Summary
Aqui, descrevemos um método para a co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas usando um conjunto de vetores compatíveis, seguido pelas técnicas convencionais de pulldown para estudar complexos proteicos que não podem se montar in vitro.
Abstract
Pulldown é um ensaio de interação proteína-proteína fácil e amplamente utilizado. No entanto, tem limitações no estudo de complexos proteicos que não se reúnem efetivamente in vitro. Tais complexos podem exigir montagem co-translacional e a presença de chaperonas moleculares; ou formam oligômeros estáveis que não podem dissociar e reassociar in vitro ou são instáveis sem um parceiro de ligação. Para superar esses problemas, é possível utilizar um método baseado na co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas utilizando um conjunto de vetores compatíveis seguidos pelas técnicas convencionais de pulldown. O fluxo de trabalho é mais eficiente em termos de tempo em comparação com o pulldown tradicional, porque não possui as etapas demoradas de purificação separada de proteínas que interagem e sua incubação seguinte. Outra vantagem é uma maior reprodutibilidade devido a um número significativamente menor de etapas e um menor período de tempo em que as proteínas que existem dentro do ambiente in vitro são expostas à proteólise e oxidação. O método foi aplicado com sucesso para estudar uma série de interações proteína-proteína quando outras técnicas in vitro foram consideradas inadequadas. O método pode ser usado para testar em lote as interações proteína-proteína. Resultados representativos são mostrados para estudos de interações entre o domínio BTB e proteínas intrinsecamente desordenadas, e de heterodímeros de domínios associados ao dedo de zinco.
Introduction
O pulldown convencional é amplamente utilizado para estudar as interações proteína-proteína1. No entanto, as proteínas purificadas muitas vezes não interagem efetivamente in vitro2,3, e algumas delas são insolúveis sem seu parceiro de ligação 4,5. Tais proteínas podem necessitar de montagem co-translacional ou da presença de chaperonas moleculares 5,6,7,8,9. Outra limitação do pulldown convencional é o teste de possível atividade de heteromultimerização entre domínios que podem existir como homooligômeros estáveis montados co-translacionalmente 8,10, pois muitos deles não conseguem dissociar e reassociar in vitro durante o tempo de incubação. A co-expressão mostrou-se útil na superação de tais problemas 3,11. A co-expressão usando vetores compatíveis em bactérias foi utilizada com sucesso para purificar grandes complexos macromoleculares multi-subunidades, incluindo o complexo repressivo policomb PRC212, o módulo de cabeça mediador da RNA polimerase II13, a placa de base do bacteriófago T4 14, o módulo 15,16 da desubiquitinilase do complexo SAGA 15,16 e a ferritina 17. As origens de replicação comumente usadas para coexpressão são ColE1, p15A18, CloDF1319 e RSF20. No sistema de expressão Duet comercialmente disponível, essas origens são combinadas com diferentes genes de resistência a antibióticos e convenientes múltiplos locais de clonagem para produzir vetores policistrônicos, permitindo a expressão de até oito proteínas. Essas origens têm diferentes números de cópia e podem ser usadas em combinações variadas para alcançar níveis de expressão equilibrados de proteínas-alvo21. Para testar as interações proteína-proteína, várias tags de afinidade são usadas; os mais comuns são 6xHistidina, glutationa-S-transferase (GST) e proteína ligadora de maltose (MBP), cada uma das quais tem uma afinidade específica com a resina correspondente. GST e MBP também aumentam a solubilidade e a estabilidade das proteínas marcadas22.
