Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التعبير عن الجينات المحورة في ظهارة المسالك البولية في المثانة الأصلية باستخدام النقل بوساطة الفيروس الغدي

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

يتم وصف طرق لتوليد كميات كبيرة من الفيروسات الغدية المؤتلفة ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحويل ظهارة القوارض الأصلية مما يسمح بالتعبير عن الجينات المحورة أو خفض تنظيم منتجات الجينات الداخلية.

Abstract

بالإضافة إلى تشكيل حاجز عالي المقاومة ، يفترض أن الظهارة البولية المبطنة للحوض الكلوي والحالب والمثانة والإحليل القريب لاستشعار ونقل المعلومات حول بيئتها إلى الأنسجة الكامنة ، مما يعزز وظيفة الإفراغ والسلوك. يمكن أن يؤدي تعطيل حاجز الظهارة البولية ، أو وظيفته الحسية / محول الطاقة ، إلى المرض. تعوق دراسة هذه الأحداث المعقدة عدم وجود استراتيجيات بسيطة لتغيير التعبير الجيني والبروتيني في الظهارة البولية. يتم وصف الطرق هنا التي تسمح للمحققين بتوليد كميات كبيرة من الفيروس الغدي عالي العيار ، والذي يمكن استخدامه بعد ذلك لتحويل ظهارة القوارض بكفاءة عالية ، وبطريقة مباشرة نسبيا. يمكن التعبير عن كل من cDNAs والحمض النووي الريبي الصغير المتداخل باستخدام نقل الفيروس الغدي ، ويمكن تقييم تأثير التعبير الجيني على وظيفة الظهارة البولية بعد 12 ساعة إلى عدة أيام. هذه الطرق لها قابلية تطبيق واسعة على دراسات بيولوجيا الظهارة البولية الطبيعية وغير الطبيعية باستخدام نماذج الفئران أو الفئران.

Introduction

الظهارة البولية هي الظهارة المتخصصة التي تبطن الحوض الكلوي والحالب والمثانة والإحليل القريب1. وهو يتألف من ثلاث طبقات: طبقة من الخلايا المظلة ثنائية النواة شديدة التمايز والاستقطاب في كثير من الأحيان، والتي تغمرها أسطحها القمية في البول؛ وطبقة من الخلايا المظلية ثنائية النواة شديدة التمايز والاستقطاب، التي تغمرها أسطحها القمية في البول؛ وطبقة من الخلايا المظلية ثنائية النواة شديدة التمايز والاستقطاب، التي تغمرها أسطحها القمية في البول؛ و طبقة خلية وسيطة مع مجموعة من الخلايا العابرة ثنائية النواة التي يمكن أن تؤدي إلى خلايا مظلة سطحية استجابة لفقدانها الحاد ؛ وطبقة واحدة من الخلايا القاعدية ، تعمل مجموعة فرعية منها كخلايا جذعية يمكنها تجديد كامل الظهارة البولية استجابة للإصابة المزمنة. الخلايا المظلية مسؤولة بشكل رئيسي عن تشكيل حاجز الظهارة البولية عالي المقاومة ، وتشمل مكوناته غشاء قمي (غني بالكوليسترول والمخيبروسيدات) مع نفاذية منخفضة للماء والمواد المذابة ، ومركب وصلة قمي عالي المقاومة (يتكون من تقاطعات ضيقة ، وتقاطعات ملتصقة ، وديسموسومات ، وحلقة أكتوميوسين مرتبطة بها) 1 . يتمدد كل من السطح القمي للخلية المظلية وحلقتها الموصلة أثناء ملء المثانة ويعودان إلى حالتهما المملوءة مسبقا بسرعة بعد إفراغ1،2،3،4،5. بالإضافة إلى دورها في وظيفة الحاجز ، يفترض أيضا أن يكون للظهارة البولية وظائف حسية ومحول طاقة تسمح لها باستشعار التغيرات في الوسط خارج الخلية (على سبيل المثال ، التمدد) ونقل هذه المعلومات عن طريق إطلاق الوسطاء (بما في ذلك ATP والأدينوزين والأسيتيل كولين) إلى الأنسجة الكامنة ، بما في ذلك عمليات العصب الوارد تحت الظهارة6،7،8 . تم العثور على أدلة حديثة على هذا الدور في الفئران التي تفتقر إلى التعبير البولية لكل من Piezo1 و Piezo2 ، مما يؤدي إلى تغيير وظيفة الإفراغ9. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفئران التي تفرط في التعبير عن البروتين CLDN2 المكون للمسام ذات الوصلات الضيقة في طبقة الخلية المظلة تصاب بالتهاب وألم مشابه لتلك التي تظهر في المرضى الذين يعانون من التهاب المثانة الخلالي10. من المفترض أن اضطراب وظيفة الظهارة البولية الحسية / محول الطاقة أو الحاجز قد يساهم في العديد من اضطرابات المثانة 6,11.

يعتمد الفهم الأفضل لبيولوجيا الظهارة البولية في الحالات الطبيعية والمرضية على توافر الأدوات التي ستسمح للمحققين بتقليل تنظيم التعبير الجيني الداخلي بسهولة أو السماح بالتعبير عن الجينات المحورة في الأنسجة الأصلية. في حين أن أحد الأساليب لتقليل تنظيم التعبير الجيني هو توليد فئران بالضربة القاضية الشرطية ، فإن هذا النهج يعتمد على توافر الفئران ذات الأليلات المتخبطة ، وهو كثيف العمالة ، ويمكن أن يستغرق شهورا إلى سنوات لإكمال12. ليس من المستغرب إذن أن يطور الباحثون تقنيات لنقل أو تحويل الظهارة البولية ، والتي يمكن أن تؤدي إلى نتائج على نطاق زمني أقصر. تشمل الطرق المنشورة للنقل استخدام الدهون الكاتيونية13 ، أو oligodeoxynucleotides المضادة للفسفور14 ، أو الأحماض النووية المضادة للحساسية المربوطة ببروتين فيروس نقص المناعة البشرية TAT الذي يخترق 11-merpeptide 15. ومع ذلك ، فإن تركيز هذا البروتوكول ينصب على استخدام التنبيغ بوساطة غدية ، وهي منهجية مدروسة جيدا وفعالة في توصيل الجينات إلى مجموعة واسعة من الخلايا ، وقد تم اختبارها في العديد من التجارب السريرية ، وتم استخدامها مؤخرا لتوصيل cDNA الذي يشفر بروتين قفيصة COVID-19 إلى متلقي متغير واحد من لقاح COVID-1916 ، 17. للحصول على وصف أكثر شمولا لدورة حياة الفيروس الغدي ، ونواقل الفيروسات الغدية ، والتطبيقات السريرية للفيروسات الغدية ، يتم توجيه القارئ إلى المرجع17.

كان معلما مهما في استخدام الفيروسات الغدية لتحويل الظهارة البولية ، تقريرا أعده Ramesh et al. أظهر معالجات مسبقة قصيرة بالمنظفات ، بما في ذلك N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) عززت بشكل كبير نقل الظهارة البولية بواسطة تشفير الفيروس الغدي β-galactosidase18. باستخدام دراسة إثبات المبدأ هذه كدليل ، تم الآن استخدام نقل الظهارة البولية بوساطة غدية للتعبير عن مجموعة متنوعة من البروتينات ، بما في ذلك GTPases من عائلة Rab ، وعوامل تبادل الجوانين ونوكليوتيدات ، وشظايا محرك الميوسين ، والكلاودينات المرتبطة بالوصلات الضيقة المكونة للمسام ، و ADAM17 10،19،20،21،22 . تم تكييف نفس النهج للتعبير عن الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siRNA) ، والذي تم إنقاذ آثاره من خلال التعبير المشترك عن المتغيرات المقاومة ل siRNA من الجيناتالمحورة 22. يتضمن البروتوكول الموصوف هنا طرقا عامة لتوليد كميات كبيرة من الفيروس الغدي عالي التركيز ، وهو مطلب لهذه التقنيات ، بالإضافة إلى تعديلات طرق Ramesh et al.18 للتعبير عن جينات التحوير في الظهارة البولية بكفاءة عالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء التجارب التي تنطوي على توليد الفيروسات الغدية ، والتي تتطلب شهادة BSL2 ، بموجب موافقة من مكاتب الصحة والسلامة البيئية بجامعة بيتسبرغ ولجنة السلامة البيولوجية المؤسسية. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات ، بما في ذلك نقل الفيروسات الغدية (الذي يتطلب شهادة ABSL2) ، وفقا للمبادئ التوجيهية / اللوائح ذات الصلة لسياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر وقانون رعاية الحيوان ، وبموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة بيتسبرغ. يتم ارتداء القفازات وحماية العين والزي المناسب لجميع الإجراءات التي تنطوي على الفيروسات المؤتلفة. يجب التخلص من أي نفايات سائلة أو صلبة كما هو موضح أدناه. وينبغي معاملة فراش الحيوانات بعد نقل اللحية وأي جثث حيوانية ناتجة عنها كمواد خطرة بيولوجيا والتخلص منها وفقا للسياسات المؤسسية.

1. تحضير مخزون الفيروسات الغدية عالية العيار

ملاحظة: يعتمد النقل الفعال لمثانات القوارض على استخدام المخزونات الفيروسية النقية والمركزة ، عادة 1 × 107 إلى 1 × 108 جزيئات فيروسية معدية (IVP) لكل ميكرولتر. يركز هذا الجزء من البروتوكول على توليد مخزونات عالية من الفيروسات الغدية من الاستعدادات الحالية للفيروس. يجب تنفيذ جميع الخطوات في غطاء زراعة الخلايا باستخدام الكواشف والأدوات المعقمة. في حين أن السلالات المتاحة من الفيروس الغدي المستخدمة اليوم معيبة في النسخ المتماثل ، فإن معظم المؤسسات تتطلب الموافقة على استخدام الفيروسات الغدية والحمض النووي المؤتلف. يتضمن ذلك غالبا تعيين غرفة زراعة الخلايا كمنشأة معتمدة من BSL2 لإنتاج وتضخيم الفيروسات الغدية. تشمل بعض الاعتبارات العامة استخدام الأقنعة وحماية العين والقفازات والزي المناسب في جميع مراحل إنتاج الفيروس وتنقيته. عند إجراء الطرد المركزي ، يوصى باستخدام أغطية الأمان إذا كانت أنابيب الطرد المركزي تفتقر إلى أغطية ضيقة. تتم معالجة جميع المواد التي لا يمكن التخلص منها ، بما في ذلك أغطية أمان أجهزة الطرد المركزي والزجاجات والدوارات التي يحتمل أن تكون ملوثة بمحلول مضاد للفيروسات (انظر جدول المواد) ، ثم تشطف بالماء أو 70٪ من الإيثانول. تتم معالجة النفايات السائلة عن طريق إضافة المبيض إلى تركيز نهائي بنسبة 10٪ (v / v). وسيعتمد التخلص من هذه النفايات السائلة على السياسات المؤسسية. عادة ما يتم التخلص من النفايات الصلبة في النفايات الخطرة بيولوجيا.

  1. ثقافة خلايا HEK293T
    1. قم بإذابة قارورة مجمدة من خلايا HEK293T في حمام مائي عند 37 درجة مئوية واستخدم ماصة سعة 5 مل لنقل الخلايا إلى طبق زراعة الخلايا بقطر 15 سم. باستخدام ماصة سعة 25 مل ، أضف ببطء 20 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ (v / v) مصل بقري جنيني ومضاد حيوي للبنسلين / الستربتومايسين (DMEM-FBS-PS) إلى الطبق. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا 37 درجة مئوية بالغاز مع 5٪ (v / v) CO 2 حتى تصل إلى التقاء 80٪ -90٪ (~2 × 107 خلايا).
    2. باستخدام ماصة زجاجية متصلة بمصدر فراغ ، قم بشفط الوسط ، ثم اشطف الخلايا عن طريق نقل 20 مل من PBS المعقم (2.7 mM KCl ، 1.5 mM KH 2 PO 4 ، 136.9 mM NaCl ، و 8.9 mMNa 2HPO4) إلى الطبق باستخدام ماصة 25 مل. قم بنضح برنامج تلفزيوني مستهلك ، ثم استخدم ماصة سعة 5 مل لنقل 3 مل من محلول بروتيناز دافئ (37 درجة مئوية) (انظر جدول المواد) إلى الطبق ، واحتضان الطبق في حاضنة زراعة الخلايا حتى تنفصل الخلايا (~ 3-4 دقائق).
      ملاحظة: يمكن تقييم التحلل البروتيني الفعال بشكل أفضل عن طريق إمالة الطبق ببطء ذهابا وإيابا بحثا عن إطلاق الخلايا من جميع أجزاء الطبق إلى السائل المتحرك. خلايا HEK293T حساسة لعلاج البروتيناز الممتد وستموت إذا تركت أكثر من بضع دقائق في محلول البروتيناز.
    3. استخدم ماصة 10 مل لنقل 7 مل من DMEM-FBS-PS إلى طبق الخلايا المنفصلة ، ثم استخدم نفس الماصة لشفط الخلايا والوسط. انقل الخلايا العالقة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، ثم قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي للتعليق في جهاز طرد مركزي سريري منخفض السرعة عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية باستخدام ماصة زجاجية متصلة بمصدر فراغ. استخدم ماصة سعة 25 مل لإعادة تعليق حبيبات الخلية في 15 مل من DMEM-FBS-PS.
    4. أضف 1 مل من معلق الخلية إلى كل من خمسة عشر طبقا مقاس 15 سم تحتوي على 19 مل من DMEM-FBS-PS.
    5. تنمو الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة حتى تصل إلى التقاء 85٪ -90٪ (~ 3-4 أيام).
  2. تحضير محلول فيروس مخفف
    1. أضف ~ 1.5 × 10 9 إلى 3 × 109 IVP من مخزون فيروس موجود (5-10 IVP / خلية) إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل مملوء ب 45 مل من DMEM يفتقر إلى FBS أو المضادات الحيوية.
      ملاحظة: من الممكن استخدام تركيز أقل من الفيروس (1-5 IVP / خلية) ؛ ومع ذلك ، سوف يستغرق إنتاج الفيروس وقتا أطول.
  3. تصيب الخلايا المستزرعة بالفيروس.
    1. باستخدام ماصة زجاجية متصلة بمصدر فراغ ، قم بشفط الوسط من الخلايا المتقاربة تقريبا في الخطوة 1.1.5.
    2. استخدم ماصة سعة 25 مل لنقل 3.0 مل من محلول الفيروس المخفف (المحضر في الخطوة 1.2.1) إلى كل طبق لزراعة الخلايا. بعد ذلك ، استخدم ماصة 10 مل لإضافة 7.0 مل من وسط DMEM (يفتقر إلى FBS أو المضادات الحيوية) إلى كل طبق. احتضن لمدة 60 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا ، ثم أضف 10 مل من DMEM تحتوي على 20٪ (v / v) FBS و 2x PS لكل طبق.
      ملاحظة: إن استخدام أحد الأطباق ال 15 كلوحة تحكم (لا يضاف فيها الفيروس) يجعل من السهل تحديد تقريب الخلايا الناجم عن الفيروس وموتها في الخلايا المصابة في الخطوة التالية.
    3. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 2-4 أيام حتى يبدأ معظمها في التقريب وانفصل >60٪ من الخلايا.
      ملاحظة: في حالة استخدام عيار أقل من الفيروس ، قد يستغرق الأمر ما يصل إلى أسبوع حتى يحدث موت الخلايا. إذا لم يحدث موت الخلايا في غضون أسبوع ، فمن المحتمل أن تحتاج العملية إلى تكرارها باستخدام عيار أعلى من الفيروس.
  4. استعادة الفيروس من محللات الخلية
    1. استخدم مكشطة الخلايا لكشط قاع كل طبق ، وإطلاق الخلايا المرفقة في الوسط.
    2. باستخدام ماصة سعة 25 مل ، قم بجمع وتجميع الوسط والخلايا وحطام الخلية من كل طبق من أطباق زراعة الخلايا في أنبوب زراعة خلية مخروطي سعة 50 مل.
      ملاحظة: لتوفير الموارد ، يمكن دمج الوسيط من طبقين في أنبوب واحد سعة 50 مل.
    3. قم بتجميع المادة الخلوية عن طريق الطرد المركزي باستخدام جهاز طرد مركزي منخفض السرعة على سطح الطاولة: 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة عند 3000 × جم. استخدم ماصة زجاجية متصلة بجهاز تفريغ لشفط المادة الطافية.
    4. استخدم ماصة 10 مل ، جنبا إلى جنب مع التثليث ، لدمج جميع المواد الحبيبية الناتجة في ما مجموعه 7 مل من 100 مللي متر من درجة حموضة Tris-HCl المعقمة المفلترة 7.4 التي تحتوي على 10 mM EDTA (محلول Tris-EDTA). انقل المادة المجمعة إلى أنبوب مخروطي معقم لزراعة الخلايا سعة 15 مل وضعها على الجليد.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تجميد تحضير الفيروس عند -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
  5. تحضير محللات الخلية
    1. قم بإجراء ثلاث دورات تجميد وذوبان لتعطيل الخلايا المتبقية ، وبالتالي زيادة تحرير جزيئات الفيروس المشكلة. قم بتجميد المادة المجمعة في الخطوة 1.4.4 عن طريق غمر الأنبوب في النيتروجين السائل (~ 30-60 ثانية). قم بإذابة العينة بسرعة عن طريق وضع الأنبوب في حاضنة 37 درجة مئوية. دوامة العينة لمدة 15 ثانية ، ثم كرر إجراء التجميد والذوبان السريع 2x إضافي.
      ملاحظة: يمكن إذابة محلول الفيروس بسرعة في درجة حرارة 37 درجة مئوية في حمام مائي ، ولكن هناك ما يبرر الحذر لأن تقلبات درجة الحرارة يمكن أن تتسبب في تصدع الأنبوب ، مما يؤدي إلى إطلاق محلول الفيروس في حمام مائي. لمنع حدوث ذلك ، ضع الأنبوب الذي يحتوي على المادة الطافية الفيروسية في أنبوب أكبر ، ثم يتم وضعه في حمام مائي.
    2. استخدم ماصة سعة 10 مل لنقل المادة الخلوية المذابة بالتجميد ثلاث مرات إلى أنبوب طرد مركزي فائق السرعة. أجهزة الطرد المركزي المواد في الأنبوب لمدة 30 دقيقة عند 4 °C أجهزة الطرد المركزي فائقة السرعة في ~ 18500 × ز.
    3. استرجع ~ 7 مل من المادة الطافية الغنية بالفيروسات باستخدام ماصة 10 مل وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. احتفظ بالعينة على الثلج حتى الخطوة التالية.
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، ضع في اعتبارك الاحتفاظ بقسمة من المادة الطافية الفيروسية غير المنقاة كديباجة لبدء إعداد فيروس جديد (أو كنسخة احتياطية). قم بتخزين هذه القسيمة في -80 درجة مئوية.
  6. عزل وتنقية الفيروس باستخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة.
    1. قم بإعداد تدرج متقطع ل CsCl في أنبوب طرد مركزي فائق شفاف PET سعة 12 مل (انظر جدول المواد) أو ما يعادله. استخدم حقنة سعة 3 مل مزودة بإبرة 18 جم لإدخال 2.5 مل من محلول CsCl سعة 1.4 جم / مل بعناية في قاع الأنبوب ، ثم استخدم حقنة / إبرة جديدة لوضعها في طبقة 2.5 مل من محلول CsCl 1.25 جم / مل.
      ملاحظة: سيؤدي إسقاط المحاليل مباشرة فوق طبقة موجودة مسبقا إلى خلط كبير وغير مرغوب فيه. بدلا من ذلك ، ضع الجزء المشطوف من الإبرة على حافة الأنبوب ، ثم اضغط ببطء شديد على مكبس المحقنة ، وارفع موضع الإبرة بينما يملأ المحلول الأنبوب.
    2. قم بتحميل ~ 7 مل من المادة الطافية الفيروسية أعلى التدرج بطريقة مماثلة باستخدام حقنة سعة 10 مل. إذا كان هناك أكثر من 2-3 مم من المسافة بين المادة الطافية الفيروسية وأعلى الأنبوب ، أضف محلول Tris-EDTA إضافي لملء الأنبوب حتى يتبقى 2-3 مم فقط من المساحة.
    3. اصنع أنبوب توازن معد بالمثل ، يحتوي على طبقات من CsCl ، ولكن استبدل محلول Tris-EDTA بالطافية الفيروسية.
      ملاحظة: يجب أن يكون للأنبوبين أوزان متطابقة (وكثافات مماثلة) لمنع حدوث حالة تحميل غير متوازنة يحتمل أن تكون خطرة في أجهزة الطرد المركزي الفائقة.
  7. عزل الفيروس باستخدام معدل الطرد المركزي المناطقي.
    1. قم بتحميل التدرجات التي تشكلت في الخطوات 1.6.2-1.6.3 في جرافات دوار SW41 أو ما يعادله. المسمار في أغطية دلو ، ووضع الدوار في جهاز طرد مركزي فائق (مبرد مسبقا إلى 4 °C) ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 ساعة في ~ 150,000 × غرام.
    2. أثناء الطرد المركزي ، وازن العمود الموصوف في الخطوة 1.9.1 أدناه.
  8. استعادة جزيئات الفيروس المعزولة
    1. في نهاية خطوة الطرد المركزي ، افصل الدلاء بعناية عن الدوار ، وفي غطاء زراعة الخلايا ، قم بإزالة أغطية الجرافة ، ثم قم بإزالة الأنابيب ووضعها في رف.
    2. اجمع المواد ذات النطاقات ، الغنية بجزيئات الفيروس ، التي تطفو على السطح البيني بين محلول CsCl 1.25 جم / مل و 1.4 جم / مل CsCl. عند إمساك الأنبوب الذي يحتوي على التدرج فوق النصف السفلي من طبق زراعة الخلايا (الذي سيلتقط أي مواد مسكوبة) ، استخدم إبرة 1 بوصة 18 جم متصلة بحقنة سعة 3 مل لثقب الأنبوب بعناية ، أسفل الفيروس المربوط مباشرة. استنشاق الفيروس ببطء ، والذي يتم استرداده عادة في ~ 1 مل.
    3. قم بإزالة الإبرة من الأنبوب ، مما سيؤدي إلى تدفق المادة المتبقية في التدرج من الأنبوب إلى النصف السفلي من طبق زراعة الخلايا (يجب معاملة أي سوائل على أنها نفايات خطرة).
    4. نقل محلول الفيروس في المحقنة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم على الجليد.
      ملاحظة: عند استعادة الفيروس في هذه الخطوة ، ضع الإبرة بحيث يكون تجويف الإبرة متجها لأعلى مع فتح الإبرة على بعد بضعة مم أسفل الشريط الغني بالفيروس. تجنب التلوث بالشريط الرفيع للفيروس الذي تم تجميعه بشكل غير صحيح والذي لوحظ أحيانا 2-3 مم فوق الفيروس ذي النطاقات (انظر السهم الأسود الرفيع في الشكل 1 أ).
  9. قم بإزالة CsCl من العينة عن طريق الترشيح الهلامي.
    1. قم بموازنة عمود PD-10 (معبأ مسبقا ب Sephadex G-25M) ، مثبت بحامل دعم ، مع 50 مل من PBS المعقم المصفى 0.2 ميكرومتر يحتوي على 10٪ (v / v) من الجلسرين.
      ملاحظة: تستغرق خطوة التوازن الأولية 2-3 ساعات لإكمالها وهي ضرورية لضمان الغسل الكامل للمواد الحافظة التي تستخدمها الشركة المصنعة لتثبيت العمود.
    2. اترك محلول الغسيل ينحسر أسفل فريت (قرص واقي من مادة بيضاء في الجزء العلوي من وسط العمود) ، ثم انقل بعناية محلول الفيروس المنقى الذي تم جمعه في الخطوة 1.8 إلى أعلى العمود. اسمح للمحلول الغني بالفيروسات بالانحسار أسفل فريت ، ثم ابدأ في ملء العمود بجلسرين PBS.
      ملاحظة: تتمثل إحدى وظائف فريت في منع العمود من الجفاف. نتيجة لذلك ، يتم التسامح مع التأخيرات القصيرة قبل إضافة المزيد من eluant إلى العمود.
    3. اجمع الشطف في 12 أنبوب طرد مركزي دقيق معقم ، 0.5 مل لكل كسر.
  10. تحديد العائد الفيروسي.
    1. تحديد كسور فيروس الذروة باستخدام القياس الطيفي. قم بإعداد تخفيف 1: 100 لكل كسر في PBS وقم بقياس OD260 في مقياس الطيف الضوئي ، باستخدام تخفيف 1: 100 من المخزن المؤقت وحده كفراغ. يجب أن تتلاشى جزيئات الفيروس في حجم الفراغ ، بدءا من الجزء 6 تقريبا. قم بتجميع الكسور التي تحتوي على أعلى قراءات OD260 .
    2. قم بتخفيف 1: 100 من الكسور الفيروسية المجمعة وأعد قياس OD260. احسب التركيز النهائي لجزيئات الفيروس وعدد IVP في الكسور المجمعة باستخدام الصيغة التالية: جسيمات الفيروس لكل مل = OD260 × 100 (هذا يصحح عامل التخفيف) × 1012. التقدير العام هو أن 1٪ من جزيئات الفيروس هي IVP ، على هذا النحو: IVP / mL = OD 260 × 100 × 1010 أو IVP / μL = OD260 × 100 ×10 7.
  11. قسمة كسور الفيروس المجمعة (التي تحتوي على 5 × 107 إلى 1 × 108 IVP) في أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة أو cryovials. قم بتخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

2. نقل المثانة القوارض

ملاحظة: إذا كانت هذه التقنية جديدة ، فمن المستحسن أن يقتصر عدد الحيوانات التي تم تحويلها في وقت واحد على 2-4. يمكن تحقيق ذلك عن طريق ترتيب أوقات البدء لكل ، خاصة أثناء معالجة المنظفات في الخطوة 2.2 ، ثم حضانة الفيروس في الخطوة 2.3. يمكن للمحققين ذوي الخبرة تحويل ما يصل إلى ستة في وقت واحد.

  1. قسطرة المثانة
    1. تخدير إناث الفئران C57Bl / 6J (عادة من 8 إلى 10 أسابيع ، ~ 20-25 جم) أو إناث فئران Sprague Dawley (عادة ما تكون 2-3 أشهر ، ~ 250 جم) باستخدام مبخر مع مخروط أنف متصل. قم بمعايرة المرذاذ لإنتاج 3.0٪ (v / v) isoflurane ، 97٪ (v / v) O 2 للفئران أو 4.0٪ (v / v) isoflurane ، 96٪ (v / v) O2 للفئران. تأكد من تخدير الحيوانات من خلال التأكد من أنها لا تستجيب لقرصة إصبع القدم (عادة بعد 1-2 دقيقة).
    2. الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان عن طريق وضع الحيوانات على وسادة ساخنة. راقب الحيوان طوال بروتوكول التنبيغ للتأكد من تخدير الحيوانات وعدم التعرض لأي ألم أثناء هذا الإجراء.
    3. تقليل الأيزوفلوران إلى 1.5٪ (v / v) للفئران أو 2.0٪ (v / v) للفئران والحفاظ على الحيوانات تحت التخدير طوال مدة البروتوكول.
    4. لمنع إدخال الهواء إلى المثانة ، املأ جزء القسطرة البلاستيكية من قسطرة وريدية (انظر جدول المواد) والمحور المرتبط بها ب PBS معقم باستخدام ماصة نقل.
    5. مع وجود الحيوان في وضع ضعيف ، قم بمسح الصماخ الخارجي بنسبة 70٪ كحول ، وأدخل القسطرة المعقمة في الصماخ الخارجي ، ثم مجرى البول ، ثم في المثانة.
      1. لأداء هذه المهمة ، استخدم ملقط ناعم للإمساك برفق الأنسجة التي تشكل الصماخ الخارجي وتمديده عموديا ، بعيدا عن الحيوان. باستخدام اليد الأخرى ، أدخل القسطرة بعناية عموديا حوالي 3-4 مم في صماخ مجرى البول (كومة من اللحم فوق فتحة المهبل مباشرة). ثم ، بسبب انحناء في مجرى البول ، قم بخفض القسطرة ، وإدخالها في الصماخ الخارجي ، باتجاه ذيل الحيوان ، مما يسهل دخوله إلى جزء مجرى البول الذي يمر أسفل عظم العانة ، وفي النهاية إلى المثانة.
        . ملاحظة: خاصة في حالة الماوس ، قد تكون القسطرة طويلة جدا ، ويجب إدخال أكثر من 1.0-1.1 سم منها في الحيوان. خلاف ذلك ، سوف يترتب على ذلك تلف الغشاء المخاطي في المثانة. لمنع ذلك ، ضع علامة على القسطرة ~ 1 سم أسفل طرفها ، ثم لا تدخل القسطرة بعد هذه العلامة.
    6. اسمح للبول في المثانة بالتسرب. قم بإزالة أي بول متبقي عن طريق إجراء مناورة Credé: قم بالتدليك واضغط برفق على نتوء المثانة في منطقة أسفل البطن.
  2. اجعل الظهارة البولية متقبلة للنقل عن طريق معالجتها بمحلول منظف.
    1. اغسل الفأر أو مثانة الفئران عن طريق توصيل حقنة معقمة سعة 1 مل مملوءة ب PBS بمحور القسطرة. حقن 100 ميكرولتر من PBS المعقمة في مثانة الفأر (أو 450 ميكرولتر في حالة مثانة الفئران). افصل المحقنة عن تركيب القسطرة واترك PBS يستنزف. إذا لزم الأمر ، قم بإجراء مناورة Crede لإزالة سائل المثانة الزائد.
    2. غرس 100 ميكرولتر من 0.1٪ (وزن / حجم) N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) (مذاب في PBS و 0.2 ميكرومتر معقم بالمرشح) في مثانة الفأر باستخدام حقنة معقمة سعة 1 مل. احتفظ ب DDM في المثانة لمدة 10 دقائق عن طريق ترك المحقنة في مكانها. في الفئران ، يتم زيادة حجم DDM إلى 450 ميكرولتر.
    3. قم بإزالة DDM من المثانة عن طريق فصل المحقنة والسماح لها بالتصريف. أداء مناورة Crede إذا لزم الأمر.
  3. إدخال الفيروس في المثانة.
    1. نعلق حقنة معقمة 1 مل إلى محور القسطرة وغرس 0.5 × 107 إلى 1 × 108 IVP من الفيروس الغدي (أعدت في الخطوة 1) ، مخففة في 100 ميكرولتر من PBS المعقمة للفئران أو 450 ميكرولتر للفئران ، في المثانة. اترك المحقنة متصلة بالقسطرة لمنع محلول الفيروس من الهروب.
    2. بعد 30 دقيقة ، افصل المحقنة واسمح لمحلول الفيروس بإخلاء المثانة على وسادة يمكن التخلص منها. امسح أي محلول فيروسي متبقي بمنديل ماص ، وتخلص من الوسادة وامسح النفايات الخطرة بيولوجيا.
      ملاحظة: الجلسرين سام للخلايا. على هذا النحو ، يقتصر الحجم الأقصى لمحلول الفيروس الذي يتم غرسه في الفئران على 5 ميكرولتر (والذي عند تخفيفه إلى 100 ميكرولتر من PBS سيؤدي إلى تركيز الجلسرين النهائي ~ 0.5٪ [v / v]). بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن تعزيز كفاءة النقل عن طريق زيادة عدد IVP المغروس وتمديد حضانة الفيروس إلى 45 دقيقة.
    3. خطوة اختيارية: يمكن شطف المثانة باستخدام برنامج تلفزيوني كما هو موضح في الخطوة 2.2.1 أعلاه ؛ ومع ذلك ، هذا غير مطلوب.
  4. السماح للحيوان بالتعافي.
    1. أوقف تدفق الأيزوفلوران واسمح للحيوان بالتعافي والحركة الكاملة قبل إعادته إلى قفصه ، خاصة إذا كانت الحيوانات مجمعة.
      ملاحظة: نظرا لأن نقل الفيروس في حد ذاته لا يسبب أعراضا أو ألما ملحوظا في المسالك البولية السفلية ، فلا توجد عادة حاجة للعلاج بعد الجراحة. ومع ذلك ، إذا كان جين التحوير المشفر ساما ، فقد يكون التسكين أو المضادات الحيوية بعد الإجراء ضروريا كما هو مطلوب من قبل المؤسسة.
  5. تحليل آثار التعبير الجيني التحوير 12-72 ساعة بعد العلاج باستخدام طرق مثل mRNA في التهجين في الموقع ، أو اللطخة الغربية ، أو التألق المناعي9،10،23 (انظر النتائج التمثيلية).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إعداد الفيروس
يظهر مثال على تنقية الفيروس عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة في الشكل 1 أ. يتكون الشريط الوردي الفاتح ، الموجود في واجهة المادة الخلوية المحملة وطبقة CsCl 1.25 جم / مل ، بشكل أساسي من الخلايا المعطلة وحطامها (انظر السهم الأرجواني في الشكل 1A). يستمد لونه الوردي من الكمية الصغيرة من وسط الاستزراع الذي يتم نقله من الخطوة 1.5 في البروتوكول. توجد جزيئات الفيروس محل الاهتمام ، والتي تظهر كشريط أبيض حليبي ، في واجهة محاليل CsCl 1.25 جم / مل و 1.40 جم / مل CsCl (انظر السهم الأصفر في الشكل 1A). يمكن للمرء أيضا ملاحظة شريط من المواد يطفو 2-3 مم فوق جزيئات الفيروس المخصب (انظر السهم الأسود الرفيع في الشكل 1 أ). وهو يتألف من فيروسات وحطام غير مجمعة ، ويحتوي على عدد قليل من IVP ، ويجب تجنبه عند جمع عينة الفيروس.

يصور الشكل 1B مزيدا من تنقية الفيروس وتبادل المخزن المؤقت باستخدام عمود PD10 ، وتظهر قراءات OD260 للكسور الناتجة بعد الشطف في الشكل 1C. يبلغ حجم الفراغ لهذه الأعمدة حوالي 3 مل ، وبالتالي يبدأ الفيروس في الظهور في الكسر 6 ويبلغ ذروته في الكسر 9. في هذه التجربة ، تم تجميع الكسور 6-9. في حين أن الكسر 6 و 7 منخفضان نسبيا في جزيئات الفيروس ، إلا أنهما يحتويان على فيروس كاف ليستحق الشفاء ، ويعملان على تخفيف أجزاء العيار العالية جدا إلى تركيز أكثر منطقية. ولم تدرج الكسور 10-12 لأن الزيادة في التوجيه التنفيذي260 في الكسر 11 تشير إلى احتمال وجود ذروة تلوثية ثانية، وهو ما لوحظ بشكل متفاوت في هذه المستحضرات. عادة ما يكون للجزء المجمع 1 × 107 إلى 1 × 108 IVP / μL ، وسيكون العائد المتوقع في حدود 1 × 10 10 إلى 2 ×10 11 إجمالي IVP. هذه كمية كافية من الفيروس لأداء مئات عمليات النقل. في حين أنه من الممكن معايرة الفيروس عن طريق مقايسات البلاك أو عن طريق حساب مستعمرات الخلايا التي تعبر عن البروتينات الفلورية22 ، فإن قاعدة 1٪ كافية في معظم الحالات. تنص هذه القاعدة على أن 1٪ من جزيئات الفيروس المنقاة ، المقدرة بقياس OD260 للعينة ، هي IVP. يبلغ عمر صلاحية حصص الفيروس المخزنة في -80 درجة مئوية 2-5 سنوات ، على الرغم من انخفاض العدوى على المدى الطويل. يمكن إعادة تجميد الحصص المذابة من الفيروس عند -80 درجة مئوية مرة واحدة دون فقدان كبير للعدوى. ومع ذلك ، فإن الذوبان والتجميد المتكرر يؤثر سلبا على العدوى الفيروسية.

نقل المثانة
تتمثل الخطوة الأولى المهمة عند تقييم تأثير النقل في تأكيد التعبير الجيني المحور. يمكن تقييم ذلك باستخدام العديد من التقنيات ، بما في ذلك الأدوات التي تكتشف mRNA (على سبيل المثال ، RNAScope) ، أو تحليل اللطخة الغربية ، أو استخدام التألق المناعي9،10،23. الشكل 2 هو مثال على ظهارة البول للفأر التي تم تحويلها مع فيروس غدي يشفر V5-epitope الموسوم بهرمون النمو البشري (V5-hGH)23. يتم تعبئة هذا البروتين في حويصلات قرصية / مغزلية ويمكن أن يكون خارجيا أثناء ملء المثانة19,23. كشف تحليل اللطخة الغربية لمحللات الظهارة البولية عن تعبير V5-hGH في الظهارة البولية للمثانات المحولة ، ولكن ليس في الصمامات غير المنقولة (الشكل 2 أ). تم تأكيد التعبير أيضا عن طريق التألق المناعي ، في هذه الحالة باستخدام الأجسام المضادة التي تعرفت على هرمون النمو أو علامة الظهارة V5 (تفتقر المثانة غير المنقولة إلى الإشارة ، غير موضحة) (الشكل 2B).

مثال إضافي هو نقل مثانة الفئران مع فيروس ترميز CLDN2 ، وهو بروتين مرتبط بتقاطع ضيق مكونللمسام 24,25. يزيد CLDN2 من تدفق الكاتيونات شبه الخلوية (بما في ذلك K +) ويؤدي الإفراط في التعبير عنه إلى التهاب وتطور الألم الحشوي10. أكد تحليل اللطخة الغربية تعبير CLND2 في مثانات الفئران المحولة بتشفير الفيروس الغدي Cldn2 ، ولكن ليس تلك التي تم تحويلها باستخدام فيروس ترميز GFP للتحكم (الشكل 2C). بشكل عام ، لا يعتبر GFP ساما عند التعبير عنه في الخلايا ، وبالتالي فهو بمثابة عنصر تحكم مفيد. يسمح استخدام GFP أيضا للمحقق بتأكيد أن النقل يعمل. أكد تحليل التألق المناعي كذلك تعبير CLDN2 الخارجي في خلايا مظلة الظهارة البولية المنقولة بتشفير الفيروس Cldn2 cDNA (إشارة حمراء في الشكل 2D). علاوة على ذلك ، على غرار CLDN2 الداخلي (غير معروض) ، يتم ترجمة CLDN2 المعبر عنه إلى تقاطعات ضيقة تحمل علامة TJP1 ، بالإضافة إلى الأسطح القاعدية للخلايا المظلة (CLDN2 مسمى باللون الأخضر في الشكل 2E)10. في حالة تعبير CLDN2 ، كان أعلى مستوى بعد يوم واحد من التحويل ، ولكن بعد ذلك تأخر ، وكان بالكاد يمكن اكتشافه بعد 15 يوما.

الاعتبار الثاني هو ، ما هي أنواع الخلايا التي سيتم استهدافها عن طريق نقل الفيروسات الغدية. بينما في الفئران من الممكن في الغالب تحويل طبقة الخلية المظلة19 ، في الماوس ، يمكن تحويل جميع طبقات الظهارة البولية ، على الرغم من أن نقل طبقات الخلايا الوسيطة والقاعدية يمكن أن يكون متغيرا. الأهم من ذلك ، في كامل جدار المثانة ، يتم تحويل الظهارة البولية فقط ولا يتم استهداف أي نسيج آخر بواسطة الفيروس الغدي المغروس (الشكل 3).

بينما يمكن إجراء تحليلات للخلايا المحولة على مستوى الخلية المفردة ، عند استكشاف النمط الظاهري الكلي للمثانة ، يجب على المرء تحويل غالبية خلايا الظهارة البولية. وبالتالي ، من المهم تحديد كفاءة التنبيغ (أي ما هو جزء من خلايا الظهارة البولية التي يتم تحويلها). على سبيل المثال ، في حالة الفيروس الغدي المعبر عن Cldn2 ، تم تحويل > 95٪ من الخلايا المظلة (انظر الشكل 2D). مثال إضافي هو حقل الصورة الموضح في الشكل 3 ، حيث يكشف حساب عدد الخلايا المظلة المحولة (في هذه الحالة ، معبرا عن مستشعر Ca2+ GCAMP5G) ، عن كفاءة تقترب من 95٪. ومع ذلك ، يجب على المرء فحص الخلايا في الحقول العشوائية المأخوذة في جميع أنحاء جدار المثانة لتحقيق تقدير دقيق وغير متحيز لكفاءة النقل.

Figure 1
الشكل 1: تنقية الفيروس الغدي. (أ) تم تنقية جسيمات الفيروس الغدي التي تنتجها خلايا HEK293T المصابة عن طريق الطرد المركزي على تدرج CsCl متقطع يتكون من طبقة 1.4 جم / مل CsCl ، وطبقة 1.25 جم / مل CsCl ، وطبقة من العينة (S) مخففة في محلول Tris-EDTA. تتراكم المادة الخلوية (السهم الوردي) عند واجهة S / 1.25 ، بينما يطفو الفيروس الغدي المنقى عند واجهة 1.25 / 1.4 (السهم الأصفر). تطفو مجموعة صغيرة من الفيروس الذي تم تجميعه بشكل غير صحيح فوق الأخير (سهم أسود رفيع). (ب) يتم استعادة الشريط الغني بالفيروس الغدي في التدرج باستخدام إبرة ، ويتم إزالة CsCl من الفيروس الغدي عن طريق الترشيح الهلامي باستخدام عمود PD10 مملوء ب G25 Sephadex متوازن مع PBS يحتوي على 10.0٪ (v / v) من الجلسرين. سطح Sephadex محمي بواسطة فريت بلاستيكي مسامي. (ج) جمعت الكسور، 0.5 mL، من عمود PD10. تم قياس OD260 من الكسور في مقياس الطيف الضوئي ورسم القيم. تتلاشى الكسور الغنية بالفيروسات في حجم الفراغ ، والذي يبدأ عند الكسر 6 ويمتد إلى الكسر 9. الكسور المجمعة لهذه التجربة التمثيلية مظللة باللون الأزرق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نقل ظهارة المثانة البولية للقوارض مع الفيروسات الغدية المشفرة V5-hGH أو CLDN2. (أ) تركت ظهارة الفأر البولية دون تحويل (UT) أو تم تحويلها باستخدام الفيروسات الغدية التي تشفر V5 epitope الموسومة بهرمون النمو البشري (hGH). بعد 24 ساعة ، تم استعادة المثانة ، وتم تحضير محللات الظهارة البولية وتعريضها للرحلان الكهربائي لكبريتات دوديسيل الصوديوم بولي أكريلاميد جل ، وتم تأكيد تعبير V5-hGH باستخدام البقع الغربية التي تم فحصها بجسم مضاد ضد هرمون النمو. (ب) الكشف عن V5-hGH في ظهارة الفأر المجزأة والملطخة باستخدام الأجسام المضادة لهرمون النمو (الأخضر) أو الظهارة V5 (الحمراء) والأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلوروفور. تم التقاط التألق المناعي باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. تم تلطيخ العينات باستخدام TO-PRO3 لتسمية النوى. (سي إف) تم تحويل ظهارة الجرذ مع فأر ترميز الفيروس CLDN2 (الاسم الشائع claudin-2) أو GFP (الاسم الشائع بروتين الفلورسنت الأخضر) كعنصر تحكم. (ج) الكشف عن CLDN2 الخارجي عن طريق النشاف الغربي باستخدام جسم مضاد مرة أخرى CLDN2. لاحظ أن CLDN2 الداخلي يتم التعبير عنه بمستويات منخفضة ولم يتم اكتشافه في هذه التجربة. (د) يتم الكشف عن نقل طبقة الخلية المظلة عن طريق التألق المناعي والفحص المجهري متحد البؤر. يتم الكشف عن حدود الخلية عن طريق تلطيخ الأنسجة مع FITC-phaloidin ، الذي يسمي الهيكل الخلوي للأكتين القشري. (ه) الكشف عن CLDN2 و TJP1 الخارجيين (الاسم الشائع ZO1) عن طريق التألق المناعي والفحص المجهري متحد البؤر للظهارة البولية المركبة بالكامل أو المقطعية. تشير الأسهم البيضاء الصغيرة إلى موقع التقاطع الضيق ورؤوس الأسهم الأرجواني الصغيرة التي تشير إلى موقع التراكمات داخل الخلايا ل CLDN2 في سيتوبلازم الخلية. تم الكشف سابقا عن أنها CLDN210 المرتبطة بجولجي. (و) بعد النقل ، تم القتل الرحيم للحيوانات في الأيام المشار إليها بعد الإصابة. تم الكشف عن تعبير CLDN2 الخارجي باستخدام النشاف الغربي. تم قتل الحيوانات التي تعبر عن GFP بعد اليوم 1. تم تعديل البيانات الواردة في الشكل 2C-E من Montalbetti et al.10 ، ويتم استنساخها بإذن من الجمعية الفسيولوجية الأمريكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: كفاءة نقل الفيروسات الغدية. تم تحويل ظهارة المثانة الفأرية باستخدام فيروس غدي يشفر مستشعر الكالسيوم GCaMP5G. تظهر الألواح العلوية تلطيخا ل GCaMP5G (تم اكتشافه باستخدام جسم مضاد لبروتين الفلورسنت الأخضر. GFP ، أخضر) ، تظهر اللوحات الوسطى توزيع النوى الملطخة ب DAPI (الأزرق) والأكتين المسمى بالرودامين فالويدين (الأحمر) ، والألواح السفلية عبارة عن اندماج للإشارات الثلاث. رؤوس الأسهم البيضاء في اللوحة السفلية هي خلايا مظلة نادرة لا يتم تحويلها. الكفاءة الكلية لنقل الخلايا المظلة في هذه الصورة هي ~ 95٪. لاحظ أنه يتم تحويل الظهارة البولية فقط. يتم تكبير المناطق المحاصرة في اللوحات الموجودة على اليمين. تتألف المنطقة في الإطار 1 بشكل أساسي من خلايا مظلة محزومة. المنطقة في الإطار 2 هي الظهارة البولية التي تظهر نقلا فعالا للخلايا المظلية ، ولكن النقل الأقل كفاءة لطبقات الخلايا الأساسية. LP = الصفيحة المخصوصة ؛ ME = العضلات الخارجية. Se = سيروسا ؛ Ut = الظهارة البولية. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بينما ركز Ramesh et al. على تطوير استراتيجيات لاستخدام نقل الفيروسات الغدية في علاج سرطان المثانة 18 ، أظهرت التقارير الحديثة فائدة هذه التقنيات في دراسة بيولوجيا الظهارة البولية الطبيعية / علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية 10،18،19،20،21 . تشمل السمات المهمة لهذا النهج ما يلي: (ط) في كامل جدار المثانة القوارض ، يتم تحويل الظهارة البولية فقط 10،19،20،21،22. في حالة الفئران ، يقتصر التنبيغ في الغالب على طبقة الخلية المظلة ، بينما في الفئران ، يمكن استهداف كامل الظهارة البولية. (ii) يمكن استخدام هذا النهج للتعبير عن البروتينات أو siRNAs 10،19،20،21،22 ؛ (iii) يمكن أن تقترب كفاءة النقل من 70٪ -95٪ (على سبيل المثال ، انظر الشكل 3)18،20 ؛ (iv) بعد يوم واحد من التنبيغ ، تكون البنية التحتية للظهارة البولية ، وسلامة الأنسجة ، ووجود حاجز عالي المقاومة (يتم تقييمه عن طريق قياس المقاومة عبر الظهارة) ، والتعبير عن علامات تمايز الظهارة البولية "طبيعية"10,19. التأثير المورفولوجي الوحيد الذي لوحظ حتى الآن هو انخفاض في قطر الخلية المظلة (عند النظر إليه من الأعلى) ؛ ومع ذلك ، فإنها تعود إلى حجمها الطبيعي بعد 3-4 أيام10,19 ؛ (ت) يمكن تحويل الظهارة البولية مع ما يصل إلى ثلاثة فيروسات غدية مختلفة في وقت واحد18 ؛ (vi) يمكن تغيير تعبير الجينات المحورة عن طريق معايرة عدد IVP ، مما يؤثر على كمية تعبير البروتين ، أو إطالة أو تقصير وقت الحضانة قبل التضحية بالحيوان ، أو استخدام محفزات مختلفة مثل نظام tet-regulation (tet-off) 19. في الحالة الأخيرة ، يمكن للمرء أن يشارك في التعبير عن فيروس يشفر المنشط / مثبط tet ، ثم يعدل التعبير عن جين التحوير عن طريق تغيير تركيز الدوكسيسيكلين في النظام الغذائي للحيوان.

في حين أن البروتوكول العام بسيط نسبيا ، إلا أن هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب مراعاتها عند إجراء هذه التجارب. أحدها هو توافر مخزونات الفيروسات عالية العيار ذات النقاء المعقول. يمكن الحصول على الفيروسات الغدية من البائعين التجاريين ، أو من مراكز إنتاج الفيروسات المؤسسية ، أو من محققين آخرين ، أو يمكن إنتاجها داخليا. في الحالة الأخيرة ، يوصى باستخدام نظام AdEasy لمختبر Bert Vogelstein لأنه يمكن شراء مكوناته من Addgene ، وتعمل الفيروسات الغدية المتولدة باستخدام هذا النهج بشكل جيد في نقل الظهارة البولية4. تسمح هذه التقنية للمرء بتوليد فيروسات غدية تشفر cDNAs بحجم 8 كيلو بايت باستخدام بلازميد تغليف pAdEasy-1 (يحل الإدخال محل الجينات الفيروسية E1 و E3) ، والخلايا البكتيرية pAdEasy-1 (التي تشفر جينات الفيروسات الغدية اللازمة لإنتاج الفيروس) ، وإنتاج الفيروسات الغدية المعيبة في النسخ المتماثل في خلايا HEK293T (التي تعبر عن بروتين E1 الفيروسي المطلوب). ومع ذلك ، فإن استبدال بلازميد التعبئة والتغليف pAdEasy-1 ببلازميد التعبئة pAdEasy-2 يزيد من حجم العبوة بمقدار 2.7 كيلو بايت إضافي ، ولكنه يتطلب استخدام خط خلية مختلف (خلايا الشبكية الجنينية البشرية المحولة E1 911) حيث تفتقر الفيروسات إلى الجين المبكر E4 بالإضافة إلى E1 و E34. يمكن تحقيق التعبير عن siRNAs باستخدام عدة أنظمة ، بما في ذلك pAdloss ، الموصوف بالتفصيل في Kasahara et al.26. في حين أنه قد يكون من الممكن استخدام وسيط زراعة الخلايا الغنية بالفيروسات لتحويل الظهارة البولية ، إلا أن هذه الطريقة قد تكون غير موثوقة. بدلا من ذلك ، يوفر تضخيم الفيروس على نطاق واسع ، وتنقية التدرج CsCl ، متبوعا بترشيح الهلام الطريقة الأكثر موثوقية لتوليد كميات كبيرة من فيروس العيار العالي. إن الاستقرار النسبي للفيروس عند -80 درجة مئوية ، إلى جانب غلة كبيرة نسبيا من الفيروس ، يجعل هذه طريقة مثالية للحصول على مخزون ثابت من الفيروس يمكن استخدامه في عدد كبير من التجارب.

تشمل الخطوات الحاسمة الإضافية في هذا البروتوكول تلك المرتبطة ببروتوكول النقل. وتشمل هذه استخدام PBS (بدون كاتيونات ثنائية التكافؤ) كعامل غسيل ومخفف ، واستخدام منظف DDM. نظرا لأن المركب الموصلي يعتمد على Ca2+ للحصول على الوظيفة المناسبة ، فمن المحتمل أن يعزز PBS الدخول الفيروسي عن طريق تعطيل الحاجز المرتبط بالتقاطع. DDM أمر بالغ الأهمية أيضا. كما ذكر Ramesh et al. ، فإن كفاءة نقل الفيروس الغدي منخفضة للغاية في غياب معالجة المنظفات18. ومع ذلك ، فإن طريقة عمل المنظف غير واضحة. تعتبر الحضانة لمدة 10 دقائق مع DDM مثالية ، ولكن يمكن تقصيرها إلى 5 دقائق ؛ ومع ذلك ، لا يوصى بأن تمتد الحضانة إلى ما بعد 10 دقائق لأن المنظف قد يتسبب في تلف غير متوقع للأنسجة الكامنة. كمية الفيروس المستخدمة هي معلمة حرجة ، مع تركيزات أعلى تؤدي عموما إلى كميات أكبر من التعبير الجيني التحوير وكفاءة أعلى في النقل. ومع ذلك ، يجب تحديد تركيز الفيروس الأمثل الذي يعطي أفضل مزيج من التعبير والكفاءة والنمط الظاهري تجريبيا. كتركيز أولي ، يوصى بنطاق من 5.0 × 106 إلى 2.0 × 107 IVP لكل. اعتمادا على البروتين الذي يتم التعبير عنه ، ينتج عن ذلك كفاءات في نطاق 70٪ -95٪ 10،19،20،21،22 ؛ ومع ذلك ، فإن بعض تركيبات GTPase السلبية السائدة أقل كفاءة (30٪ -50٪) وتتطلب نهج تحليل خلية واحدة 4,20. وقد تعكس هذه الاختلافات في الكفاءة دوران جين التحوير، أو سميته، أو نقاء وإنتاجية الفيروس المستخدم في النقل. يمكن استبعاد هذا الأخير عن طريق إجراء فحوصات البلاك. على الرغم من أنه ليس شديد الحرجة ، يجب أن يكون الوقت الذي يبقى فيه الفيروس في المثانة طويلا بما يكفي حتى يلتصق الفيروس بمستقبل CXADR الخاص به. مرات أقل من 30 دقيقة يمكن أن تقلل من كفاءة التنبيغ ، في حين أن تمديد فترة الحضانة إلى 45 دقيقة يمكن أن يزيد من الكفاءة ؛ ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا معتمدا على الجينات المحورة. الخطوة الأخيرة الحاسمة في هذا البروتوكول هي تحديد المدة التي سيتم فيها احتجاز الحيوان قبل تقييم النمط الظاهري. تظهر جينات التحوير أعلى تعبير بعد 1-2 أيام19 ، ولكن يمكن أن ينخفض التعبير بعد ذلك. في حالة siRNAs ، يعتمد ذلك على معدل دوران البروتين نفسه. على سبيل المثال ، عند التعبير عن siRNAs التي تستهدف التعبير عن Rab11a ، وهو GTPase من عائلة Rab ، يتم ملاحظة التنظيم المنخفض الفعال فقط بعد 72 ساعة من التحويل23. وبالتالي ، قد لا تكون البروتينات طويلة العمر (مع نصف عمر يقاس بالأيام) أهدافا مناسبة باستخدام هذا النهج.

يجب أن يكون المحقق أيضا على دراية بالمحاذير المرتبطة بهذا النهج. أولا ، قد تقتصر فائدته على إناث القوارض بسبب الصعوبات في قسطرة ذكور القوارض من خلال قضيبها. ومع ذلك ، قد يكون من الممكن تقنيا إجراء هذا البروتوكول عند الذكور عن طريق إدخال قسطرة في قبة المثانة ، على غرار التحضير المستخدم عند إجراء قياس المثانة9. هذا من شأنه أن يسمح للمرء بإدخال منظف أو فيروس ، وإجراء عمليات الغسيل حسب الحاجة. التحذير الثاني هو أن الإفراط في التعبير عن البروتينات يمكن أن يستنفد مسارات الخلايا ومواردها ، مما قد يؤدي إلى أحداث مثل تراكم البروتين ، وتنشيط مسارات إجهاد الخلايا ، والموت27. وبالتالي ، من الحكمة عموما قصر التعبير الجيني التحوير على مستويات غير سامة (ما لم يكن هذا بالطبع هو القصد من التعبير عن جين التحوير) ، كما تم تقييمه باستخدام علامات إجهاد الخلايا وموت الخلايا. التحذير الثالث هو أنه في بعض الأماكن ، يمكن أن يؤدي تعبير الفيروس الغدي طويل المدى إلى استجابات مناعية28. على الرغم من عدم وجود دليل على أن نقل الفيروس الغدي للظهارة البولية في حد ذاته يحفز الاستجابات المناعية10 ، فإن هذا يعتمد على الجينات المحورة وكما هو مذكور أعلاه يؤدي الإفراط في التعبير CLDN2 إلى التهاب المثانة.

حاليا ، لدى الباحثين مجموعة متنوعة من الطرق التي يمكنهم استخدامها لتعديل التعبير الجيني والبروتيني في ظهارة المسالك البولية ، بما في ذلك استخدام الفئران المعدلة وراثيا أو المشروطة بالضربة القاضية للظهارة البولية ، أو استخدام كواشف النقل ، أو استخدام نقل الفيروسات الغدية. الطريقة الأخيرة ، موضوع هذا البروتوكول ، سهلة نسبيا وفعالة وقابلة للتكرار. بخلاف التكلفة الأولية لكواشف زراعة الخلايا اللازمة لتوليد مخزونات الفيروس ، فإن الكمية الكبيرة جدا من الفيروس المنتجة (بما يكفي لإجراء مئات عمليات النقل) ، تؤدي إلى تكلفة منخفضة نسبيا على أساس كل. يمكن استغلال نقل الفيروسات الغدية لدراسة بيولوجيا الظهارة البولية. على سبيل المثال ، تم استخدام نقل الفيروسات الغدية لتحديد أهمية GTPases من عائلة Rho وعائلة Rab ، وعوامل تبادل الجوانين ونوكليوتيدات ، وشظايا محرك الميوسين ، و ADAM17 في الإخراج الخلوي و endocytosis 10،19،20،21،22 ، وتم استخدام نقل الفيروس الغدي مؤخرا لدراسة النقل الميكانيكي للظهارة البولية9 . وبالمثل ، قد يكون نقل الفيروسات الغدية ذا صلة عند استكشاف وعلاج الأمراض البشرية. على سبيل المثال ، راميش وآخرون اقترح في البداية نقل الفيروس الغدي قد يكون وسيلة مفيدة لاستهداف الخلايا السرطانية18. في حين أن دراساتهم كانت أكثر من نهج إثبات المبدأ ، يمكن للمرء أن يتخيل أن التعبير عن السموم في الخلايا السرطانية أو التعبير عن الحواتم التي يمكن التعرف عليها من قبل الجهاز المناعي ستكون استراتيجيات مفيدة. قد يكون نقل الفيروس الغدي مفيدا أيضا في فهم الأمراض التي يؤدي فيها الإفراط في التعبير أو نقص التعبير عن المنتجات الجينية إلى المرض. على سبيل المثال ، تظهر الخزعات من مثانات المرضى الذين يعانون من التهاب المثانة الخلالي زيادة بمقدار 90 ضعفا في تعبير CLDN2 29. ومن المثير للاهتمام ، أن الإفراط في التعبير عن CLDN2 باستخدام نقل الفيروسات الغدانية يكرر العديد من أعراض هذا المرض في الفئران10. وبالتالي ، يمكن أن يكون CLDN2 هدفا واحدا في علاج المرضى الذين يعانون من هذا الاضطراب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال جائزة مشروع تجريبي من خلال P30DK079307 (إلى M.G.D.) ، منحة المعاهد الوطنية للصحة R01DK119183 (إلى GA و MDC) ، منحة المعاهد الوطنية للصحة R01DK129473 (إلى GA) ، جائزة التطوير الوظيفي لجمعية المسالك البولية الأمريكية ومنحة مؤسسة وينترز (إلى NM) ، من قبل فسيولوجيا الخلية والكائنات الحية النموذجية لتصوير الكلى في مركز بيتسبرغ لأبحاث الكلى (P30DK079307) ، وبواسطة S10OD028596 (إلى G.A.) ، التي مولت شراء نظام متحد البؤر المستخدم لالتقاط بعض الصور المعروضة في هذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  2. Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
  3. Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
  4. Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
  5. Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
  6. Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
  7. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
  8. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
  9. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
  10. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
  11. Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
  12. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
  13. Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
  14. Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
  15. Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
  16. Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
  17. Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  18. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
  19. Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
  20. Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
  21. Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
  22. Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
  23. Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
  24. Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
  25. Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
  26. Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
  27. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
  28. Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
  29. Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).

Tags

علم الأحياء، العدد 188،
التعبير عن الجينات المحورة في ظهارة المسالك البولية في المثانة الأصلية باستخدام النقل بوساطة الفيروس الغدي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, … More

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter