Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Экспрессия трансгенов в уротелии нативного мочевого пузыря с использованием аденовирус-опосредованной трансдукции

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Описаны способы генерации больших количеств рекомбинантных аденовирусов, которые затем могут быть использованы для трансдукции нативного уротелия грызунов, позволяющего экспрессировать трансгены или подавлять эндогенные генные продукты.

Abstract

Предполагается, что в дополнение к образованию барьера с высоким сопротивлением уротелий, выстилающий почечную лоханку, мочеточники, мочевой пузырь и проксимальный отдел уретры, воспринимает и передает информацию об окружающей среде в подлежащие ткани, способствуя мочеиспусканию и поведению. Нарушение уротелиального барьера или его сенсорной/преобразовательной функции может привести к заболеванию. Изучение этих сложных событий затруднено отсутствием простых стратегий изменения экспрессии генов и белков в уротелии. Здесь описаны методы, которые позволяют исследователям генерировать большое количество аденовируса с высоким титром, который затем может быть использован для трансдукции уротелия грызунов с высокой эффективностью и относительно простым способом. Как кДНК, так и малые интерферирующие РНК могут быть экспрессированы с помощью аденовирусной трансдукции, а влияние экспрессии трансгена на функцию уротелия можно оценить через 12 часов или несколько дней. Эти методы имеют широкое применение для изучения нормальной и аномальной уротелиальной биологии с использованием моделей мышей или крыс.

Introduction

Уротелий представляет собой специализированный эпителий, который выстилает почечную лоханку, мочеточники, мочевой пузырь и проксимальный отделуретры 1. Он состоит из трех слоев: слоя высокодифференцированных и поляризованных, часто двуядерных зонтичных клеток, апикальные поверхности которых омываются мочой; промежуточный клеточный слой с популяцией двуядерных транзитно-амплифицирующих клеток, которые могут давать начало поверхностным зонтичным клеткам в ответ на их острую потерю; и один слой базальных клеток, подмножество которых функционирует как стволовые клетки, которые могут регенерировать весь уротелий в ответ на хроническое повреждение. Зонтичные клетки в основном ответственны за формирование высокорезистентного уротелиального барьера, компоненты которого включают апикальную мембрану (богатую холестерином и цереброзидами) с низкой проницаемостью для воды и растворенных веществ и высокоомистный апикальный соединительный комплекс (состоящий из плотных соединений, адгезивных соединений, десмосом и связанного с ними актомиозинового кольца)1 . Как апикальная поверхность зонтичной клетки, так и ее соединительное кольцо расширяются во время наполнения мочевого пузыря и быстро возвращаются в предварительно заполненное состояние после мочеиспускания 1,2,3,4,5. В дополнение к своей роли в барьерной функции, предполагается также, что уротелий обладает сенсорными и преобразовательными функциями, которые позволяют ему ощущать изменения во внеклеточной среде (например, растяжение) и передавать эту информацию через высвобождение медиаторов (включая АТФ, аденозин и ацетилхолин) в подлежащие ткани, включая субуротелиальные афферентные нервные отростки 6,7,8 . Недавние доказательства этой роли были обнаружены у мышей, у которых отсутствует уротелиальная экспрессия как Piezo1, так и Piezo2, что приводит к изменению функции мочеиспускания9. Кроме того, у крыс, сверхэкспрессирующих порообразующий белок CLDN2 с плотным соединением в зонтичном клеточном слое, развиваются воспаление и боль, аналогичные тем, которые наблюдаются у пациентов с интерстициальным циститом10. Предполагается, что нарушение уротелиальной сенсорной/преобразовательной или барьерной функции может способствовать нескольким заболеваниям мочевого пузыря 6,11.

Лучшее понимание биологии уротелия в нормальных и болезненных состояниях зависит от наличия инструментов, которые позволят исследователям легко подавлять экспрессию эндогенных генов или разрешать экспрессию трансгенов в нативной ткани. В то время как один из подходов к подавлению экспрессии генов заключается в создании условных мышей с нокаутом уротелия, этот подход зависит от наличия мышей с флоксированными аллелями, является трудоемким и может занять от нескольких месяцев донескольких лет. Неудивительно, что исследователи разработали методы трансфекции или трансдукции уротелия, что может привести к результатам в более короткие сроки. Опубликованные методы трансфекции включают использование катионных липидов13, антисмысловых фосфоротиосодержащих олигодеоксинуклеотидов 14 или антисмысловых нуклеиновых кислот, привязанных к 11-мерному пептиду15 белка ТАТ ВИЧ. Тем не менее, основное внимание в этом протоколе уделяется использованию аденовирально-опосредованной трансдукции, хорошо изученной методологии, которая эффективна при доставке генов в широкий спектр клеток, была протестирована в многочисленных клинических испытаниях и совсем недавно использовалась для доставки кДНК, кодирующей капсидный белок COVID-19, реципиентам одного варианта вакцины противCOVID-19 16. 17. Для более подробного описания жизненного цикла аденовируса, аденовирусных векторов и клинического применения аденовирусов читатель направляется к ссылке17.

Важной вехой в использовании аденовирусов для трансдукции уротелия стал отчет Ramesh et al., в котором показано, что короткие предварительные обработки детергентами, включая N-додецил-β-D-мальтозид (DDM), резко усиливают трансдукцию уротелия аденовирусом, кодирующим β-галактозидазу18. Используя это исследование в качестве руководства, аденовирально-опосредованная трансдукция уротелия в настоящее время используется для экспрессии различных белков, включая ГТФазы семейства Rab, факторы обмена гуанин-нуклеотидов, моторные фрагменты миозина, порообразующие плотные соединения, связанные с клаудинами, и ADAM17 10,19,20,21,22 . Тот же подход был адаптирован для экспрессии малых интерферирующих РНК (миРНК), эффекты которых были спасены коэкспрессирующими миРНК-резистентными вариантами трансгена22. Описанный здесь протокол включает в себя общие методы получения больших количеств высококонцентрированного аденовируса, что является требованием для этих методов, а также адаптацию методов Ramesh et al.18 для экспрессии трансгенов в уротелии с высокой эффективностью.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты, связанные с генерацией аденовирусов, для которых требуется сертификация BSL2, были проведены с одобрения отделов гигиены и безопасности окружающей среды Университета Питтсбурга и Институционального комитета по биобезопасности. Все проведенные эксперименты на животных, включая аденовирусную трансдукцию (которая требует сертификации ABSL2), были проведены в соответствии с соответствующими руководящими принципами / правилами Политики службы общественного здравоохранения по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и Закона о благополучии животных, а также с одобрения Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию Университета Питтсбурга. Перчатки, средства защиты глаз и соответствующая одежда надеваются на все процедуры, связанные с рекомбинантными вирусами. Любые жидкие или твердые отходы следует утилизировать, как описано ниже. Подстилка животных после трансдукции и любые полученные в результате этого туши животных должны рассматриваться как биологически опасные материалы и утилизироваться в соответствии с институциональной политикой.

