التي تنطوي على التعبير المشترك للبروتين في الخلايا حقيقية النواة ، وأبرزها مقايسة الخميرة ثنائية الهجين (Y2H) 23. اختبار Y2H رخيص وسهل ويسمح باختبار تفاعلات متعددة ؛ ومع ذلك ، يستغرق سير العمل أكثر من 1 أسبوع لإكماله. هناك أيضا عدد قليل من المقايسات القائمة على خلايا الثدييات الأقل استخداما ، على سبيل المثال ، مقايسة الفلورسنت ثنائية الهجين (F2H) 24 ومقايسة تفاعل البروتين والبروتين في مجموعة الخلايا (CAPPIA) 25. اختبار F2H سريع نسبيا ، مما يسمح بمراقبة تفاعلات البروتين في بيئتها الخلوية الأصلية ، ولكنه يتضمن استخدام معدات تصوير باهظة الثمن. كل هذه الطرق لها ميزة على التعبير بدائية النواة التي توفر الترجمة حقيقية النواة الأصلية وبيئة قابلة للطي. ومع ذلك ، فإنها تكتشف التفاعل بشكل غير مباشر ، إما عن طريق التنشيط النسخي أو عن طريق نقل الطاقة الفلورية ، والتي غالبا ما تنتج القطع الأثرية. أيضا ، قد تحتوي الخلايا حقيقية النواة على شركاء تفاعل آخرين للبروتينات ذات الأهمية ، والتي يمكن أن تتداخل مع اختبار التفاعلات الثنائية بين بروتينات حقيقيات النوى العليا.
تصف الدراسة الحالية طريقة للتعبير المشترك البكتيري للبروتينات الموسومة بشكل تفاضلي تليها تقنيات السحب التقليدية. تسمح هذه الطريقة بدراسة التفاعلات بين البروتينات المستهدفة التي تتطلب التعبير المشترك. إنه أكثر كفاءة من حيث الوقت مقارنة بالسحب التقليدي ، مما يسمح باختبار الدفعات لأهداف متعددة ، مما يجعله مفيدا في معظم الحالات. يعد التعبير المشترك باستخدام المتجهات المتوافقة أكثر ملاءمة من التعبير المشترك متعدد السيسترونيك لأنه لا يتطلب خطوة استنساخ شاقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يظهر التمثيل التخطيطي لسير عمل الطريقة في الشكل 1.
1. التحول المشترك للإشريكية القولونية
- تحضير متجهات التعبير للبروتينات المستهدفة باستخدام طرق الاستنساخ القياسية.
ملاحظة: عادة ما تكون نقطة البداية الجيدة هي استخدام نواقل pGEX / pMAL التقليدية التي تحمل جين مقاومة الأمبيسلين وأصل ColE1 للتعبير عن البروتينات الموسومة ب GST / MBP وناقل متوافق مع أصل p15A أو RSF ومقاومة الكانامايسين للتعبير عن البروتينات الموسومة ب 6xHis، في بعض الحالات مقترنة إما بثيوريدوكسين أو علامة SUMO لزيادة الذوبان. عادة ، يجب اختبار عدة مجموعات من العلامات قبل التجربة. الطريقة الموصوفة نفسها ملائمة لاختبار الدفعات لظروف التعبير عن البروتينات المستهدفة. من المهم ملاحظة أن معظم سلالات رشيد تحتوي بالفعل على البلازميد مع أصل p15A للتعبير عن tRNAs للكودون النادر ؛ وبالتالي إذا كان استخدام مثل هذه السلالات خيارا ممكنا ، فيجب تجنب البلازميدات p15A. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل.- تنمو البكتيريا من سلالة مناسبة في وسط Luria-Bertani (LB) عند 37 درجة مئوية إلى كثافة بصرية (OD) من 0.1-0.2. تم استخدام سلالة BL21 (DE3) كأمثلة في هذه الدراسة.
