Summary
Her beskriver vi en metode for bakteriell samekspresjon av differensielt merkede proteiner ved hjelp av et sett med kompatible vektorer, etterfulgt av konvensjonelle nedtrekksteknikker for å studere proteinkomplekser som ikke kan samles in vitro.
Abstract
Nedtrekk er en enkel og mye brukt protein-protein-interaksjonsanalyse. Det har imidlertid begrensninger i å studere proteinkomplekser som ikke monteres effektivt in vitro. Slike komplekser kan kreve co-translasjonell montering og tilstedeværelsen av molekylære chaperoner; Enten danner de stabile oligomerer som ikke kan dissosiere og assosieres in vitro , eller de er ustabile uten en bindende partner. For å overvinne disse problemene er det mulig å bruke en metode basert på bakteriell samuttrykk av differensielt merkede proteiner ved hjelp av et sett med kompatible vektorer etterfulgt av konvensjonelle nedtrekksteknikker. Arbeidsflyten er mer tidseffektiv sammenlignet med tradisjonell nedtrekk fordi den mangler de tidkrevende trinnene med separat rensing av samvirkende proteiner og deres påfølgende inkubasjon. En annen fordel er en høyere reproduserbarhet på grunn av et betydelig mindre antall trinn og en kortere periode hvor proteiner som finnes i in vitro-miljøet blir utsatt for proteolyse og oksidasjon. Metoden ble vellykket brukt for å studere en rekke protein-protein-interaksjoner når andre in vitro-teknikker ble funnet å være uegnet. Metoden kan brukes til batchtesting av protein-protein-interaksjoner. Representative resultater er vist for studier av interaksjoner mellom BTB-domene og iboende forstyrrede proteiner, og av heterodimerer av sink-finger-assosierte domener.
Introduction
Konvensjonell nedtrekk er mye brukt til å studere protein-protein-interaksjoner1. Imidlertid interagerer rensede proteiner ofte ikke effektivt in vitro2,3, og noen av dem er uløselige uten bindingspartner 4,5. Slike proteiner kan kreve co-translasjonell montering eller tilstedeværelse av molekylære chaperones 5,6,7,8,9. En annen begrensning av konvensjonell nedtrekk er testing av mulig heteromultimeriseringsaktivitet mellom domener som kan eksistere som stabile homo-oligomerer samlet co-translasjonelt 8,10, da mange av dem ikke kan dissosiere og re-assosiere in vitro i inkubasjonstiden. Meduttrykk ble funnet å være nyttig for å overvinne slike problemer 3,11. Samuttrykk ved bruk av kompatible vektorer i bakterier ble vellykket brukt til å rense store multi-subenhet makromolekylære komplekser, inkludert polycomb repressive komplekse PRC212, RNA polymerase II mediatorhodemodul13, bakteriofag T4 baseplate 14, SAGA-kompleks deubiquitinylasemodul 15,16 og ferritin 17. Replikasjonsopprinnelser som vanligvis brukes for co-uttrykk er ColE1, p15A18, CloDF1319 og RSF20. I det kommersielt tilgjengelige Duet-ekspresjonssystemet kombineres disse opprinnelsene med forskjellige antibiotikaresistensgener og praktiske flere kloningssteder for å produsere polycistronic vektorer, noe som tillater ekspresjon av opptil åtte proteiner. Disse opprinnelsene har forskjellige kopinumre og kan brukes i varierende kombinasjoner for å oppnå balanserte ekspresjonsnivåer av målproteiner21. For å teste protein-protein-interaksjoner brukes forskjellige affinitetsmerker; de vanligste er 6xHistidin, glutation-S-transferase (GST) og maltosebindende protein (MBP), som hver har en spesifikk affinitet til den tilsvarende harpiksen. GST og MBP forbedrer også løseligheten og stabiliteten til merkede proteiner22.