1. Подготовка запасов аденовируса с высоким титром

ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективная трансдукция мочевого пузыря грызунов зависит от использования очищенных и концентрированных вирусных запасов, обычно от 1 x 107 до 1 x 108 инфекционных вирусных частиц (IVP) на мкл. Эта часть протокола ориентирована на создание запасов аденовирусов с высоким титром из существующих вирусных препаратов. Все этапы должны выполняться в вытяжке для культивирования клеток с использованием стерильных реагентов и инструментов. В то время как доступные штаммы аденовируса, используемые сегодня, имеют дефекты репликации, большинству учреждений требуется разрешение на использование аденовирусов и рекомбинантной ДНК. Это часто включает в себя обозначение помещения для культивирования клеток в качестве одобренного BSL2 объекта для производства и амплификации аденовирусов. Некоторые общие соображения включают использование масок, средств защиты глаз, перчаток и соответствующей одежды на всех этапах производства и очистки вируса. При выполнении центрифугирования рекомендуется использовать защитные колпачки, если в центрифужных пробирках отсутствуют плотно прилегающие крышки. Все одноразовые материалы, включая потенциально загрязненные крышки центрифуг, бутылки и роторы, обрабатывают противовирусным раствором (см. Таблицу материалов), а затем промывают водой или 70% этанолом. Жидкие отходы обрабатываются добавлением отбеливателя до конечной концентрации 10% (об. / об.). Утилизация этих жидких отходов будет зависеть от институциональной политики. Твердые отходы, как правило, утилизируются вместе с биологически опасными отходами.