ملاحظة: يوصى باستخدام خلايا مختصة معدة حديثا لتحقيق التحول المشترك الفعال مع متجهين. إذا كانت هناك حاجة إلى تحويل أكثر من متجهين ، فمن الأفضل تحويلهما بالتتابع لتحقيق كفاءة تحويل جيدة. التثقيب الكهربائي هو بديل جيد. - جهاز طرد مركزي 1.0 مل من المعلق البكتيري لمدة دقيقة واحدة عند 9000 × جم عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
- أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت لتحويل المخزن المؤقت البارد (TB) (10 mM MOPS [pH 6.7] ، 250 mM KCl ، 55 mM MnCl 2 ، و 15 mM CaCl2) واحتضانها لمدة 10 دقائق على الجليد.
- أجهزة طرد مركزي لمدة 30 ثانية عند 8000 × جم عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول السل ، وأضف 100 نانوغرام من كل ناقل ، واحتضن لمدة 30 دقيقة على الجليد. تحويل النواقل المفردة بشكل منفصل لدراسة سلوك البروتين دون التعبير المشترك. بالإضافة إلى ذلك، التحويل المشترك لمتجهات التعبير في أزواج مع متجهات التعبير المشترك الفارغة لعناصر تحكم الربط غير المحددة.
ملاحظة: في الأمثلة المقدمة في هذه الدراسة ، تم استخدام نواقل pGEX / pMAL مع cDNAs المقابلة المدمجة في GST / MBP cDNAs بالاشتراك مع ناقلات متوافقة مشتقة من pACYC تحمل مجالات بروتين شريك ترميز cDNA مدمجة في Thioredoxin cDNA. - يسخن على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 150 ثانية ، ثم يبرد لمدة 1 دقيقة على الثلج.
- أضف 1 مل من السائل LB Media بدون مضادات حيوية واحتضانه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. لوحة على صفائح LB-agar تحتوي على 0.5٪ جلوكوز والمضادات الحيوية المقابلة (التركيزات الشائعة هي: 50 ملغم / لتر أمبيسلين ؛ 20 ملغ / لتر كاناميسين ؛ 50 ملغ / لتر ستربتومايسين ؛ 35 ملغ / لتر كلورامفينيكول). احتضان الأطباق طوال الليل على حرارة 37 درجة مئوية.
- تنمو البكتيريا من سلالة مناسبة في وسط Luria-Bertani (LB) عند 37 درجة مئوية إلى كثافة بصرية (OD) من 0.1-0.2. تم استخدام سلالة BL21 (DE3) كأمثلة في هذه الدراسة.
2. التعبير
- اغسل الخلايا من الصفيحة ب 2 مل من وسائط LB السائلة إلى 50 مل من وسائط LB مع المضادات الحيوية المقابلة (التركيزات الشائعة هي: 50 مجم / لتر أمبيسيلين ؛ 20 مجم / لتر كاناميسين ؛ 50 مجم / لتر ستربتومايسين ؛ 35 مجم / لتر كلورامفينيكول). أضف أيونات المعادن أو غيرها من العوامل المساعدة المعروفة (في الأمثلة المقدمة في هذه الدراسة ، تمت إضافة 0.2 mM ZnCl2 إلى الوسائط). قم بتخزين القسمة مع 20٪ من الجلسرين عند -70 درجة مئوية لتكرار التجربة لاحقا.
ملاحظة: يوصى بطرد العديد من المستعمرات مباشرة من اللوحة لاستبعاد إمكانية التعبير السيئ في استنساخ واحد معزول بسبب أحداث إعادة التركيب العرضية بين اثنين من البلازميدات. - قم بتنمية الخلايا بدوران ثابت يبلغ 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية إلى OD من 0.5-0.7 ، وتبرد إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ، وأضف الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى 1 mM. قم بتخزين حصة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية كعنصر تحكم في العينة غير المستحثة.
- احتضان الخلايا مع دوران ثابت من 220 دورة في الدقيقة عند 18 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: قد يختلف الوقت الأمثل ودرجة حرارة الحضانة. 18 درجة مئوية بين عشية وضحاها يعمل بشكل أفضل لمعظم البروتينات وينصح بتجربتها افتراضيا. تقليل وقت الحضانة إلى 2-3 ساعات إذا لوحظ ارتباط قوي غير محدد. - قسم المعلق البكتيري إلى جزأين (أو أكثر إذا تم استخدام أكثر من علامتين مختلفتين) وقم بتخزين حصة 20 ميكرولتر من معلق الخلية لتأكيد تعبير البروتين. جهاز طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: نقطة التوقف: يمكن تخزين الكريات البكتيرية في -70 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.