Vários métodos envolvendo a co-expressão de proteínas em células eucarióticas também foram desenvolvidos, o mais proeminente dos quais é o ensaio híbrido de levedura dupla (Y2H)23. O ensaio Y2H é barato, fácil e permite o teste de múltiplas interações; no entanto, seu fluxo de trabalho leva mais de 1 semana para ser concluído. Há também alguns ensaios baseados em células de mamíferos menos utilizados, por exemplo, ensaio fluorescente de dois híbridos (F2H)24 e ensaio de interação proteína-proteína de matriz celular (CAPPIA)25. O ensaio F2H é relativamente rápido, permitindo observar interações proteicas em seu ambiente celular nativo, mas envolve o uso de equipamentos de imagem caros. Todos esses métodos têm uma vantagem sobre a expressão procariótica, proporcionando a tradução eucariótica nativa e o ambiente de dobramento; no entanto, eles detectam a interação indiretamente, seja por ativação transcricional ou por transferência de energia fluorescente, que muitas vezes produz artefatos. Além disso, as células eucarióticas podem conter outros parceiros de interação de proteínas de interesse, o que pode interferir no teste de interações binárias entre proteínas de eucariotas superiores.
O presente estudo descreve um método para a co-expressão bacteriana de proteínas diferencialmente marcadas seguido de técnicas convencionais de pulldown. O método permite estudar as interações entre proteínas-alvo que requerem co-expressão. É mais eficiente em termos de tempo em comparação com o pulldown tradicional, permitindo o teste em lote de vários alvos, o que o torna vantajoso na maioria dos casos. A co-expressão usando vetores compatíveis é mais conveniente do que a co-expressão policistrônica, uma vez que não requer uma etapa de clonagem trabalhosa.
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Protocol
A representação esquemática do fluxo de trabalho do método é mostrada na Figura 1.
1. Co-transformação de E. coli
- Preparar vetores de expressão para proteínas-alvo usando métodos de clonagem padrão.
NOTA: Normalmente, um bom ponto de partida é usar vetores pGEX/pMAL convencionais com um gene de resistência à ampicilina e origem ColE1 para a expressão de proteínas marcadas com GST/MBP e um vetor compatível com origem p15A ou RSF e resistência à canamicina para expressar proteínas marcadas com 6xHis, em alguns casos combinadas com tioredoxina ou SUMO-tag para aumentar a solubilidade. Normalmente, várias combinações de tags precisam ser testadas antes do experimento. O método descrito em si é conveniente para testar em lote as condições de expressão das proteínas-alvo. É importante notar que a maioria das cepas Rosetta já contém o plasmídeo com origem p15A para expressar os tRNAs para códons raros; portanto, se o uso de tais cepas é uma opção possível, os plasmídeos p15A devem ser evitados. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes.- Cultivar bactérias de uma estirpe apropriada em meio de Luria-Bertani (LB) a 37 °C para uma densidade óptica (OD) de 0,1-0,2. A cepa BL21(DE3) foi utilizada como exemplo neste estudo.
NOTA: Recomenda-se o uso de células competentes recém-preparadas para alcançar uma cotransformação eficiente com dois vetores. Se mais de dois vetores precisarem ser cotransformados, é melhor transformá-los sequencialmente para alcançar uma boa eficiência de transformação. A eletroporação é uma boa alternativa. - Centrifugar 1,0 ml da suspensão bacteriana durante 1 min a 9.000 x g a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
- Adicione 0,5 mL de tampão de transformação de tampão gelado (TB) (MOPS de 10 mM [pH 6,7], KCl de 250 mM, MnCl2 de 55 mM e CaCl2 de 15 mM) e incube por 10 min no gelo.
- Centrifugar durante 30 s a 8.000 x g a 4 °C e eliminar o sobrenadante.
- Adicione 100 μL de tampão TB, adicione 100 ng de cada vetor e incube por 30 minutos no gelo. Transforme separadamente vetores únicos para estudar o comportamento das proteínas sem co-expressão. Além disso, co-transformam vetores de expressão em pares com vetores de co-expressão vazios para controles de vinculação não específicos.
NOTA: Nos exemplos fornecidos neste estudo, vetores pGEX/pMAL com cDNAs correspondentes fundidos a cDNAs GST/MBP foram usados em combinação com vetores derivados de pACYC compatíveis com domínios de proteína parceira codificadores de cDNA fundidos ao cDNA com cDNA de tioredoxina cDNA. - Aqueça a 42 °C durante 150 s e, em seguida, arrepie durante 1 min no gelo.
- Adicionar 1 ml de meio LB líquido sem antibióticos e incubar a 37 °C durante 90 min. Placa em placas de ágar LB contendo 0,5% de glicose e antibióticos correspondentes (as concentrações comuns são: 50 mg/L de ampicilina; 20 mg/L de canamicina; 50 mg/L de estreptomicina; 35 mg/L de cloranfenicol). Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
- Cultivar bactérias de uma estirpe apropriada em meio de Luria-Bertani (LB) a 37 °C para uma densidade óptica (OD) de 0,1-0,2. A cepa BL21(DE3) foi utilizada como exemplo neste estudo.
2. Expressão
- Lavar as células da placa com 2 mL de meio LB líquido em 50 mL de LB media com antibióticos correspondentes (as concentrações comuns são: 50mg/L de ampicilina; 20 mg/L de canamicina; 50 mg/L de estreptomicina; 35 mg/L de cloranfenicol). Adicione íons metálicos ou outros cofatores conhecidos (nos exemplos fornecidos neste estudo, 0,2 mM ZnCl2 foi adicionado ao meio). Conservar uma alíquota com 20% de glicerol a -70 °C para uma repetição subsequente da experiência.
NOTA: Recomenda-se lavar várias colônias diretamente da placa para excluir a possibilidade de má expressão em um único clone isolado devido a eventos ocasionais de recombinação entre dois plasmídeos. - Cultivar as células com uma rotação constante de 220 rpm a 37 °C a uma OD de 0,5-0,7, arrefecer até à temperatura ambiente (RT) e adicionar isopropilo β-D-1-thiogalactopiranóside (IPTG) a 1 mM. Armazenar uma alíquota de 20 μL de suspensão celular como controlo da amostra não induzida.
- Incubar as células com uma rotação constante de 220 rpm a 18 °C durante a noite.
NOTA: O tempo e a temperatura ideais de incubação podem variar; 18 °C durante a noite funciona melhor para a maioria das proteínas e é aconselhável ser tentado por padrão. Reduza o tempo de incubação para 2-3 h se for observada uma forte ligação não específica. - Divida a suspensão bacteriana em duas partes (ou mais se mais de duas etiquetas diferentes foram usadas) e armazene uma alíquota de 20 μL da suspensão celular para confirmar a expressão da proteína. Centrífuga a 4.000 x g por 15 min.
NOTA: Ponto de pausa: os pellets bacterianos podem ser armazenados a -70 °C durante pelo menos 6 meses.
3. Ensaio suspenso
NOTA: Os procedimentos detalhados são descritos para proteínas marcadas com 6xHis ou MBP/GST. Todos os procedimentos são realizados a 4°C.
- Ressussuscite os pellets bacterianos em 1 mL de tampão de lise gelada com inibidores de protease e agentes redutores (ver abaixo) adicionados imediatamente antes do experimento. Evite o ditiotreitol (TDT) ao usar resinas quelantes de metal, uma vez que retira os íons metálicos. Ajustar a composição tampão para as proteínas testadas. As receitas comuns de tampões de lise encontradas adequadas para a maioria das proteínas são:
- 6xHis-pulldown: Misture 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, 0,1% NP40, 10% [p/p] de glicerol, 5 mM de beta-mercaptoetanol, 1 mM de fenilmetilsfulfonilfluoreto (PMSF) e uma diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease (ver Tabela de Materiais).
- Pulldown GST ou MBP: Misture 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [p/p] de glicerol, 5 mM de TDT, 1 mM PMSF e uma diluição de 1:1.000 do coquetel inibidor de protease (ver Tabela de Materiais).
