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Biochemistry

चुनौतीपूर्ण प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के परीक्षण के लिए एक समय-कुशल उपकरण के रूप में बैक्टीरिया कोशिकाओं में सह-अभिव्यक्ति के साथ युग्मित पुलडाउन परख

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64541
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 2, 1
1Department of the Control of Genetic Processes, Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, 2Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences

Summary

यहां, हम संगत वैक्टर के एक सेट का उपयोग करके अलग-अलग टैग किए गए प्रोटीन की जीवाणु सह-अभिव्यक्ति के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, इसके बाद प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक पुलडाउन तकनीकें हैं जो विट्रो में इकट्ठा नहीं हो सकती हैं।

Abstract

पुलडाउन एक आसान और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परख है। हालांकि, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का अध्ययन करने में इसकी सीमाएं हैं जो विट्रो में प्रभावी ढंग से इकट्ठा नहीं होती हैं। ऐसे परिसरों को सह-ट्रांसलेशनल असेंबली और आणविक चैपरोन की उपस्थिति की आवश्यकता हो सकती है; या तो वे स्थिर ऑलिगोमर्स बनाते हैं जो विट्रो में अलग और फिर से जुड़ नहीं सकते हैं या बाध्यकारी साथी के बिना अस्थिर हैं। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, पारंपरिक पुलडाउन तकनीकों के बाद संगत वैक्टर के एक सेट का उपयोग करके अलग-अलग टैग किए गए प्रोटीन की जीवाणु सह-अभिव्यक्ति के आधार पर एक विधि का उपयोग करना संभव है। वर्कफ़्लो पारंपरिक पुलडाउन की तुलना में अधिक समय-कुशल है क्योंकि इसमें बातचीत करने वाले प्रोटीन और उनके निम्नलिखित इनक्यूबेशन के अलग-अलग शुद्धिकरण के समय लेने वाले चरणों का अभाव है। एक और लाभ यह है कि चरणों की काफी कम संख्या और कम समय के कारण उच्च प्रजनन क्षमता है जिसमें इन विट्रो वातावरण के भीतर मौजूद प्रोटीन प्रोटियोलिसिस और ऑक्सीकरण के संपर्क में आते हैं। इस विधि को कई प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था जब अन्य इन विट्रो तकनीकों को अनुपयुक्त पाया गया था। विधि का उपयोग बैच परीक्षण प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए किया जा सकता है। प्रतिनिधि परिणाम बीटीबी डोमेन और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन और जिंक-फिंगर से जुड़े डोमेन के हेटेरोडिमर्स के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए दिखाए गए हैं।

Introduction

प्रोटीन-प्रोटीनइंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक पुलडाउन का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, शुद्ध प्रोटीन अक्सर विट्रो 2,3 में प्रभावी ढंग से बातचीत नहीं करते हैं, और उनमें से कुछ अपने बाध्यकारी साथी 4,5 के बिना अघुलनशील होते हैं। ऐसे प्रोटीन को सह-ट्रांसलेशनल असेंबली या आणविक चैपरोन 5,6,7,8,9 की उपस्थिति की आवश्यकता हो सकती है। पारंपरिक पुलडाउन की एक और सीमा उन डोमेन के बीच संभावित हेटरोमल्टीमराइजेशन गतिविधि का परीक्षण है जो स्थिर होमो-ओलिगोमर्स के रूप में 8,10 को सह-अनुवाद के रूप में मौजूद हो सकते हैं, क्योंकि उनमें से कई इनक्यूबेशन समय के दौरान विट्रो में अलग और फिर से जुड़ नहीं सकते हैं। सह-अभिव्यक्ति को ऐसी समस्याओं पर काबू पाने में उपयोगी पाया गया 3,11. बैक्टीरिया में संगत वैक्टर का उपयोग करके सह-अभिव्यक्ति का उपयोग बड़े मल्टी-सबयूनिट मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स को शुद्ध करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था, जिसमें पॉलीकॉम्ब दमनकारी कॉम्प्लेक्स पीआरसी 212, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय मध्यस्थ हेड मॉड्यूल13, बैक्टीरियोफेज टी 4 बेसप्लेट14, एसएजीए कॉम्प्लेक्स डियूबिकिटिनाइलेज मॉड्यूल15,16 और फेरिटिन17 शामिल थे। आमतौर पर सह-अभिव्यक्ति के लिए उपयोग की जाने वाली प्रतिकृति उत्पत्ति कोलई 1, पी15 ए 18, क्लोडीएफ13 19 और आरएसएफ20 हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डुएट अभिव्यक्ति प्रणाली में, इन उत्पत्ति को विभिन्न एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन और पॉलीसिस्ट्रोनिक वैक्टर का उत्पादन करने के लिए सुविधाजनक कई क्लोनिंग साइटों के साथ जोड़ा जाता है, जिससे आठ प्रोटीन तक की अभिव्यक्ति की अनुमति मिलती है। इन उत्पत्ति में अलग-अलग प्रतिलिपि संख्याएं हैं और लक्ष्य प्रोटीन21 के संतुलित अभिव्यक्ति स्तरों को प्राप्त करने के लिए अलग-अलग संयोजनों में उपयोग किया जा सकता है। प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का परीक्षण करने के लिए, विभिन्न आत्मीयता टैग का उपयोग किया जाता है; सबसे आम 6xHistidine, ग्लूटाथियोन-एस-ट्रांसफेरेज़ (GST), और माल्टोज-बाइंडिंग प्रोटीन (MBP) हैं, जिनमें से प्रत्येक का संबंधित राल के लिए एक विशिष्ट संबंध है। जीएसटी और एमबीपी टैग किए गए प्रोटीन की घुलनशीलता और स्थिरता को भीबढ़ाते हैं।

यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रोटीन सह-अभिव्यक्ति से जुड़े कई तरीके भी विकसित किए गए हैं, जिनमें से सबसे प्रमुख खमीर दो-संकर परख (वाई 2 एच) 23 है। वाई 2 एच परख सस्ता, आसान है, और कई इंटरैक्शन के परीक्षण की अनुमति देता है; हालाँकि, इसका वर्कफ़्लो पूरा होने में 1 सप्ताह से अधिक समय लगता है। कुछ कम बार उपयोग किए जाने वाले स्तनधारी सेल-आधारित परख भी हैं, उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट टू-हाइब्रिड परख (एफ 2 एच) 24 और सेल सरणी प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परख (सीएपीपीआईए)25। एफ 2 एच परख अपेक्षाकृत तेज है, जिससे उनके मूल सेलुलर वातावरण में प्रोटीन इंटरैक्शन का निरीक्षण करने की अनुमति मिलती है, लेकिन इसमें महंगे इमेजिंग उपकरणों का उपयोग करना शामिल है। इन सभी विधियों में प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति पर एक लाभ है जो देशी यूकेरियोटिक अनुवाद और तह वातावरण प्रदान करता है; हालांकि, वे अप्रत्यक्ष रूप से बातचीत का पता लगाते हैं, या तो ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण या फ्लोरोसेंट ऊर्जा हस्तांतरण द्वारा, जो अक्सर कलाकृतियों का उत्पादन करता है। इसके अलावा, यूकेरियोटिक कोशिकाओं में रुचि के प्रोटीन के अन्य इंटरैक्शन पार्टनर हो सकते हैं, जो उच्च यूकेरियोट्स के प्रोटीन के बीच बाइनरी इंटरैक्शन के परीक्षण में हस्तक्षेप कर सकते हैं।

वर्तमान अध्ययन में पारंपरिक पुलडाउन तकनीकों के बाद अलग-अलग टैग किए गए प्रोटीन की जीवाणु सह-अभिव्यक्ति के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। विधि लक्ष्य प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देती है जिसके लिए सह-अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। यह पारंपरिक पुलडाउन की तुलना में अधिक समय-कुशल है, जिससे कई लक्ष्यों के बैच परीक्षण की अनुमति मिलती है, जो इसे ज्यादातर मामलों में फायदेमंद बनाती है। संगत वैक्टर का उपयोग करके सह-अभिव्यक्ति पॉलीसिस्ट्रोनिक सह-अभिव्यक्ति की तुलना में अधिक सुविधाजनक है क्योंकि इसके लिए श्रमसाध्य क्लोनिंग चरण की आवश्यकता नहीं होती है।