3. مقايسة القائمة المنسدلة
ملاحظة: يتم وصف الإجراءات التفصيلية للبروتينات الموسومة إما ب 6xhis أو MBP / GST. يتم تنفيذ جميع الإجراءات عند 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق الكريات البكتيرية في 1 مل من محلول التحلل المثلج البارد مع مثبطات الأنزيم البروتيني وعوامل الاختزال (انظر أدناه) المضافة مباشرة قبل التجربة. تجنب ديثيوتريتول (DTT) عند استخدام راتنجات مخلبية معدنية لأنه يزيل أيونات المعادن. اضبط تركيبة المخزن المؤقت للبروتينات المختبرة. الوصفات الشائعة لمخازن التحلل التي تم العثور عليها مناسبة لمعظم البروتينات هي:
- 6xHis-pulldown: امزج 30 مللي مول HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 400 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي مول إيميدازول ، 0.1٪ NP40 ، 10٪ [وزن / وزن] جلسرين ، 5 مللي مول بيتا ميركابتوإيثانول ، 1 مللي متر فينيل ميثيل فولفونيل فلوريد (PMSF) ، وتخفيف 1: 1000 من كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني (انظر جدول المواد).
- GST- أو MBP-pulldown: امزج 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ، 150 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي مول KCl ، 10 مللي مول MgCl 2 ، 0.1 مللي مول ZnCl2 ، 0.1٪ NP40 ، 10٪ [وزن / وزن] جلسرين ، 5 مللي متر DTT ، 1 مللي مول PMSF ، وتخفيف 1: 1000 من كوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني (انظر جدول المواد).
- تعطيل الخلايا عن طريق صوتنة على الجليد. تخزين حصص 20 ميكرولتر للكهربائي.
ملاحظة: عادة ، يلزم 20-25 نبضة من 5 ثوان مع فترات 15 ثانية مع طاقة خرج 20 واط لكل عينة. يجب ضبط قوة الصوتنة المناسبة لكل أداة لتجنب ارتفاع درجة الحرارة وضمان تعطيل الخلية بالكامل. لتحقيق أداء أفضل ، يوصى بشدة باستخدام مجسات صوتي متعددة الأطراف عالية الإنتاجية. - جهاز طرد مركزي عند 20000 × جرام لمدة 30 دقيقة. اجمع 20 ميكرولتر من المحللة الموضحة لتحليل SDS-PAGE اللاحق.
- قم بموازنة الراتنج (50 ميكرولتر لكل عينة) مع 1 مل من محلول تحلل الثلج البارد لمدة 10 دقائق ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية.
- أضف محللات الخلايا (تركيز البروتين الكلي: 20-50 مجم / مل) إلى الراتنج ، واحتضانها لمدة 10 دقائق عند دوران ثابت يبلغ 15 دورة في الدقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية. اجمع 20 ميكرولتر من الكسر غير المنضم لتحليل SDS-PAGE اللاحق.
- أضف 1 مل من محلول الغسيل المثلج والاحتضان لمدة دقيقة واحدة. أجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية. الوصفات الشائعة لمخازن الغسيل هي:
- 6xHis-pulldown: مزيج 30 مللي متر HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 400 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 30 مللي متر إيميدازول ، 0.1٪ NP40 ، 10٪ [وزن / وزن] الجلسرين ، و 5 مللي متر بيتا ميركابتوإيثانول.
- GST- أو MBP-pulldown: امزج 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ، 500 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي مول KCl ، 10 مللي مول MgCl 2 ، 0.1 مللي مول ZnCl2 ، 0.1٪ NP40 ، 10٪ [وزن / وزن] الجلسرين ، و 5 مللي متر DTT.
- قم بإجراء غسلتين طويلتين: أضف 1 مل من محلول الغسيل المثلج ، واحتضانه لمدة 10-30 دقيقة مع دوران ثابت يبلغ 15 دورة في الدقيقة ، وأجهزة طرد مركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية.
- أضف 1 مل من محلول الغسيل المثلج ، واحتضانه لمدة دقيقة واحدة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية.
- قم بإزالة البروتينات المرتبطة ب 50 ميكرولتر من محلول الشطف في شاكر عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. الوصفات الشائعة لمخازن الشطف هي:
- 6xHis-pulldown: امزج 30 مللي متر HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 400 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 300 مللي متر إيميدازول ، و 5 مللي متر بيتا ميركابتوإيثانول.
- سحب ضريبة السلع والخدمات: 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ، 150 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 50 مللي مول الجلوتاثيون (المعدل إلى الرقم الهيدروجيني 7.5 مع Tris الأساسي) ، و 5 مللي متر DTT.
- MBP-pulldown: امزج 20 مللي متر تريس (درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية) ، 150 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 40 مللي متر مالتوز ، و 5 مللي متر DTT.
- تحليل البروتينات المستخلصة باستخدام SDS-PAGE.
ملاحظة: يجب تعديل نسبة مادة الأكريلاميد حسب حجم البروتينات. في الأمثلة المقدمة في هذه الدراسة ، تم استخدام 12٪ من المواد الهلامية الأكريلاميد ، تعمل في محلول tris-glycine-SDS (2 mM Tris ، 250 mM Glycine ، 0.1٪ SDS) بجهد ثابت يبلغ 180 فولت. تم تلطيخ المواد الهلامية بالغليان في 0.2٪ Coomassie blue R250 ، و 10٪ حمض الخليك ، و 30٪ إيزوبروبانول ، وإزالة تلطيخها بالغليان في 10٪ حمض الأسيتيك. يجب ألا تكون كمية البروتين المحمل متساوية ، حيث يمكن سحب كميات مختلفة من البروتينات المتفاعلة في تجارب مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام الطريقة الموصوفة بشكل روتيني مع العديد من الأهداف المختلفة. تظهر هنا بعض النتائج التمثيلية التي من المحتمل ألا يمكن الحصول عليها باستخدام تقنيات السحب التقليدية. الأول هو دراسة DIMERIZATION محددة ZAD (المجال المرتبط بإصبع الزنك)11. تشكل ZADs ثنائيات مستقرة ومحددة ، مع إمكانية التغاير فقط بين المجالات ذات الصلة الوثيقة داخل المجموعات المتشابهة. الثنائيات التي تشكلها هذه المجالات مستقرة ولا تنفصل لبضعة أيام على الأقل ؛ وبالتالي ، فإن خلط ZADs المنقى لا ينتج عنه أي ربط يمكن اكتشافه. في الوقت نفسه ، يظهر التعبير المشترك ل MBP و Thioredoxin-6xHis-fused ZADs نشاطا جيدا وقابلا للتكرار (الشكل 2 أ) ، يظهر كنطاق إضافي في نتائج SDS-PAGE لمقايسة MBP-pulldown. يمكن رؤية جزء صغير من heterodimers مع M1BP معبرا عنها بشكل مشترك مع مجال آخر. لم يتم تأكيد هذا التفاعل مع Y2A وعلى الأرجح هو نتيجة لارتباط غير محدد بسبب ارتفاع تركيز البروتين ، لأن هذه المجالات غنية بالسيستين وعرضة للغاية للتجميع. والجدير بالذكر ، في هذه الحالة ، أن السحب 6xHis غير مناسب لأن ZADs هي مجالات تنسيق معدنية لا ترتبط على وجه التحديد بالراتنج المخلب المعدني. يجب فحص هذا النشاط بعناية في تجربة موازية.
مثال آخر هو اختبار المنافسة بين بروتين ENY2 وشركائه الملزمين Sgf11 (1-83aa) ومجال إصبع الزنك (460-631 aa) لبروتين CTCF26. عند التعبير عنه بمفرده ، يشكل بروتين ENY2 ثنائيات تمنعه من التفاعل مع شركائه الملزمين الأصليين. من المفترض أن كلا من بروتينات Sgf11 و CTCF ترتبط بنفس السطح الجزيئي ل ENY2 ، مما يجعل تفاعلها متعارضا. في مقايسة التعبير المشترك ، تفاعل ENY2 الموسوم 6xHisمع كل من Sgf11 و MBP-CTCF الموسوم بضريبة السلع والخدمات ، ولكن لم يكن GST-Sgf11 موجودا في عمليات سحب MBP والعكس صحيح ، (الشكل 2B). تشير هذه النتائج إلى أنه لا يمكن تشكيل مركب ثلاثي ، وأن التفاعلات يستبعد بعضها بعضا. تم تأكيد هذه البيانات بشكل مستقل مع فحوصات أخرى ودعم الأدوار الوظيفية المختلفة ل ENY2 في هذه المجمعات. يجب لفت الانتباه إلى حقيقة أن علامات التقارب الكبيرة يمكن أن تفرض عوائق صارمة في حد ذاتها ، مما يمنع التكوين المعقد ؛ لذلك ، لا ينبغي أن يستند الاستنتاج فقط إلى بيانات التعبير المشترك.