- Perturbe as células por sonicação no gelo. Armazenar uma alíquota de 20 μl para eletroforese.
NOTA: Normalmente, são necessários 20-25 pulsos de 5 s com intervalos de 15 s com potência de saída de 20 W por amostra. O poder de sonicação apropriado deve ser ajustado para cada instrumento para evitar o superaquecimento e garantir a interrupção total da célula. Para obter um melhor desempenho, é altamente recomendável usar sondas sonicatoras de várias pontas de alto rendimento. - Centrífuga a 20.000 x g por 30 min. Coletar 20 μL do lisado clarificado para posterior análise SDS-PAGE.
- Equilibrar a resina (50 μL para cada amostra) com 1 mL de tampão de lise gelada por 10 min, centrifugar a 2.000 x g por 30 s e descartar o sobrenadante.
- Adicionar lisados celulares (concentração de proteína total: 20-50 mg/mL) à resina, incubar por 10 min a uma rotação constante de 15 rpm, centrifugar a 2.000 x g por 30 s e descartar o sobrenadante. Coletar 20 μL da fração não ligada para análise SDS-PAGE subsequente.
- Adicione 1 mL de tampão de lavagem gelada e incube por 1 min. Centrifugar a 2.000 x g por 30 s e descartar o sobrenadante. As receitas comuns para amortecedores de lavagem são:
- 6xHis-pulldown: Misture 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazol, 0,1% NP40, 10% [p/p] de glicerol e 5 mM de beta-mercaptoetanol.
- Pulldown GST ou MBP: Misture 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, 0,1% NP40, 10% [p/p] de glicerol e 5 mM de TDT.
- Realize duas lavagens longas: adicione 1 mL de tampão de lavagem gelado, incube por 10-30 min com uma rotação constante de 15 rpm, centrifugar a 2.000 x g por 30 s e descarte o sobrenadante.
- Adicione 1 mL de tampão de lavagem gelada, incube por 1 min, centrifuga a 2.000 x g por 30 s e descarte o sobrenadante.
- Eluir as proteínas ligadas com 50 μL do tampão de eluição em um agitador a 1.200 rpm por 10 min. As receitas comuns de buffers de eluição são:
- 6xHis-pulldown: Misture 30 mM HEPES (pH 7,5), 400 mM NaCl, 300 mM imidazol e 5 mM beta-mercaptoetanol.
- GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutationa (ajustado para pH 7,5 com Tris básico) e 5 mM TDT.
- MBP-pulldown: Misture 20 mM Tris (pH 7,5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM de maltose e 5 mM de TDT.
- Analise as proteínas eluídas com SDS-PAGE.
NOTA: A percentagem de acrilamida deve ser ajustada ao tamanho das proteínas. Nos exemplos fornecidos neste estudo, foram utilizados géis de acrilamida a 12%, funcionando em tampão tris-glicina-SDS (2 mM Tris, 250 mM de glicina, 0,1% SDS) em tensão constante de 180 V. Os géis foram corados por ebulição em azul de Coomassie a 0,2% R250, ácido acético a 10% e isopropanol a 30%, e descorados por ebulição em ácido acético a 10%. A quantidade de proteína carregada não deve ser igual, uma vez que várias quantidades de proteínas que interagem podem ser puxadas para baixo em diferentes experimentos.