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Protocol

विधि वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1 में दिखाया गया है।

1. ई कोलाई का सह-परिवर्तन

  1. मानक क्लोनिंग विधियों का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन के लिए अभिव्यक्ति वैक्टर तैयार करें।
    नोट: आमतौर पर, एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु जीएसटी / एमबीपी-टैग किए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन और कोलई 1 मूल वाले पारंपरिक पीजीईएक्स / पीएमएएल वैक्टर का उपयोग करना है और पी 15 ए या आरएसएफ मूल के साथ एक संगत वेक्टर और 6एक्सएचआईएस-टैग किए गए प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए कानामाइसिन प्रतिरोध है, कुछ मामलों में घुलनशीलता बढ़ाने के लिए थियोरेडॉक्सिन या सूमो-टैग के साथ जोड़ा जाता है। आमतौर पर, प्रयोग से पहले टैग के कई संयोजनों का परीक्षण करने की आवश्यकता होती है। वर्णित विधि स्वयं लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति स्थितियों के बैच परीक्षण के लिए सुविधाजनक है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि अधिकांश रोसेटा उपभेदों में पहले से ही दुर्लभ कोडन के लिए टीआरएनए व्यक्त करने के लिए पी 15 ए मूल के साथ प्लास्मिड होता है; इस प्रकार यदि ऐसे उपभेदों का उपयोग करना एक संभावित विकल्प है, तो पी 15 ए प्लास्मिड से बचा जाना चाहिए। विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    1. लुरिया-बर्टानी (एलबी) मीडिया में 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.1-0.2 के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) में एक उपयुक्त तनाव के बैक्टीरिया को विकसित करें। इस अध्ययन में उदाहरणों के लिए बीएल 21 (डीई 3) तनाव का उपयोग किया गया था।
      नोट: दो वैक्टर के साथ कुशल सह-परिवर्तन प्राप्त करने के लिए ताजा तैयार सक्षम कोशिकाओं का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यदि दो से अधिक वैक्टर को सह-रूपांतरित करने की आवश्यकता है, तो अच्छी परिवर्तन दक्षता प्राप्त करने के लिए उन्हें क्रमिक रूप से बदलना बेहतर है। इलेक्ट्रोपोरेशन एक अच्छा विकल्प है।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 9,000 x g पर 1 मिनट के लिए बैक्टीरियल निलंबन के 1.0 एमएल सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को त्याग दें।
    3. बर्फ-ठंडा बफर ट्रांसफॉर्मेशन बफर (टीबी) के 0.5 एमएल (10 एमएम एमओपीएस [पीएच 6.7], 250 एमएम केसीएल, 55 एमएम एमएनसीएल2, और 15 एमएम सीएसीएल2) जोड़ें और बर्फ पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8,000 x g पर 30 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज, और सुपरनैटेंट को त्याग दें।
    5. टीबी बफर के 100 μL जोड़ें, प्रत्येक वेक्टर के 100 ng जोड़ें, और बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सह-अभिव्यक्ति के बिना प्रोटीन व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एकल वैक्टर को अलग से बदलें। इसके अतिरिक्त, गैर-विशिष्ट बाध्यकारी नियंत्रणों के लिए खाली सह-अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ जोड़े में अभिव्यक्ति वैक्टर को सह-रूपांतरित करें।
      नोट: इस अध्ययन में दिए गए उदाहरणों में, जीएसटी / एमबीपी सीडीएनए से जुड़े संबंधित सीडीएनए के साथ पीजीईएक्स / पीएमएएल वैक्टर का उपयोग संगत पीएसीवाईसी-व्युत्पन्न वैक्टर के साथ संयोजन में किया गया था, जिसमें सीडीएनए एन्कोडिंग पार्टनर प्रोटीन डोमेन थे।
    6. 150 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें, फिर बर्फ पर 1 मिनट के लिए ठंडा करें।
    7. एंटीबायोटिक दवाओं के बिना तरल एलबी मीडिया के 1 एमएल जोड़ें और 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एलबी-एगर प्लेटों पर प्लेट जिसमें 0.5% ग्लूकोज और संबंधित एंटीबायोटिक्स होते हैं (सामान्य सांद्रता हैं: 50 मिलीग्राम / एल एम्पीसिलीन; 20 मिलीग्राम / एल कनामाइसिन; 50 मिलीग्राम / एल स्ट्रेप्टोमाइसिन; 35 मिलीग्राम / एल क्लोरैम्फेनिकॉल)। प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

2. अभिव्यक्ति

  1. 2 एमएल तरल एलबी मीडिया के साथ प्लेट से कोशिकाओं को संबंधित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एलबी मीडिया के 50 एमएल में फ्लश करें (सामान्य सांद्रता हैं: 50 मिलीग्राम / एल एम्पीसिलिन; 20 मिलीग्राम / एल कनामाइसिन; 50 मिलीग्राम / एल स्ट्रेप्टोमाइसिन; 35 मिलीग्राम / एल क्लोरैम्फेनिकॉल)। धातु आयनों या अन्य ज्ञात सह-कारकों को जोड़ें (इस अध्ययन में दिए गए उदाहरणों में, 0.2 mM ZnCl2 को मीडिया में जोड़ा गया था)। प्रयोग के बाद के दोहराव के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर 20% ग्लिसरॉल के साथ एक एलिकोट स्टोर करें।
    नोट: दो प्लास्मिड के बीच कभी-कभी पुनर्संयोजन की घटनाओं के कारण एकल पृथक क्लोन में खराब अभिव्यक्ति की संभावना को बाहर करने के लिए प्लेट से सीधे कई कॉलोनियों को फ्लश करने की सिफारिश की जाती है।
  2. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 220 आरपीएम के निरंतर रोटेशन के साथ 0.5-0.7 के ओडी में विकसित करें, कमरे के तापमान (आरटी) को ठंडा करें, और आइसोप्रोपिल β-डी -1-थियोगलैक्टोपायरानोसाइड (आईपीटीजी) को 1 एमएम में जोड़ें। गैर-प्रेरित नमूने के नियंत्रण के रूप में सेल निलंबन के 20 μL एलिकोट स्टोर करें।
  3. कोशिकाओं को रात भर 18 डिग्री सेल्सियस पर 220 आरपीएम के निरंतर रोटेशन के साथ इनक्यूबेट करें।
    नोट: इनक्यूबेशन का इष्टतम समय और तापमान भिन्न हो सकता है; रात भर 18 डिग्री सेल्सियस अधिकांश प्रोटीनों के लिए सबसे अच्छा काम करता है और डिफ़ॉल्ट रूप से कोशिश करने की सलाह दी जाती है। यदि एक मजबूत गैर-विशिष्ट बंधन देखा जाता है तो इनक्यूबेशन समय को 2-3 घंटे तक कम करें।
  4. बैक्टीरियल निलंबन को दो भागों में विभाजित करें (या अधिक यदि दो से अधिक अलग-अलग टैग का उपयोग किया गया था) और प्रोटीन अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए सेल निलंबन के 20 μL एलिकोट को स्टोर करें। 15 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    नोट: विराम बिंदु: जीवाणु छर्रों को कम से कम 6 महीने के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. पुलडाउन परख

नोट: विस्तृत प्रक्रियाओं को 6xHis या MBP / GST के साथ टैग किए गए प्रोटीन के लिए वर्णित किया गया है। सभी प्रक्रियाएं 4 डिग्री सेल्सियस पर की जाती हैं।

