Qui, descriviamo un metodo per la co-espressione batterica di proteine marcate differenzialmente utilizzando un insieme di vettori compatibili, seguito dalle tecniche convenzionali di pulldown per studiare complessi proteici che non possono assemblarsi in vitro.
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Articolo metodologico
Saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il pulldown è un test di interazione proteina-proteina facile e ampiamente utilizzato. Tuttavia, ha limitazioni nello studio di complessi proteici che non si assemblano efficacemente in vitro. Tali complessi possono richiedere l'assemblaggio co-traduzionale e la presenza di chaperoni molecolari; o formano oligomeri stabili che non possono dissociarsi e riassociarsi in vitro o sono instabili senza un partner legante. Per superare questi problemi, è possibile utilizzare un metodo basato sulla co-espressione batterica di proteine marcate differenzialmente utilizzando un insieme di vettori compatibili seguiti dalle tecniche convenzionali di pulldown. Il flusso di lavoro è più efficiente in termini di tempo rispetto al pulldown tradizionale perché manca delle lunghe fasi di purificazione separata delle proteine interagenti e della loro successiva incubazione. Un altro vantaggio è una maggiore riproducibilità dovuta a un numero significativamente inferiore di passaggi e un periodo di tempo più breve in cui le proteine che esistono all'interno dell'ambiente in vitro sono esposte alla proteolisi e all'ossidazione. Il metodo è stato applicato con successo per studiare una serie di interazioni proteina-proteina quando altre tecniche in vitro sono risultate inadatte. Il metodo può essere utilizzato per testare in batch le interazioni proteina-proteina. Risultati rappresentativi sono mostrati per studi di interazioni tra dominio BTB e proteine intrinsecamente disordinate, e di eterodimeri di domini associati a dita di zinco.
Introduzione
Il pulldown convenzionale è ampiamente utilizzato per studiare le interazioni proteina-proteina1. Tuttavia, le proteine purificate spesso non interagiscono efficacemente in vitro2,3, e alcune di esse sono insolubili senza il loro partner legante 4,5. Tali proteine potrebbero richiedere l'assemblaggio co-traduzionale o la presenza di chaperoni molecolari 5,6,7,8,9.<....
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Protocollo
La rappresentazione schematica del flusso di lavoro del metodo è illustrata nella Figura 1.
1. Co-trasformazione di E. coli
- Preparare vettori di espressione per proteine bersaglio utilizzando metodi di clonazione standard.
NOTA: Tipicamente, un buon punto di partenza è quello di utilizzare vettori pGEX/pMAL convenzionali che portano un gene di resistenza all'ampicillina e l'origine ColE1 per l'espressione di proteine marcate con GST / MBP e un vettore compatibile con origine p15A o RSF e resistenza alla kanamicina per esprimere proteine marcate con 6xHis, in alcuni casi co....
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Risultati
Il metodo descritto è stato utilizzato di routine con molti obiettivi diversi. Presentati qui sono alcuni risultati rappresentativi che probabilmente non possono essere ottenuti utilizzando tecniche di pulldown convenzionali. Il primo è lo studio della dimerizzazione specifica ZAD (Zinc-finger-associated domain)11. Gli ZAD formano dimeri stabili e specifici, con eterodimeri possibili solo tra domini strettamente correlati all'interno di gruppi paraloghi. I dimeri formati da questi domini sono stab.......
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Discussione
Il metodo descritto consente di testare le interazioni proteina-proteina che non possono essere assemblate in modo efficiente in vitro e richiedono la co-espressione. Il metodo è uno dei pochi approcci adatti per lo studio delle proteine eterodimerizzanti, che sono anche in grado di omodimerizzare poiché, se purificate separatamente, tali proteine formano omodimeri stabili che il più delle volte non possono dissociarsi e riassociarsi durante l'esperimento 3,11.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dai progetti della Russian Science Foundation 19-74-30026 (sviluppo e convalida del metodo) e 19-74-10099 (saggi di interazione proteina-proteina); e dal Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore della Federazione Russa-grant 075-15-2019-1661 (analisi delle interazioni rappresentative proteina-proteina).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sonda a 8 ELEMENTI | Sonics | 630-0586 | L'alta produttività Sonde sonicatrici a 8 elementi Agar |
| AppliChem | A0949 | ||
| Resina di amilosio | New England Biolabs | E8021 | Resina per la purificazione di proteine marcate con MBP |
| Antibiotici | AppliChem | A4789 (kanamicina); A0839 (ampicillina) | |
| Beta-mercaptoetanolo | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutatione | AppliChem | A9782 | |
| Glutatione agarosio | Pierce | 16100 | Resina per la purificazione di proteine marcate |
| GST Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resina per la purificazione di 6 proteine con tag His-taged |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltosio | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vettore per la co-espressione di proteine con origine di replicazione p15A |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vettore per la co-espressione di proteine con origine di replicazione CloDF13 |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi VII | Calbiochem | 539138 | Cocktail di inibitori della proteasi |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vettore per la co-espressione di proteine con origine di replicazione |
| RSF SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | Sonicatore AppliChem | A2264 | |
| VC505 | Sonics | CV334 | Processore di liquidi ad ultrasuoni |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
Riferimenti
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 ....
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Ristampe e permessi