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Representative Results
O método descrito foi utilizado rotineiramente com muitos alvos diferentes. Apresentamos aqui alguns resultados representativos que provavelmente não podem ser obtidos usando técnicas convencionais de pulldown. O primeiro é o estudo da dimerização específica do ZAD (domínio associado ao dedo do zinco)11. As ZADs formam dímeros estáveis e específicos, com heterodímeros possíveis apenas entre domínios intimamente relacionados dentro de grupos parálogos. Os dímeros formados por esses domínios são estáveis e não se dissociam por pelo menos alguns dias; assim, a mistura de ZADs purificadas não produz nenhuma ligação detectável. Ao mesmo tempo, a co-expressão de ZADs fundidos com MBP e tiorredoxina-6xHis mostra boa e reprodutível atividade de homodimerização (Figura 2A), aparecendo como uma banda adicional nos resultados do SDS-PAGE do ensaio MBP-pulldown. Uma pequena porção de heterodímeros pode ser observada com M1BP co-expressa com outro domínio; essa interação não foi confirmada com Y2A e, muito provavelmente, é resultado de associação inespecífica devido à alta concentração de proteínas, uma vez que esses domínios são ricos em cisteína e extremamente propensos à agregação. Notavelmente, neste caso, 6xHis-pulldown é inadequado, pois os ZADs são domínios de coordenação de metais que não se ligam especificamente à resina quelante de metais. Tal atividade deve ser cuidadosamente examinada em um experimento paralelo.
Outro exemplo é o ensaio de competição entre a proteína ENY2 e seus parceiros de ligação Sgf11 (1-83aa) e o domínio zinco-dedo (460-631 aa) da proteína CTCF26. Quando expressa isoladamente, a proteína ENY2 forma dímeros que a impedem de interagir com seus parceiros de ligação nativos. Presumivelmente, as proteínas Sgf11 e CTCF ligam-se à mesma superfície molecular do ENY2, tornando a sua interação mutuamente exclusiva. No ensaio de co-expressão, o ENY2 com marcação 6xHis interagiu tanto com o Sgf11 marcado com GST quanto com o MBP-CTCF, mas nenhum GST-Sgf11 estava presente nos pulldowns MBP e vice-versa, (Figura 2B). Esses resultados sugerem que nenhum complexo triplo pode ser formado, e as interações são mutuamente exclusivas. Esses dados foram confirmados de forma independente com outros ensaios e suportam os diferentes papéis funcionais do ENY2 nesses complexos. Deve-se chamar a atenção para o fato de que grandes marcas de afinidade podem impor obstáculos estéricos por si só, impedindo a formação complexa; por conseguinte, a conclusão não deve basear-se apenas em dados de co-expressão.
Uma comparação passo a passo dos fluxos de trabalho de pulldowns de coexpressão convencionais e acoplados é mostrada na Figura 3A. O pulldown acoplado à coexpressão é pelo menos duas vezes mais eficiente em termos de tempo, mesmo com um pequeno número de amostras, e permite uma boa escalabilidade. Os resultados da utilização de ambas as técnicas para estudar a mesma interação entre o domínio BTB da proteína CP190 (1-126aa) e o domínio C-terminal marcado com GST (610-818aa) da proteína Drosophila CTCF (dCTCF) são mostrados na Figura 3B. Ambos os métodos apresentam boa eficiência e reprodutibilidade (ensaios foram realizados em três repetições); para este caso, o pulldown acoplado à coexpressão apresentou menor ligação não específica, como pode ser observado nas amostras controle apenas com proteína GST.
Figura 1: A representação esquemática do protocolo. O esquema mostra o método de fluxo de trabalho empregado neste estudo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados representativos . (A) Estudo da homodimerização do domínio associado ao dedo de zinco (ZAD) nos ensaios de MBP e 6xHis-pulldown. ZADs fundidos com MBP (40 kDa) ou com 6xHis-Tioredoxina (20 kDa) foram co-expressos em células bacterianas e afinidade purificada com resina de amilose (liga proteínas marcadas com MBP) ou com resina Ni-NTA (liga proteínas marcadas com 6xHis). Proteínas copurificadas foram visualizadas com SDS-PAGE seguida de coloração Coomassie. Os resultados do MBP-pulldown são mostrados nos painéis superiores, os resultados do 6xHis-pulldown são nos painéis inferiores (usados apenas como controle de expressão de proteínas, uma vez que muitos ZADs se ligam não especificamente ao Ni-NTA). (B) Estudo de interações mutuamente exclusivas entre as proteínas ENY2 e Sgf11/CTCF. Sgf11 (1-81aa), CTCF com marcação GST (460-631aa) e 6xHis, proteínas ENY2 marcadas com MBP foram coexpressas em várias combinações e afinidade purificadas com resina de amilose, resina de glutationa (liga proteínas marcadas com GST) ou com resina Ni-NTA. Proteínas copurificadas foram visualizadas com SDS-PAGE seguida de coloração Coomassie. A figura nos painéis A e B foi modificada com permissão de Bonchuk et al.11 e Bonchuk et al.26. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação de fluxos de trabalho de ensaios pulldown de co-expressão convencionais e acoplados. (A) Comparação passo a passo dos intervalos de tempo necessários no fluxo de trabalho do ensaio pulldown convencional em comparação com o pulldown acoplado à co-expressão. (B) Comparação de duas técnicas diferentes de pulldown no estudo da interação entre o domínio C-terminal dCTCF (610-818aa) e o domínio BTB da proteína CP190 (1-126aa) em ensaios GST-pulldown. dCTCF (610-818aa) fundidos com GST (25kDa) ou GST sozinhos foram co-expressos em células bacterianas ou incubados in vitro com Thioredoxin-6xHis-tagged CP190 BTB e afinidade purificada com resina de glutationa. Três réplicas independentes de cada ensaio são mostradas. Proteínas copurificadas foram visualizadas com SDS-PAGE seguida de coloração Coomassie. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método descrito permite o teste de interações proteína-proteína que não podem ser eficientemente montadas in vitro e requerem co-expressão. O método é uma das poucas abordagens adequadas para o estudo de proteínas heterodimerizantes, que também são capazes de homodimerização, uma vez que, quando purificadas separadamente, essas proteínas formam homodímeros estáveis que, na maioria das vezes, não conseguem dissociar e reassociar durante o experimento 3,11.
O fluxo de trabalho do método descrito é mais eficiente em termos de tempo em comparação com o pulldown tradicional, porque não possui as etapas demoradas de purificação separada de proteínas interagindo e sua incubação seguinte. Outra vantagem é uma maior reprodutibilidade, devido a um número significativamente menor de etapas e um menor período de tempo em que as proteínas existem dentro de um ambiente artificial in vitro enquanto são expostas à proteólise e oxidação. O método foi aplicado com sucesso para o estudo de diversas interações proteína-proteína quando outras técnicas in vitro se mostraram inadequadas 3,11,27. A coprecipitação paralela com diferentes tags de afinidade fornece controle do nível de expressão de proteínas. Como o método é mais fácil e rápido do que o pulldown convencional, ele pode ser usado em vez dele, mesmo que a co-expressão não seja absolutamente necessária. A velocidade de ruptura celular é um gargalo não óbvio que pode aumentar significativamente o tempo total e pode levar a um desvio nos resultados, devido à quantidade de tempo entre a primeira e a última amostra sendo exposta a condições in vitro e proteólise. Assim, o uso de sondas sonicator multi-ponta de alto rendimento é altamente recomendado; consulte a Tabela de Materiais para obter exemplos.
O uso de esferas magnéticas pode diminuir a ligação não específica e acelerar ainda mais o método, reduzindo o tempo necessário para as etapas de lavagem. O uso de vetores com origens compatíveis tem uma vantagem sobre a expressão policistrônica, pois eles fornecem uma abordagem combinatória conveniente para testar múltiplas interações proteicas com o mesmo alvo e não exigem a produção de um novo vetor para cada combinação.
Uma desvantagem do método é a probabilidade relativamente alta de resultados falso-positivos, já que as proteínas são co-expressas em bactérias em altas concentrações. Assim, interações inesperadas descobertas por esse método devem ser tratadas com cautela e testadas com um ensaio independente, como o Y2A ou técnicas celulares24, que também utiliza a coexpressão 3,11,28. Abordagens bioinformáticas de alto rendimento também podem ser usadas para analisar e validar redes complexas de interação proteína-proteína29. Outro obstáculo peculiar é que os complexos proteicos podem ter propriedades bioquímicas completamente diferentes em comparação com proteínas separadas; o complexo pode ser insolúvel enquanto seus componentes estão presentes na solução. Este problema normalmente pode ser resolvido fundindo as proteínas com a etiqueta de solubilidade apropriada. O MBP é o mais eficaz, enquanto o NusA é outra boa alternativa geral22. A GST-tag mostrou-se eficiente com muitos domínios de coordenação de zinco, embora, por ser dimérica, deva ser evitada ao trabalhar com domínios oligoméricos. Pelo contrário, pequenos domínios monoméricos, como tioredoxina e sumô, funcionam bem com domínios proteicos multiméricos.
As etapas críticas do método descrito são o tempo adequado de expressão da proteína (um tempo mais curto é necessário se a ligação não específica for observada, enquanto tempos de incubação mais longos podem ser necessários para melhorar a baixa expressão de proteínas), ruptura celular rápida, escolha adequada de tampões e manutenção da temperatura constante durante o protocolo. Tempos de incubação excessivos após a indução podem resultar em agregação de proteínas em bactérias, levando a resultados falso-positivos. Por outro lado, algumas proteínas requerem mais tempo para serem expressas em quantidades suficientes. Flutuações de temperatura durante as etapas de sonicação e lavagem podem levar a mudanças no pH do tampão e na precipitação de proteínas. A escolha inadequada do tampão também pode resultar em agregação proteica inespecífica.
No caso de má expressão proteica, diferentes marcas de solubilidade devem ser tentadas, bem como um aumento do tempo de incubação após a indução. Se uma forte associação não específica for observada, todos os controles negativos necessários devem ser executados para determinar a possível associação não específica de proteínas com resina ou a marca de afinidade. Caso os controles não funcionem, diferentes combinações de marcas de afinidade devem ser tentadas e diferentes buffers usados. Muitas proteínas tendem a se ligar não especificamente às ZADs semelhantes a resinas quelantes de metais mencionadas neste artigo; nesses casos, o pulldown MBP/GST, em geral, seria suficiente sem um experimento recíproco que possa ser usado apenas para o controle da expressão de proteínas. Se os controles negativos funcionarem bem, o tempo de expressão da proteína deve ser diminuído e o sistema tampão e o agente redutor alterados ou a concentração do agente redutor aumentada, especialmente quando se trabalha com proteínas ricas em cisteína. No caso de má reprodutibilidade dos resultados, deve-se prestar atenção à etapa de ruptura celular, que deve ser realizada rapidamente, mas sem superaquecimento. A temperatura deve ser monitorada durante todo o experimento.
Este método pode ser facilmente modificado para estudar complexos multiproteicos ou ribonucleoproteínas. Outra aplicação possível é o teste em lote de condições de expressão e purificação de complexos proteicos para estudos subsequentes.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos projetos da Fundação Russa de Ciência 19-74-30026 (desenvolvimento e validação de métodos) e 19-74-10099 (ensaios de interação proteína-proteína); e pelo Ministério da Ciência e Ensino Superior da Federação Russa - concessão 075-15-2019-1661 (análise de interações representativas proteína-proteína).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-ELEMENT probe | Sonics | 630-0586 | The high throughput 8-element sonicator probes |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amylose resin | New England Biolabs | E8021 | Resin for purification of MBP-tagged proteins |
| Antibiotics | AppliChem | A4789 (kanamycin); A0839 (ampicillin) | |
| Beta-mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | Resin for purification of GST-tagged proteins |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | Resin for purification of 6xHis-tagged proteins |
| Imidazole | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | Vector for co-expression of proteins with p15A replication origin |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonicator | Sonics | CV334 | Ultrasonic liquid processor |
| ZnCl2 | AppliChem | A6285 |
References
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