  1. प्रयोग से तुरंत पहले जोड़े गए प्रोटीज इनहिबिटर और कम करने वाले एजेंटों (नीचे देखें) के साथ 1 एमएल आइस-कोल्ड लाइसिस बफर में जीवाणु छर्रों को फिर से निलंबित करें। धातु-चेलेटिंग रेजिन का उपयोग करते समय डिथियोट्रीटोल (डीटीटी) से बचें क्योंकि यह धातु आयनों को बाहर निकालता है। परीक्षण किए गए प्रोटीन के लिए बफर संरचना समायोजित करें। अधिकांश प्रोटीनों के लिए उपयुक्त पाए जाने वाले लाइसिस बफर के सामान्य व्यंजन हैं:
    1. 6xHis-पुलडाउन: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazole, 0.1% NP40, 10% [w/w] ग्लिसरॉल, 5 mM बीटा-मर्काप्टोएथेनॉल, 1 mM फेनिलमेथिल्सफुलफोनिलफ्लोराइड (PMSF), और प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल का 1:1,000 पतला होना ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. जीएसटी- या एमबीपी-पुलडाउन: 20 एमएम ट्राइस (पीएच 7.5 पर 25 डिग्री सेल्सियस), 150 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम केसीएल, 10 एमएम केसीएल, 10 एमएम एमजीसीएल2, 0.1 एमएम जेडएनसीएल2, 0.1% एनपी 40, 10% [डब्ल्यू / डब्ल्यू] ग्लिसरॉल, 5 एमएम डीटीटी, 1 एमएम पीएमएसएफ, और 1: 1,000 प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल का पतला होना ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. बर्फ पर सोनिकेशन द्वारा कोशिकाओं को बाधित करें। वैद्युतकणसंचलन के लिए 20 μl aliquot स्टोर करें।
    नोट: आमतौर पर, प्रति नमूना 20 वाट आउटपुट पावर के साथ 15 सेकंड के अंतराल के साथ 5 एस की 20-25 दालों की आवश्यकता होती है। ओवरहीटिंग से बचने और कुल सेल व्यवधान सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक उपकरण के लिए उपयुक्त सोनिकेशन पावर को समायोजित किया जाना चाहिए। बेहतर प्रदर्शन प्राप्त करने के लिए, उच्च-थ्रूपुट मल्टी-टिप सोनिकेटर जांच का उपयोग करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है।
  3. सेंट्रीफ्यूज 30 मिनट के लिए 20,000 x g पर। बाद के एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए स्पष्ट लाइसेट के 20 μL एकत्र करें।
  4. राल (प्रत्येक नमूने के लिए 50 μL) को 10 मिनट के लिए 1 एमएल आइस-कोल्ड लाइसिस बफर के साथ, सेंट्रीफ्यूज को 30 सेकंड के लिए 2,000 x g पर बराबर करें, और सुपरनैटेंट को त्याग दें।
  5. राल में सेल लाइसेट (कुल प्रोटीन सांद्रता: 20-50 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें, 15 आरपीएम के निरंतर रोटेशन पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, 30 सेकंड के लिए 2,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को त्याग दें। बाद के एसडीएस-पेज विश्लेषण के लिए अनबाउंड अंश का 20 μL एकत्र करें।
  6. 1 एमएल आइस-कोल्ड वॉश बफर जोड़ें और 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 30 सेकंड के लिए 2,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। वॉश बफर के लिए सामान्य व्यंजन हैं:
    1. 6xHis-पुलडाउन: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazole, 0.1% NP40, 10% [w /w] ग्लिसरॉल, और 5 mM बीटा-मर्काप्टोएथेनॉल मिलाएं।
    2. जीएसटी- या एमबीपी-पुलडाउन: 20 एमएम ट्राइस (पीएच 7.5 पर 25 डिग्री सेल्सियस), 500 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम केसीएल, 10 एमएम एमजीसीएल2, 0.1 एमएम जेडएनसीएल2, 0.1% एनपी 40, 10% [डब्ल्यू / डब्ल्यू] ग्लिसरॉल, और 5 एमएम डीटीटी मिलाएं।
  7. दो लंबे वॉश करें: 1 एमएल आइस-कोल्ड वॉश बफर जोड़ें, 15 आरपीएम के निरंतर रोटेशन के साथ 10-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, 30 सेकंड के लिए 2,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को त्याग दें।
  8. 1 एमएल आइस-कोल्ड वॉश बफर जोड़ें, 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, 30 सेकंड के लिए 2,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
  9. 10 मिनट के लिए 1,200 आरपीएम पर एक शेकर में 50 μL क्षालन बफर के साथ बंधे प्रोटीन का उपयोग करें। क्षालन बफर के सामान्य व्यंजन हैं:
    1. 6xHis-पुलडाउन: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazole, और 5 mM बीटा-मर्काप्टोएथेनॉल मिलाएं।
    2. जीएसटी-पुलडाउन: 20 एमएम ट्राइस (पीएच 7.5 पर 25 डिग्री सेल्सियस), 150 एमएम एनएसीएल, 50 एमएम ग्लूटाथियोन (बेसिक ट्राइस के साथ पीएच 7.5 में समायोजित), और 5 एमएम डीटीटी।
    3. एमबीपी-पुलडाउन: 20 एमएम ट्राइस (पीएच 7.5 पर 25 डिग्री सेल्सियस), 150 एमएम एनएसीएल, 40 एमएम माल्टोज और 5 एमएम डीटीटी मिलाएं।
  10. एसडीएस-पेज के साथ इल्यूटेड प्रोटीन का विश्लेषण करें।
    नोट: एक्रिलामाइड का प्रतिशत प्रोटीन के आकार में समायोजित किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में दिए गए उदाहरणों में, 12% एक्रिलामाइड जैल का उपयोग किया गया था, जो ट्राइस-ग्लाइसिन-एसडीएस बफर (2 एमएम ट्राइस, 250 एमएम ग्लाइसिन, 0.1% एसडीएस) में 180 वी के निरंतर वोल्टेज पर चल रहा था। लोड किए गए प्रोटीन की मात्रा बराबर नहीं होनी चाहिए, क्योंकि विभिन्न प्रयोगों में बातचीत करने वाले प्रोटीन की विभिन्न मात्रा को नीचे खींचा जा सकता है।

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Representative Results

वर्णित विधि का उपयोग नियमित रूप से कई अलग-अलग लक्ष्यों के साथ किया गया था। यहां प्रस्तुत कुछ प्रतिनिधि परिणाम हैं जो संभवतः पारंपरिक पुलडाउन तकनीकों का उपयोग करके प्राप्त नहीं किए जा सकते हैं। पहला विशिष्ट जेडएडी (जिंक-फिंगर-संबद्ध डोमेन) डिमराइजेशन11 का अध्ययन है। जेडएडी स्थिर और विशिष्ट डिमर बनाते हैं, जिसमें हेटेरोडिमर केवल पैरालॉगस समूहों के भीतर निकटता से संबंधित डोमेन के बीच संभव होते हैं। इन डोमेन द्वारा गठित डिमर स्थिर होते हैं और कम से कम कुछ दिनों के लिए अलग नहीं होते हैं; इस प्रकार, शुद्ध जेडएडी को मिलाने से कोई पता लगाने योग्य बंधन का उत्पादन नहीं होता है। इसी समय, एमबीपी और थियोरेडॉक्सिन -6एक्सएचआईएस-फ्यूज्ड जेडएडी की सह-अभिव्यक्ति अच्छी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होमो-डिमराइजेशन गतिविधि (चित्रा 2 ए) दिखाती है, जो एमबीपी-पुलडाउन परख के एसडीएस-पेज परिणामों में एक अतिरिक्त बैंड के रूप में दिखाई देती है। हेटेरोडिमर्स का एक छोटा सा हिस्सा एम 1 बीपी के साथ दूसरे डोमेन के साथ सह-व्यक्त किया जा सकता है; इस बातचीत की पुष्टि वाई 2 ए के साथ नहीं की गई थी और सबसे अधिक संभावना उच्च प्रोटीन एकाग्रता के कारण गैर-विशिष्ट संबंध का परिणाम है, क्योंकि ये डोमेन सिस्टीन युक्त और बेहद एकत्रीकरण-प्रवण हैं। विशेष रूप से, इस मामले में, 6xHis-पुलडाउन अनुचित है क्योंकि जेडएडी धातु-समन्वय डोमेन हैं जो गैर-विशेष रूप से धातु-चेलटिंग राल से बंधते हैं। इस तरह की गतिविधि को एक समानांतर प्रयोग में सावधानीपूर्वक जांच की जानी चाहिए।

एक अन्य उदाहरण ईएनवाई 2 प्रोटीन और इसके बाध्यकारी भागीदारों एसजीएफ 11 (1-83एए) और सीटीसीएफ प्रोटीन26 के जिंक-फिंगर डोमेन (460-631 एए) के बीच प्रतिस्पर्धा परख है। जब अकेले व्यक्त किया जाता है, तो ENY2 प्रोटीन डिमर बनाता है जो इसे अपने मूल बाध्यकारी भागीदारों के साथ बातचीत करने से रोकता है। संभवतः, एसजीएफ 11 और सीटीसीएफ प्रोटीन दोनों ईएनवाई 2 की एक ही आणविक सतह से जुड़ते हैं, जिससे उनकी बातचीत पारस्परिक रूप से अनन्य हो जाती है। सह-अभिव्यक्ति परख में, 6xHis-टैग किए गए ENY2 ने GST-टैग किए गए SGF11 और MBP-CTCF दोनों के साथ बातचीत की, लेकिन MBP-पुलडाउन में कोई GST-SGF11 मौजूद नहीं था और इसके विपरीत, (चित्रा 2B)। इन परिणामों से पता चलता है कि कोई ट्रिपल कॉम्प्लेक्स नहीं बनाया जा सकता है, और इंटरैक्शन पारस्परिक रूप से अनन्य हैं। इन आंकड़ों को स्वतंत्र रूप से अन्य परखों के साथ पुष्टि की गई थी और इन परिसरों में ENY2 की विभिन्न कार्यात्मक भूमिकाओं का समर्थन किया गया था। इस तथ्य पर ध्यान दिया जाना चाहिए कि बड़े आत्मीयता टैग स्वयं स्टेरिक बाधाओं को लागू कर सकते हैं, जटिल गठन को रोक सकते हैं; इसलिए, निष्कर्ष पूरी तरह से सह-अभिव्यक्ति डेटा पर आधारित नहीं होना चाहिए।