  1. Культивирование клеток HEK293T
    1. Разморозьте замороженный флакон с клетками HEK293T на водяной бане при 37 ° C и используйте пипетку объемом 5 мл для переноса клеток в чашку для культивирования клеток диаметром 15 см. Используя пипетку объемом 25 мл, медленно добавьте в блюдо 20 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle Medium (DMEM), содержащей 10% (v/v) эмбриональной бычьей сыворотки и антибиотик пенициллин/стрептомицин (DMEM-FBS-PS). Инкубируют клетки в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 °C, отравленном газом с 5% (об. / об.) CO 2 до тех пор, пока они не достигнут слияния 80% -90% (~2 x 107 клеток).
    2. Используя стеклянную пипетку, прикрепленную к источнику вакуума, аспирируйте среду, а затем промойте клетки, перенеся 20 мл стерильного PBS (2,7 мМ KCl, 1,5 мМ KH 2 PO 4, 136,9 мМ NaCl и 8,9 мМ Na2HPO4) в чашку с помощью пипетки объемом 25 мл. Аспирируйте отработанный PBS, а затем с помощью пипетки объемом 5 мл перенесите 3 мл теплого (37 °C) раствора протеиназы (см. Таблицу материалов) в чашку, инкубируя чашку в инкубаторе клеточных культур до тех пор, пока клетки не отсоединятся (~3-4 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективный протеолиз можно лучше всего оценить, медленно наклоняя чашку вперед и назад в поисках высвобождения клеток из всех частей чашки в движущуюся жидкость. Клетки HEK293T чувствительны к длительному лечению протеиназой и погибнут, если оставить их более чем на несколько минут в растворе протеиназы.
    3. Используйте пипетку объемом 10 мл для переноса 7 мл DMEM-FBS-PS в чашку с отделившимися клетками, а затем используйте ту же пипетку для аспирации клеток и среды. Перенесите взвешенные клетки в коническую пробирку объемом 50 мл, а затем гранулируйте клетки, центрифугируя суспензию в низкоскоростной клинической центрифуге при 200 x g в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пипетки, прикрепленной к источнику вакуума. Используйте пипетку объемом 25 мл для ресуспендирования клеточной гранулы в 15 мл DMEM-FBS-PS.
    4. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в каждую из пятнадцати 15-сантиметровых чаек, содержащих 19 мл DMEM-FBS-PS.
    5. Выращивайте клетки в инкубаторе тканевых культур до тех пор, пока они не достигнут слияния 85%-90% (~ 3-4 дня).
  2. Приготовьте разбавленный раствор вируса
    1. Добавьте ~ 1,5 x 10 9 до 3 x 109 IVP существующего вирусного запаса (5-10 IVP / клетка) в коническую пробирку объемом 50 мл, заполненную 45 мл DMEM, в котором отсутствуют FBS или антибиотики.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать более низкую концентрацию вируса (1-5 IVP/клетка); Однако для производства вируса потребуется больше времени.
  3. Заразить культивируемые клетки вирусом.
    1. Используя стеклянную пипетку, прикрепленную к источнику вакуума, аспирируйте среду из почти сливающихся клеток на шаге 1.1.5.
    2. Используйте пипетку объемом 25 мл для переноса 3,0 мл разбавленного раствора вируса (приготовленного на шаге 1.2.1) в каждую чашку для клеточной культуры. Затем с помощью пипетки объемом 10 мл добавьте 7,0 мл среды DMEM (в которой отсутствуют FBS или антибиотики) в каждую чашку. Инкубировать в течение 60 мин в инкубаторе клеточных культур, а затем добавить 10 мл DMEM, содержащего 20% (об./об.) FBS и 2x PS в каждую чашку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование одной из 15 чашек в качестве контрольной пластины (в которую вирус не добавляется) облегчает идентификацию вызванного вирусом округления клеток и гибели инфицированных клеток на следующем этапе.
    3. Инкубируйте клетки в инкубаторе клеточных культур в течение 2-4 дней, пока большинство из них не начнет округляться и >60% клеток не отделятся.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании более низкого титра вируса гибель клеток может занять до недели. Если гибель клеток не происходит в течение недели, вполне вероятно, что процесс необходимо будет повторить с использованием более высокого титра вируса.
  4. Восстановление вируса из клеточных лизатов
    1. Используйте скребок для ячеек, чтобы соскоблить дно каждой чашки, высвобождая прикрепленные клетки в среду.
    2. Используя пипетку объемом 25 мл, соберите и объедините среду, клетки и клеточный мусор из каждой чашки для культивирования клеток в коническую пробирку для культуры клеток объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экономии ресурсов среду из двух посуды можно объединить в одну пробирку объемом 50 мл.
    3. Гранулирование клеточного материала центрифугированием с использованием низкоскоростной настольной центрифуги: 5 мин при комнатной температуре при 3 000 x g. Используйте стеклянную пипетку, прикрепленную к вакуумному устройству, для аспирации надосадочной жидкости.
    4. Используйте пипетку объемом 10 мл в сочетании с растиранием, чтобы консолидировать весь полученный гранулированный материал в общей сложности 7 мл стерильно отфильтрованного 100 мМ Tris-HCl pH 7,4, содержащего 10 мМ ЭДТА (раствор трис-ЭДТА). Переложите объединенный материал в стерильную коническую пробирку для клеточной культуры объемом 15 мл и поместите на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе подготовку к вирусу можно заморозить при -80 ° C на неопределенный срок.
  5. Подготовьте лизаты клеток
    1. Выполните три цикла замораживания-оттаивания, чтобы разрушить оставшиеся клетки и, таким образом, дополнительно высвободить образовавшиеся вирусные частицы. Заморозьте объединенный материал на шаге 1.4.4, погрузив трубку в жидкий азот (~30-60 с). Быстро разморозьте образец, поместив пробирку в инкубатор с температурой 37 °C. Встряхните образец в течение 15 с, а затем повторите процедуру быстрого замораживания и оттаивания еще 2 раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор вируса можно быстро разморозить при температуре 37 ° C на водяной бане, но следует соблюдать осторожность, так как колебания температуры могут привести к растрескиванию трубки, что приведет к высвобождению вирусного раствора в водяную баню. Чтобы этого не произошло, поместите пробирку, содержащую вирусную надосадочную жидкость, в большую пробирку, которую затем устанавливают на водяной бане.
