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Biology

Expresión de transgenes en urotelio de vejiga nativa mediante transducción mediada por adenovirus

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Se describen métodos para la generación de grandes cantidades de adenovirus recombinantes, que luego se pueden utilizar para transducir el urotelio nativo de roedores permitiendo la expresión de transgenes o la regulación a la baja de productos génicos endógenos.

Abstract

Además de formar una barrera de alta resistencia, se plantea la hipótesis de que el urotelio que recubre la pelvis renal, los uréteres, la vejiga y la uretra proximal detecta y transmite información sobre su entorno a los tejidos subyacentes, promoviendo la función miccional y el comportamiento. La interrupción de la barrera urotelial, o su función sensorial/transductora, puede conducir a la enfermedad. El estudio de estos eventos complejos se ve obstaculizado por la falta de estrategias simples para alterar la expresión génica y proteica en el urotelio. Aquí se describen métodos que permiten a los investigadores generar grandes cantidades de adenovirus de alto título, que luego se pueden usar para transducir urotelio de roedores con alta eficiencia y de una manera relativamente sencilla. Tanto los ADNc como los ARN interferentes pequeños pueden expresarse mediante transducción adenoviral, y el impacto de la expresión transgénica en la función urotelial se puede evaluar de 12 h a varios días después. Estos métodos tienen una amplia aplicabilidad a estudios de biología urotelial normal y anormal utilizando modelos animales de ratón o rata.

Introduction

El urotelio es el epitelio especializado que recubre la pelvis renal, los uréteres, la vejiga y la uretra proximal1. Comprende tres estratos: una capa de células paraguas a menudo binucleadas altamente diferenciadas y polarizadas, cuyas superficies apicales están bañadas en orina; una capa celular intermedia con una población de células binucleadas amplificadoras del tránsito que pueden dar lugar a células paraguas superficiales en respuesta a su pérdida aguda; y una sola capa de células basales, un subconjunto de las cuales funcionan como células madre que pueden regenerar la totalidad del urotelio en respuesta a una lesión crónica. Las células paraguas son las principales responsables de formar la barrera urotelial de alta resistencia, cuyos componentes incluyen una membrana apical (rica en colesterol y cerebrósidos) con baja permeabilidad al agua y los solutos, y un complejo de unión apical de alta resistencia (compuesto por uniones estrechas, uniones adherentes, desmosomas y un anillo de actomiosina asociado)1 . Tanto la superficie apical de la célula paraguas como su anillo de unión se expanden durante el llenado de la vejiga y vuelven a su estado precargado rápidamente después de vaciar 1,2,3,4,5. Además de su papel en la función de barrera, también se presume que el urotelio tiene funciones sensoriales y transductoras que le permiten detectar cambios en el medio extracelular (por ejemplo, estiramiento) y transmitir esta información a través de la liberación de mediadores (incluyendo ATP, adenosina y acetilcolina) a los tejidos subyacentes, incluidos los procesos nerviosos aferentes suburoteliales 6,7,8 . La evidencia reciente de este papel se encuentra en ratones que carecen de expresión urotelial tanto de Piezo1 como de Piezo2, lo que resulta en una función miccional alterada9. Además, las ratas que sobreexpresan la proteína formadora de poros de unión estrecha CLDN2 en la capa de células paraguas desarrollan inflamación y dolor análogos a los observados en pacientes con cistitis intersticial10. Se plantea la hipótesis de que la interrupción de la función sensorial/transductor urotelial o de barrera puede contribuir a varios trastornos de la vejiga 6,11.

Una mejor comprensión de la biología del urotelio en estados normales y de enfermedad depende de la disponibilidad de herramientas que permitan a los investigadores regular fácilmente a la baja la expresión génica endógena o permitir la expresión de transgenes en el tejido nativo. Si bien un enfoque para regular a la baja la expresión génica es generar ratones knockout uroteliales condicionales, este enfoque depende de la disponibilidad de ratones con alelos floxados, requiere mucho trabajo y puede tardar meses o años en completar12. No es sorprendente entonces, que los investigadores hayan desarrollado técnicas para transfectar o transducir el urotelio, lo que puede conducir a resultados en una escala de tiempo más corta. Los métodos publicados para la transfección incluyen el uso de lípidos catiónicos13, oligodesoxinucleótidos fosforotioados antisentido 14 o ácidos nucleicos antisentido atados a la proteína TAT del VIH que penetra en el péptido 11-mer15. Sin embargo, el enfoque de este protocolo está en el uso de la transducción mediada por adenovirus, una metodología bien estudiada que es eficiente en la entrega de genes a una amplia gama de células, se ha probado en numerosos ensayos clínicos y, más recientemente, se utilizó para administrar el ADNc que codifica la proteína de la cápside COVID-19 a los receptores de una variante de la vacuna COVID-1916, 17. Para una descripción más completa del ciclo de vida de los adenovirus, los vectores adenovirales y las aplicaciones clínicas de los adenovirus, se dirige al lector a la referencia17.

Un hito importante en el uso de adenovirus para transducir el urotelio fue un informe de Ramesh et al. que mostró pretratamientos cortos con detergentes, incluyendo N-dodecil-β-D-maltósido (DDM) dramáticamente mejorado transducción del urotelio por un adenovirus que codifica β-galactosidasa18. Utilizando este estudio de prueba de principio como guía, la transducción mediada por adenovirus del urotelio ahora se ha utilizado para expresar una variedad de proteínas, incluidas las GTPasas de la familia Rab, los factores de intercambio guanina-nucleótido, los fragmentos motores de miosina, las claudinas asociadas a la unión estrecha formadoras de poros y ADAM17 10,19,20,21,22 . El mismo enfoque se adaptó para expresar pequeños ARN interferentes (ARNsi), cuyos efectos fueron rescatados mediante la coexpresión de variantes resistentes al ARNip del transgen22. El protocolo aquí descrito incluye métodos generales para generar grandes cantidades de adenovirus altamente concentrados, requisito para estas técnicas, así como adaptaciones de los métodos de Ramesh et al.18 para expresar transgenes en el urotelio con alta eficiencia.

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Protocol

Los experimentos que involucran la generación de adenovirus, que requiere certificación BSL2, se realizaron bajo la aprobación de las oficinas de Salud y Seguridad Ambiental de la Universidad de Pittsburgh y el Comité Institucional de Bioseguridad. Todos los experimentos con animales realizados, incluida la transducción adenoviral (que requiere la certificación ABSL2), se realizaron de acuerdo con las pautas / regulaciones relevantes de la Política del Servicio de Salud Pública sobre Cuidado Humanitario y Uso de Animales de Laboratorio y la Ley de Bienestar Animal, y bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh. Se usan guantes, protección para los ojos y ropa adecuada para todos los procedimientos que involucran virus recombinantes. Cualquier residuo líquido o sólido debe eliminarse como se describe a continuación. La cama de los animales después de la transducción, y cualquier cadáver de animal resultante, deben tratarse como materiales biopeligrosos y eliminarse de acuerdo con las políticas institucionales.

1. Preparación de las existencias de adenovirus de alto título

NOTA: La transducción efectiva de vejigas de roedores depende del uso de cepas virales purificadas y concentradas, típicamente 1 x 107 a 1 x 108 partículas virales infecciosas (PIV) por μL. Esta parte del protocolo se centra en generar existencias de adenovirus de alto título a partir de preparaciones de virus existentes. Todos los pasos deben realizarse en una campana de cultivo celular utilizando reactivos y herramientas estériles. Si bien las cepas disponibles de adenovirus utilizadas hoy en día son defectuosas de replicación, la mayoría de las instituciones requieren aprobación para usar adenovirus y ADN recombinante. Esto a menudo incluye la designación de una sala de cultivo celular como una instalación aprobada por BSL2 para producir y amplificar adenovirus. Algunas consideraciones generales incluyen el uso de máscaras, protección para los ojos, guantes y vestimenta adecuada en todas las etapas de la producción y purificación del virus. Al realizar la centrifugación, se recomiendan tapas de seguridad si los tubos de centrífuga carecen de tapas ajustadas. Todos los materiales no desechables, incluidas las tapas de seguridad de centrífugas potencialmente contaminadas, las botellas y los rotores, se tratan con una solución antiviral (consulte la Tabla de materiales) y luego se enjuagan con agua o etanol al 70%. Los desechos líquidos se tratan agregando lejía a una concentración final del 10% (v / v). La eliminación de estos desechos líquidos dependerá de las políticas institucionales. Los desechos sólidos generalmente se eliminan en desechos biopeligrosos.

  1. Cultivo de células HEK293T
    1. Descongele un vial congelado de células HEK293T en un baño maría a 37 °C y utilice una pipeta de 5 ml para transferir las células a una placa de cultivo celular de 15 cm de diámetro. Con una pipeta de 25 ml, agregue lentamente 20 ml de medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco que contenga suero fetal bovino al 10% (v / v) y antibiótico de penicilina/estreptomicina (DMEM-FBS-PS) al plato. Incubar las células en una incubadora de cultivo celular a 37 °C gaseada con 5% (v/v) de CO2 hasta que alcancen una confluencia del 80%-90% (~2 x 107 células).
    2. Usando una pipeta de vidrio conectada a una fuente de vacío, aspire el medio y luego enjuague las células transfiriendo 20 ml de PBS estéril (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4, 136.9 mM NaCl y 8.9 mM Na2HPO4) al plato usando una pipeta de 25 ml. Aspirar el PBS gastado y luego usar una pipeta de 5 ml para transferir 3 ml de solución de proteinasa tibia (37 °C) (ver Tabla de materiales) al plato, incubando el plato en la incubadora de cultivo celular hasta que las células se desprendan (~ 3-4 min).
      NOTA: La proteólisis efectiva se puede evaluar mejor inclinando lentamente el plato hacia adelante y hacia atrás buscando la liberación de células de todas las porciones del plato en el líquido en movimiento. Las células HEK293T son sensibles al tratamiento prolongado con proteinasa y morirán si se dejan más de unos pocos minutos en solución de proteinasa.
    3. Use una pipeta de 10 ml para transferir 7 ml de DMEM-FBS-PS a la placa de células desprendidas, y luego use la misma pipeta para aspirar las células y el medio. Transfiera las células suspendidas a un tubo cónico de 50 ml y luego granule las células centrifugando la suspensión en una centrífuga clínica de baja velocidad a 200 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con una pipeta de vidrio conectada a una fuente de vacío. Utilice una pipeta de 25 ml para resuspender el pellet celular en 15 ml de DMEM-FBS-PS.
    4. Añadir 1 ml de la suspensión celular a cada uno de los quince platos de 15 cm que contienen 19 ml de DMEM-FBS-PS.
    5. Cultivar las células en una incubadora de cultivo de tejidos hasta que alcancen el 85%-90% de confluencia (~3-4 días).
  2. Preparar una solución de virus diluida
    1. Agregue ~ 1.5 x 109 a 3 x 109 IVP de un stock de virus existente (5-10 IVP / célula) a un tubo cónico de 50 ml lleno de 45 ml de DMEM que carece de FBS o antibióticos.
      NOTA: Es posible utilizar una concentración más baja del virus (1-5 PIV/célula); Sin embargo, tomará más tiempo para que la producción del virus se produzca.
  3. Infectar las células cultivadas con el virus.
    1. Utilizando una pipeta de vidrio conectada a una fuente de vacío, aspirar el medio a partir de las células casi confluentes en el paso 1.1.5.
    2. Utilice una pipeta de 25 ml para transferir 3,0 ml de solución de virus diluida (preparada en el paso 1.2.1) a cada placa de cultivo celular. Luego, use una pipeta de 10 ml para agregar 7.0 ml de medio DMEM (que carece de FBS o antibióticos) a cada plato. Incubar durante 60 minutos en una incubadora de cultivo celular, y luego añadir 10 ml de DMEM que contiene 20% (v/v) FBS y 2x PS a cada plato.
      NOTA: El uso de uno de los 15 platos como placa de control (en el que no se agrega el virus) facilita la identificación del redondeo celular inducido por el virus y la muerte en las células infectadas en el siguiente paso.
    3. Incubar las células en la incubadora de cultivo celular durante 2-4 días hasta que la mayoría de ellas comiencen a redondearse y el >60% de las células se hayan desprendido.
      NOTA: Si se usa un título más bajo del virus, puede tomar hasta una semana para que ocurra la muerte celular. Si la muerte celular no ocurre dentro de una semana, es probable que el proceso deba repetirse usando un título más alto del virus.
  4. Recuperar virus de lisados celulares
    1. Use un raspador de células para raspar el fondo de cada plato, liberando células adheridas en el medio.
    2. Usando una pipeta de 25 ml, recolecte y agrupe el medio, las células y los restos celulares de cada placa de cultivo celular en un tubo de cultivo celular cónico de 50 ml.
      NOTA: Para ahorrar recursos, el medio de dos platos se puede combinar en un tubo de 50 ml.
    3. Granular el material celular por centrifugación utilizando una centrífuga de mesa de baja velocidad: 5 min a temperatura ambiente a 3.000 x g. Utilice una pipeta de vidrio conectada a un dispositivo de vacío para aspirar el sobrenadante.
    4. Utilice una pipeta de 10 ml, combinada con trituración, para consolidar todo el material granulado resultante en un total de 7 ml de Tris-HCl de 100 mM de pH 7,4 de 100 mM filtrado estéril que contiene 10 mM de EDTA (solución de Tris-EDTA). Transfiera el material agrupado a un tubo cónico estéril de cultivo celular de 15 ml y colóquelo en hielo.
      NOTA: En este punto, la preparación del virus se puede congelar a -80 °C indefinidamente.
  5. Preparar lisados celulares
    1. Realice tres ciclos de congelación-descongelación para interrumpir las células restantes y, por lo tanto, liberar aún más las partículas de virus formadas. Congelar el material agrupado en el paso 1.4.4 sumergiendo el tubo en nitrógeno líquido (~30-60 s). Descongelar rápidamente la muestra colocando el tubo en una incubadora a 37 °C. Vortex la muestra durante 15 s, y luego repita el procedimiento de congelación y descongelación rápida 2 veces más.
      NOTA: La solución de virus se puede descongelar rápidamente en un baño de agua a 37 ° C, pero se debe tener precaución ya que los cambios de temperatura pueden hacer que el tubo se agriete, liberando la solución de virus en el baño de agua. Para evitar que esto ocurra, coloque el tubo que contiene el sobrenadante viral en un tubo más grande, que luego se coloca en el baño de agua.
    2. Use una pipeta de 10 ml para transferir el material celular tres veces congelado y descongelado a un tubo centrífugo de supervelocidad. Centrifugar el material en el tubo durante 30 min a 4 °C centrífuga de súper velocidad a ~18,500 x g.