En rekke metoder som involverer proteinekspresjon i eukaryote celler har også blitt utviklet, hvorav den mest fremtredende er gjær-to-hybridanalyse (Y2H)23. Y2H-analysen er billig, enkel og tillater testing av flere interaksjoner; Imidlertid tar arbeidsflyten mer enn 1 uke å fullføre. Det er også noen få mindre brukte pattedyrcellebaserte analyser, for eksempel fluorescerende to-hybridanalyse (F2H)24 og cellematriseprotein-proteininteraksjonsanalyse (CAPPIA)25. F2H-analysen er relativt rask, noe som gjør det mulig å observere proteininteraksjoner i sitt opprinnelige cellulære miljø, men innebærer bruk av dyrt bildeutstyr. Alle disse metodene har en fordel i forhold til prokaryot uttrykk som gir det opprinnelige eukaryote oversettelses- og foldemiljøet; Imidlertid oppdager de interaksjon indirekte, enten ved transkripsjonsaktivering eller ved fluorescerende energioverføring, som ofte produserer artefakter. Eukaryote celler kan også inneholde andre interaksjonspartnere av proteiner av interesse, noe som kan forstyrre testingen av binære interaksjoner mellom proteiner av høyere eukaryoter.
Denne studien beskriver en metode for bakteriell samekspresjon av differensielt merkede proteiner etterfulgt av konvensjonelle nedtrekksteknikker. Metoden tillater å studere interaksjoner mellom målproteiner som krever samuttrykk. Det er mer tidseffektivt sammenlignet med tradisjonell nedtrekk, noe som tillater batchtesting av flere mål, noe som gjør det fordelaktig i de fleste tilfeller. Samuttrykk ved hjelp av kompatible vektorer er mer praktisk enn polycistronic co-uttrykk siden det ikke krever et møysommelig kloningstrinn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den skjematiske fremstillingen av arbeidsflyten for metoden er vist i figur 1.
1. Samtransformasjon av E. coli
- Klargjøre ekspresjonsvektorer for målproteiner ved bruk av standard kloningsmetoder.
MERK: Vanligvis er et godt utgangspunkt å bruke konvensjonelle pGEX / pMAL-vektorer som bærer et ampicillinresistensgen og ColE1-opprinnelse for ekspresjon av GST / MBP-merkede proteiner og en kompatibel vektor med p15A- eller RSF-opprinnelse og kanamycinresistens for å uttrykke 6xHis-merkede proteiner, i noen tilfeller kombinert med enten tioredoksin eller SUMO-tag for å øke løseligheten. Vanligvis må flere kombinasjoner av tagger testes før eksperimentet. Den beskrevne metoden i seg selv er praktisk for batchtesting av ekspresjonsbetingelsene for målproteiner. Det er viktig å merke seg at de fleste Rosetta-stammer allerede inneholder plasmidet med p15A-opprinnelse for å uttrykke tRNAene for sjeldne kodon;, så hvis bruk av slike stammer er et mulig alternativ, bør p15A-plasmidene unngås. Se materialfortegnelsen for detaljer.- Dyrk bakterier av en passende stamme i Luria-Bertani (LB) media ved 37 °C til en optisk tetthet (OD) på 0,1-0,2. BL21(DE3)-stamme ble brukt for eksempler i denne studien.
MERK: Det anbefales å bruke nytilberedte kompetente celler for å oppnå effektiv samtransformasjon med to vektorer. Hvis mer enn to vektorer må samtransformeres, er det bedre å transformere dem sekvensielt for å oppnå god transformasjonseffektivitet. Elektroporering er et godt alternativ. - Sentrifuge 1,0 ml av bakteriesuspensjonen i 1 min ved 9000 x g ved 4 °C, og kast supernatanten.
- Tilsett 0,5 ml iskald buffertransformasjonsbuffer (TB) (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 og 15 mM CaCl2) og inkuber i 10 minutter på is.
- Sentrifuge i 30 s ved 8000 x g ved 4 °C, og kast supernatanten.
- Tilsett 100 μL TB-buffer, tilsett 100 ng av hver vektor, og inkuber i 30 minutter på is. Transformer enkeltvektorer separat for å studere proteinoppførsel uten samuttrykk. I tillegg kan du transformere uttrykksvektorer i par med tomme co-uttrykksvektorer for ikke-spesifikke bindingskontroller.