تظهر مقارنة خطوة بخطوة لسير عمل عمليات السحب التقليدية والمقترنة للتعبير المشترك في الشكل 3 أ. يعد الرسم المنسدل المقترن بالتعبير المشترك أكثر كفاءة من حيث الوقت مرتين على الأقل ، حتى مع وجود عدد صغير من العينات ، ويسمح بقابلية جيدة للتوسع. نتائج استخدام كلتا التقنيتين لدراسة نفس التفاعل بين مجال BTB لبروتين CP190 (1-126aa) والمجال الطرفي C الموسوم بضريبة السلع والخدمات (610-818aa) لبروتين ذبابة الفاكهة CTCF (dCTCF) موضحة في الشكل 3B. تظهر كلتا الطريقتين كفاءة جيدة وقابلية للتكرار (تم إجراء المقايسات في ثلاث نسخ متماثلة) ؛ في هذه الحالة ، أظهر الرسم المنسدل المقترن بالتعبير المشترك ارتباطا أقل غير محدد ، كما يمكن رؤيته في عينات التحكم مع بروتين GST وحده.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للبروتوكول. يوضح الرسم التخطيطي طريقة سير العمل المستخدمة في هذه الدراسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج التمثيلية . (أ) دراسة تجانس المجال المرتبط بإصبع الزنك (ZAD) في مقايسات MBP- و 6xHis-pulldown. تم دمج ZADs إما مع MBP (40 كيلو دالتون) أو مع 6xHis-Thioredoxin (20 كيلو دالتون) تم التعبير عنها بشكل مشترك في خلايا البكتيريا وتقارب منقى براتنج الأميلوز (يربط البروتينات الموسومة ب MBP) أو مع راتنج Ni-NTA (يربط البروتينات الموسومة 6xHis). تم تصور البروتينات المنقاة المشتركة باستخدام SDS-PAGE متبوعة بتلوين Coomasie. تظهر نتائج السحب MBP في اللوحات العلوية ، ونتائج السحب 6xHis-في الألواح السفلية (تستخدم فقط كتحكم في التعبير عن البروتين نظرا لأن العديد من ZADs ترتبط بشكل غير محدد ب Ni-NTA). (ب) دراسة التفاعلات الحصرية المتبادلة بين بروتينات ENY2 و Sgf11 / CTCF. تم التعبير عن Sgf11 (1-81aa) الموسومة بضريبة السلع والخدمات ، ومجال إصبع الزنك CTCF الموسوم ب MBP (460-631aa) ، وبروتينات ENY2 الموسومة ب 6xHis-His في مجموعات مختلفة وتقارب منقى براتنج الأميلوز أو راتنج الجلوتاثيون (يربط البروتينات الموسومة ب GST) أو مع راتنج Ni-NTA. تم تصور البروتينات المنقاة المشتركة باستخدام SDS-PAGE متبوعة بتلوين Coomasie. وقد عدل الشكل الوارد في اللوحتين ألف وباء بإذن من بونشوك وآخرين 11 وبونشوك وآخرون 26. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة سير عمل مقايسات القائمة المنسدلة التقليدية والمقترنة. (أ) مقارنة خطوة بخطوة للفترات الزمنية المطلوبة في سير عمل مقايسة القائمة المنسدلة التقليدية مقارنة بالقائمة المنسدلة المقترنة بالتعبير المشترك. (ب) مقارنة بين تقنيتين مختلفتين للسحب في دراسة التفاعل بين المجال الطرفي C dCTCF (610-818aa) ومجال BTB لبروتين CP190 (1-126aa) في مقايسات سحب ضريبة السلع والخدمات. dCTCF (610-818aa) المنصهر مع GST (25kDa) أو GST وحده إما تم التعبير عنه بشكل مشترك في خلايا البكتيريا أو تم تحضينه في المختبر مع Thioredoxin-6xHis-Taged CP190 BTB وتقارب منقى براتنج الجلوتاثيون. يتم عرض ثلاث نسخ مكررة مستقلة لكل فحص. تم تصور البروتينات المنقاة المشتركة باستخدام SDS-PAGE متبوعة بتلوين Coomasie. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تسمح الطريقة الموصوفة باختبار تفاعلات البروتين والبروتين التي لا يمكن تجميعها بكفاءة في المختبر وتتطلب تعبيرا مشتركا. هذه الطريقة هي واحدة من الطرق القليلة المناسبة لدراسة البروتينات غير المتجانسة ، والتي هي أيضا قادرة على homodimerization لأنه ، عند تنقيتها بشكل منفصل ، تشكل هذه البروتينات homodimers مستقرة والتي في معظم الأحيان لا يمكن أن تنفصل وتعيد الارتباط خلال التجربة 3,11.
يعد سير عمل الطريقة الموصوفة أكثر كفاءة من حيث الوقت مقارنة بالسحب التقليدي لأنه يفتقر إلى الخطوات التي تستغرق وقتا طويلا للتنقية المنفصلة للبروتينات المتفاعلة وحضانتها التالية. ميزة أخرى هي قابلية استنساخ أعلى ، بسبب عدد أقل بكثير من الخطوات وفترة زمنية أقصر توجد فيها البروتينات داخل بيئة اصطناعية في المختبر أثناء تعرضها للتحلل البروتيني والأكسدة. تم تطبيق الطريقة بنجاح لدراسة العديد من تفاعلات البروتين والبروتين عندما وجد أن التقنيات الأخرى في المختبر غير مناسبة3،11،27. يوفر الترسيب المشترك المتوازي مع علامات التقارب المختلفة التحكم في مستوى تعبير البروتين. نظرا لأن الطريقة أسهل وأسرع من القائمة المنسدلة التقليدية ، فيمكن استخدامها بدلا من ذلك ، حتى لو لم يكن التعبير المشترك مطلوبا تماما. سرعة اضطراب الخلايا هي عنق زجاجة غير واضح يمكن أن يزيد بشكل كبير من الوقت الإجمالي ويمكن أن يؤدي إلى انحراف في النتائج ، بسبب مقدار الوقت المختلف بين العينات الأولى والأخيرة التي تتعرض لها في ظروف المختبر والتحلل البروتيني. وبالتالي ، يوصى بشدة باستخدام مجسات صوتي متعددة الأطراف عالية الإنتاجية ؛ انظر جدول المواد للحصول على أمثلة.
يمكن أن يؤدي استخدام الخرز المغناطيسي إلى تقليل الارتباط غير المحدد وزيادة تسريع الطريقة ، مما يقلل من الوقت اللازم لخطوات الغسيل. إن استخدام المتجهات ذات الأصول المتوافقة له ميزة على التعبير متعدد السيسترونيك لأنها توفر نهجا اندماجيا مناسبا لاختبار تفاعلات بروتينية متعددة مع نفس الهدف ولا تتطلب إنتاج ناقل جديد لكل مجموعة.
عيب هذه الطريقة هو الاحتمال الكبير نسبيا للنتائج الإيجابية الكاذبة ، حيث يتم التعبير عن البروتينات بشكل مشترك في البكتيريا بتركيزات عالية. وبالتالي ، يجب التعامل مع التفاعلات غير المتوقعة التي تم اكتشافها بواسطة هذه الطريقة بحذر واختبارها باستخدام فحص مستقل ، مثل Y2A أو التقنيات الخلوية24 ، والتي تستخدم أيضا التعبير المشترك3،11،28. يمكن أيضا استخدام مناهج المعلوماتية الحيوية عالية الإنتاجية لتحليل شبكات التفاعل المعقدة بين البروتين والبروتينوالتحقق من صحتها 29. عقبة غريبة أخرى هي أن مجمعات البروتين قد يكون لها خصائص كيميائية حيوية مختلفة تماما مقارنة بالبروتينات المنفصلة. قد يكون المركب غير قابل للذوبان أثناء وجود مكوناته في المحلول. يمكن حل هذه المشكلة عادة عن طريق دمج البروتينات في علامة الذوبانية المناسبة. MBP هو الأكثر فعالية ، في حين أن NusA هو بديل شامل جيدآخر 22. تم العثور على علامة GST لتكون فعالة مع العديد من مجالات تنسيق الزنك ، على الرغم من أنها dimeric ، يجب تجنبها عند العمل مع مجالات oligomeric. على العكس من ذلك ، تعمل المجالات الأحادية الصغيرة مثل Thioredoxin و SUMO بشكل جيد مع مجالات البروتين متعدد الميريك.
الخطوات الحاسمة للطريقة الموصوفة هي الوقت المناسب للتعبير عن البروتين (مطلوب وقت أقصر إذا لوحظ ارتباط غير محدد ، بينما قد تكون هناك حاجة إلى أوقات حضانة أطول لتحسين التعبير الضعيف للبروتين) ، وتعطيل الخلايا السريع ، والاختيار الصحيح للمخازن المؤقتة ، والحفاظ على درجة حرارة ثابتة أثناء البروتوكول. قد تؤدي أوقات الحضانة المفرطة بعد الحث إلى تراكم البروتين في البكتيريا ، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة. من ناحية أخرى ، تتطلب بعض البروتينات مزيدا من الوقت للتعبير عنها بكميات كافية. قد تؤدي تقلبات درجة الحرارة أثناء خطوات الصوتنة والغسيل إلى تغيرات في درجة الحموضة العازلة وترسيب البروتين. قد يؤدي اختيار المخزن المؤقت غير الصحيح أيضا إلى تراكم بروتين غير محدد.
في حالة ضعف التعبير عن البروتين ، يجب محاولة علامات الذوبان المختلفة ، وكذلك زيادة وقت الحضانة بعد الحث. إذا لوحظ ارتباط قوي غير محدد ، فيجب تشغيل جميع الضوابط السلبية اللازمة لتحديد الارتباط غير المحدد المحتمل للبروتينات مع الراتنج أو علامة التقارب. في حالة عدم عمل عناصر التحكم ، يجب محاولة مجموعات مختلفة من علامات التقارب واستخدام مخازن مؤقتة مختلفة. تميل العديد من البروتينات إلى الارتباط بشكل غير محدد ب ZADs الشبيهة بالراتنج المخلب المذكور في هذه المقالة. في مثل هذه الحالات ، سيكون سحب MBP / GST ، بشكل عام ، كافيا بدون تجربة متبادلة يمكن استخدامها فقط للتحكم في تعبير البروتين. إذا كانت الضوابط السلبية تعمل بشكل جيد ، فيجب تقليل وقت التعبير عن البروتين ، وتغيير نظام المخزن المؤقت وعامل الاختزال أو زيادة تركيز عامل الاختزال ، خاصة عند العمل مع البروتينات الغنية بالسيستين. في حالة ضعف استنساخ النتائج ، يجب الانتباه إلى خطوة تعطيل الخلية ، والتي يجب إجراؤها بسرعة ولكن دون ارتفاع درجة الحرارة. يجب مراقبة درجة الحرارة طوال التجربة بأكملها.
يمكن تعديل هذه الطريقة بسهولة لدراسة مجمعات البروتينات المتعددة أو البروتينات النووية الريبية. تطبيق آخر ممكن هو اختبار دفعة التعبير المركب للبروتين وظروف تنقية للدراسات اللاحقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل مشاريع مؤسسة العلوم الروسية 19-74-30026 (تطوير الطريقة والتحقق من صحتها) و 19-74-10099 (مقايسات التفاعل بين البروتين والبروتين) ؛ ومن قبل وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي - منحة 075-15-2019-1661 (تحليل تفاعلات البروتين والبروتين التمثيلية).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S.
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
- Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
- Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
- Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
- Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G.
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
- Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
- Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
- Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
- Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
- Lariviere, L., et al.
- Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
- Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
- Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
- Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
- Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
- Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
- Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
- Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
- Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
- Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
- Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
- Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
- Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
- Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
- Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
- Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).