    2. Используйте пипетку объемом 10 мл для переноса трижды размороженного клеточного материала в сверхскоростную центрифужную пробирку. Центрифугируйте материал в пробирке в течение 30 мин при 4 °C сверхскоростной центрифуге при ~ 18 500 x g.
    3. Извлеките ~ 7 мл богатой вирусами надосадочной жидкости с помощью пипетки объемом 10 мл и перенесите ее в коническую пробирку объемом 15 мл. Оставьте образец на льду до следующего шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе рассмотрите возможность сохранения аликвоты неочищенной вирусной надосадочной жидкости в качестве преамбулы для начала нового вирусного препарата (или в качестве резервной копии). Храните аликвоту при температуре -80 °C.
  6. Изолируйте и очистите вирус с помощью центрифугирования с градиентом плотности.
    1. Приготовьте прерывистый градиент CsCl в тонкостенной прозрачной ультрацентрифужной пробирке из ПЭТ объемом 12 мл (см. Таблицу материалов) или эквивалентной. Используйте шприц объемом 3 мл, оснащенный иглой 18 г, чтобы осторожно ввести 2,5 мл раствора CsCl 1,4 г / мл на дно пробирки, а затем используйте новый шприц / иглу, чтобы наложить на него 2,5 мл раствора CsCl 1,25 г / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Капание растворов непосредственно поверх уже существующего слоя приведет к значительному и нежелательному перемешиванию. Вместо этого поместите скошенную часть иглы к краю трубки, а затем очень медленно нажмите на поршень шприца, повышая положение иглы по мере того, как раствор заполняет трубку.
    2. Загрузите ~ 7 мл вирусной надосадочной жидкости поверх градиента аналогичным образом, используя шприц объемом 10 мл. Если между надосадочной жидкостью вируса и верхней частью пробирки более 2-3 мм пространства, добавьте дополнительный раствор Tris-EDTA, чтобы заполнить пробирку до тех пор, пока не останется только 2-3 мм пространства.
    3. Сделайте аналогично подготовленную балансовую трубку, содержащую слои CsCl, но заменяющую раствор Tris-EDTA на вирусную надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Две трубки должны иметь одинаковый вес (и одинаковую плотность), чтобы предотвратить потенциально опасную ситуацию с несбалансированной нагрузкой в ультрацентрифуге.
  7. Изолируют вирус с помощью скорозонального ультрацентрифугирования.
    1. Загрузите градиенты, сформированные на этапах 1.6.2-1.6.3, в ковши ротора SW41 или аналогичного ротора. Завинтите крышки ведра, поместите ротор в ультрацентрифугу (предварительно охлажденную до 4 °C) и центрифугу в течение 1 часа при ~ 150 000 x g.
    2. Во время центрифугирования уравновесьте колонку, описанную на этапе 1.9.1 ниже.
  8. Восстановление изолированных вирусных частиц
    1. В конце этапа центрифугирования осторожно отсоедините ведра от ротора и в колпаке для культивирования клеток снимите крышки ведра, а затем снимите пробирки и поместите их в стойку.
    2. Соберите полосчатый материал, богатый вирусными частицами, который плавает на границе раздела между раствором CsCl 1,25 г/мл и 1,4 г/мл. Держа пробирку, содержащую градиент, над нижней половиной чашки для клеточных культур (которая будет улавливать любые пролитые материалы), используйте 1-дюймовую иглу 18 G, прикрепленную к шприцу объемом 3 мл, чтобы осторожно проколоть пробирку, чуть ниже полосатого вируса. Медленно аспирируйте вирус, который обычно восстанавливается в ~ 1 мл.
    3. Извлеките иглу из трубки, в результате чего оставшийся материал в градиенте вытечет из трубки в нижнюю половину чашки для клеточных культур (любые жидкости следует рассматривать как опасные отходы).
    4. Переведите раствор вируса в шприце в стерильную микроцентрифужную пробирку на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При извлечении вируса на этом этапе расположите иглу так, чтобы просвет иглы был направлен вверх, а игла открылась на несколько мм ниже богатой вирусом полосы. Избегайте заражения тонкой полосой неправильно собранного вируса, которая иногда наблюдается на 2-3 мм выше полосчатого вируса (см. тонкую черную стрелку на рисунке 1A).
  9. Удалите CsCl из образца с помощью гель-фильтрации.
    1. Уравновесьте колонку PD-10 (предварительно упакованную Sephadex G-25M), прикрепленную к опорной подставке, 50 мл 0,2 мкм стерильно отфильтрованного PBS, содержащего 10% (об. / об.) глицерина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начальный этап уравновешивания занимает 2-3 часа и необходим для обеспечения полного вымывания консервантов, которые используются производителем для стабилизации колонны.
    2. Дайте промывочному раствору отступить ниже фритты (защитный диск из белого материала в верхней части среды колонны), а затем осторожно перенесите очищенный раствор вируса, собранный на шаге 1.8, в верхнюю часть колонки. Дайте богатому вирусами раствору отступить ниже фритты, а затем начните заполнять колонку PBS-глицерином.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одной из функций фритты является предотвращение высыхания колонны. В результате допускаются короткие задержки, прежде чем в колонну будет добавлено больше элюанта.
    3. Соберите элюат в 12 стерильных микроцентрифужных пробирок по 0,5 мл на фракцию.
  10. Определите вирусный выход.
    1. Определите пиковые фракции вируса с помощью спектрофотометрии. Приготовьте разбавление каждой фракции в соотношении 1:100 в PBS и измерьте OD260 в спектрофотометре, используя разбавление 1:100 только буфера в качестве заготовки. Вирусные частицы должны растворяться в объеме пустоты, начиная примерно с фракции 6. Объедините фракции, содержащие самые высокие показания OD260 .
    2. Разбавьте объединенные вирусные фракции в соотношении 1:100 и повторно отмерьте OD260. Рассчитайте конечную концентрацию вирусных частиц и количество IVP в объединенных фракциях по следующей формуле: Вирусные частицы на мл = OD260 × 100 (это с поправкой на коэффициент разбавления) × 1012. Общая оценка заключается в том, что 1% вирусных частиц являются IVP, как таковые: IVP / мл = OD 260 × 100 ×10 10 или IVP / мкл = OD260 × 100 ×10 7.
  11. Аликвотируйте объединенные фракции вируса (содержащие от 5 x 107 до 1 x 108 IVP) в стерильные микроцентрифужные пробирки или криовиалы. Храните образцы при температуре -80 °C.

2. Трансдукция мочевого пузыря грызунов

ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы новичок в этой технике, рекомендуется ограничить количество животных, передаваемых за один раз, до 2-4. Это может быть достигнуто путем поэтапного распределения времени начала для каждого животного, особенно во время обработки моющим средством на шаге 2.2, а затем инкубации вируса на шаге 2.3. Опытные исследователи могут трансдуцировать до шести животных одновременно.

  1. Катетеризация мочевого пузыря
    1. Анестезируют самок мышей C57Bl / 6J (обычно 8-10 недель, ~ 20-25 г) или самок крыс Sprague Dawley (обычно 2-3 месяца, ~ 250 г) с помощью испарителя с прикрепленным носовым конусом. Откалибруйте испаритель для получения 3,0% (об./об.) изофлурана, 97% (об./об.) O2 для мышей или 4,0% (об./об.) изофлурана, 96% (об./об.)O2 для крыс. Убедитесь, что животные находятся под наркозом, убедившись, что они не реагируют на ущипывание пальцев ног (обычно через 1-2 минуты).
    2. Поддерживайте температуру тела животного, помещая животных на гретую подушку. Следите за животным на протяжении всего протокола трансдукции, чтобы убедиться, что животные находятся под наркозом и не испытывают боли во время этой процедуры.
    3. Уменьшите изофлуран до 1,5% (об./об.) для мышей или 2,0% (об./об.) для крыс и поддерживайте животных под наркозом в течение всего срока действия протокола.
    4. Чтобы предотвратить попадание воздуха в мочевой пузырь, заполните пластиковую часть катетера для внутривенного введения (см. Таблицу материалов) и связанный с ним концентратор стерильным PBS с помощью пипетки для переноса.
    5. Когда животное находится в положении лежа на спине, протрите наружный проход 70% спиртом и вставьте стерильный катетер в наружный проход, затем в мочеиспускательный канал, а затем в мочевой пузырь.
      1. Чтобы выполнить эту задачу, используйте тонкие щипцы, чтобы осторожно захватить ткань, образующую наружный проход, и вытянуть ее вертикально, подальше от животного. Другой рукой осторожно введите катетер вертикально примерно на 3-4 мм в проход уретры (холмик плоти чуть выше отверстия влагалища). Затем, из-за изгиба мочеиспускательного канала, опустите катетер, вставленный в наружный проход, к хвосту животного, что облегчит его проникновение в часть уретры, проходящую ниже лобковой кости, и, в конечном итоге, в мочевой пузырь
        . ПРИМЕЧАНИЕ: Особенно в случае мыши катетер может быть слишком длинным, и не более 1,0-1,1 см его следует вводить животному. В противном случае последует повреждение слизистой оболочки мочевого пузыря. Чтобы предотвратить это, пометьте катетер на ~1 см ниже его кончика, а затем не вставляйте катетер за пределы этой маркировки.
    6. Дайте моче в мочевом пузыре вытечь. Удалите остатки мочи, выполнив маневр Креде: помассируйте и осторожно надавите на шишку мочевого пузыря в нижней части живота.
  2. Сделайте уротелий восприимчивым к трансдукции, обработав его раствором моющего средства.
    1. Промойте мочевой пузырь мыши или крысы, присоединив стерильный шприц объемом 1 мл, наполненный PBS, к концентратору катетера. Введите 100 мкл стерильного PBS в мочевой пузырь мыши (или 450 мкл в случае мочевого пузыря крысы). Отсоедините шприц от штуцера катетера и дайте PBS стечь. При необходимости выполните маневр Креде для удаления лишней жидкости мочевого пузыря.
    2. Закапывают 100 мкл 0,1% (мас./об.) N-додецил-β-D-мальтозида (DDM) (растворенного в PBS и стерилизованного фильтром 0,2 мкм) в мочевой пузырь мыши с помощью стерильного шприца объемом 1 мл. Удерживайте DDM в мочевом пузыре в течение 10 минут, оставив шприц на месте. У крыс объем ДДМ увеличивают до 450 мкл.
    3. Удалите DDM из мочевого пузыря, отсоединив шприц и позволив ему вытечь. При необходимости выполните маневр Креда.
  3. Ввести вирус в мочевой пузырь.
    1. Прикрепите стерильный шприц объемом 1 мл к концентратору катетера и закапывайте в мочевой пузырь 0,5 x 10от 7 до 1 x 108 IVP аденовируса (приготовленного на этапе 1), разведенного в 100 мкл стерильного PBS для мышей или 450 мкл для крыс. Оставьте шприц прикрепленным к катетеру, чтобы предотвратить утечку вирусного раствора.
    2. Через 30 минут отсоедините шприц и дайте раствору вируса эвакуироваться из мочевого пузыря на одноразовую прокладку. Промокните остатки вирусного раствора впитывающей салфеткой, выбросьте прокладку и протрите биологически опасные отходы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глицерин цитотоксичен. Таким образом, максимальный объем раствора вируса, закапываемого мышам, ограничен 5 мкл (что при разбавлении 100 мкл PBS приведет к конечной концентрации глицерина ~ 0,5% [об./об.]). Кроме того, можно повысить эффективность трансдукции за счет увеличения количества инстиллированных IVP и продления инкубации вируса до 45 минут.
    3. Необязательный шаг: мочевой пузырь можно промыть с помощью PBS, как описано на шаге 2.2.1 выше; Однако это не обязательно.
  4. Дайте животному восстановиться.
    1. Прекратите поток изофлурана и дайте животному восстановиться и быть полностью мобильным, прежде чем возвращать его в клетку, особенно если животные содержатся в группе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку трансдукция вируса сама по себе не вызывает наблюдаемых симптомов или боли в нижних мочевыводящих путях, обычно нет необходимости в послеоперационном лечении. Однако, если кодируемый трансген токсичен, может потребоваться послепроцедурная анальгезия или антибиотики в соответствии с требованиями учреждения.
  5. Проанализируйте эффекты экспрессии трансгена через 12-72 ч после лечения, используя такие методы, как гибридизация мРНК in situ, вестерн-блоттинг или иммунофлюоресценция 9,10,23 (см. репрезентативные результаты).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Подготовка к вирусу
Пример очистки от вирусов центрифугированием в градиенте плотности показан на рисунке 1А. Светло-розовая полоса, обнаруженная на границе раздела загруженного клеточного материала и слоя CsCl 1,25 г/мл, в основном состоит из разрушенных клеток и их обломков (см. пурпурную стрелку на рисунке 1A). Он получает свой розоватый цвет из-за небольшого количества питательной среды, которая переносится с шага 1.5 в протоколе. Интересующие вирус частицы, которые выглядят как молочно-белая полоса, находятся на границе раздела растворов CsCl 1,25 г/мл и 1,40 г/мл CsCl (см. желтую стрелку на рисунке 1A). Можно также наблюдать полосу материала, которая плавает на 2-3 мм над обогащенными вирусными частицами (см. тонкую черную стрелку на рисунке 1А). Он состоит из несобранных вирусов и мусора, содержит мало IVP, и его следует избегать при сборе образца вируса.

Дальнейшая очистка вируса и буферный обмен с помощью колонки PD10 изображены на рисунке 1B, а показания OD260 полученных фракций после элюирования показаны на рисунке 1C. Объем пустот этих колонок составляет примерно 3 мл, и, таким образом, вирус начинает появляться во фракции 6 и достигает пика во фракции 9. В этом эксперименте фракции 6-9 были объединены. В то время как фракции 6 и 7 имеют относительно низкое содержание вирусных частиц, они содержат достаточное количество вируса, чтобы заслуживать восстановления, и служат для разбавления фракций с очень высоким титром до более разумной концентрации. Фракции 10-12 не были включены, так как увеличение OD260 во фракции 11 указывает на возможное наличие второго пика загрязнения, который по-разному наблюдается в этих препаратах. Объединенная фракция обычно имеет от 1 x 107 до 1 x 108 IVP/мкл, а ожидаемый выход будет порядка 1 x 10 10 до 2 x10 11 общего IVP. Это достаточное количество вируса для выполнения сотен трансдукций. Хотя титрировать вирус можно с помощью анализов бляшек или путем подсчета колоний клеток, экспрессирующих флуоресцентные белки22, в большинстве случаев достаточно правила 1%. Это правило гласит, что 1% очищенных вирусных частиц, оцененных путем измерения OD260 образца, являются IVP. Аликвоты вируса, хранящиеся при -80 °C, имеют срок годности 2-5 лет, хотя инфекционность снижается в течение длительного времени. Размороженные аликвоты вируса могут быть повторно заморожены при -80 ° C один раз без значительной потери инфекционности. Однако повторное размораживание и замораживание негативно влияет на вирусную заразность.

Трансдукция мочевого пузыря
Важным первым шагом при оценке влияния трансдукции является подтверждение экспрессии трансгена. Это можно оценить с помощью нескольких методов, включая инструменты, которые обнаруживают мРНК (например, RNAScope), анализ вестерн-блоттинга или использование иммунофлуоресценции 9,10,23. На рисунке 2 показан пример мышиного уротелия, который был трансдуцирован аденовирусом, кодирующим меченый V5-эпитопом гормон роста человека (V5-hGH)23. Этот белок упаковывается в дискоидальные/веретенообразные везикулы и может быть экзоцитозирован во время наполнения мочевого пузыря19,23. Вестерн-блоттинг-анализ уротелиальных лизатов выявил экспрессию V5-hGH в уротелии трансдуцированных мочевых пузырей, но не в нетрансдуцированных (рис. 2А). Экспрессия также была подтверждена иммунофлюоресценцией, в данном случае с использованием антител, которые распознавали hGH или эпитопную метку V5 (нетрансдуцированные мочевые пузыри не имели сигнала, не показаны) (рис. 2B).

