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Biology

アデノウイルスを介した形質導入を用いた天然膀胱尿路上皮における導入遺伝子の発現

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

大量の組換えアデノウイルスを生成するための方法が記載されており、次いで、それを使用して天然のげっ歯類の尿路上皮を形質導入し、導入遺伝子の発現または内因性遺伝子産物のダウンレギュレーションを可能にすることができる。

Abstract

高抵抗バリアを形成することに加えて、腎盂、尿管、膀胱、および近位尿道の内側を覆う尿路上皮は、その環境に関する情報を感知して下にある組織に伝達し、排尿機能と行動を促進すると仮定されています。尿路上皮バリアまたはその感覚/トランスデューサー機能の破壊は、疾患につながる可能性があります。これらの複雑な事象の研究は、尿路上皮における遺伝子およびタンパク質発現を変化させるための単純な戦略の欠如によって妨げられている。ここでは、研究者が大量の高力価アデノウイルスを生成することを可能にし、それを使用してげっ歯類の尿路上皮を高効率で比較的簡単な方法で形質導入することができる方法について説明します。cDNAと低分子干渉RNAの両方をアデノウイルス形質導入を用いて発現させることができ、尿路上皮機能に対する導入遺伝子発現の影響を12時間から数日後に評価することができる。これらの方法は、マウスまたはラット動物モデルを用いた正常および異常な尿路上皮生物学の研究に広く適用できます。

Introduction

尿路上皮は、腎盂、尿管、膀胱、および近位尿道1を覆う特殊な上皮です。それは3つの層で構成されています:高度に分化し分極したしばしば二核傘細胞の層であり、その頂端表面は尿に浸されています。それらの急性喪失に応答して表在性アンブレラ細胞を生じさせることができる二核トランジット増幅細胞の集団を有する中間細胞層。基底細胞の単層であり、そのサブセットは、慢性損傷に応答して尿路上皮全体を再生することができる幹細胞として機能する。アンブレラ細胞は主に、水や溶質に対する透過性の低い頂端膜(コレステロールとセレブロシドが豊富)や、高抵抗の頂端接合複合体(タイトジャンクション、アドヒアレンスジャンクション、デスモソーム、および関連するアクトミオシンリングで構成される)を含む高抵抗尿路上皮バリアの形成に関与しています1。.傘細胞の頂端表面とその接合リングの両方が膀胱充填中に拡張し、排尿後に急速に充填前の状態に戻ります1、2、3、4、5。バリア機能におけるその役割に加えて、尿路上皮はまた、細胞外環境の変化を感知することを可能にする感覚およびトランスデューサー機能を有すると仮定されている(例えば、伸張)そしてメディエーター(ATP、アデノシン、アセチルコリンを含む)の放出を介してこの情報を、下皮下求心性神経突起を含む下層組織に伝達する6,7,8。.この役割の最近の証拠は、Piezo1とPiezo2の両方の尿路上皮発現を欠くマウスで発見され、その結果、排尿機能が変化します9。さらに、傘細胞層でタイトジャンクション孔形成タンパク質CLDN2を過剰発現しているラットは、間質性膀胱炎の患者に見られるのと同様の炎症と痛みを発症します10。尿路上皮感覚/トランスデューサーまたはバリア機能の破壊がいくつかの膀胱障害に寄与する可能性があるという仮説が立てられています6,11。

正常状態および疾患状態における尿路上皮の生物学のより良い理解は、研究者が内因性遺伝子発現を容易にダウンレギュレートしたり、天然組織における導入遺伝子の発現を可能にしたりすることを可能にするツールの利用可能性にかかっています。遺伝子発現をダウンレギュレートする1つのアプローチは、条件付き尿路上皮ノックアウトマウスを生成することですが、このアプローチは、フロックス対立遺伝子を持つマウスの利用可能性に依存し、労働集約的であり、完了するまでに数か月から数年かかる場合があります12。当然のことながら、研究者は尿路上皮をトランスフェクトまたは形質導入する技術を開発しており、これによりより短い時間スケールで結果が得られる可能性があります。トランスフェクションのための公表された方法には、カチオン性脂質13、アンチセンスホスホロチオ化オリゴデオキシヌクレオチド14、またはHIV TATタンパク質につなが留されたアンチセンス核酸透過性11量体ペプチド15の使用が含まれる。ただし、このプロトコルの焦点は、広範囲の細胞への遺伝子送達に効率的である十分に研究された方法論であるアデノウイルス媒介形質導入の使用にあり、多数の臨床試験でテストされており、最近では、COVID-19カプシドタンパク質をコードするcDNAをCOVID-19ワクチンの1つの変異体のレシピエントに送達するために使用されました16。17.アデノウイルスのライフサイクル、アデノウイルスベクター、およびアデノウイルスの臨床応用のより完全な説明については、読者は参考文献17に向けられる。

尿路上皮を形質導入するためのアデノウイルスの使用における重要なマイルストーンは、N-ドデシル-β-D-マルトシド(DDM)を含む界面活性剤による短い前処理が、β-ガラクトシダーゼ18をコードするアデノウイルスによる尿路上皮の形質導入を劇的に増強したことを示したRameshらの報告でした。この原理実証研究をガイドとして、尿路上皮のアデノウイルス媒介形質導入は、RabファミリーGTPアーゼ、グアニンヌクレオチド交換因子、ミオシンモーターフラグメント、孔形成タイトジャンクション関連クローディン、およびADAM17 10、19、20、21、22を含むさまざまなタンパク質を発現するために使用されています10、19、20、21、22.同じアプローチが小さな干渉RNA(siRNA)を発現するように適応され、その効果は導入遺伝子22のsiRNA耐性変異体を共発現することによって救出された。ここで説明するプロトコルには、これらの技術の要件である大量の高濃度アデノウイルスを生成するための一般的な方法、および尿路上皮で導入遺伝子を高効率で発現させるためのRameshらの方法の適応が含まれます18。

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Protocol

BSL2認証を必要とするアデノウイルスの生成を含む実験は、ピッツバーグ大学環境衛生安全局および施設内バイオセーフティ委員会の承認を受けて実施されました。アデノウイルス形質導入(ABSL2認証が必要)を含むすべての動物実験は、実験動物の人道的管理と使用に関する公衆衛生サービスポリシーおよび動物福祉法の関連するガイドライン/規制に従って、ピッツバーグ大学施設動物管理および使用委員会の承認の下で行われました。手袋、目の保護具、および適切な衣服は、組換えウイルスを含むすべての手順で着用されます。液体または固体の廃棄物は、以下に説明するように処分する必要があります。形質導入後の動物の寝具、および結果として生じる動物の死骸は、バイオハザード物質として扱われ、制度的方針に従って処分されるべきです。

1. 高力価アデノウイルスストックの調製

注:げっ歯類の膀胱の効果的な形質導入は、精製および濃縮されたウイルスストックの使用に依存し、通常はμLあたり1 x 107 〜1 x 108 感染性ウイルス粒子(IVP)です。.プロトコルのこの部分は、既存のウイルス調製物から高力価のアデノウイルスストックを生成することに焦点を当てています。すべてのステップは、滅菌試薬とツールを使用して細胞培養フードで実行する必要があります。現在使用されているアデノウイルスの利用可能な株は複製に欠陥がありますが、ほとんどの施設ではアデノウイルスと組換えDNAを使用するために承認が必要です。これには、多くの場合、アデノウイルスを産生および増幅するためのBSL2承認施設としての細胞培養室の指定が含まれます。いくつかの一般的な考慮事項には、ウイルスの生成と精製のすべての段階でのマスク、目の保護具、手袋、および適切な衣服の使用が含まれます。遠心分離を行う際、遠心分離管にしっかりとフィットするキャップがない場合は、安全キャップをお勧めします。汚染された可能性のある遠心分離機の安全キャップ、ボトル、ローターを含むすべての非使い捨て材料は、抗ウイルス溶液( 材料の表を参照)で処理され、水または70%エタノールですすがれます。液体廃棄物は、最終濃度10%(v / v)まで漂白剤を添加することによって処理されます。これらの液体廃棄物の処分は、制度上の方針によって異なります。固形廃棄物は通常、バイオハザード廃棄物として処分されます。

  1. HEK293T細胞の培養
    1. HEK293T細胞の凍結バイアルを37°Cの水浴中で解凍し、5 mLピペットを使用して細胞を直径15cmの細胞培養皿に移します。25 mLのピペットを使用して、10%(v / v)ウシ胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質(DMEM-FBS-PS)を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)20 mLを皿にゆっくりと加えます。.細胞が80%-90%のコンフルエント(~2 x 107細胞)に達するまで、5%(v/v)のCO2でガス化された37°Cの細胞培養インキュベーターで細胞をインキュベートします。
    2. 真空源に取り付けられたガラスピペットを使用して、培地を吸引し、次いで25mLピペットを用いて20mLの滅菌PBS(2.7mM KCl、1.5mMKH2PO4、136.9mM NaCl、および8.9mM Na2HPO4)をディッシュに移して細胞をリンスした。使用済みPBSを吸引し、5 mLピペットを使用して3 mLの温かい(37°C)プロテイナーゼ溶液(材料の表を参照)をディッシュに移し、細胞が剥離するまで(~3-4分)細胞培養インキュベーター内でディッシュをインキュベートします。
      注:効果的なタンパク質分解は、ディッシュをゆっくりと前後に傾けて、ディッシュのすべての部分から移動する液体への細胞の放出を探すことによって最もよく評価できます。HEK293T細胞は長時間のプロテイナーゼ処理に敏感であり、プロテイナーゼ溶液に数分以上放置すると死滅します。
    3. 10 mLピペットを使用して7 mLのDMEM-FBS-PSを剥離した細胞のディッシュに移し、同じピペットを使用して細胞と培地を吸引します。懸濁した細胞を50 mLのコニカルチューブに移し、懸濁液を低速臨床遠心分離機で200 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化します。真空源に取り付けられたガラスピペットを使用して上清を吸引します。25 mL ピペットを使用して、細胞ペレットを 15 mL の DMEM-FBS-PS に再懸濁します。
    4. 19 mLのDMEM-FBS-PSを含む15 cmディッシュ15 cmディッシュのそれぞれに1 mLの細胞懸濁液を追加します。
    5. 細胞が85%〜90%のコンフルエントに達するまで組織培養インキュベーター内で細胞を増殖させます(~3〜4日)。
  2. 希釈したウイルス溶液を準備する
    1. 既存のウイルスストック(5-10 IVP/細胞)の~1.5 x 10 9から3 x10 9 IVPを、FBSまたは抗生物質を含まない45 mLのDMEMで満たされた50 mLコニカルチューブに追加します。
      注:低濃度のウイルス(1-5 IVP /細胞)を使用することが可能です。ただし、ウイルスの生成には時間がかかります。
  3. 培養細胞をウイルスに感染させる。
    1. 真空源に取り付けられたガラスピペットを使用して、ステップ1.1.5でほぼコンフルエントな細胞から培地を吸引します。
    2. 25 mL ピペットを使用して、希釈したウイルス溶液 3.0 mL (ステップ 1.2.1 で調製) を各細胞培養皿に移します。次に、10 mLピペットを使用して、7.0 mLのDMEM培地(FBSまたは抗生物質を含まない)を各ディッシュに追加します。細胞培養インキュベーターで60分間インキュベートした後、20%(v/v)FBSと2x PSを含むDMEM10 mLを各ディッシュに加えます。
      注:15皿の1つをコントロールプレート(ウイルスを添加していない)として使用すると、次のステップでウイルス誘発性の細胞の丸みと感染細胞の死を簡単に特定できます。
    3. 細胞培養インキュベーター内で細胞の大部分が切り上げ始め、細胞の>60%が剥離するまで、細胞を2〜4日間インキュベートします。
      注:ウイルスの力価が低い場合、細胞死が発生するまでに最大1週間かかる場合があります。細胞死が1週間以内に起こらない場合は、ウイルスのより高い力価を使用してこのプロセスを繰り返す必要がある可能性があります。
  4. 細胞溶解物からウイルスを回収
    1. セルスクレーパーを使用して各皿の底をこすり、付着した細胞を培地に放出します。
    2. 25 mLピペットを使用して、各細胞培養皿から培地、細胞、および細胞破片を収集し、50 mLのコニカル細胞培養チューブにプールします。
      注:リソースを節約するために、2つのディッシュの培地を1つの50 mLチューブに組み合わせることができます。
    3. 低速卓上遠心分離機を使用した遠心分離によって細胞材料をペレット化します:3,000 x gで室温で5分間。真空装置に取り付けられたガラスピペットを使用して、上清を吸引します。
    4. 10 mLピペットを使用し、粉砕と組み合わせて、得られたすべてのペレット材料を、10 mM EDTA(Tris-EDTA溶液)を含む滅菌ろ過された100 mM Tris-HCl pH 7.4の合計7 mLに固めました。プールした材料を滅菌済みの15 mL細胞培養コニカルチューブに移し、氷上に置きます。
      注:この時点で、ウイルス調製は-80°Cで無期限に凍結できます。
  5. 細胞ライセートの調製
    1. 3回の凍結融解サイクルを実行して残りの細胞を破壊し、形成されたウイルス粒子をさらに遊離させます。ステップ1.4.4で、チューブを液体窒素(~30-60秒)に沈めて、プールされた材料を凍結します。チューブを37°Cのインキュベーターに入れてサンプルを急速に解凍します。サンプルを15秒間ボルテックスしてから、急速凍結解凍手順をさらに2倍繰り返します。
      注意: ウイルス溶液は水浴中で37°Cで急速に解凍できますが、温度変動によりチューブにひびが入り、ウイルス溶液が水浴に放出される可能性があるため注意が必要です。これを防ぐには、ウイルス上清を含むチューブをより大きなチューブに入れ、それを水浴にセットします。
    2. 10 mLピペットを使用して、3回凍結融解した細胞材料を超高速遠心チューブに移します。チューブ内の材料を~18,500 x gの4°C超高速遠心分離機で30分間遠心分離します。
    3. ウイルスが豊富な上清を10 mLピペットで~7 mL回収し、15 mLのコニカルチューブに移します。次のステップまでサンプルを氷上に保持します。
      注:この時点で、未精製のウイルス上清のアリコートを、新しいウイルス調製を開始するための前文として(またはバックアップとして)保持することを検討してください。このアリコートを-80°Cで保存してください。
  6. 密度勾配遠心分離を使用してウイルスを分離および精製します。
    1. 12 mL PET薄肉透明超遠心チューブ( 材料表を参照)または同等のチューブでCsClの不連続グラジエントを調製します。18 Gの針を備えた3 mLシリンジを使用して、2.5 mLの1.4 g / mL CsCl溶液をチューブの底に注意深く導入し、次に新しいシリンジ/ニードルを使用して2.5 mLの1.25 g / mL CsCl溶液と層状にします。
      注意: 既存の層の上に溶液を直接落とすと、重大で不要な混合が発生します。代わりに、針の斜角部分をチューブの端に当ててから、シリンジプランジャーを非常にゆっくりと押して、溶液がチューブを満たすときに針の位置を上げます。
    2. 10 mLシリンジを使用して、同様の方法で~7 mLのウイルス上清を勾配の上にロードします。ウイルス上清とチューブの上部の間に2〜3 mmを超えるスペースがある場合は、Tris-EDTA溶液を追加して、2〜3 mmのスペースが残るまでチューブを満たします。
    3. 同様に調製したバランスチューブを作り、CsClの層を含むが、ウイルス上清の代わりにTris-EDTA溶液を使用する。
      注意: 超遠心分離機での潜在的に危険な不均衡な負荷状況を防ぐために、2つのチューブは同じ重量(および同様の密度)である必要があります。
  7. 速度帯超遠心分離を使用してウイルスを分離します。
    1. ステップ1.6.2〜1.6.3で形成された勾配をSW41ローターまたは同等のバケットにロードします。バケットキャップをねじ込み、ローターを超遠心分離機(4°Cに予冷)に入れ、~150,000 x gで1時間遠心分離します。
    2. 遠心分離中は、以下のステップ1.9.1に記載のカラムを平衡化します。
  8. 分離されたウイルス粒子を回収する
    1. 遠心分離ステップの最後に、ローターからバケットを慎重に取り外し、細胞培養フードでバケットキャップを取り外してから、チューブを取り外してラックに入れます。
    2. 1.25 g/mL と 1.4 g/mL の CsCl 溶液の界面に浮遊するウイルス粒子が豊富なバンド状物質を収集します。勾配の入ったチューブを細胞培養皿の下半分(こぼれた物質を捕らえる)にかざし、3 mLシリンジに取り付けられた1インチ18 Gの針を使用して、縞模様のウイルスのすぐ下でチューブに注意深く穴を開けます。ウイルスをゆっくりと吸引し、通常は~1 mLで回収します。
    3. チューブから針を外すと、勾配の残りの材料がチューブから細胞培養皿の下半分に流れ込みます(液体は有害廃棄物として処理する必要があります)。
    4. シリンジ内のウイルス溶液を氷上の滅菌微量遠心チューブに移します。
      注意: このステップでウイルスを回収するときは、針の内腔が上を向くように針を配置し、針がウイルスリッチバンドの数mm下に開きます。縞模様のウイルスの2〜3 mm上に時々観察される不適切に組み立てられたウイルスの薄い帯による汚染を避けてください( 図1Aの細い黒い矢印を参照)。
  9. ゲルろ過によりサンプルからCsClを除去します。
    1. サポートスタンドにクランプしたPD-10カラム(Sephadex G-25Mを充填済み)を、10%(v/v)グリセロールを含む0.2 μm滅菌ろ過PBS50 mLで平衡化します。
      注:最初の平衡化ステップは完了するまでに2〜3時間かかり、カラムを安定させるためにメーカーが使用する防腐剤を完全に洗い流すために必要です。
    2. 洗浄液をフリット(カラム培地の上部にある白い物質の保護ディスク)の下に沈め、手順1.8で収集した精製ウイルス溶液をカラムの上部に注意深く移します。ウイルスが豊富な溶液をフリットの下に後退させてから、カラムにPBSグリセロールを充填し始めます。
      注意: フリットの1つの機能は、カラムが乾くのを防ぐことです。その結果、溶離液がカラムに添加されるまでの短い遅延が許容されます。
    3. 溶出液を12本の滅菌マイクロ遠心チューブ(フラクションあたり0.5 mL)に集めます。
  10. ウイルス収量を決定します。
    1. 分光光度法を用いてピークウイルス画分を決定する。PBS中の各画分の1:100希釈液を調製し、バッファー単独の1:100希釈をブランクとして使用して、分光光度計でOD260 を測定します。ウイルス粒子は、フラクション6付近からボイドボリュームで溶出するはずです。最高のOD260 測定値を含むフラクションをプールします。
    2. プールされたウイルス画分を1:100に希釈し、OD260を再測定します。次の式を使用して、ウイルス粒子の最終濃度とプールされた画分中のIVPの数を計算します:mLあたりのウイルス粒子= OD260 × 100(これは希釈係数を補正します)×1012。一般的な推定では、ウイルス粒子の1%がIVPであり、IVP / mL = OD 260 × 100 ×10 10またはIVP / μL = OD260 × 100 ×10 7。
  11. プールされたウイルス画分(5 x 107 〜1 x 108 IVPを含む)を滅菌マイクロ遠心チューブまたはクライオバイアルに分注します。サンプルは-80°Cで保存してください。

2.げっ歯類の膀胱の形質導入

注:この手法を初めて使用する場合は、一度に形質転換する動物の数を2〜4匹に制限することをお勧めします。これは、特にステップ2.2の界面活性剤処理中、およびステップ2.3のウイルスインキュベーション中に、各動物の開始時間をずらすことによって達成できます。経験豊富な研究者は、一度に最大6匹の動物を形質転換することができます。

  1. 膀胱をカテーテルする
    1. 雌のC57Bl/6Jマウス(通常8-10週齢、~20-25 g)または雌のSprague Dawleyラット(典型的には2-3ヶ月齢、~250 g)を、ノーズコーンを取り付けた気化器を使用して麻酔します。気化器を校正して、マウスの場合は3.0%(v / v)のイソフルラン、97%(v / v)O 2、ラットの場合は4.0%(v / v)のイソフルラン、96%(v / v)O2を生成します。つま先のつまみに反応しないことを確認して、動物が麻酔をかけていることを確認します(通常は1〜2分後)。
    2. 動物を加熱パッドの上に置いて、動物の体温を維持します。形質導入プロトコル全体を通して動物を監視して、動物が麻酔をかけられ、この手順中に痛みを感じないことを確認します。
    3. イソフルランをマウスの場合は1.5%(v / v)、ラットの場合は2.0%(v / v)に減らし、プロトコルの期間中、動物を麻酔下に維持します。.
    4. 膀胱に空気が入らないようにするには、トランスファーピペットを使用して、IVカテーテルのプラスチックカテーテル部分( 材料の表を参照)および関連するハブに滅菌PBSを充填します。
    5. 動物を仰臥位にして、外口を70%アルコールで拭き取り、滅菌カテーテルを外口、尿道、膀胱の順に挿入します。
      1. このタスクを実行するには、細かい鉗子を使用して、外部口を形成する組織をそっとつかみ、動物から離れて垂直に伸ばします。もう一方の手を使用して、カテーテルを尿道口(膣の開口部のすぐ上の肉の山)に垂直に約3〜4 mm慎重に挿入します。次に、尿道が曲がっているため、外道に挿入されたカテーテルを動物の尾に向かって下げ、恥骨の下を通過する尿道の部分への侵入を容易にし、最終的には膀胱に入ります。
        .注:特にマウスの場合、カテーテルは長すぎる可能性があり、1.0〜1.1 cm以上を動物に挿入しないでください。さもなければ、膀胱粘膜への損傷が起こります。これを防ぐには、カテーテルの先端から~1 cm下にマークを付けてから、このマーキングを超えてカテーテルを挿入しないでください。
    6. 膀胱内の尿が漏れるのを待ちます。クレデの操作を実行して、残りの尿を取り除きます:マッサージし、下腹部の膀胱隆起をそっと押し下げます。
  2. 尿路上皮を界面活性剤溶液で処理することにより、形質導入を受け入れられるようにします。
    1. PBSで満たされた滅菌1 mLシリンジをカテーテルハブに取り付けて、マウスまたはラットの膀胱を洗浄します。100 μLの滅菌PBSをマウス膀胱に注射します(またはラットの膀胱の場合は450 μL)。シリンジをカテーテルフィッティングから取り外し、PBSドレーンを許可します。必要に応じて、Credeの操作を実行して余分な膀胱液を取り除きます。
    2. 滅菌した1 mLシリンジを使用して、100 μLの0.1%(w / v)N-ドデシル-β-D-マルトシド(DDM)(PBSに溶解し、0.2 μmフィルター滅菌)をマウス膀胱に注入します。シリンジを所定の位置に残して、DDMを膀胱内に10分間保持します。ラットでは、DDMの容量は450μLに増加します。
    3. シリンジを取り外して排出させることにより、DDMを膀胱から取り外します。必要に応じて、クリードの操作を実行します。
  3. 膀胱にウイルスを導入します。
    1. 滅菌1 mLシリンジをカテーテルハブに取り付け、マウスの場合は滅菌PBS100 μL、ラットの場合は450 μLで希釈したアデノウイルス(ステップ1で調製)の0.5 x 107 〜1x 10 8 IVP を膀胱に注入します。ウイルス溶液が逃げないように、注射器をカテーテルに取り付けたままにします。
    2. 30分後、シリンジを取り外し、ウイルス溶液が膀胱を使い捨てパッドに排出できるようにします。残留ウイルス溶液を吸収性ワイプで拭き取り、パッドを廃棄してバイオハザード廃棄物で拭きます。
      注:グリセロールは細胞毒性があります。そのため、マウスに点滴されるウイルス溶液の最大量は5 μLに制限されています(100 μLのPBSに希釈すると、最終グリセロール濃度は~0.5%[v/v]になります)。さらに、点滴するIVPの数を増やし、ウイルスのインキュベーションを45分に延長することにより、形質導入効率を高めることができます。
    3. オプションのステップ:上記のステップ2.2.1で説明されているように、膀胱をPBSですすぐことができます。ただし、これは必須ではありません。
  4. 動物が回復するのを待ちます。
    1. イソフルランの流れを止め、特に動物が集団収容されている場合は、ケージに戻す前に動物が回復して完全に移動できるようにします。.
      注:ウイルス導入 自体は 観察可能な下部尿路症状や痛みを引き起こさないため、通常、術後治療は必要ありません。ただし、コードされた導入遺伝子が有毒である場合は、施設の必要に応じて、手順後の鎮痛または抗生物質が必要になる場合があります。
  5. mRNA in situハイブリダイゼーション、ウェスタンブロット、または免疫蛍光9、10、23などの方法を使用して、治療後12〜72時間の導入遺伝子発現の影響を分析します(代表的な結果を参照)。

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Representative Results

ウイルスの準備
密度勾配遠心分離によるウイルス精製の一例を 図1Aに示す。ロードされた細胞物質と1.25 g / mLのCsCl層の界面に見られる淡いピンク色のバンドは、主に破壊された細胞とその破片で構成されています( 図1Aのマゼンタの矢印を参照)。ピンクがかった色は、プロトコルのステップ1.5から引き継がれた少量の培地に由来します。乳白色のバンドとして現れる目的のウイルス粒子は、1.25 g/mL CsCl溶液と1.40 g/mL CsCl溶液の界面にあります( 図1Aの黄色の矢印を参照)。濃縮されたウイルス粒子の上に2〜3 mm浮かぶ物質の帯を観察することもできます( 図1Aの細い黒い矢印を参照)。組み立てられていないウイルスや破片で構成され、IVPはほとんど含まれていないため、ウイルスサンプルを収集する際には避ける必要があります。

PD10カラムを用いたウイルスのさらなる精製および緩衝液交換を図1Bに示し、溶出後に得られた画分のOD260測定値を図1Cに示す。これらのカラムの空隙容量は約3mLであるため、ウイルスは画分6に現れ始め、画分9でピークに達します。この実験では、画分6〜9をプールした。画分6および7はウイルス粒子が比較的少ないが、回収に値する十分なウイルスを含み、非常に高い力価画分をより合理的な濃度に希釈するのに役立つ。画分10〜12は、画分11におけるOD260の増加が、これらの調製物において変動的に観察される第2の汚染ピークの存在の可能性を示すので、含まれなかった。プールされたフラクションは通常、1 x 107〜1 x 108 IVP / μLであり、期待される収率は1 x 10 10〜2 x10 11の合計IVPのオーダーになります。これは、何百もの形質導入を実行するのに十分な量のウイルスです。プラークアッセイによって、または蛍光タンパク質22を発現する細胞のコロニーをカウントすることによってウイルスを力価を付けることが可能であるが、ほとんどの場合、1%ルールで十分である。このルールは、サンプルのOD260を測定することによって推定された精製ウイルス粒子の1%がIVPであることを示しています。-80°Cで保存されたウイルスのアリコートの保存期間は2〜5年ですが、感染力は長期的に低下します。解凍したウイルスアリコートは、感染力を大幅に失うことなく、-80°Cで1回再凍結できます。ただし、解凍と凍結を繰り返すと、ウイルスの感染力に悪影響を及ぼします。

膀胱形質導入
形質導入の影響を評価する際の重要な最初のステップは、導入遺伝子発現を確認することです。これは、mRNAを検出するツール(例えば、RNAScope)、ウェスタンブロット分析、または免疫蛍光の使用を含むいくつかの技術を用いて評価することができる9、10、23。図2は、V5エピトープタグ付きヒト成長ホルモン(V5-hGH)23をコードするアデノウイルスで形質導入されたマウス尿路上皮の例です。このタンパク質は円盤状/紡錘状小胞にパッケージ化されており、膀胱充填中にエキソサイトーゼすることができます19,23。尿路上皮ライセートのウェスタンブロット分析では、形質導入膀胱の尿路上皮でV5-hGHの発現が明らかになりましたが、形質導入されていない膀胱では発現しませんでした(図2A)。発現は免疫蛍光法によっても確認され、この場合、hGHまたはV5エピトープタグを認識する抗体を用いた(非形質導入膀胱はシグナルを欠いており、図示せず)(図2B)。

さらなる例は、孔形成タイトジャンクション関連タンパク質であるCLDN2をコードするウイルスによるラット膀胱の形質導入である24,25である。CLDN2は陽イオン(K+を含む)の傍細胞フラックスを増加させ、その過剰発現は炎症と内臓痛の発症をもたらします10。ウエスタンブロット分析では、Cldn2をコードするアデノウイルスで形質導入されたラット膀胱におけるCLND2の発現が確認されたが、対照GFPコードウイルスで形質導入されたものは確認されなかった(図2C)。一般に、GFPは細胞内で発現しても毒性があるとは考えられないため、有用なコントロールとして機能します。GFPを使用することで、研究者は形質導入が機能していることを確認することもできます。免疫蛍光分析により、Cldn2 cDNAをコードするウイルスで形質導入された尿路上皮傘細胞における外因性CLDN2発現がさらに確認された(図2Dの赤色シグナル)。さらに、内因性CLDN2(図示せず)と同様に、発現されたCLDN2は、TJP1標識タイトジャンクション、ならびにアンブレラ細胞の基底外側表面に局在する(CLDN2は図2Eにおいて緑色に標識されている)10。CLDN2発現の場合、形質導入後1日で最も高かったが、その後引きずり出され、15日後にはほとんど検出されなかった。

2番目の考慮事項は、どの細胞タイプがアデノウイルス形質導入の標的になるかです。ラットでは傘細胞層19を大部分形質導入することが可能であるが、マウスでは、尿路上皮のすべての層を形質導入することができるが、中間細胞層および基底細胞層の形質導入は可変であり得る。重要なことに、膀胱壁全体では、尿路上皮のみが形質導入され、他の組織は点滴アデノウイルスの標的になりません(図3)。

形質導入された細胞の分析は単一細胞レベルで実行できますが、膀胱全体の表現型を探索する場合は、尿路上皮細胞の大部分を形質導入する必要があります。したがって、形質導入の効率(すなわち、尿路上皮細胞のどの画分が形質導入されるか)を定義することが重要である。例えば、 Cldn2発現アデノウイルスの場合、>95%のアンブレラ細胞が形質導入された( 図2D参照)。追加の例は、 図3に示す画像野であり、ここで、形質導入されたアンブレラ細胞の数をカウントすると(この場合、Ca2+ センサーGCAMP5Gを発現すると)、95%に近づく効率が明らかになります。ただし、形質導入効率の正確で偏りのない推定値を達成するために、膀胱壁全体で撮影されたランダムフィールドで細胞を調べる必要があります。

Figure 1
図1:アデノウイルスの精製 。 (A)感染したHEK293T細胞によって産生されたアデノウイルス粒子は、1.4 g / mL CsClの層、1.25 g / mL CsClの層、およびTris-EDTA溶液で希釈されたサンプルの層(S)からなる不連続CsCl勾配で遠心分離によって精製されました。細胞物質(ピンクの矢印)はS / 1.25界面に蓄積し、精製されたアデノウイルスは1.25 / 1.4界面に浮遊します(黄色矢印)。不適切に組み立てられたウイルスの小さな帯が後者の上に浮かんでいます(細い黒い矢印)。(B)グラジエントのアデノウイルスリッチバンドを針を使用して回収し、10.0%(v / v)グリセロールを含むPBSで平衡化したG25セファデックス充填PD10カラムを使用したゲルろ過によってCsClをアデノウイルスから除去します。セファデックスの表面は、多孔質のプラスチックフリットで保護されています。(c)画分0.5mLをPD10カラムから回収した。OD260 の分画を分光光度計で測定し、その値をプロットした。ウイルスに富む画分は、画分6から始まり、画分9まで広がるボイドボリュームで溶出します。この代表的な実験のプールされた画分は青色で網掛けされています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:V5-hGHまたはCLDN2をコードするアデノウイルスによるげっ歯類膀胱尿路上皮の形質導入。 (A)マウス尿路上皮を形質導入せずに放置した(UT)か、V5エピトープタグ付きヒト成長ホルモン(hGH)をコードするアデノウイルスで形質導入した。24時間後、膀胱を回収し、尿路上皮溶解物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、hGHに対する抗体でプローブしたウェスタンブロットを用いてV5-hGH発現を確認した。(B)hGH(緑)またはV5エピトープ(赤)に対する抗体と蛍光色素タグ付き二次抗体を用いて切片化したマウス尿路上皮におけるV5-hGHの検出。免疫蛍光は、共焦点顕微鏡を用いて捕捉した。サンプルをTO-PRO3で対比染色して核を標識した。(C-F)ラット尿路上皮は、ラットCLDN2(一般名クローディン-2)またはGFP(一般名緑色蛍光タンパク質)をコードするウイルスを対照として形質導入した。(c)再度CLDN2抗体を用いたウエスタンブロッティングによる外因性CLDN2の検出。内因性CLDN2は低レベルで発現しており、この実験では検出されないことに注意してください。(D)傘細胞層の形質導入は、免疫蛍光および共焦点顕微鏡によって明らかにされる。細胞の境界は、皮質アクチン細胞骨格を標識するFITCファロイジンで組織を共染色することによって明らかにされます。(E)全マウントまたは断面尿路上皮の免疫蛍光および共焦点顕微鏡による外因性CLDN2およびTJP1(一般名ZO1)の検出。小さな白い矢印はタイトジャンクションの位置を示し、小さなマゼンタの矢印は細胞質内のCLDN2の細胞内蓄積の位置を示します。これらは以前にゴルジ体CLDN210であることが明らかになった。(F)形質導入後、動物は感染後指示された日に安楽死させた。外因性CLDN2発現は、ウエスタンブロッティングを用いて検出した。GFPを発現する動物を1日目以降に安楽死させた。図2C-Eのデータは、Montalbettiら10から改変されており、米国生理学会の許可を得て複製されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:アデノウイルス形質導入の効率。 マウス膀胱尿路上皮は、カルシウムセンサーGCaMP5Gをコードするアデノウイルスで形質導入した。上のパネルは、GCaMP5G(緑色蛍光タンパク質に対する抗体を用いて検出;GFP、緑)、中央のパネルはDAPI染色核(青)とローダミンファロイジン標識アクチン(赤)の分布を示し、下のパネルは3つのシグナルの融合を示しています。下のパネルの白い矢印は、形質導入されていないまれな傘細胞です。この画像における傘細胞の形質導入の全体的な効率は~95%である。尿路上皮のみが形質導入されることに注意してください。ボックス化された領域は、右側のパネルで拡大されます。ボックス1の領域は、主に形質導入されたアンブレラ細胞を含む。ボックス2の領域は尿路上皮であり、傘細胞の効率的な形質導入を示すが、下にある細胞層の効率的な形質導入は少ない。LP =固有層;ME =筋筋外筋;Se =漿膜;Ut=尿路上皮。画像は共焦点顕微鏡を用いて取得した( 材料表参照)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

Rameshらは、膀胱癌の治療にアデノウイルス形質導入を使用する戦略の開発に焦点を当てていましたが18、最近の報告では、正常な尿路上皮生物学/生理学および病態生理学の研究におけるこれらの技術の有用性が実証されています10,18,19,20,21。.このアプローチの重要な特徴は、以下を含む:(i)げっ歯類の膀胱壁全体において、尿路上皮のみが形質導入される10、19、20、21、22。ラットの場合、形質導入は主に傘細胞層に限定されますが、マウスでは尿路上皮全体を標的にすることができます。 (ii)このアプローチは、タンパク質またはsiRNAを発現するために使用することができる10、19、20、21、22;(iii)形質導入の効率は70%〜95%に近づく可能性があります(例えば、図3を参照)18,20;(iv)形質導入の1日後、尿路上皮の微細構造、組織の完全性、高抵抗バリアの存在(経上皮抵抗を測定することによって評価)、および尿路上皮分化マーカーの発現は「正常」です10,19。これまでに指摘された唯一の形態学的効果は、(上から見た場合の)傘細胞直径の減少です。ただし、3〜4日後に通常のサイズに戻ります10,19;(v)尿路上皮は、最大3つの異なるアデノウイルスを同時に形質導入することができます18;(vi)導入遺伝子発現は、タンパク質発現量に影響を与えるIVPの数を滴定すること、動物が屠殺される前の潜伏時間を延長または短縮すること、またはtet調節システム(tet-off)19などの異なるプロモーターを使用することによって変化させることができる。後者の場合、トランスアクチベーター/テットリプレッサーをコードするウイルスを共発現し、動物の食事中のドキシサイクリンの濃度を変えることによって導入遺伝子の発現を調節することができる。

全体的なプロトコルは比較的単純ですが、これらの実験を実行する際に考慮しなければならないいくつかの重要なステップがあります。これらの1つは、妥当な純度の高力価ウイルスストックの入手可能性です。アデノウイルスは、商業ベンダー、機関のウイルス産生コア、他の研究者から入手することも、社内で製造することもできます。後者の場合、その成分はAddgeneから購入でき、このアプローチを使用して生成されたアデノウイルスは尿路上皮形質導入でうまく機能するため、バートフォーゲルシュタイン研究所AdEasyシステムが推奨されます4。この技術により、pAdEasy-1パッケージングプラスミド(インサートはウイルス遺伝子E1およびE3を置き換える)、pAdEasy-1細菌細胞(ウイルスの産生に必要なアデノウイルス遺伝子をコードする)、およびHEK293T細胞(必要なウイルスE1タンパク質を発現する)における複製欠損アデノウイルスの産生を使用して、8 KbまでのcDNAをコードするアデノウイルスを生成することができます。ただし、pAdEasy-1パッケージングプラスミドをpAdEasy-2パッケージングプラスミドに置き換えると、パッケージングサイズがさらに2.7 kB増加しますが、ウイルスはE1およびE34に加えて初期遺伝子E4を欠くため、別の細胞株(E1形質転換ヒト胚性網膜911細胞)を使用する必要があります。siRNAの発現は、Kasaharaら26に詳細に記載されているpAdlossを含むいくつかのシステムを用いて達成することができる。ウイルスに富む細胞培養培地を使用して尿路上皮を形質導入することは可能かもしれませんが、この方法は信頼性が低い場合があります。代わりに、大規模なウイルス増幅、CsClグラジエント精製、それに続くゲルろ過が、大量の高力価ウイルスを生成する最も信頼性の高い方法を提供します。-80°Cでのウイルスの相対的な安定性と比較的高い収量のウイルスは、多数の実験で使用できるウイルスの一貫したストックを持つための理想的な方法になります。

このプロトコルにおける追加の重要なステップには、形質導入プロトコルに関連するステップが含まれる。これらには、洗浄剤および希釈剤としてのPBS(二価カチオンなし)の使用、およびDDM洗剤の使用が含まれます。接合複合体は適切な機能のためにCa2+に依存しているため、PBSは接合関連障壁を破壊することによってウイルスの侵入を促進する可能性があります。DDMも重要です。Rameshらが報告したように、アデノウイルス形質導入の効率は、界面活性剤処理の非存在下では非常に低い18。しかしながら、洗剤の作用機序は明らかではない。DDMによる10分のインキュベーションが理想的ですが、これは5分に短縮できます。ただし、洗剤が下にある組織に予期しない損傷を引き起こす可能性があるため、インキュベーションを10分を超えて延長することはお勧めしません。使用されるウイルスの量は重要なパラメータであり、一般に濃度が高いほど導入遺伝子の発現量が多くなり、形質導入効率が高くなります。ただし、発現、効率、表現型の最適な組み合わせを提供する最適なウイルス濃度は、経験的に決定する必要があります。開始濃度として、動物あたり5.0 x 106〜2.0 x 107 IVPの範囲が推奨されます。.発現されるタンパク質に応じて、これは70%〜95%の範囲の効率をもたらす10,19,20,21,22;しかしながら、いくつかのドミナントネガティブGTPアーゼ構築物は効率が低く(30%〜50%)、単一細胞解析アプローチを必要とする4,20。これらの効率の違いは、導入遺伝子の代謝回転、その毒性、または形質導入に使用されるウイルスの純度と収量を反映している可能性があります。後者は、プラークアッセイを行うことによって除外することができる。超臨界ではありませんが、ウイルスが膀胱に留まる時間は、ウイルスがCXADR受容体に付着するのに十分な長さでなければなりません。30分未満の時間は形質導入の効率を低下させる可能性がありますが、インキュベーション期間を45分に延長すると効率を高めることができます。ただし、これは導入遺伝子に依存する可能性があります。このプロトコルの最後の重要なステップは、表現型が評価される前に動物が保持される時間を決定することです。導入遺伝子は1〜2日後に最も高い発現を示します19が、その後は発現が低下する可能性があります。siRNAの場合、それはタンパク質自体の代謝回転率に依存します。例えば、RabファミリーGTPaseであるRab11aの発現を標的とするsiRNAを発現する場合、効率的なダウンレギュレーションは形質導入後72時間でしか観察されない23。したがって、長寿命タンパク質(半減期が日数で測定される)は、このアプローチを使用した適切なターゲットではない可能性があります。

研究者は、このアプローチに関連する警告にも注意する必要があります。第一に、その有用性は、陰茎を通して雄のげっ歯類をカテーテル挿入することが困難であるため、雌のげっ歯類に限定される可能性があります。しかしながら、膀胱測定9を行うときに採用される調製物と同様に、膀胱のドームにカテーテルを導入することによって男性においてこのプロトコルを実行することは技術的に可能であり得る。これにより、洗剤やウイルスを導入し、必要に応じて洗浄を行うことができます。2番目の注意点は、タンパク質の過剰発現が細胞経路と資源を使い果たす可能性があり、タンパク質の凝集、細胞ストレス経路の活性化、死などのイベントにつながる可能性があることです27。したがって、細胞ストレスおよび細胞死のマーカーを用いて評価されるように、導入遺伝子発現を非毒性レベルに制限することが一般に賢明である(もちろんそれが導入遺伝子発現の意図でない限り)。3番目の注意点は、一部の設定では、長期的なアデノウイルス発現が免疫応答を引き起こす可能性があることです28。尿路上皮のアデノウイルス形質導入 自体が 免疫応答を刺激するという証拠はないが10、これは導入遺伝子依存性であり、上記のようにCLDN2の過剰発現は膀胱炎を引き起こす。

現在、研究者は、トランスジェニックまたは条件付き尿路上皮ノックアウトマウスの使用、トランスフェクション試薬の使用、またはアデノウイルス形質導入の使用など、尿路上皮における遺伝子およびタンパク質発現を調節するために使用できるさまざまな方法を持っています。このプロトコルの主題である後者の方法は、比較的簡単で、効率的で、再現性があります。ウイルスストックを生成するために必要な細胞培養試薬の初期費用以外に、非常に大量のウイルスが産生され(数百の形質導入を実行するのに十分)、動物あたりで比較的低コストになります。アデノウイルス形質導入は、尿路上皮生物学の研究に利用できます。例えば、アデノウイルス形質導入は、エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスにおけるRhoファミリーおよびRabファミリーGTPアーゼ、グアニンヌクレオチド交換因子、ミオシンモーターフラグメント、およびADAM17の重要性を定義するために使用され10、19、20、21、22、およびアデノウイルス形質導入は最近、尿路上皮メカノトランスダクションの研究に使用されました9。.同様に、アデノウイルス形質導入は、ヒトの疾患を探索および治療する際に関連し得る。例えば、Rameshらが最初に提案したアデノウイルス形質導入は、腫瘍細胞を標的とする有用な方法であり得る18。彼らの研究は原理実証のアプローチでしたが、癌細胞における毒素の発現または免疫系によって認識される可能性のあるエピトープの発現が有用な戦略であると想像することができます。アデノウイルス形質導入は、遺伝子産物の過剰発現または低発現が疾患につながる疾患を理解するのにも有用であり得る。一例として、間質性膀胱炎患者の膀胱からの生検は、CLDN2発現の90倍の増加を示す29。興味深いことに、アデノウイルス形質導入を用いたCLDN2の過剰発現は、ラット10においてこの疾患の症状の多くを再現する。したがって、CLDN2は、この障害を有する患者の治療における1つの標的となり得る。

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Disclosures

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgments

この作業は、P30DK079307(MGDへ)、NIH助成金R01DK119183(GAおよびMDCへ)、NIH助成金R01DK129473(GAへ)、米国泌尿器科学会キャリア開発賞、ウィンターズ財団助成金(NMへ)、ピッツバーグ腎臓研究センターの細胞生理学およびモデル生物腎臓イメージングコア(P30DK079307)によるパイロットプロジェクト賞によってサポートされました。 S10OD028596(G.A.へ)は、この原稿で提示された画像の一部をキャプチャするために使用される共焦点システムの購入に資金を提供しました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

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References

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生物学、第188号、
アデノウイルスを介した形質導入を用いた天然膀胱尿路上皮における導入遺伝子の発現
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Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, … More

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

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