    3. Recuperar los ~7 ml de sobrenadante rico en virus con una pipeta de 10 ml y transferirlo a un tubo cónico de 15 ml. Retenga la muestra en hielo hasta el siguiente paso.
      NOTA: En este punto, considere mantener una alícuota del sobrenadante viral no purificado como preámbulo para comenzar una nueva preparación de virus (o como respaldo). Conservar esta alícuota a -80 °C.
  6. Aislar y purificar el virus mediante centrifugación por gradiente de densidad.
    1. Prepare un gradiente discontinuo de CsCl en un tubo de ultracentrífuga transparente de pared delgada de PET de 12 ml (consulte la Tabla de materiales) o equivalente. Use una jeringa de 3 ml equipada con una aguja de 18 g para introducir cuidadosamente 2,5 ml de solución de CsCl de 1,4 g/ml en el fondo del tubo, y luego use una jeringa/aguja nueva para colocarla en capas con 2,5 ml de solución de CsCl de 1,25 g/ml.
      NOTA: Dejar caer soluciones directamente sobre una capa preexistente causará una mezcla significativa y no deseada. En su lugar, coloque la porción biselada de la aguja contra el borde del tubo, y luego presione muy lentamente el émbolo de la jeringa, elevando la posición de la aguja a medida que la solución llena el tubo.
    2. Cargue los ~7 ml de sobrenadante viral en la parte superior del gradiente de manera similar usando una jeringa de 10 ml. Si hay más de 2-3 mm de espacio entre el sobrenadante viral y la parte superior del tubo, agregue una solución adicional de Tris-EDTA para llenar el tubo hasta que solo queden 2-3 mm de espacio.
    3. Haga un tubo de equilibrio preparado de manera similar, que contenga capas de CsCl, pero sustituya la solución de Tris-EDTA por el sobrenadante viral.
      NOTA: Los dos tubos deben tener pesos idénticos (y densidades similares) para evitar una situación de carga desequilibrada potencialmente peligrosa en la ultracentrífuga.
  7. Aislar el virus mediante ultracentrifugación zonal de velocidad.
    1. Cargue los gradientes formados en los pasos 1.6.2-1.6.3 en los cucharones de un rotor SW41 o equivalente. Atornille las tapas del cucharón, coloque el rotor en una ultracentrífuga (preenfriada a 4 °C) y centrifugar durante 1 h a ~150,000 x g.
    2. Durante la centrifugación, equilibrar la columna descrita en el paso 1.9.1.
  8. Recuperar partículas de virus aisladas
    1. Al final de la etapa de centrifugación, separe cuidadosamente los cucharones del rotor y, en una campana de cultivo celular, retire las tapas del cucharón y luego retire los tubos y colóquelos en una rejilla.
    2. Recoja el material con bandas, rico en partículas de virus, que flota en la interfaz entre la solución de CsCl de 1,25 g/ml y 1,4 g/ml. Sosteniendo el tubo que contiene el gradiente sobre la mitad inferior de una placa de cultivo celular (que atrapará cualquier material derramado), use una aguja de 1 pulgada y 18 G conectada a una jeringa de 3 ml para perforar cuidadosamente el tubo, justo debajo del virus con bandas. Aspire lentamente el virus, que generalmente se recupera en ~ 1 ml.
    3. Retire la aguja del tubo, lo que hará que el material restante en el gradiente fluya fuera del tubo hacia la mitad inferior de la placa de cultivo celular (cualquier líquido debe tratarse como residuo peligroso).
    4. Transfiera la solución de virus en la jeringa a un tubo de microcentrífuga estéril sobre hielo.
      NOTA: Cuando recupere el virus en este paso, coloque la aguja de modo que la luz de la aguja quede hacia arriba con la abertura de la aguja unos pocos mm por debajo de la banda rica en virus. Evite la contaminación por la banda delgada de virus ensamblado incorrectamente que a veces se observa 2-3 mm por encima del virus con bandas (ver flecha negra delgada en la Figura 1A).
  9. Eliminar el CsCl de la muestra mediante filtración en gel.
    1. Equilibre una columna PD-10 (preempaquetada con Sephadex G-25M), sujeta a un soporte de soporte, con 50 ml de PBS filtrado estéril de 0,2 μm que contiene 10% (v/v) de glicerol.
      NOTA: El paso de equilibrio inicial tarda 2-3 h en completarse y es necesario para garantizar el lavado completo de los conservantes que utiliza el fabricante para estabilizar la columna.
    2. Deje que la solución de lavado retroceda por debajo de la frita (un disco protector de material blanco en la parte superior del medio de la columna) y, a continuación, transfiera con cuidado la solución de virus purificada recogida en el paso 1.8 a la parte superior de la columna. Permita que la solución rica en virus retroceda por debajo de la frita y luego comience a llenar la columna con PBS-glicerol.
      NOTA: Una función de la frita es evitar que la columna se seque. Como resultado, se toleran retrasos cortos antes de que se agregue más eluyente a la columna.
    3. Recoger el eluido en 12 tubos de microcentrífuga estériles, 0,5 mL por fracción.
  10. Determinar el rendimiento viral.
    1. Determinar las fracciones máximas del virus mediante espectrofotometría. Prepare una dilución 1:100 de cada fracción en PBS y mida el OD260 en un espectrofotómetro, utilizando una dilución 1:100 del tampón solo como espacio en blanco. Las partículas de virus deben eluir en el volumen vacío, comenzando alrededor de la fracción 6. Agrupe las fracciones que contienen las lecturas más altas de OD260 .
    2. Haga una dilución 1:100 de las fracciones virales agrupadas y vuelva a medir el OD260. Calcule la concentración final de partículas de virus y el número de PIV en las fracciones agrupadas utilizando la siguiente fórmula: Partículas de virus por ml = OD260 × 100 (esto corrige el factor de dilución) × 1012. Una estimación general es que el 1% de las partículas del virus son PIV, como tal: PIV/ml = OD 260 × 100 × 10 10 o PIV/μL = OD260 × 100 ×10 7.
  11. Alícuota las fracciones de virus agrupadas (que contienen 5 x 107 a 1 x 108 PIV) en tubos de microcentrífuga estériles o crioviales. Conservar las muestras a -80 °C.

2. Transducción de vejiga de roedor

NOTA: Si es nuevo en esta técnica, se recomienda que el número de animales transducidos a la vez se limite a 2-4. Esto se puede lograr escalonando los tiempos de inicio de cada animal, especialmente durante el tratamiento con detergente en el paso 2.2, y luego la incubación del virus en el paso 2.3. Los investigadores experimentados pueden transducir hasta seis animales a la vez.

  1. Cateterizar la vejiga
    1. Anestesiar ratones hembra C57Bl/6J (típicamente 8-10 semanas de edad, ~20-25 g) o ratas hembras Sprague Dawley (típicamente 2-3 meses de edad, ~250 g) usando un vaporizador con un cono nasal adjunto. Calibre el vaporizador para producir 3.0% (v/v) de isoflurano, 97% (v/v) O2 para ratones o 4.0% (v/v) isoflurano, 96% (v/v)O2 para ratas. Confirme que los animales están anestesiados asegurándose de que no respondan al pellizco del dedo del pie (generalmente después de 1-2 minutos).
    2. Mantenga la temperatura corporal del animal colocando a los animales en una almohadilla térmica. Controle al animal durante todo el protocolo de transducción para asegurarse de que los animales estén anestesiados y no experimenten ningún dolor durante este procedimiento.
    3. Reducir el isoflurano al 1,5% (v/v) para ratones o al 2,0% (v/v) para ratas y mantener a los animales bajo anestesia durante la duración del protocolo.
    4. Para evitar la introducción de aire en la vejiga, llene la porción plástica del catéter de un catéter intravenoso (consulte la Tabla de materiales) y el cubo asociado con PBS estéril usando una pipeta de transferencia.
    5. Con el animal en posición supina, frote el meato externo con alcohol al 70% e inserte el catéter estéril en el meato externo, luego en la uretra y luego en la vejiga.
      1. Para realizar esta tarea, use pinzas finas para agarrar suavemente el tejido que forma el meato externo y extenderlo verticalmente, lejos del animal. Con la otra mano, inserte cuidadosamente el catéter verticalmente unos 3-4 mm en el meato uretral (un montículo de carne justo encima de la abertura de la vagina). Luego, debido a una curva en la uretra, baje el catéter, insertado en el meato externo, hacia la cola del animal, lo que facilita su entrada en la porción de la uretra que pasa por debajo del hueso púbico y, finalmente, en la vejiga.
        . NOTA: Especialmente en el caso del ratón, el catéter puede ser demasiado largo y no se deben insertar más de 1.0-1.1 cm en el animal. De lo contrario, se producirá daño a la mucosa de la vejiga. Para evitar esto, marque el catéter ~1 cm por debajo de su punta y luego no inserte el catéter más allá de esta marca.
    6. Permita que la orina en la vejiga se escape. Elimine cualquier orina residual realizando la maniobra de Credé: masajee y presione suavemente hacia abajo la protuberancia de la vejiga en el área abdominal inferior.
  2. Haga que el urotelio sea receptivo a la transducción tratándolo con una solución detergente.
    1. Lave la vejiga del ratón o rata conectando una jeringa estéril de 1 ml llena de PBS al cubo del catéter. Inyecte 100 μL de PBS estéril en la vejiga del ratón (o 450 μL en el caso de la vejiga de rata). Separe la jeringa del accesorio del catéter y permita que el PBS drene. Si es necesario, realice la maniobra de Crede para eliminar el exceso de líquido de la vejiga.
    2. Instilar 100 μL de N-dodecil-β-D-maltósido (DDM) al 0,1% (p/v) (disuelto en PBS y 0,2 μm esterilizado por filtro) en la vejiga del ratón utilizando una jeringa estéril de 1 ml. Retenga la DDM en la vejiga durante 10 minutos dejando la jeringa en su lugar. En ratas, el volumen de DDM aumenta a 450 μL.
    3. Retire el DDM de la vejiga desprendiendo la jeringa y dejando que drene. Realice la maniobra de Crede si es necesario.
  3. Introducir el virus en la vejiga.
    1. Conecte una jeringa estéril de 1 ml al cubo del catéter e instilar 0,5 x 107 a 1 x 108 PIV de adenovirus (preparado en el paso 1), diluido en 100 μL de PBS estéril para ratones o 450 μL para ratas, en la vejiga. Deje la jeringa conectada al catéter para evitar que la solución del virus se escape.
    2. Después de 30 minutos, separe la jeringa y permita que la solución del virus evacue la vejiga a una almohadilla desechable. Seque cualquier solución de virus residual con una toallita absorbente y deseche la almohadilla y limpie los desechos biopeligrosos.
      NOTA: El glicerol es citotóxico. Como tal, el volumen máximo de solución de virus instilada en ratones se limita a 5 μL (que cuando se diluye en 100 μL de PBS daría como resultado una concentración final de glicerol de ~ 0.5% [v / v]). Además, es posible mejorar la eficiencia de la transducción aumentando el número de PIV instiladas y extendiendo la incubación del virus a 45 min.
    3. Paso opcional: La vejiga se puede enjuagar con PBS como se describe en el paso 2.2.1 anterior; sin embargo, esto no es necesario.
  4. Permita que el animal se recupere.
    1. Detener el flujo de isoflurano y permitir que el animal se recupere y esté completamente móvil antes de devolverlo a su jaula, especialmente si los animales están alojados en grupo.
      NOTA: Como la transducción del virus per se no causa síntomas observables del tracto urinario inferior o dolor, generalmente no hay necesidad de tratamiento postquirúrgico. Sin embargo, si el transgén codificado es tóxico, puede ser necesaria la analgesia posterior al procedimiento o los antibióticos, según lo requiera la institución.
  5. Analizar los efectos de la expresión transgénica 12-72 h después del tratamiento utilizando métodos como la hibridación in situ de ARNm, western blot o inmunofluorescencia 9,10,23 (ver los resultados representativos).

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Representative Results

Preparación del virus
Un ejemplo de purificación de virus por centrifugación por gradiente de densidad se muestra en la Figura 1A. La banda de color rosa claro, que se encuentra en la interfaz del material celular cargado y la capa de CsCl de 1,25 g/ml, está compuesta principalmente de células interrumpidas y sus restos (ver flecha magenta en la Figura 1A). Deriva su color rosado de la pequeña cantidad de medio de cultivo que se transfiere del paso 1.5 del protocolo. Las partículas de virus de interés, que aparecen como una banda blanca lechosa, se encuentran en la interfaz de las soluciones de CsCl de 1,25 g/ml y CsCl de 1,40 g/ml (véase la flecha amarilla de la figura 1A). También se puede observar una banda de material que flota 2-3 mm por encima de las partículas de virus enriquecidas (ver flecha negra delgada en la Figura 1A). Comprende virus y desechos desensamblados, contiene pocos IVP y debe evitarse al recolectar la muestra de virus.

La purificación adicional del virus y el intercambio de tampón utilizando una columna PD10 se representan en la Figura 1B, y las lecturas de OD260 de las fracciones resultantes después de la elución se muestran en la Figura 1C. El volumen vacío de estas columnas es de aproximadamente 3 mL, y así el virus comienza a aparecer en la fracción 6 y alcanza su punto máximo en la fracción 9. En este experimento, se agruparon las fracciones 6-9. Si bien las fracciones 6 y 7 son relativamente bajas en partículas de virus, contienen suficiente virus para merecer la recuperación, y sirven para diluir las fracciones de títulos muy altos a una concentración más razonable. Las fracciones 10-12 no se incluyeron ya que el aumento de OD260 en la fracción 11 indica la posible presencia de un segundo pico contaminante, que se observa de manera variable en estas preparaciones. La fracción agrupada normalmente tendrá 1 x 107 a 1 x 108 IVP/μL, y el rendimiento esperado sería del orden de 1 x 10 10 a 2 x10 11 IVP total. Esta es una cantidad suficiente de virus para realizar cientos de transducciones. Si bien es posible valorar el virus mediante ensayos de placa o contando colonias de células que expresan proteínas fluorescentes22, la regla del 1% es suficiente en la mayoría de los casos. Esta regla establece que el 1% de las partículas de virus purificadas, estimadas midiendo el OD260 de la muestra, son IVP. Las alícuotas de virus almacenadas a -80 °C tienen una vida útil de 2-5 años, aunque la infectividad disminuye a largo plazo. Las alícuotas descongeladas del virus pueden volver a congelarse a -80 °C una vez sin pérdida significativa de infectividad. Sin embargo, la descongelación y congelación repetidas afectan negativamente la infectividad viral.

Transducción vesical
Un primer paso importante al evaluar el impacto de la transducción es confirmar la expresión transgénica. Esto se puede evaluar utilizando varias técnicas, incluidas herramientas que detectan ARNm (por ejemplo, RNAScope), análisis de Western blot o uso de inmunofluorescencia 9,10,23. La figura 2 es un ejemplo de urotelio de ratón que fue transducido con un adenovirus que codifica la hormona de crecimiento humano marcada con Epítopo V5 (V5-hGH)23. Esta proteína se empaqueta en vesículas discoidales/fusiformes y puede ser exocitosada durante el llenado de la vejiga19,23. El análisis Western blot de lisados uroteliales reveló expresión de V5-hGH en el urotelio de vejigas transducidas, pero no en las no transducidas (Figura 2A). La expresión también se confirmó por inmunofluorescencia, en este caso utilizando anticuerpos que reconocieron hGH o la etiqueta de epítopo V5 (vejigas no transducidas carecían de señal, no se muestra) (Figura 2B).

Un ejemplo adicional es la transducción de la vejiga de rata con un virus que codifica CLDN2, una proteína asociada a la unión estrechaformadora de poros 24,25. CLDN2 aumenta el flujo paracelular de cationes (incluyendo K+) y su sobreexpresión resulta en inflamación y desarrollo de dolor visceral10. El análisis de Western blot confirmó la expresión de CLND2 en vejigas de rata transducidas con adenovirus que codifica Cldn2, pero no en aquellas transducidas con un virus control codificante de GFP (Figura 2C). En general, la GFP no se considera tóxica cuando se expresa en las células y, por lo tanto, sirve como un control útil. El uso de GFP también permite al investigador confirmar que la transducción está funcionando. El análisis de inmunofluorescencia confirmó además la expresión exógena de CLDN2 en células paraguas uroteliales transducidas con el virus que codifica el ADNc de Cldn2 (señal roja en la Figura 2D). Además, de manera similar a la CLDN2 endógena (no se muestra), la CLDN2 expresada se localiza en uniones estrechas marcadas con TJP1, así como en las superficies basolaterales de las células paraguas (CLDN2 está marcada en verde en la Figura 2E)10. En el caso de la expresión de CLDN2, fue más alta un día después de la transducción, pero luego se alejó, y apenas fue detectable después de 15 días.

Una segunda consideración es, qué tipos de células serán el objetivo de la transducción adenoviral. Mientras que en ratas es posible transducir principalmente la capa de células paraguas19, en ratón se pueden transducir todas las capas del urotelio, aunque la transducción de las capas de células intermedias y basales puede ser variable. Es importante destacar que, en la totalidad de la pared de la vejiga, solo se transduce el urotelio y ningún otro tejido es atacado por el adenovirus instilado (Figura 3).

Si bien los análisis de las células transducidas se pueden realizar a nivel de una sola célula, cuando se explora un fenotipo general de la vejiga, se debe transducir la mayoría de las células uroteliales. Por lo tanto, es importante definir la eficiencia de la transducción (es decir, qué fracción de células uroteliales se transducen). Por ejemplo, en el caso del adenovirus que expresa Cldn2, se transdujeron >95% de las células paraguas (ver Figura 2D). Un ejemplo adicional es el campo de imagen que se muestra en la Figura 3, donde contando el número de celdas paraguas transducidas (en este caso, expresando el sensor de Ca2+ GCAMP5G), revela una eficiencia que se acerca al 95%. Sin embargo, uno debe examinar las células en campos aleatorios tomados a través de la pared de la vejiga para lograr una estimación precisa e imparcial de la eficiencia de la transducción.

Figure 1
Figura 1: Purificación del adenovirus. (A) Las partículas de adenovirus producidas por células HEK293T infectadas se purificaron por centrifugación en un gradiente discontinuo de CsCl compuesto por una capa de 1,4 g/ml de CsCl, una capa de 1,25 g/ml de CsCl y una capa de muestra (S) diluida en solución de Tris-EDTA. El material celular (flecha rosa) se acumula en la interfaz S/1.25, mientras que el adenovirus purificado flota en la interfaz 1.25/1.4 (flecha amarilla). Una pequeña banda de virus mal ensamblados flota sobre este último (flecha negra delgada). (B) La banda rica en adenovirus en el gradiente se recupera con una aguja, y el CsCl se elimina del adenovirus mediante filtración en gel utilizando una columna PD10 llena de Sephadex G25 equilibrada con PBS que contiene 10.0% (v / v) de glicerol. La superficie del Sephadex está protegida por una frita plástica porosa. (C) Las fracciones, 0,5 mL, fueron recolectadas de la columna PD10. El OD260 de las fracciones se midió en un espectrofotómetro y se graficaron los valores. Las fracciones ricas en virus eluyen en el volumen vacío, que comienza en la fracción 6 y se extiende hasta la fracción 9. Las fracciones agrupadas para este experimento representativo están sombreadas en azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Transducción de urotelio vesical de roedores con adenovirus que codifican V5-hGH o CLDN2. (A) El urotelio de ratón se dejó sin transducir (UT) o se transdució con adenovirus que codifican la hormona de crecimiento humano marcada con el epítopo V5 (hGH). Después de 24 h, se recuperaron las vejigas, se prepararon lisados uroteliales y se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio, y se confirmó la expresión de V5-hGH mediante Western blots probados con un anticuerpo contra hGH. (B) Detección de V5-hGH en urotelio de ratón seccionado y teñido usando anticuerpos contra hGH (verde) o el epítopo V5 (rojo) y anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos. La inmunofluorescencia se capturó mediante microscopía confocal. Las muestras se contrastaron con TO-PRO3 para etiquetar los núcleos. (C-F) El urotelio de rata se transdució con un virus que codifica para rata CLDN2 (nombre común claudina-2) o GFP (proteína fluorescente verde de nombre común) como control. (C) Detección de CLDN2 exógena mediante western blot utilizando un anticuerpo de nuevo CLDN2. Tenga en cuenta que la CLDN2 endógena se expresa en niveles bajos y no se detecta en este experimento. (D) La transducción de la capa de células paraguas se revela mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal. Los bordes de la célula se revelan al teñir conjuntamente el tejido con FITC-faloidina, que marca el citoesqueleto de actina cortical. (E) Detección de CLDN2 y TJP1 exógenas (nombre común ZO1) por inmunofluorescencia y microscopía confocal de urotelio montado entero o seccionado transversalmente. Pequeñas flechas blancas indican la ubicación de la unión estrecha y pequeñas puntas de flecha magenta marcan la ubicación de las acumulaciones intracelulares de CLDN2 en el citoplasma celular. Anteriormente se reveló que estos eran CLDN210 asociados a Golgi. (F) Después de la transducción, los animales fueron sacrificados en los días indicados después de la infección. La expresión exógena de CLDN2 se detectó mediante western blotting. Los animales que expresaban GFP fueron sacrificados después del día 1. Los datos de la Figura 2C-E han sido modificados de Montalbetti et al.10, y se reproducen con permiso de la American Physiological Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Eficiencia de la transducción adenoviral. El urotelio vesical de ratón se transdució con un adenovirus que codifica el sensor de calcio GCaMP5G. Los paneles superiores muestran tinción para GCaMP5G (detectado usando un anticuerpo contra la proteína fluorescente verde; GFP, verde), los paneles centrales muestran la distribución de los núcleos teñidos con DAPI (azul) y la actina marcada con rodamina-faloidina (rojo), y los paneles inferiores son una fusión de las tres señales. Las puntas de flecha blancas en el panel inferior son las raras células paraguas que no se transducen. La eficiencia general de la transducción de células paraguas en esta imagen es ~ 95%. Tenga en cuenta que sólo se transduce el urotelio. Las regiones en caja se magnifican en los paneles de la derecha. La región del recuadro 1 comprende principalmente células paraguas transducidas. La región en el cuadro 2 es urotelio que muestra una transducción eficiente de las células paraguas, pero una transducción menos eficiente de las capas celulares subyacentes. LP = lámina propia; EM = muscularis externa; Se = serosa; Ut = urotelio. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal (ver Tabla de materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Mientras que Ramesh et al. se centraron en desarrollar estrategias para utilizar la transducción adenoviral en el tratamiento del cáncer de vejiga 18, informes más recientes han demostrado la utilidad de estas técnicas en el estudio de la biología/fisiología urotelial normal y la fisiopatología 10,18,19,20,21 . Las características importantes de este enfoque incluyen las siguientes: (i) En la totalidad de la pared de la vejiga del roedor, solo se transduce el urotelio 10,19,20,21,22. En el caso de las ratas, la transducción se limita principalmente a la capa de células paraguas, mientras que en ratones, la totalidad del urotelio puede ser dirigida; (ii) Este enfoque puede utilizarse para expresar proteínas o siRNAs 10,19,20,21,22; (iii) La eficiencia de la transducción puede acercarse al 70%-95% (por ejemplo, ver Figura 3)18,20; (iv) Un día después de la transducción, la ultraestructura del urotelio, la integridad del tejido, la presencia de una barrera de alta resistencia (evaluada midiendo la resistencia transepitelial) y la expresión de marcadores de diferenciación urotelial es "normal"10,19. El único efecto morfológico observado hasta ahora es una disminución en el diámetro de las células paraguas (cuando se ve desde arriba); sin embargo, vuelven a su tamaño normal después de 3-4 días10,19; v) El urotelio puede ser transducido con hasta tres adenovirus diferentes simultáneamente18; (vi) La expresión transgénica puede ser alterada por la titulación del número de PIV, lo que afecta la cantidad de expresión proteica, alargando o acortando el tiempo de incubación antes de sacrificar al animal, o utilizando diferentes promotores como un sistema regulado por tet (tet-off)19. En este último caso, se puede co-expresar un virus que codifica el transactivador/tet-represor, y luego modular la expresión del transgén alterando la concentración de doxiciclina en la dieta del animal.

Si bien el protocolo general es relativamente simple, hay algunos pasos críticos que deben considerarse al realizar estos experimentos. Uno de ellos es la disponibilidad de existencias de virus de alto título que son de pureza razonable. Los adenovirus se pueden obtener de proveedores comerciales, de núcleos de producción de virus institucionales, de otros investigadores, o se pueden producir internamente. En el caso de este último, se recomienda el sistema AdEasy del laboratorio Bert Vogelstein porque sus componentes se pueden comprar en Addgene, y los adenovirus generados utilizando este enfoque funcionan bien en la transducción urotelial4. Esta técnica permite generar adenovirus que codifican ADNc de hasta 8 Kb utilizando el plásmido de empaquetamiento pAdEasy-1 (el inserto reemplaza los genes virales E1 y E3), las células bacterianas pAdEasier-1 (que codifican los genes adenovirales necesarios para producir virus) y la producción de adenovirus defectuosos de replicación en células HEK293T (que expresan la proteína E1 viral requerida). Sin embargo, la sustitución del plásmido de empaquetamiento pAdEasy-1 con el plásmido de empaquetado pAdEasy-2 aumenta el tamaño del empaquetamiento en 2.7 kB adicionales, pero requiere usar una línea celular diferente (células 911 retinianas embrionarias humanas transformadas en E1) ya que los virus carecen del gen E4 temprano además de E1 y E34. La expresión de siRNAs puede lograrse utilizando varios sistemas, incluyendo pAdloss, que se describe en detalle en Kasahara et al.26. Si bien puede ser posible utilizar un medio de cultivo celular rico en virus para transducir el urotelio, este método puede ser poco confiable. En cambio, la amplificación de virus a gran escala, la purificación del gradiente de CsCl, seguida de la filtración en gel, proporciona la forma más confiable de generar grandes cantidades de virus de alto título. La relativa estabilidad del virus a -80 °C, junto con rendimientos relativamente grandes de virus, hace que esta sea una forma ideal de tener un stock constante de virus que se puede utilizar en un gran número de experimentos.

Los pasos críticos adicionales en este protocolo incluyen los asociados con el protocolo de transducción. Estos incluyen el uso de PBS (sin cationes divalentes) como agente de lavado y diluyente, y el uso de detergente DDM. Como el complejo de unión depende de Ca2+ para su correcto funcionamiento, PBS probablemente promueve la entrada viral al interrumpir la barrera asociada a la unión. DDM también es crítico; como relataron Ramesh et al., la eficiencia de la transducción de adenovirus es extremadamente baja en ausencia de tratamiento detergente18. Sin embargo, el modo de acción del detergente no está claro. Una incubación de 10 minutos con DDM es ideal, pero esto se puede acortar a 5 minutos; Sin embargo, no se recomienda que la incubación se extienda más allá de 10 minutos, ya que el detergente puede causar daños inesperados a los tejidos subyacentes. La cantidad de virus utilizada es un parámetro crítico, con concentraciones más altas que generalmente conducen a mayores cantidades de expresión transgénica y mayores eficiencias de transducción. Sin embargo, la concentración óptima del virus que proporciona la mejor combinación de expresión, eficiencia y fenotipo debe determinarse empíricamente. Como concentración inicial, se recomienda un rango de 5,0 x 106 a 2,0 x 107 PIV por animal. Dependiendo de la proteína que se expresa, esto resulta en eficiencias en el rango de 70%-95% 10,19,20,21,22; sin embargo, algunas construcciones GTPasa dominantes-negativas son menos eficientes (30%-50%) y requieren un enfoque de análisis unicelular 4,20. Estas diferencias en la eficiencia pueden reflejar el recambio del transgén, su toxicidad o la pureza y el rendimiento del virus utilizado para la transducción. Esto último se puede descartar mediante la realización de ensayos de placa. Aunque no es hipercrítico, el tiempo que el virus permanece en la vejiga debe ser lo suficientemente largo para que el virus se adhiera a su receptor CXADR. Veces menos de 30 min puede disminuir la eficiencia de la transducción, mientras que extender el período de incubación a 45 min puede aumentar la eficiencia; sin embargo, esto puede ser transgénico-dependiente. El último paso crítico en este protocolo es determinar cuánto tiempo se mantendrá el animal antes de que se evalúe un fenotipo. Los transgenes exhiben la expresión más alta después de 1-2 días19, pero la expresión puede disminuir después de eso. En el caso de los siRNAs, depende de la tasa de renovación de la propia proteína. Por ejemplo, cuando se expresan siRNAs que se dirigen a la expresión de Rab11a, una GTPasa de la familia Rab, solo se observa una regulación negativa eficiente 72 h después de la transducción23. Por lo tanto, las proteínas de larga vida (con vidas medias medidas en días) pueden no ser objetivos adecuados utilizando este enfoque.

El investigador también debe ser consciente de las advertencias asociadas con este enfoque. En primer lugar, su utilidad puede limitarse a los roedores hembra debido a las dificultades para cateterizar a los roedores machos a través de su pene. Sin embargo, puede ser técnicamente posible realizar este protocolo en varones mediante la introducción de un catéter en la cúpula de la vejiga, similar a la preparación empleada al realizar cistometría9. Esto permitiría introducir un detergente o un virus, y realizar lavados según sea necesario. Una segunda advertencia es que la sobreexpresión de proteínas puede agotar las vías y recursos celulares, lo que puede conducir a eventos como la agregación de proteínas, la activación de las vías de estrés celular y la muerte27. Por lo tanto, generalmente es aconsejable limitar la expresión transgénica a niveles no tóxicos (a menos que, por supuesto, esa sea la intención de la expresión transgénica), según lo evaluado utilizando marcadores de estrés celular y muerte celular. Una tercera advertencia es que en algunos entornos, la expresión de adenovirus a largo plazo puede desencadenar respuestas inmunes28. Si bien no hay evidencia de que la transducción adenoviral del urotelio per se estimule las respuestas inmunes10, esto es dependiente de transgenes y, como se señaló anteriormente, la sobreexpresión de CLDN2 conduce a la cistitis.

Actualmente, los investigadores tienen una variedad de métodos que pueden usar para modular la expresión de genes y proteínas en el urotelio, incluido el uso de ratones knockout uroteliales transgénicos o condicionales, el uso de reactivos de transfección o el uso de transducción adenoviral. Este último método, objeto de este protocolo, es relativamente fácil, eficiente y reproducible. Aparte del gasto inicial de los reactivos de cultivo celular necesarios para generar las existencias de virus, la gran cantidad de virus producidos (suficiente para realizar cientos de transducciones), da como resultado un costo relativamente bajo por animal. La transducción adenoviral puede ser explotada para estudiar la biología urotelial. Por ejemplo, la transducción adenoviral se utilizó para definir la importancia de las GTPasas de la familia Rho y Rab, los factores de intercambio guanina-nucleótido, los fragmentos motores de miosina y ADAM17 en exocitosis y endocitosis 10,19,20,21,22, y recientemente se utilizó la transducción adenoviral para estudiar la mecanotransducción urotelial9 . Del mismo modo, la transducción adenoviral puede ser relevante cuando se explora y trata enfermedades humanas. Por ejemplo, Ramesh et al. propusieron inicialmente que la transducción adenoviral puede ser una forma útil de atacar las células tumorales18. Si bien sus estudios fueron más un enfoque de prueba de principio, uno puede imaginar que la expresión de toxinas en las células cancerosas o la expresión de epítopos que podrían ser reconocidos por el sistema inmune serían estrategias útiles. La transducción adenoviral también puede ser útil para comprender enfermedades en las que la sobreexpresión o la subexpresión de productos génicos conduce a la enfermedad. Como ejemplo, las biopsias de vejigas de pacientes con cistitis intersticial exhiben un aumento de 90 veces en la expresión de CLDN2 29. Curiosamente, la sobreexpresión de CLDN2 mediante transducción adenoviral replica muchos de los síntomas de esta enfermedad en ratas10. Por lo tanto, CLDN2 podría ser un objetivo en el tratamiento de pacientes con este trastorno.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por una adjudicación de proyecto piloto a través de P30DK079307 (a M.G.D.), subvención de los NIH R01DK119183 (a G.A. y M.D.C.), subvención de los NIH R01DK129473 (a G.A.), un premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana de Urología y una subvención de la Fundación Winters (a N.M.), por los Núcleos de Imágenes Renales de Fisiología Celular y Organismos Modelo del Centro de Investigación Renal de Pittsburgh (P30DK079307), y por S10OD028596 (a G.A.), que financió la compra del sistema confocal utilizado para capturar algunas de las imágenes presentadas en este manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

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References

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Biología Número 188
Expresión de transgenes en urotelio de vejiga nativa mediante transducción mediada por adenovirus
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Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, … More

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

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