Дополнительным примером является трансдукция мочевого пузыря крысы вирусом, кодирующим CLDN2, порообразующий плотное соединение, связанный с белком24,25. CLDN2 увеличивает парацеллюлярный поток катионов (включая K+), и его сверхэкспрессия приводит к воспалению и развитию висцеральной боли10. Вестерн-блоттинг подтвердил экспрессию CLND2 в мочевом пузыре крыс, трансдуцированном аденовирусом, кодирующим Cldn2, но не в мочевом пузыре, трансдуцированном контрольным вирусом, кодирующим GFP (рис. 2C). В целом, GFP не считается токсичным при экспрессии в клетках и, таким образом, служит полезным контролем. Использование GFP также позволяет исследователю подтвердить, что трансдукция работает. Иммунофлуоресцентный анализ дополнительно подтвердил экзогенную экспрессию CLDN2 в уротелиальных зонтичных клетках, трансдуцированных вирусом, кодирующим кДНК Cldn2 (красный сигнал на рисунке 2D). Кроме того, подобно эндогенному CLDN2 (не показан), экспрессированный CLDN2 локализуется в плотных соединениях, меченных TJP1, а также на базолатеральных поверхностях зонтичных клеток (CLDN2 помечен зеленым цветом на рисунке 2E)10. В случае экспрессии CLDN2 она была самой высокой через день после трансдукции, но затем снижалась и едва обнаруживалась через 15 дней.

Второе соображение заключается в том, какие типы клеток будут нацелены на аденовирусную трансдукцию. В то время как у крыс можно в основном трансдуцировать зонтичный клеточный слой19, у мышей все слои уротелия могут быть трансдуцированы, хотя трансдукция промежуточных и базальных клеточных слоев может быть вариабельной. Важно отметить, что во всей стенке мочевого пузыря трансдуцируется только уротелий, и никакие другие ткани не становятся мишенью для инстиллированного аденовируса (рис. 3).

В то время как анализ трансдуцированных клеток может быть выполнен на уровне отдельных клеток, при изучении общего фенотипа мочевого пузыря необходимо трансдуцировать большинство уротелиальных клеток. Таким образом, важно определить эффективность трансдукции (т.е. какую фракцию уротелиальных клеток трансдуцируют). Например, в случае аденовируса, экспрессирующего Cldn2, было трансдуцировано >95% зонтичных клеток (см. рис. 2D). Дополнительным примером является поле изображения, показанное на рисунке 3, где подсчет количества трансдуцированных зонтичных ячеек (в данном случае экспрессирующих датчик Ca2+ GCAMP5G) показывает эффективность, приближающуюся к 95%. Тем не менее, необходимо исследовать клетки в случайных полях, взятых по всей стенке мочевого пузыря, чтобы получить точную и объективную оценку эффективности трансдукции.