MERK: I eksemplene gitt i denne studien ble pGEX/pMAL-vektorer med tilsvarende cDNAer fusjonert til GST / MBP cDNA brukt i kombinasjon med kompatible pACYC-avledede vektorer som bærer cDNA-kodende partnerproteindomener fusjonert til tioredoksin cDNA. - Varm opp ved 42 °C i 150 s, avkjøl deretter i 1 min på is.
- Tilsett 1 ml flytende LB-medier uten antibiotika og inkuber ved 37 °C i 90 minutter. Plate på LB-agarplater inneholdende 0,5% glukose og tilsvarende antibiotika (vanlige konsentrasjoner er: 50 mg / l ampicillin; 20 mg / l kanamycin; 50 mg / l streptomycin; 35 mg / l kloramfenikol). Inkuber platene over natten ved 37 °C.
- Dyrk bakterier av en passende stamme i Luria-Bertani (LB) media ved 37 °C til en optisk tetthet (OD) på 0,1-0,2. BL21(DE3)-stamme ble brukt for eksempler i denne studien.
2. Uttrykk
- Skyll cellene fra platen med 2 ml flytende LB-medier til 50 ml LB-medier med tilsvarende antibiotika (vanlige konsentrasjoner er: 50 mg / l ampicillin, 20 mg / l kanamycin, 50 mg / l streptomycin, 35 mg / l kloramfenikol). Legg til metallioner eller andre kjente kofaktorer (i eksemplene gitt i denne studien ble 0,2 mM ZnCl2 tilsatt mediet). Oppbevar en alikot med 20% glyserol ved -70 ° C for en påfølgende gjentakelse av forsøket.
MERK: Det anbefales å skylle flere kolonier direkte fra platen for å utelukke muligheten for dårlig uttrykk i en enkelt isolert klon på grunn av sporadiske rekombinasjonshendelser mellom to plasmider. - Dyrk cellene med en konstant rotasjon på 220 o / min ved 37 ° C til en OD på 0,5-0,7, avkjøl til romtemperatur (RT), og tilsett isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) til 1 mM. Oppbevar en 20 μL alikot av cellesuspensjon som en kontroll av den ikke-induserte prøven.
- Inkuber cellene med en konstant rotasjon på 220 o / min ved 18 ° C over natten.
MERK: Den optimale tiden og temperaturen på inkubasjonen kan variere; 18 °C over natten fungerer best for de fleste proteiner og anbefales å bli prøvd som standard. Reduser inkubasjonstiden til 2-3 timer hvis en sterk ikke-spesifikk binding observeres. - Del bakteriesuspensjonen i to deler (eller mer hvis mer enn to forskjellige koder ble brukt) og oppbevar en 20 μL alikot av cellesuspensjonen for å bekrefte proteinuttrykk. Sentrifuge ved 4000 x g i 15 min.
MERK: Pausepunkt: bakteriepellets kan oppbevares ved -70 °C i minst 6 måneder.
3. Nedtrekksanalyse
MERK: De detaljerte prosedyrene er beskrevet for proteiner merket med enten 6xHis eller MBP / GST. Alle prosedyrer utføres ved 4 °C.
- Resuspender bakteriepellets i 1 ml iskald lysisbuffer med proteasehemmere og reduksjonsmidler (se nedenfor) tilsatt umiddelbart før forsøket. Unngå dithiotreitol (DTT) når du bruker metall-chelaterende harpikser siden det strips ut metallioner. Juster buffersammensetningen for de testede proteinene. De vanlige oppskriftene av lysisbuffere som er funnet egnet for de fleste proteiner er:
- 6xHis-nedtrekk: Bland 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 10 mM imidazol, 0,1 % NP40, 10 % [w/w] glyserol, 5 mM beta-merkaptoetanol, 1 mM fenylmetylsfulfonylfluorid (PMSF) og en 1:1000 fortynning av proteasehemmercocktailen (se materialtabellen).
- GST- eller MBP-nedtrekk: Bland 20 mM Tris (pH 7,5 ved 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1 % NP40, 10 % [w/w] glyserol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF og en 1:1 000 fortynning av proteasehemmercocktailen (se materialfortegnelsen).
- Forstyrr cellene ved sonikering på is. Oppbevar en 20 μl alikot for elektroforese.
MERK: Vanligvis kreves 20-25 pulser på 5 s med 15 s intervaller med 20 W utgangseffekt per prøve. Den riktige sonikeringseffekten bør justeres for hvert instrument for å unngå overoppheting og sikre total celleforstyrrelse. For å oppnå bedre ytelse, anbefales det sterkt å bruke high-throughput multi-tip sonicator prober. - Sentrifuge ved 20 000 x g i 30 min. Samle 20 μL av det klargjorte lysatet for påfølgende SDS-PAGE-analyse.
- Øk harpiksen (50 μL for hver prøve) med 1 ml iskald lysisbuffer i 10 minutter, sentrifuge ved 2000 x g i 30 sekunder, og kast supernatanten.
- Tilsett cellelysater (total proteinkonsentrasjon: 20-50 mg/ml) til harpiksen, inkuber i 10 minutter ved en konstant rotasjon på 15 rpm, sentrifuge ved 2000 x g i 30 s, og kast supernatanten. Samle 20 μL av den ubundne fraksjonen for påfølgende SDS-PAGE-analyse.
- Tilsett 1 ml iskald vaskebuffer og rug i 1 min. Sentrifuge ved 2000 x g i 30 s, og kast supernatanten. De vanlige oppskriftene på vaskebuffere er:
- 6xHis-nedtrekk: Bland 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM imidazol, 0,1 % NP40, 10 % [w/w] glyserol og 5 mM beta-merkaptoetanol.
- GST- eller MBP-nedtrekk: Bland 20 mM Tris (pH 7,5 ved 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1 % NP40, 10 % [w/w] glyserol og 5 mM DTT.
- Utfør to lange vasker: tilsett 1 ml iskald vaskebuffer, inkuber i 10-30 minutter med en konstant rotasjon på 15 o / min, sentrifuge ved 2000 x g i 30 sekunder, og kast supernatanten.
- Tilsett 1 ml iskald vaskebuffer, inkuber i 1 min, sentrifuge ved 2000 x g i 30 s, og kast supernatanten.
- Elute de bundne proteinene med 50 μL av elueringsbufferen i en shaker ved 1,200 rpm i 10 minutter. De vanlige oppskriftene på elueringsbuffere er:
- 6xHis-nedtrekk: Bland 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM imidazol og 5 mM beta-merkaptoetanol.
- GST-nedtrekk: 20 mM Tris (pH 7,5 ved 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM glutation (justert til pH 7,5 med basisk Tris) og 5 mM DTT.
- MBP-nedtrekk: Bland 20 mM Tris (pH 7,5 ved 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM maltose og 5 mM DTT.
- Analyser de eluerte proteinene med SDS-PAGE.
MERK: Prosentandelen akrylamid bør justeres til størrelsen på proteinene. I eksemplene gitt i denne studien ble 12% akrylamidgeler brukt, kjørt i tris-glycin-SDS-buffer (2 mM Tris, 250 mM glycin, 0,1% SDS) ved konstant spenning på 180 V. Geler ble farget ved koking i 0,2% Coomassie blå R250, 10% eddiksyre og 30% isopropanol, og de-farget ved koking i 10% eddiksyre. Mengden lastet protein bør ikke være lik, siden ulike mengder samvirkende proteiner kan trekkes ned i forskjellige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne metoden ble brukt rutinemessig med mange forskjellige mål. Her presenteres noen representative resultater som sannsynligvis ikke kan oppnås ved hjelp av konvensjonelle nedtrekksteknikker. Den første er studiet av spesifikk ZAD (Zinc-finger-associated domain) dimerisering11. ZAD danner stabile og spesifikke dimerer, med heterodimerer som bare er mulig mellom nært beslektede domener innenfor paraloge grupper. Dimerene dannet av disse domenene er stabile og dissocierer ikke i minst noen dager; Blanding av rensede ZADer gir derfor ingen påviselig binding. Samtidig viser samuttrykket av MBP og Thioredoxin-6xHis-smeltede ZADer god og reproduserbar homodimeriseringsaktivitet (figur 2A), som vises som et ekstra bånd i SDS-PAGE-resultatene fra MBP-nedtrekksanalysen. En liten del av heterodimerer kan sees med M1BP uttrykt sammen med et annet domene; denne interaksjonen ble ikke bekreftet med Y2A og er mest sannsynlig et resultat av ikke-spesifikk assosiasjon på grunn av høy proteinkonsentrasjon, siden disse domenene er cysteinrike og ekstremt aggregeringsutsatte. Spesielt i dette tilfellet er 6xHis-nedtrekk upassende ettersom ZAD er metallkoordinerende domener som ikke spesifikt binder seg til metallchelaterende harpiks. Slike aktiviteter bør undersøkes nøye i et parallelt eksperiment.
Et annet eksempel er konkurranseanalysen mellom ENY2-proteinet og dets bindingspartnere Sgf11 (1-83aa) og sinkfingerdomenet (460-631 aa) av CTCF-proteinet26. Når det uttrykkes alene, danner ENY2-proteinet dimerer som hindrer det i å interagere med sine opprinnelige bindingspartnere. Formentlig binder både Sgf11- og CTCF-proteinene seg til den samme molekylære overflaten av ENY2, noe som gjør deres interaksjon gjensidig utelukkende. I co-expression-analysen interagerte 6xHis-merket ENY2 både med GST-merket Sgf11 og MBP-CTCF, men ingen GST-Sgf11 var tilstede i MBP-nedtrekk og omvendt (figur 2B). Disse resultatene tyder på at ingen trippelkompleks kan dannes, og interaksjoner er gjensidig utelukkende. Disse dataene ble uavhengig bekreftet med andre analyser og støtter de forskjellige funksjonelle rollene til ENY2 i disse kompleksene. Det bør gjøres oppmerksom på at store affinitetsmerker kan pålegge steriske hindringer i seg selv, og forhindre kompleks dannelse; Konklusjonen bør derfor ikke bare baseres på samuttrykksdata.
En trinnvis sammenligning av arbeidsflytene for konvensjonelle og koblede rullegardinlister for samuttrykk er vist i figur 3A. Co-expression coupled pulldown er minst to ganger mer tidseffektivt, selv med et lite antall samples, og gir god skalerbarhet. Resultatene av å bruke begge teknikkene for å studere den samme interaksjonen mellom BTB-domenet til CP190-proteinet (1-126aa) og det GST-merkede C-terminale domenet (610-818aa) av Drosophila CTCF-protein (dCTCF) er vist i figur 3B. Begge metodene viser god effektivitet og reproduserbarhet (analyser ble utført i tre replikater); for dette tilfellet viste co-expression coupled pulldown lavere ikke-spesifikk binding, som det fremgår av kontrollprøvene med GST-protein alene.
Figur 1: Den skjematiske fremstillingen av protokollen. Skjemaet viser metoden arbeidsflyt benyttet i denne studien. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative resultater . (A) Studie av Zinc-finger associated domain (ZAD) homodimerisering i MBP- og 6xHis-nedtrekksanalyser. ZAD fusjonert enten med MBP (40 kDa) eller med 6xHis-tioredoksin (20 kDa) ble uttrykt samtidig i bakterieceller og affinitet renset med amyloseharpiks (binder MBP-merkede proteiner) eller med Ni-NTA-harpiks (binder 6xHis-merkede proteiner). Co-rensede proteiner ble visualisert med SDS-PAGE etterfulgt av Coomassie farging. MBP-nedtrekksresultater vises i øvre paneler, 6xHis-nedtrekksresultater er i nedre paneler (brukes kun som proteinuttrykkskontroll siden mange ZADer binder seg ikke-spesifikt til Ni-NTA). (B) Studie av gjensidig utelukkende interaksjoner mellom ENY2 og Sgf11 / CTCF proteiner. GST-merkede Sgf11 (1-81aa), MBP-merket CTCF sink-fingerdomene (460-631aa) og 6xHis-merkede ENY2-proteiner ble uttrykt i forskjellige kombinasjoner og affinitet renset med amyloseharpiks, glutationharpiks (binder GST-merkede proteiner) eller med Ni-NTA-harpiks. Co-rensede proteiner ble visualisert med SDS-PAGE etterfulgt av Coomassie farging. Figuren i panel A og B er modifisert med tillatelse fra Bonchuk et al.11 og Bonchuk et al.26. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av arbeidsflyter for konvensjonelle og koblede sammenfallsanalyser . (A) Trinnvis sammenligning av nødvendige tidsintervaller i arbeidsflyten til den konvensjonelle nedtrekksanalysen sammenlignet med nedtrekkstrekk koblet til samuttrykk. (B) Sammenligning av to forskjellige nedtrekksteknikker for å studere samspillet mellom dCTCF C-terminaldomenet (610-818aa) og BTB-domenet til CP190-proteinet (1-126aa) i GST-nedtrekksanalyser. dCTCF (610-818aa) smeltet sammen med GST (25kDa) eller GST alene ble enten uttrykt samtidig i bakterieceller eller inkubert in vitro med tioredoksin-6xHis-merket CP190 BTB og affinitet renset med glutationharpiks. Tre uavhengige replikater av hver analyse vises. Co-rensede proteiner ble visualisert med SDS-PAGE etterfulgt av Coomassie farging. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne metoden tillater testing av protein-protein-interaksjoner som ikke effektivt kan settes sammen in vitro og krever samuttrykk. Metoden er en av de få egnede tilnærmingene for å studere heterodimeriserende proteiner, som også er i stand til homodimerisering, siden slike proteiner danner stabile homodimerer når de renses separat som oftest ikke kan dissosiere og knytte seg sammen igjen under forsøket 3,11.
Arbeidsflyten til den beskrevne metoden er mer tidseffektiv sammenlignet med tradisjonell nedtrekk fordi den mangler de tidkrevende trinnene for separat rensing av samvirkende proteiner og deres følgende inkubasjon. En annen fordel er en høyere reproduserbarhet, på grunn av et betydelig mindre antall trinn og en kortere periode hvor proteiner eksisterer i et kunstig in vitro-miljø mens de blir utsatt for proteolyse og oksidasjon. Metoden ble vellykket brukt for å studere flere protein-protein-interaksjoner når andre in vitro-teknikker ble funnet å være uegnet 3,11,27. Parallell samutfelling med forskjellige affinitetskoder gir kontroll over proteinuttrykksnivå. Siden metoden er enklere og raskere enn konvensjonell nedtrekk, kan den brukes i stedet for den, selv om co-uttrykk ikke er absolutt nødvendig. Hastigheten til celleforstyrrelser er en ikke-åpenbar flaskehals som kan øke den totale tiden betydelig og kan føre til avvik i resultatene, på grunn av at det er forskjellig tid mellom første og siste prøve som blir utsatt for in vitro-forhold og proteolyse. Dermed anbefales det sterkt å bruke sonder med høy gjennomstrømning med flere spisser; se materialfortegnelsen for eksempler.
Bruk av magnetiske perler kan redusere den ikke-spesifikke bindingen og ytterligere øke hastigheten på metoden, noe som reduserer tiden som kreves for vasketrinn. Bruk av vektorer med kompatibel opprinnelse har en fordel i forhold til polycistronic uttrykk, da de gir en praktisk kombinatorisk tilnærming for å teste flere proteininteraksjoner med samme mål og ikke krever å produsere en ny vektor for hver kombinasjon.
En ulempe med metoden er den relativt høye sannsynligheten for falske positive resultater, da proteiner uttrykkes samtidig i bakterier ved høye konsentrasjoner. Dermed bør uventede interaksjoner oppdaget ved denne metoden behandles med forsiktighet og testes med en uavhengig analyse, for eksempel Y2A eller cellulære teknikker24, som også bruker co-uttrykk 3,11,28. High-throughput bioinformatiske tilnærminger kan også brukes til å analysere og validere komplekse protein-protein interaksjonsnettverk29. Et annet merkelig hinder er at proteinkomplekser kan ha helt forskjellige biokjemiske egenskaper sammenlignet med separate proteiner; Komplekset kan være uoppløselig mens komponentene er tilstede i løsningen. Dette problemet kan vanligvis løses ved å smelte proteinene til riktig løselighetsmerke. MBP er det mest effektive, mens NusA er et annet godt allsidig alternativ22. GST-tag ble funnet å være effektiv med mange sinkkoordinerende domener, men siden det er dimerisk, bør det unngås når du arbeider med oligomere domener. Tvert imot fungerer små monomere domener som tioredoksin og SUMO godt med multimere proteindomener.
Kritiske trinn i den beskrevne metoden er riktig tid for proteinuttrykk (kortere tid er nødvendig hvis ikke-spesifikk binding observeres, mens lengre inkubasjonstider kan være nødvendig for å forbedre dårlig proteinuttrykk), rask celleforstyrrelse, riktig valg av buffere og opprettholde den konstante temperaturen under protokollen. Overdreven inkubasjonstid etter induksjon kan resultere i proteinaggregering i bakterier, noe som fører til falske positive resultater. På den annen side krever noen proteiner mer tid til å bli uttrykt i tilstrekkelige mengder. Temperatursvingninger under sonikering og vasketrinn kan føre til endringer i buffer pH og proteinutfelling. Feil buffervalg kan også føre til uspesifikk proteinaggregering.
Ved dårlig proteinuttrykk bør forskjellige løselighetsmerker forsøkes, samt økt inkubasjonstid etter induksjon. Hvis en sterk ikke-spesifikk assosiasjon observeres, skal alle nødvendige negative kontroller kjøres for å bestemme den mulige ikke-spesifikke assosiasjonen mellom proteiner og harpiks eller affinitetsmerket. Hvis kontrollene ikke fungerer, bør forskjellige kombinasjoner av affinitetskoder forsøkes og forskjellige buffere brukes. Mange proteiner har en tendens til å ikke-spesifikt binde seg til de metallchelaterende harpikslignende ZADene nevnt i denne artikkelen; I slike tilfeller vil MBP / GST-nedtrekk generelt være tilstrekkelig uten et gjensidig eksperiment som bare kan brukes til proteinuttrykkskontroll. Hvis negative kontroller fungerer bra, bør proteinuttrykkstiden reduseres, og buffersystemet og reduksjonsmiddelet endres eller reduksjonsmiddelkonsentrasjonen økes, spesielt ved arbeid med cysteinrike proteiner. Ved dårlig reproduserbarhet av resultater, bør det tas hensyn til celleforstyrrelsestrinnet, som skal utføres raskt, men uten overoppheting. Temperaturen bør overvåkes gjennom hele forsøket.
Denne metoden kan enkelt modifiseres for å studere multiproteinkomplekser eller ribonukleoproteiner. En annen mulig anvendelse er batchtesting av proteinkompleksuttrykk og rensingsbetingelser for senere studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Russian Science Foundation-prosjektene 19-74-30026 (metodeutvikling og validering) og 19-74-10099 (protein-proteininteraksjonsanalyser); og av departementet for vitenskap og høyere utdanning i Russland-stipend 075-15-2019-1661 (analyse av representative protein-protein-interaksjoner).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S.
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).
- Bonchuk, A., et al. Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).
- Nair, S. K., Burley, S. K. X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors. Cell. 112 (2), 193-205 (2003).
- Badonyi, M., Marsh, J. A. Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly. Elife. 11, 79602 (2022).
- Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins. Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).
- Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G.
- Shiber, A., et al. Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling. Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).
- Shieh, Y. W., et al. Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria. Science. 350 (6261), 678-680 (2015).
- Bertolini, M., et al. Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly. Science. 371 (6524), 57-64 (2021).
- Bonchuk, A. N., et al. Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).
- Justin, N., et al. Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2. Nature Communications. 7, 11316 (2016).
- Lariviere, L., et al.
- Taylor, N. M., et al. Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction. Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).
- Samara, N. L., et al. Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module. Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).
- Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module. Cell. 141 (4), 606-617 (2010).
- Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems. Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).
- Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids. Cell. 32 (1), 119-129 (1983).
- Nijkamp, H. J., et al. The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13. Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).
- Som, T., Tomizawa, J. Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030. Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).
- Tsao, K. L., Waugh, D. S. Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase. Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).
- Nallamsetty, S., Waugh, D. S. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).
- Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70 (2019).
- Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells. Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).
- Fiebitz, A., et al. High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays. BMC Genomics. 9, 68 (2008).
- Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins. Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).
- Maksimenko, O., et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).
- Sabirov, M., et al. Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16 (2021).
- Dong, S., Provart, N. J. Analyses of protein interaction networks using computational tools. Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).