पारंपरिक और युग्मित सह-अभिव्यक्ति पुलडाउन के वर्कफ़्लो की चरण-दर-चरण तुलना चित्रा 3 ए में दिखाई गई है। सह-अभिव्यक्ति युग्मित पुलडाउन कम से कम दो गुना अधिक समय-कुशल है, यहां तक कि नमूनों की एक छोटी संख्या के साथ भी, और अच्छी स्केलेबिलिटी की अनुमति देता है। सीपी 190 प्रोटीन (1-126एए) के बीटीबी डोमेन और ड्रोसोफिला सीटीसीएफ प्रोटीन (डीसीटीसीएफ) के जीएसटी-टैग किए गए सी-टर्मिनल डोमेन (610-818एए) के बीच एक ही बातचीत का अध्ययन करने के लिए दोनों तकनीकों का उपयोग करने के परिणाम चित्रा 3 बी में दिखाए गए हैं। दोनों विधियां अच्छी दक्षता और प्रजनन क्षमता दिखाती हैं (परख तीन प्रतिकृतियों में किए गए थे); इस मामले के लिए, सह-अभिव्यक्ति युग्मित पुलडाउन ने कम गैर-विशिष्ट बंधन दिखाया, जैसा कि अकेले जीएसटी प्रोटीन के साथ नियंत्रण नमूनों में देखा जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। योजनाबद्ध इस अध्ययन में नियोजित विधि वर्कफ़्लो दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि परिणाम। (ए) एमबीपी- और 6xHis-पुलडाउन परख में जिंक-फिंगर से जुड़े डोमेन (ZAD) होमोडीमराइजेशन का अध्ययन। जेडएडी या तो एमबीपी (40 केडीए) या 6xHis-थियोरेडॉक्सिन (20 kDA) के साथ जुड़े हुए बैक्टीरिया कोशिकाओं में सह-व्यक्त किए गए थे और एमाइलोज राल (एमबीपी-टैग किए गए प्रोटीन को बांधता है) या Ni-NTA राल (6xHis-टैग किए गए प्रोटीन को बांधता है) के साथ शुद्ध किया गया था। सह-शुद्ध प्रोटीन को एसडीएस-पेज के साथ देखा गया था, जिसके बाद कूमासी धुंधला हो गया था। एमबीपी-पुलडाउन परिणाम ऊपरी पैनलों में दिखाए जाते हैं, 6xHis-पुलडाउन परिणाम निचले पैनलों में होते हैं (केवल प्रोटीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है क्योंकि कई जेडएडी गैर-विशेष रूप से Ni-NTA से जुड़ते हैं)। (बी) ईएनवाई 2 और एसजीएफ 11 / सीटीसीएफ प्रोटीन के बीच पारस्परिक रूप से अनन्य बातचीत का अध्ययन। जीएसटी-टैग किए गए एसजीएफ 11 (1-81एए), एमबीपी-टैग किए गए सीटीसीएफ जिंक-फिंगर डोमेन (460-631एए), और 6एक्सएचआईएस-टैग किए गए ईएनवाई 2 प्रोटीन को विभिन्न संयोजनों में सह-व्यक्त किया गया और एमाइलोज राल, ग्लूटाथियोन राल (जीएसटी-टैग किए गए प्रोटीन को बांधता है), या नी-एनटीए राल के साथ शुद्ध किया गया। सह-शुद्ध प्रोटीन को एसडीएस-पेज के साथ देखा गया था, जिसके बाद कूमासी धुंधला हो गया था। पैनल ए और बी में आंकड़े को बोनचुक एट अल.11 और बोंचुक एट अल.26 की अनुमति से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पारंपरिक और युग्मित सह-अभिव्यक्ति पुलडाउन परख के वर्कफ़्लो की तुलना। (ए) सह-अभिव्यक्ति के साथ युग्मित पुलडाउन की तुलना में पारंपरिक पुलडाउन परख के वर्कफ़्लो में आवश्यक समय अंतराल की चरण-दर-चरण तुलना। (ख) जीएसटी-पुलडाउन परीक्षणों में डीसीटीसीएफ सी-टर्मिनल डोमेन (610-818एए) और सीपी190 प्रोटीन (1-126एए) के बीटीबी डोमेन के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन करने में दो अलग-अलग पुलडाउन तकनीकों की तुलना। डीसीटीसीएफ (610-818एए) को अकेले जीएसटी (25 केडीए) या जीएसटी के साथ जोड़ा गया था, या तो बैक्टीरिया कोशिकाओं में सह-व्यक्त किया गया था या थियोरेडॉक्सिन -6एक्सएचआईएस-टैग सीपी 190 बीटीबी के साथ विट्रो में इनक्यूबेट किया गया था और ग्लूटाथियोन राल के साथ आत्मीयता को शुद्ध किया गया था। प्रत्येक परख के तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियां दिखाई गई हैं। सह-शुद्ध प्रोटीन को एसडीएस-पेज के साथ देखा गया था, जिसके बाद कूमासी धुंधला हो गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्णित विधि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के परीक्षण की अनुमति देती है जिसे विट्रो में कुशलतापूर्वक इकट्ठा नहीं किया जा सकता है और सह-अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। यह विधि हेटेरोडिमराइजिंग प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए कुछ उपयुक्त दृष्टिकोणों में से एक है, जो होमोडीमराइजेशन में भी सक्षम हैं, क्योंकि जब अलग से शुद्ध किया जाता है, तो ऐसे प्रोटीन स्थिर होमोडीमर बनाते हैं जो अक्सर प्रयोग 3,11 के दौरान विघटित और पुन: संबद्ध नहीं हो सकते हैं।

वर्णित विधि का वर्कफ़्लो पारंपरिक पुलडाउन की तुलना में अधिक समय-कुशल है क्योंकि इसमें बातचीत करने वाले प्रोटीन और उनके निम्नलिखित इनक्यूबेशन के अलग-अलग शुद्धिकरण के समय लेने वाले चरणों का अभाव है। एक अन्य लाभ एक उच्च प्रजनन क्षमता है, जो काफी कम संख्या में चरणों और कम समय की अवधि के कारण होता है जिसमें प्रोटीन प्रोटियोलिसिस और ऑक्सीकरण के संपर्क में आने के दौरान कृत्रिम इन विट्रो वातावरण के भीतर मौजूद होते हैं। इस विधि को कई प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था जब अन्य इन विट्रो तकनीकों कोअनुपयुक्त 3,11,27 पाया गया था। विभिन्न आत्मीयता टैग के साथ समानांतर सह-वर्षा प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर नियंत्रण प्रदान करती है। चूंकि विधि पारंपरिक पुलडाउन की तुलना में आसान और तेज़ है, इसलिए इसका उपयोग इसके बजाय किया जा सकता है, भले ही सह-अभिव्यक्ति बिल्कुल आवश्यक न हो। सेल व्यवधान की गति एक गैर-स्पष्ट अड़चन है जो कुल समय में काफी वृद्धि कर सकती है और परिणामों में विचलन का कारण बन सकती है, क्योंकि पहले और अंतिम नमूनों के बीच विभिन्न समय इन विट्रो स्थितियों और प्रोटियोलिसिस के संपर्क में हैं। इस प्रकार, उच्च-थ्रूपुट मल्टी-टिप सोनिकेटर जांच का उपयोग करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है; उदाहरण के लिए सामग्री तालिका देखें।

चुंबकीय मोतियों का उपयोग गैर-विशिष्ट बंधन को कम कर सकता है और विधि को और तेज कर सकता है, जिससे चरणों को धोने के लिए आवश्यक समय कम हो सकता है। संगत मूल वाले वैक्टर का उपयोग करने से पॉलीसिस्ट्रोनिक अभिव्यक्ति पर एक फायदा होता है क्योंकि वे एक ही लक्ष्य के साथ कई प्रोटीन इंटरैक्शन का परीक्षण करने के लिए एक सुविधाजनक मिश्रित दृष्टिकोण प्रदान करते हैं और प्रत्येक संयोजन के लिए एक नया वेक्टर बनाने की आवश्यकता नहीं होती है।

विधि का एक नुकसान झूठे-सकारात्मक परिणामों की अपेक्षाकृत उच्च संभावना है, क्योंकि प्रोटीन उच्च सांद्रता पर बैक्टीरिया में सह-व्यक्त किए जाते हैं। इस प्रकार, इस विधि द्वारा खोजे गए अप्रत्याशित इंटरैक्शन को सावधानी के साथ इलाज किया जाना चाहिए और एक स्वतंत्र परख के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए, जैसे कि वाई 2 ए या सेलुलर तकनीक24, जो सह-अभिव्यक्ति 3,11,28 का भी उपयोग करता है। जटिल प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन नेटवर्क29 का विश्लेषण और सत्यापन करने के लिए उच्च-थ्रूपुट जैव सूचना विज्ञान दृष्टिकोण का भी उपयोग किया जा सकता है। एक और अजीब बाधा यह है कि प्रोटीन कॉम्प्लेक्स में अलग-अलग प्रोटीन की तुलना में पूरी तरह से अलग जैव रासायनिक गुण हो सकते हैं; कॉम्प्लेक्स अघुलनशील हो सकता है जबकि इसके घटक समाधान में मौजूद होते हैं। इस समस्या को आमतौर पर प्रोटीन को उपयुक्त घुलनशीलता टैग में फ्यूज करके हल किया जा सकता है। एमबीपी सबसे प्रभावी है, जबकि एनयूएसए एक और अच्छा ऑल-अराउंड विकल्प22 है। जीएसटी-टैग को कई जिंक-कोऑर्डिनेटिंग डोमेन के साथ कुशल पाया गया, हालांकि चूंकि यह डिमेरिक है, इसलिए ऑलिगोमेरिक डोमेन के साथ काम करते समय इससे बचा जाना चाहिए। इसके विपरीत, छोटे मोनोमेरिक डोमेन जैसे थियोरेडॉक्सिन और सूमो मल्टीमेरिक प्रोटीन डोमेन के साथ अच्छी तरह से काम करते हैं।

वर्णित विधि के महत्वपूर्ण चरण प्रोटीन अभिव्यक्ति का उचित समय हैं (गैर-विशिष्ट बंधन देखे जाने पर कम समय की आवश्यकता होती है, जबकि खराब प्रोटीन अभिव्यक्ति में सुधार के लिए लंबे समय इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता हो सकती है), तेजी से सेल व्यवधान, बफर का उचित विकल्प, और प्रोटोकॉल के दौरान निरंतर तापमान बनाए रखना। प्रेरण के बाद अत्यधिक इनक्यूबेशन बार बैक्टीरिया में प्रोटीन एकत्रीकरण हो सकता है, जिससे गलत सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं। दूसरी ओर, कुछ प्रोटीनों को पर्याप्त मात्रा में व्यक्त करने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है। सोनिकेशन और धोने के चरणों के दौरान तापमान में उतार-चढ़ाव से बफर पीएच और प्रोटीन वर्षा में परिवर्तन हो सकता है। अनुचित बफर विकल्प के परिणामस्वरूप गैर-विशिष्ट प्रोटीन एकत्रीकरण भी हो सकता है।

खराब प्रोटीन अभिव्यक्ति के मामले में, विभिन्न घुलनशीलता टैग का प्रयास किया जाना चाहिए, साथ ही प्रेरण के बाद समय इनक्यूबेशन वृद्धि हुई है। यदि एक मजबूत गैर-विशिष्ट संबंध देखा जाता है, तो राल या आत्मीयता टैग के साथ प्रोटीन के संभावित गैर-विशिष्ट संबंध को निर्धारित करने के लिए सभी आवश्यक नकारात्मक नियंत्रण चलाए जाने चाहिए। यदि नियंत्रण काम नहीं करते हैं, तो आत्मीयता टैग के विभिन्न संयोजनों का प्रयास किया जाना चाहिए और विभिन्न बफर का उपयोग किया जाना चाहिए। कई प्रोटीन इस लेख में उल्लिखित धातु-चेलटिंग राल जैसे जेडएडी से गैर-विशेष रूप से बंधते हैं; ऐसे मामलों में, एमबीपी / जीएसटी-पुलडाउन, सामान्य रूप से, पारस्परिक प्रयोग के बिना पर्याप्त होगा जिसका उपयोग केवल प्रोटीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए किया जा सकता है। यदि नकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से काम करते हैं, तो प्रोटीन अभिव्यक्ति का समय कम हो जाना चाहिए, और बफर सिस्टम और कम करने वाले एजेंट बदल गए या कम करने वाले एजेंट एकाग्रता में वृद्धि हुई, खासकर जब सिस्टीन युक्त प्रोटीन के साथ काम किया जाता है। परिणामों की खराब प्रजनन क्षमता के मामले में, सेल व्यवधान चरण पर ध्यान दिया जाना चाहिए, जिसे तेजी से लेकिन ओवरहीटिंग के बिना किया जाना चाहिए। पूरे प्रयोग के दौरान तापमान की निगरानी की जानी चाहिए।

मल्टीप्रोटीन कॉम्प्लेक्स या राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इस विधि को आसानी से संशोधित किया जा सकता है। एक अन्य संभावित अनुप्रयोग बाद के अध्ययनों के लिए प्रोटीन जटिल अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण स्थितियों का बैच परीक्षण है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

इस काम को रूसी साइंस फाउंडेशन परियोजनाओं 19-74-30026 (विधि विकास और सत्यापन) और 19-74-10099 (प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन परख) द्वारा समर्थित किया गया था; और रूसी संघ के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय द्वारा अनुदान 075-15-2019-1661 (प्रतिनिधि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का विश्लेषण)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-ELEMENT probe Sonics 630-0586 The high throughput 8-element sonicator probes
Agar AppliChem A0949
Amylose resin New England Biolabs E8021 Resin for purification of MBP-tagged proteins
Antibiotics AppliChem A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin)
Beta-mercaptoethanol AppliChem A1108
BL21(DE3)  Novagen 69450-M
CaCl2 AppliChem A4689
Centrifuge Eppendorf 5415R (Z605212)
Glutathione AppliChem A9782
Glutathione agarose Pierce 16100 Resin for purification of GST-tagged proteins
Glycerol AppliChem A2926
HEPES  AppliChem A3724
HisPur Ni-NTA Superflow Agarose Thermo Scientific 25214 Resin for purification of 6xHis-tagged proteins
Imidazole AppliChem A1378
IPTG AppliChem A4773
KCl AppliChem A2939
LB AppliChem 414753
Maltose AppliChem A3891
MOPS AppliChem A2947
NaCl AppliChem A2942
NP40 Roche 11754599001
pACYCDuet-1 Sigma-Aldrich 71147 Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin
pCDFDuet-1 Sigma-Aldrich 71340 Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin
PMSF AppliChem A0999
Protease Inhibitor Cocktail VII Calbiochem 539138 Protease Inhibitor Cocktail
pRSFDuet-1 Sigma-Aldrich 71341 Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin
SDS  AppliChem A2263
Tris  AppliChem A2264
VC505 sonicator Sonics CV334 Ultrasonic liquid processor
ZnCl2 AppliChem A6285

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References

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चुनौतीपूर्ण प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के परीक्षण के लिए एक समय-कुशल उपकरण के रूप में बैक्टीरिया कोशिकाओं में सह-अभिव्यक्ति के साथ युग्मित पुलडाउन परख
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Bonchuk, A., Zolotarev, N.,… More

Bonchuk, A., Zolotarev, N., Balagurov, K., Arkova, O., Georgiev, P. Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (190), e64541, doi:10.3791/64541 (2022).

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