Figure 1
Рисунок 1: Очистка аденовируса. (A) Частицы аденовируса, продуцируемые инфицированными клетками HEK293T, очищали центрифугированием на прерывистом градиенте CsCl, состоящем из слоя 1,4 г/мл CsCl, слоя 1,25 г/мл CsCl и слоя образца (S), разбавленного раствором Tris-EDTA. Клеточный материал (розовая стрелка) накапливается на границе раздела S/1.25, в то время как очищенный аденовирус плавает на границе раздела 1.25/1.4 (желтая стрелка). Над последним плавает небольшая полоска неправильно собранного вируса (тонкая черная стрелка). (B) Богатая аденовирусом полоса в градиенте извлекается с помощью иглы, а CsCl удаляется из аденовируса гель-фильтрацией с использованием заполненной G25 сефадексом колонки PD10, уравновешенной PBS, содержащей 10,0% (об. / об.) глицерина. Поверхность сефадекса защищена пористой пластиковой фриттой. (C) Фракции, 0,5 мл, были собраны из колонки PD10. OD260 фракций измеряли в спектрофотометре и наносили на график значения. Фракции, богатые вирусами, растворяются в пустотном объеме, который начинается с фракции 6 и простирается до фракции 9. Объединенные фракции для этого репрезентативного эксперимента закрашены синим цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Трансдукция уротелия мочевого пузыря грызунов аденовирусами, кодирующими V5-hGH или CLDN2. (A) Мышиный уротелий был оставлен нетрансдуцированным (UT) или трансдуцирован аденовирусами, кодирующими эпитоп V5, меченный гормоном роста человека (hGH). Через 24 ч мочевые пузыри восстанавливали, уротелиальные лизаты готовили и подвергали электрофорезу полиакриламидного геля додецилсульфата натрия, а экспрессию V5-hGH подтверждали с помощью вестерн-блоттинга, зондированного антителом против hGH. (B) Обнаружение V5-hGH в уротелии мышей, срезанном и окрашенном с использованием антител к hGH (зеленый) или эпитопу V5 (красный) и вторичным антителам, меченным флуорофором. Иммунофлуоресценцию фиксировали с помощью конфокальной микроскопии. Образцы были контрокрашены TO-PRO3 для маркировки ядер. (С-Ж) Уротелий крысы трансдуцировали вирусом, кодирующим крысу CLDN2 (общее название клаудин-2) или GFP (общее название зеленого флуоресцентного белка) в качестве контроля. (C) Обнаружение экзогенного CLDN2 методом вестерн-блоттинга с использованием антитела снова CLDN2. Обратите внимание, что эндогенный CLDN2 экспрессируется на низких уровнях и не обнаруживается в этом эксперименте. (D) Трансдукция зонтичного клеточного слоя выявляется с помощью иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии. Границы клетки выявляются путем совместного окрашивания ткани с помощью FITC-фаллоидина, который маркирует цитоскелет кортикального актина. (E) Обнаружение экзогенных CLDN2 и TJP1 (общее название ZO1) с помощью иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии цельного или поперечного уротелия. Маленькие белые стрелки указывают на расположение плотного соединения, а маленькие пурпурные стрелки отмечают расположение внутриклеточных скоплений CLDN2 в цитоплазме клетки. Ранее было выявлено, что они являются CLDN210, связанными с Гольджи. (F) После трансдукции животные были усыплены в указанные дни после заражения. Экзогенная экспрессия CLDN2 была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга. Животных, экспрессирующих GFP, усыпляли после 1-го дня. Данные на рисунке 2C-E были изменены из Montalbetti et al.10 и воспроизведены с разрешения Американского физиологического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Эффективность аденовирусной трансдукции. Уротелий мочевого пузыря мыши был трансдуцирован аденовирусом, кодирующим кальциевый датчик GCaMP5G. На верхних панелях показано окрашивание на GCaMP5G (обнаруживается с помощью антитела к зеленому флуоресцентному белку; GFP, зеленый), средние панели показывают распределение ядер, окрашенных DAPI (синий), и актина, меченного родамином-фаллоидином (красный), а нижние панели представляют собой слияние трех сигналов. Белые наконечники стрелок на нижней панели - это редкие зонтичные ячейки, которые не трансдуцируются. Общая эффективность трансдукции зонтичных клеток на этом изображении составляет ~ 95%. Обратите внимание, что трансдуцируется только уротелий. Прямоугольные области увеличены на панелях справа. Область в боксе 1 в основном состоит из трансдуцированных зонтичных клеток. Областью в боксе 2 является уротелий, демонстрирующий эффективную трансдукцию зонтичных клеток, но менее эффективную трансдукцию нижележащих клеточных слоев. LP = собственная пластинка; ME = muscularis externa; Se = сероза; Ut = уротелий. Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В то время как Рамеш и др. были сосредоточены на разработке стратегий использования аденовирусной трансдукции в лечении рака мочевого пузыря 18, более поздние отчеты продемонстрировали полезность этих методов для изучения нормальной уротелиальной биологии / физиологии и патофизиологии 10,18,19,20,21 . К важным особенностям этого подхода относятся следующие: (i) Во всю стенку мочевого пузыря грызунов трансдуцируется только уротелий 10,19,20,21,22. В случае крыс трансдукция в основном ограничена слоем зонтичной клетки, в то время как у мышей весь уротелий может быть нацелен; (ii) этот подход может быть использован для экспрессии белков или миРНК 10,19,20,21,22; (iii) эффективность трансдукции может приближаться к 70%-95% (например, см. рис. 3)18,20; (iv) Через сутки после трансдукции ультраструктура уротелия, целостность ткани, наличие высокорезистентного барьера (оценивается путем измерения трансэпителиальной резистентности) и экспрессия маркеров уротелиальной дифференцировки являются «нормальными»10,19. Единственным морфологическим эффектом, отмеченным до сих пор, является уменьшение диаметра зонтичной клетки (если смотреть сверху); однако они возвращаются к своему нормальному размеру через 3-4 дня10,19; (v) уротелий может трансдуцироваться тремя различными аденовирусами одновременно18; (vi) Экспрессия трансгена может быть изменена путем титрования количества IVP, которое влияет на количество экспрессии белка, удлинения или сокращения времени инкубации до того, как животное будет принесено в жертву, или использования различных промоторов, таких как тет-регулируемая система (tet-off)19. В последнем случае можно совместно экспрессировать вирус, кодирующий трансактиватор/тет-репрессор, а затем модулировать экспрессию трансгена, изменяя концентрацию доксициклина в рационе животного.

Хотя общий протокол относительно прост, есть некоторые важные шаги, которые необходимо учитывать при выполнении этих экспериментов. Одним из них является наличие запасов вирусов с высоким титром, которые имеют разумную чистоту. Аденовирусы могут быть получены от коммерческих поставщиков, из институциональных производственных ядер вирусов, от других исследователей или они могут быть произведены собственными силами. В последнем случае рекомендуется лабораторная система AdEasy Берта Фогельштейна, поскольку ее компоненты можно приобрести у Addgene, а аденовирусы, полученные с использованием этого подхода, хорошо работают при уротелиальной трансдукции4. Этот метод позволяет генерировать аденовирусы, кодирующие кДНК размером до 8 Кб, с использованием упаковочной плазмиды pAdEasy-1 (вставка заменяет вирусные гены E1 и E3), бактериальных клеток pAdEasy-1 (которые кодируют аденовирусные гены, необходимые для продуцирования вируса) и продуцировать дефектные репликацию аденовирусы в клетках HEK293T (которые экспрессируют необходимый вирусный белок E1). Однако замена упаковочной плазмиды pAdEasy-1 упаковочной плазмидой pAdEasy-2 увеличивает размер упаковки еще на 2,7 кБ, но требует использования другой клеточной линии (E1-трансформированные эмбриональные клетки сетчатки 911 человека), поскольку у вирусов отсутствует ранний ген E4 в дополнение к E1 и E34. Экспрессия миРНК может быть осуществлена с использованием нескольких систем, включая pAdloss, который подробно описан в Kasahara et al.26. Хотя для трансдукции уротелия можно использовать богатую вирусами среду для культивирования клеток, этот метод может быть ненадежным. Вместо этого крупномасштабная амплификация вируса, градиентная очистка CsCl с последующей гель-фильтрацией обеспечивает наиболее надежный способ получения большого количества вируса с высоким титром. Относительная стабильность вируса при -80 ° C в сочетании с относительно большими выходами вируса делает это идеальным способом иметь постоянный запас вируса, который можно использовать в течение большого количества экспериментов.

Дополнительные важные шаги в этом протоколе включают те, которые связаны с протоколом трансдукции. К ним относятся использование PBS (без двухвалентных катионов) в качестве моющего средства и разбавителя, а также использование моющего средства DDM. Поскольку соединительный комплекс зависит от Ca2+ для правильного функционирования, PBS, вероятно, способствует проникновению вируса, нарушая барьер, связанный с соединением. DDM также имеет решающее значение; как сообщили Ramesh et al., эффективность трансдукции аденовируса чрезвычайно низка при отсутствии детергентной обработки18. Однако механизм действия моющего средства не ясен. 10-минутная инкубация с DDM идеальна, но ее можно сократить до 5 минут; Однако не рекомендуется, чтобы инкубация продолжалась более 10 минут, так как моющее средство может вызвать неожиданное повреждение подлежащих тканей. Количество используемого вируса является критическим параметром, при этом более высокие концентрации обычно приводят к большему количеству экспрессии трансгенов и более высокой эффективности трансдукции. Однако оптимальная концентрация вируса, которая дает наилучшее сочетание экспрессии, эффективности и фенотипа, должна быть определена эмпирически. В качестве начальной концентрации рекомендуется диапазон от 5,0 x 106 до 2,0 x 107 IVP на животное. В зависимости от экспрессируемого белка это приводит к эффективности в диапазоне 70-95% 10,19,20,21,22; однако некоторые доминантно-отрицательные конструкции ГТФазы менее эффективны (30%-50%) и требуют одноклеточного анализа 4,20. Эти различия в эффективности могут отражать оборот трансгена, его токсичность или чистоту и выход вируса, используемого для трансдукции. Последнее можно исключить, выполнив анализ зубного налета. Хотя это и не сверхкритично, время, в течение которого вирус остается в мочевом пузыре, должно быть достаточно долгим, чтобы вирус прикрепился к своему рецептору CXADR. Время менее 30 минут может снизить эффективность трансдукции, в то время как продление инкубационного периода до 45 минут может повысить эффективность; Однако это может быть трансген-зависимым. Последним важным шагом в этом протоколе является определение того, как долго животное будет содержаться до оценки фенотипа. Трансгены проявляют наибольшую экспрессию через 1-2 дня19, но после этого экспрессия может снижаться. В случае миРНК это зависит от скорости оборота самого белка. Например, при экспрессии миРНК, которые нацелены на экспрессию Rab11a, ГТФазы семейства Rab, эффективное подавление наблюдается только через 72 ч после трансдукции23. Таким образом, долгоживущие белки (с периодом полураспада, измеряемым в днях) могут не быть подходящими мишенями при использовании этого подхода.

Исследователь также должен знать о предостережениях, связанных с этим подходом. Во-первых, его полезность может быть ограничена самками грызунов из-за трудностей с катетеризацией самцов грызунов через их половой член. Тем не менее, технически возможно выполнить этот протокол у мужчин путем введения катетера в купол мочевого пузыря, аналогично препарату, используемому при выполнении цистометрии9. Это позволило бы ввести моющее средство или вирус и выполнять стирку по мере необходимости. Второе предостережение заключается в том, что чрезмерная экспрессия белков может истощить клеточные пути и ресурсы, что может привести к таким событиям, как агрегация белков, активация путей клеточного стресса и смерть27. Таким образом, как правило, разумно ограничить экспрессию трансгена нетоксичными уровнями (если, конечно, это не является целью экспрессии трансгена), что оценивается с использованием маркеров клеточного стресса и гибели клеток. Третье предостережение заключается в том, что в некоторых условиях длительная экспрессия аденовируса может вызывать иммунные реакции28. Хотя нет никаких доказательств того, что аденовирусная трансдукция уротелия сама по себе стимулирует иммунные реакции10, это трансген-зависимо, и, как отмечалось выше, гиперэкспрессия CLDN2 приводит к циститу.

В настоящее время у исследователей есть множество методов, которые они могут использовать для модуляции экспрессии генов и белков в уротелии, включая использование трансгенных или условных мышей с нокаутом уротелия, использование реагентов для трансфекции или использование аденовирусной трансдукции. Последний метод, являющийся предметом данного протокола, относительно прост, эффективен и воспроизводим. Помимо первоначальных затрат на реагенты для клеточных культур, необходимые для создания запасов вируса, очень большое количество производимого вируса (достаточное для выполнения сотен трансдукций) приводит к относительно низким затратам на одно животное. Аденовирусная трансдукция может быть использована для изучения уротелиальной биологии. Например, аденовирусная трансдукция была использована для определения важности ГТФаз семейства Rho и Rab, факторов гуанин-нуклеотидного обмена, моторных фрагментов миозина и ADAM17 в экзоцитозе и эндоцитозе 10,19,20,21,22, а аденовирусная трансдукция недавно была использована для изучения уротелиальной механотрансдукции9 . Аналогичным образом, аденовирусная трансдукция может иметь значение при изучении и лечении заболеваний человека. Например, Ramesh et al. первоначально предположили, что аденовирусная трансдукция может быть полезным способом нацеливания на опухолевые клетки18. Хотя их исследования были скорее доказательством принципиального подхода, можно представить, что экспрессия токсинов в раковых клетках или экспрессия эпитопов, которые могут быть распознаны иммунной системой, были бы полезными стратегиями. Аденовирусная трансдукция также может быть полезна для понимания заболеваний, при которых чрезмерная экспрессия или недостаточная экспрессия генных продуктов приводит к заболеванию. Например, биопсия мочевого пузыря пациентов с интерстициальным циститом показывает 90-кратное увеличение экспрессии CLDN29. Интересно, что чрезмерная экспрессия CLDN2 с использованием аденовирусной трансдукции воспроизводит многие симптомы этого заболевания у крыс10. Таким образом, CLDN2 может быть одной из мишеней при лечении пациентов с этим расстройством.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана наградой пилотного проекта через P30DK079307 (для M.G.D.), грантом NIH R01DK119183 (для G.A. и MDC), грантом NIH R01DK129473 (для G.A.), премией Американской ассоциации урологов за развитие карьеры и грантом Фонда Уинтерса (для Н.М.), ядром визуализации клеток и модельных организмов почек Питтсбургского центра исследований почек (P30DK079307), и S10OD028596 (G.A.), который финансировал покупку конфокальной системы, используемой для захвата некоторых изображений, представленных в этой рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  2. Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
  3. Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
  4. Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
  5. Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
  6. Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
  7. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
  8. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
  9. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
  10. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
  11. Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
  12. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
  13. Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
  14. Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
  15. Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
  16. Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
  17. Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  18. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
  19. Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
  20. Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
  21. Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
  22. Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
  23. Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
  24. Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
  25. Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
  26. Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
  27. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
  28. Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
  29. Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).

Tags

Биология выпуск 188
Экспрессия трансгенов в уротелии нативного мочевого пузыря с использованием аденовирус-опосредованной трансдукции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, … More

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter