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Biology

Expressão de Transgenes no Urotélio da Bexiga Nativa utilizando Transdução Mediada por Adenovírus

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

São descritos métodos para a geração de grandes quantidades de adenovírus recombinantes, que podem então ser usados para transduzir o urotélio nativo de roedores, permitindo a expressão de transgenes ou downregulation de produtos gênicos endógenos.

Abstract

Além de formar uma barreira de alta resistência, o urotélio que reveste a pelve renal, ureteres, bexiga e uretra proximal é hipotetizado para detectar e transmitir informações sobre seu ambiente aos tecidos subjacentes, promovendo a função e o comportamento miccional. A ruptura da barreira urotelial, ou sua função sensorial/transdutor, pode levar à doença. O estudo desses eventos complexos é dificultado pela falta de estratégias simples para alterar a expressão gênica e proteica no urotélio. São descritos métodos que permitem aos investigadores gerar grandes quantidades de adenovírus de alto título, que podem então ser usados para transduzir urotélio de roedores com alta eficiência e de maneira relativamente simples. Tanto cDNAs quanto pequenos RNAs interferentes podem ser expressos usando transdução adenoviral, e o impacto da expressão de transgênicos na função urotelial pode ser avaliado 12 h a vários dias depois. Estes métodos têm ampla aplicabilidade em estudos de biologia urotelial normal e anormal utilizando modelos animais de camundongos ou ratos.

Introduction

O urotélio é o epitélio especializado que reveste a pelve renal, ureteres, bexiga e uretra proximal1. É composto por três estratos: uma camada de células guarda-chuva altamente diferenciadas e polarizadas, muitas vezes binucleadas, cujas superfícies apicais são banhadas por urina; uma camada celular intermediária com uma população de células binucleadas de amplificação de trânsito que pode dar origem a células guarda-chuva superficiais em resposta à sua perda aguda; e uma única camada de células basais, cujo subconjunto funciona como células-tronco que podem regenerar a totalidade do urotélio em resposta à lesão crônica. As células-guarda-chuva são as principais responsáveis pela formação da barreira urotelial de alta resistência, cujos componentes incluem uma membrana apical (rica em colesterol e cerebrosídeos) com baixa permeabilidade à água e solutos, e um complexo juncional apical de alta resistência (composto por tight junctions, junções aderentes, desmossomos e um anel de actomiosina associado)1 . Tanto a superfície apical da célula guarda-chuva quanto seu anel juncional expandem-se durante o enchimento vesical e retornam ao seu estado pré-preenchido rapidamente após a micção 1,2,3,4,5. Além de seu papel na função de barreira, o urotélio também tem funções sensoriais e transdutores que lhe permitem detectar mudanças no meio extracelular (por exemplo, estiramento) e transmitir essa informação por meio da liberação de mediadores (incluindo ATP, adenosina e acetilcolina) para os tecidos subjacentes, incluindo processos nervosos aferentes suburoteliais 6,7,8 . Evidências recentes desse papel são encontradas em camundongos sem expressão urotelial de Piezo1 e Piezo2, o que resulta em alteração da função miccional9. Além disso, ratos superexpressando a proteína formadora de poros de tight-junction CLDN2 na camada de células guarda-chuva desenvolvem inflamação e dor análogas àquelas observadas em pacientes com cistite intersticial10. Hipotetiza-se que a interrupção da função sensorial/transdutor ou barreira urotelial possa contribuir para vários distúrbios vesicais 6,11.

Uma melhor compreensão da biologia do urotélio em estados normais e patológicos depende da disponibilidade de ferramentas que permitam aos investigadores prontamente desregular a expressão gênica endógena ou permitir a expressão de transgenes no tecido nativo. Enquanto uma abordagem para downregulate da expressão gênica é gerar camundongos knockout uroteliais condicionais, essa abordagem depende da disponibilidade de camundongos com alelos floxed, é trabalhosa e pode levar meses a anos para completar12. Não surpreendentemente, então, os pesquisadores desenvolveram técnicas para transfectar ou transduzir o urotélio, o que pode levar a resultados em uma escala de tempo mais curta. Os métodos publicados para transfecção incluem o uso de lipídios catiônicos13, oligodesoxinucleotídeos fosforotiotados anti-senso 14 ou ácidos nucleicos antisenso ligados à proteína TAT do HIV penetrando no peptídeo 11-mer15. No entanto, o foco deste protocolo é no uso da transdução mediada por adenovírus, uma metodologia bem estudada que é eficiente na entrega do gene a uma ampla gama de pilhas, foi testada em numerosos ensaios clínicos, e mais recentemente foi usada para entregar o cDNA que codifica a proteína do capsídeo COVID-19 aos receptores de uma variante da vacina COVID-1916, 17º. Para uma descrição mais completa do ciclo de vida dos adenovírus, vetores adenovirais e aplicações clínicas dos adenovírus, o leitor é direcionado para a referência17.

Um marco importante no uso de adenovírus para transduzir o urotélio foi o relato de Ramesh e col. que mostrou pré-tratamentos curtos com detergentes, incluindo N-dodecil-β-D-maltosídeo (DDM) que aumentaram drasticamente a transdução do urotélio por um adenovírus que codifica a β-galactosidase18. Usando este estudo de prova de princípio como guia, a transdução mediada por adenovírus do urotélio tem sido agora usada para expressar uma variedade de proteínas, incluindo GTPases da família Rab, fatores de troca de guanina-nucleotídeos, fragmentos motores de miosina, claudinas associadas à junção apertada formadora de poros e ADAM17 10,19,20,21,22 . A mesma abordagem foi adaptada para expressar pequenos RNAs interferentes (siRNA), cujos efeitos foram resgatados pela co-expressão de variantes resistentes a siRNA do transgene22. O protocolo aqui descrito inclui métodos gerais para gerar grandes quantidades de adenovírus altamente concentrados, uma exigência para essas técnicas, bem como adaptações dos métodos de Ramesh et al.18 para expressar transgenes no urotélio com alta eficiência.

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Protocol

Experimentos envolvendo a geração de adenovírus, que requer certificação BSL2, foram realizados sob aprovação dos escritórios de Saúde e Segurança Ambiental da Universidade de Pittsburgh e do Comitê Institucional de Biossegurança. Todos os experimentos com animais realizados, incluindo a transdução adenoviral (que requer a certificação ABSL2), foram feitos de acordo com as diretrizes/regulamentos relevantes da Política de Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório e da Lei de Bem-Estar Animal, e sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh. Luvas, proteção ocular e vestuário apropriado são usados para todos os procedimentos que envolvem vírus recombinantes. Qualquer resíduo líquido ou sólido deve ser descartado conforme descrito abaixo. A cama dos animais após a transdução, e quaisquer carcaças de animais resultantes, devem ser tratadas como materiais bioperigosos e descartadas de acordo com as políticas institucionais.

1. Preparação de estoques de adenovírus de alto título

NOTA: A transdução eficaz de bexigas de roedores depende do uso de estoques virais purificados e concentrados, tipicamente 1 x 107 a 1 x 108 partículas virais infecciosas (PIV) por μL. Esta parte do protocolo é focada na geração de estoques de adenovírus de alto título a partir de preparações de vírus existentes. Todas as etapas devem ser realizadas em capela de cultura celular utilizando reagentes e ferramentas estéreis. Embora as cepas disponíveis de adenovírus usadas hoje sejam defeituosas de replicação, a maioria das instituições exige aprovação para usar adenovírus e DNA recombinante. Isso geralmente inclui a designação de uma sala de cultura de células como uma instalação aprovada pela BSL2 para produzir e amplificar adenovírus. Algumas considerações gerais incluem o uso de máscaras, proteção ocular, luvas e roupas apropriadas em todos os estágios de produção e purificação do vírus. Ao realizar a centrifugação, as tampas de segurança são recomendadas se os tubos da centrífuga não tiverem tampas de encaixe apertadas. Todos os materiais não descartáveis, incluindo tampas de segurança de centrífugas potencialmente contaminadas, garrafas e rotores são tratados com uma solução antiviral (consulte a Tabela de Materiais) e, em seguida, enxaguados com água ou etanol 70%. Os resíduos líquidos são tratados pela adição de água sanitária a uma concentração final de 10% (v/v). A destinação desses resíduos líquidos dependerá de políticas institucionais. Os resíduos sólidos são normalmente dispostos em resíduos bioperigosos.

  1. Cultura de células HEK293T
    1. Descongelar um frasco congelado de células HEK293T em banho-maria a 37 °C e usar uma pipeta de 5 mL para transferir as células para uma placa de cultura celular de 15 cm de diâmetro. Com uma pipeta de 25 mL, adicione lentamente 20 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 10% (v/v) de soro fetal bovino e antibiótico penicilina/estreptomicina (DMEM-FBS-PS) ao prato. Incubar as células em uma incubadora de cultura celular a 37 °C gaseificado com 5% (v/v) de CO2 até que atinjam 80%-90% de confluência (~2 x 107 células).
    2. Usando uma pipeta de vidro conectada a uma fonte de vácuo, aspirar o meio e, em seguida, enxaguar as células transferindo 20 mL de PBS estéril (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2 PO 4, 136,9 mM NaCl e 8,9 mM Na2HPO4) para a placa usando uma pipeta de 25 mL. Aspirar o PBS gasto e, em seguida, usar uma pipeta de 5 mL para transferir 3 mL de solução de proteinase morna (37 °C) (ver Tabela de Materiais) para o prato, incubando o prato na incubadora de cultura celular até que as células se desprenda (~3-4 min).
      NOTA: A proteólise eficaz pode ser melhor avaliada inclinando lentamente o prato para frente e para trás procurando a liberação de células de todas as porções do prato no fluido em movimento. As células HEK293T são sensíveis ao tratamento prolongado com proteinases e morrerão se deixadas mais do que alguns minutos em solução de proteinase.
    3. Use uma pipeta de 10 mL para transferir 7 mL de DMEM-FBS-PS para a placa de células destacadas e, em seguida, use a mesma pipeta para aspirar as células e o meio. Transfira as células suspensas para um tubo cônico de 50 mL e, em seguida, peletize as células centrifugando a suspensão em uma centrífuga clínica de baixa velocidade a 200 x g por 5 min. Aspirar o sobrenadante usando uma pipeta de vidro conectada a uma fonte de vácuo. Use uma pipeta de 25 mL para ressuspender o pellet de células em 15 mL de DMEM-FBS-PS.
    4. Adicionar 1 mL da suspensão celular a cada uma das quinze placas de 15 cm contendo 19 mL de DMEM-FBS-PS.
    5. Cultivar as células em uma incubadora de cultura de tecidos até que atinjam 85%-90% de confluência (~3-4 dias).
  2. Preparar uma solução de vírus diluída
    1. Adicione ~1,5 x 10 9 a 3 x 109 IVP de um estoque de vírus existente (5-10 IVP/célula) a um tubo cônico de 50 mL preenchido com 45 mL de DMEM sem SFB ou antibióticos.
      NOTA: É possível usar uma concentração mais baixa do vírus (1-5 IVP/célula); no entanto, levará mais tempo para que a produção do vírus ocorra.
  3. Infectar as células cultivadas com o vírus.
    1. Usando uma pipeta de vidro ligada a uma fonte de vácuo, aspirar o meio das células quase confluentes na etapa 1.1.5.
    2. Utilizar uma pipeta de 25 ml para transferir 3,0 ml de solução viral diluída (preparada no passo 1.2.1) para cada placa de cultura celular. Em seguida, use uma pipeta de 10 mL para adicionar 7,0 mL de meio DMEM (sem FBS ou antibióticos) a cada prato. Incubar por 60 min em uma incubadora de cultura celular e, em seguida, adicionar 10 mL de DMEM contendo 20% (v/v) de SFB e 2x PS a cada prato.
      NOTA: Usar uma das 15 placas como placa de controle (na qual o vírus não é adicionado) facilita a identificação de arredondamento celular induzido pelo vírus e morte em células infectadas na próxima etapa.
    3. Incubar as células na incubadora de cultura celular por 2-4 dias até que a maioria delas comece a arredondar e >60% das células tenham se destacado.
      NOTA: Se usar um título mais baixo do vírus, pode levar até uma semana para que a morte celular ocorra. Se a morte celular não ocorrer dentro de uma semana, é provável que o processo precise ser repetido usando um título mais alto do vírus.
  4. Recuperar vírus de lisados celulares
    1. Use um raspador de células para raspar o fundo de cada prato, liberando células conectadas no meio.
    2. Usando uma pipeta de 25 mL, colete e agrupe o meio, as células e os restos celulares de cada placa de cultura celular em um tubo de cultura de células cônico de 50 mL.
      NOTA: Para economizar recursos, o meio de dois pratos pode ser combinado em um tubo de 50 mL.
    3. Pellet o material celular por centrifugação usando uma centrífuga de mesa de baixa velocidade: 5 min à temperatura ambiente a 3.000 x g. Use uma pipeta de vidro acoplada a um dispositivo de vácuo para aspirar o sobrenadante.
    4. Utilizar uma pipeta de 10 mL, combinada com trituração, para consolidar todo o material peletizado resultante em um total de 7 mL de Tris-HCl 100 mM filtrado estéril pH 7,4 contendo 10 mM EDTA (solução de Tris-EDTA). Transfira o material agrupado para um tubo cônico estéril de 15 mL de cultura celular e coloque no gelo.
      NOTA: Neste ponto, a preparação do vírus pode ser congelada a -80 °C indefinidamente.
  5. Preparar lisados celulares
    1. Realizar três ciclos de congelamento-descongelamento para interromper as células restantes e, assim, liberar ainda mais as partículas virais formadas. Congelar o material agrupado na etapa 1.4.4 submergindo o tubo em nitrogênio líquido (~30-60 s). Descongelar rapidamente a amostra colocando o tubo numa incubadora a 37 °C. Vórtice a amostra por 15 s e, em seguida, repita o procedimento de congelamento e descongelamento rápido mais 2x.
      NOTA: A solução de vírus pode ser rapidamente descongelada em uma temperatura de 37 °C em banho-maria, mas é necessário cuidado, pois as oscilações de temperatura podem fazer com que o tubo rache, liberando a solução de vírus no banho-maria. Para evitar que isso ocorra, coloque o tubo que contém o sobrenadante viral em um tubo maior, que é então colocado no banho-maria.
    2. Use uma pipeta de 10 mL para transferir o material celular descongelado três vezes para um tubo de centrífuga de supervelocidade. Centrifugar o material no tubo por 30 min a 4 °C de centrífuga de supervelocidade a ~18.500 x g.
    3. Recupere o sobrenadante rico em vírus ~7 mL com uma pipeta de 10 mL e transfira-o para um tubo cônico de 15 mL. Retenha a amostra no gelo até a próxima etapa.
      NOTA: Neste ponto, considere manter uma alíquota do sobrenadante viral não purificado como um preâmbulo para iniciar uma nova preparação de vírus (ou como um backup). Conservar esta alíquota a -80 °C.
  6. Isolar e purificar o vírus usando centrifugação por gradiente de densidade.
    1. Preparar um gradiente descontínuo de CsCl em um tubo de ultracentrífuga transparente de parede fina PET de 12 mL (ver Tabela de Materiais) ou equivalente. Use uma seringa de 3 mL equipada com uma agulha de 18 G para introduzir cuidadosamente 2,5 mL de solução de CsCl 1,4 g/mL no fundo do tubo e, em seguida, use uma nova seringa/agulha para cobri-la com 2,5 mL de solução de CsCl 1,25 g/mL.
      NOTA: Soltar soluções diretamente sobre uma camada pré-existente causará uma mistura significativa e indesejada. Em vez disso, coloque a porção chanfrada da agulha contra a borda do tubo e, em seguida, pressione muito lentamente o êmbolo da seringa, elevando a posição da agulha à medida que a solução enche o tubo.
    2. Coloque o ~7 mL de sobrenadante viral sobre o gradiente de maneira semelhante usando uma seringa de 10 mL. Se houver mais de 2-3 mm de espaço entre o sobrenadante viral e a parte superior do tubo, adicione solução adicional de Tris-EDTA para encher o tubo até que restem apenas 2-3 mm de espaço.
    3. Faça um tubo de equilíbrio preparado de forma semelhante, contendo camadas de CsCl, mas substituindo a solução de Tris-EDTA pelo sobrenadante viral.
      NOTA: Os dois tubos devem ter pesos idênticos (e densidades semelhantes) para evitar uma situação de carga desequilibrada potencialmente perigosa na ultracentrífuga.
  7. Isolar o vírus usando ultracentrifugação zonal de taxa.
    1. Carregue os gradientes formados nas etapas 1.6.2-1.6.3 nas caçambas de um rotor SW41 ou equivalente. Rosqueie em tampas de caçamba, coloque o rotor em uma ultracentrífuga (pré-resfriada a 4 °C) e centrífuga por 1 h a ~150.000 x g.
    2. Durante a centrifugação, equilibrar a coluna descrita no passo 1.9.1 infra.
  8. Recuperar partículas virais isoladas
    1. No final da etapa de centrifugação, retire cuidadosamente as caçambas do rotor e, em uma coifa de cultura celular, remova as tampas da caçamba e, em seguida, remova os tubos e coloque-os em um rack.
    2. Coletar o material bandado, rico em partículas virais, que flutua na interface entre a solução de CsCl de 1,25 g/mL e 1,4 g/mL. Segurando o tubo que contém o gradiente sobre a metade inferior de uma placa de cultura celular (que irá capturar qualquer material derramado), use uma agulha de 1 polegada 18 G conectada a uma seringa de 3 mL para perfurar cuidadosamente o tubo, logo abaixo do vírus bandado. Aspirar lentamente o vírus, que normalmente é recuperado em ~1 mL.
    3. Remova a agulha do tubo, o que resultará no material restante no gradiente para fluir para fora do tubo para a metade inferior da placa de cultura celular (quaisquer líquidos devem ser tratados como resíduos perigosos).
    4. Transfira a solução de vírus na seringa para um tubo de microcentrífuga estéril sobre gelo.
      NOTA: Ao recuperar o vírus nesta etapa, posicione a agulha de modo que o lúmen da agulha esteja voltado para cima com a agulha abrindo alguns milímetros abaixo da faixa rica em vírus. Evite a contaminação pela fina faixa de vírus mal montada que às vezes é observada 2-3 mm acima do vírus em bandas (veja seta preta fina na Figura 1A).
  9. Remover CsCl da amostra por filtração em gel.
    1. Equilibre uma coluna PD-10 (pré-embalada com Sephadex G-25M), presa a um suporte com 50 mL de PBS filtrado estéril a 0,2 μm contendo glicerol a 10% (v/v).
      NOTA: A etapa inicial de equilíbrio leva de 2 a 3 h para ser concluída e é necessária para garantir a lavagem completa dos conservantes que são usados pelo fabricante para estabilizar a coluna.
    2. Deixe a solução de lavagem recuar abaixo da frita (um disco protector de material branco na parte superior do meio da coluna) e, em seguida, transfira cuidadosamente a solução de vírus purificada recolhida no passo 1.8 para o topo da coluna. Deixe a solução rica em vírus recuar abaixo da frita e, em seguida, comece a encher a coluna com PBS-glicerol.
      NOTA: Uma função da frita é evitar que a coluna fique seca. Como resultado, pequenos atrasos são tolerados antes que mais eluente seja adicionado à coluna.
    3. Coletar o eluato em 12 tubos de microcentrífuga estéreis, 0,5 mL por fração.
  10. Determine o rendimento viral.
    1. Determinar as frações de pico do vírus usando espectrofotometria. Preparar uma diluição de 1:100 de cada fracção em PBS e medir o OD260 num espectrofotómetro, utilizando uma diluição de 1:100 de tampão isoladamente em branco. As partículas virais devem eluir no volume vazio, começando por volta da fração 6. Agrupe as frações que contêm as leituras OD260 mais altas.
    2. Faça uma diluição de 1:100 das frações virais agrupadas e remeça o OD260. Calcular a concentração final de partículas virais e o número de IVP nas fracções agrupadas utilizando a seguinte fórmula: Partículas virais por ml = OD260 × 100 (isto corrige o factor de diluição) × 1012. Uma estimativa geral é que 1% das partículas virais são PIV, como tal: PIV/mL = OD 260 × 100 × 10 10 ou IVP/μL = OD260 ×100 × 10 7.
  11. Aliquot as frações de vírus agrupadas (contendo 5 x 107 a 1 x 108 IVP) em tubos de microcentrífuga estéreis ou criofrascos. Conservar as amostras a -80 °C.

2. Transdução da bexiga de roedores

NOTA: Se for novo nesta técnica, recomenda-se que o número de animais transduzidos de uma só vez seja limitado a 2-4. Isto pode ser conseguido escalonando os horários de início de cada animal, particularmente durante o tratamento com detergente na etapa 2.2 e, em seguida, a incubação do vírus na etapa 2.3. Investigadores experientes podem transduzir até seis animais por vez.

  1. Cateterizar a bexiga
    1. Anestesiar camundongos fêmeas C57Bl/6J (tipicamente 8-10 semanas de idade, ~20-25 g) ou ratos fêmeas Sprague Dawley (tipicamente 2-3 meses de idade, ~250 g) usando um vaporizador com um cone nasal acoplado. Calibrar o vaporizador para produzir 3,0% (v/v) de isoflurano, 97% (v/v) O 2 para camundongos ou 4,0% (v/v) de isoflurano, 96% (v/v) de O2 para ratos. Confirme se os animais estão anestesiados, garantindo que eles não respondam à pinça dos dedos dos pés (normalmente após 1-2 minutos).
    2. Mantenha a temperatura corporal do animal colocando-os em uma almofada aquecida. Monitorar o animal durante todo o protocolo de transdução para garantir que os animais estejam anestesiados e não sintam dor durante este procedimento.
    3. Reduzir o isoflurano para 1,5% (v/v) para camundongos ou 2,0% (v/v) para ratos e manter os animais sob anestesia durante todo o protocolo.
    4. Para evitar a introdução de ar na bexiga, preencha a porção plástica do cateter de um cateter IV (ver Tabela de Materiais) e o cubo associado com PBS estéril usando uma pipeta de transferência.
    5. Com o animal em decúbito dorsal, esfregue o meato externo com álcool a 70% e insira o cateter estéril no meato externo, depois na uretra e, em seguida, na bexiga.
      1. Para realizar essa tarefa, utilize pinças finas para agarrar suavemente o tecido que forma o meato externo e estendê-lo verticalmente, longe do animal. Usando a outra mão, insira cuidadosamente o cateter verticalmente cerca de 3-4 mm no meato uretral (um monte de carne logo acima da abertura da vagina). Então, por causa de uma curvatura na uretra, abaixe o cateter, inserido no meato externo, em direção à cauda do animal, o que facilita sua entrada na porção da uretra que passa abaixo do osso púbico e, finalmente, na bexiga
        . NOTA: Especialmente no caso do rato, o cateter pode ser muito longo, e não mais que 1,0-1,1 cm dele deve ser inserido no animal. Caso contrário, ocorrerão danos à mucosa da bexiga. Para evitar isso, marque o cateter ~1 cm abaixo de sua ponta e, em seguida, não insira o cateter além dessa marcação.
    6. Deixe a urina na bexiga vazar. Remova qualquer resíduo de urina realizando a manobra de Credé: massageie e pressione suavemente a bexiga na área abdominal inferior.
  2. Tornar o urotélio receptivo à transdução, tratando-o com uma solução detergente.
    1. Lave a bexiga do rato ou do rato ligando uma seringa estéril de 1 ml preenchida com PBS ao cubo do cateter. Injetar 100 μL de PBS estéril na bexiga do rato (ou 450 μL no caso da bexiga do rato). Retire a seringa do encaixe do cateter e permita o dreno PBS. Se necessário, realize a manobra de Crede para remover o excesso de líquido vesical.
    2. Instilar 100 μL de N-dodecil-β-D-maltosídeo (DDM) a 0,1% (p/v) (dissolvido em PBS e 0,2 μm esterilizado por filtro) na bexiga de camundongo usando uma seringa estéril de 1 mL. Retenha o DDM na bexiga durante 10 minutos, deixando a seringa no lugar. Em ratos, o volume da DDM é aumentado para 450 μL.
    3. Retire o DDM da bexiga desprendendo a seringa e deixando-a escorrer. Realize a manobra de Crede, se necessário.
  3. Introduzir o vírus na bexiga.
    1. Anexar uma seringa estéril de 1 mL ao cubo do cateter e instilar 0,5 x 107 a 1 x 108 IVP de adenovírus (preparado na etapa 1), diluído em 100 μL de PBS estéril para camundongos ou 450 μL para ratos, na bexiga. Deixe a seringa presa ao cateter para evitar que a solução de vírus escape.
    2. Após 30 minutos, retire a seringa e deixe a solução do vírus evacuar a bexiga para uma almofada descartável. Limpe qualquer solução de vírus residual com um lenço absorvente, descarte a almofada e limpe os resíduos bioperigosos.
      NOTA: O glicerol é citotóxico. Como tal, o volume máximo de solução viral instilada em camundongos é limitado a 5 μL (que quando diluído em 100 μL de PBS resultaria em uma concentração final de glicerol de ~0,5% [v/v]). Além disso, é possível aumentar a eficiência da transdução aumentando o número de PIV instiladas e estendendo a incubação do vírus para 45 min.
    3. Degrau opcional: A bexiga pode ser lavada com PBS conforme descrito no passo 2.2.1 acima; no entanto, isso não é necessário.
  4. Permita que o animal se recupere.
    1. Cessar o fluxo de isoflurano e permitir que o animal se recupere e fique totalmente móvel antes de devolvê-lo à sua gaiola, especialmente se os animais estiverem alojados em grupo.
      NOTA: Como a transdução do vírus por si só não causa sintomas observáveis do trato urinário inferior ou dor, geralmente não há necessidade de tratamento pós-cirúrgico. No entanto, se o transgene codificado for tóxico, analgesia pós-procedimento ou antibióticos podem ser necessários, conforme exigido pela instituição.
  5. Analisar os efeitos da expressão transgênica 12-72 h após o tratamento usando métodos como hibridização in situ de RNAm, western blot ou imunofluorescência 9,10,23 (ver resultados representativos).

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Representative Results

Preparação do vírus
Um exemplo de purificação do vírus por centrifugação por gradiente de densidade é mostrado na Figura 1A. A faixa rosa claro, encontrada na interface do material celular carregado com a camada de CsCl de 1,25 g/mL, é composta principalmente por células rompidas e seus detritos (ver seta magenta na Figura 1A). Deriva sua cor rosada da pequena quantidade de meio de cultura que é transportada da etapa 1.5 do protocolo. As partículas virais de interesse, que aparecem como uma faixa branca leitosa, são encontradas na interface das soluções de CsCl 1,25 g/mL e CsCl 1,40 g/mL (ver seta amarela na Figura 1A). Pode-se também observar uma faixa de material que flutua 2-3 mm acima das partículas virais enriquecidas (ver seta preta fina na Figura 1A). É composto por vírus e detritos não montados, contém poucos IVP e deve ser evitado ao coletar a amostra do vírus.

A purificação adicional do vírus e a troca de tampão usando uma coluna PD10 são mostradas na Figura 1B, e as leituras OD260 das frações resultantes após a eluição são mostradas na Figura 1C. O volume vazio dessas colunas é de aproximadamente 3 mL, e assim o vírus começa a aparecer na fração 6 e atinge o pico na fração 9. Neste experimento, as frações 6-9 foram agrupadas. Embora as frações 6 e 7 sejam relativamente baixas em partículas virais, elas contêm vírus suficientes para merecer recuperação e servem para diluir as frações de títulos muito altos para uma concentração mais razoável. As frações 10-12 não foram incluídas, pois o aumento de OD260 na fração 11 indica a possível presença de um segundo pico de contaminação, o que é observado variavelmente nessas preparações. A fração agrupada normalmente terá 1 x 107 a 1 x 108 IVP/μL, e o rendimento esperado seria da ordem de 1 x 10 10 a 2 x10 11 IVP total. Esta é a quantidade suficiente de vírus para realizar centenas de transduções. Embora seja possível titular o vírus por meio de ensaios de placa ou pela contagem de colônias de células que expressam proteínas fluorescentes22, a regra de 1% é suficiente na maioria dos casos. Esta regra estabelece que 1% das partículas virais purificadas, estimadas pela medição do OD260 da amostra, são PIV. Alíquotas de vírus armazenadas a -80 °C têm uma vida útil de 2-5 anos, embora a infectividade diminua a longo prazo. Alíquotas descongeladas do vírus podem ser congeladas a -80 °C uma vez sem perda significativa de infectividade. No entanto, o descongelamento e congelamento repetidos impactam negativamente a infectividade viral.

Transdução da bexiga
Um primeiro passo importante na avaliação do impacto da transdução é a confirmação da expressão transgênica. Isso pode ser avaliado usando várias técnicas, incluindo ferramentas que detectam RNAm (por exemplo, RNAScope), análise de western blot ou uso de imunofluorescência 9,10,23. A Figura 2 é um exemplo de urotélio de camundongo que foi transduzido com um adenovírus que codifica o hormônio do crescimento humano marcado com epítopo V5 (V5-hGH)23. Essa proteína é embalada em vesículas discoidais/fusiformes e pode ser exocitada, durante o enchimento vesical19,23. A análise por Western blot dos lisados uroteliais revelou expressão de V5-hGH no urotélio das bexigas transduzidas, mas não nas bexigas não transduzidas (Figura 2A). A expressão também foi confirmada por imunofluorescência, neste caso com anticorpos que reconheceram hGH ou o epítopo V5 tag (bexigas não transduzidas não tinham sinal, não mostradas) (Figura 2B).

Um exemplo adicional é a transdução da bexiga de ratos com um vírus que codifica CLDN2, uma proteína associada à junção apertada formadora de poros24,25. A CLDN2 aumenta o fluxo paracelular de cátions (incluindo K+) e sua superexpressão resulta em inflamação e desenvolvimento de dor visceral10. A análise de Western blot confirmou a expressão de CLND2 em bexigas de ratos transduzidas com adenovírus que codificam Cldn2, mas não naquelas transduzidas com um vírus que codifica GFP controle (Figura 2C). Em geral, a GFP não é considerada tóxica quando expressa em células e, portanto, serve como um controle útil. O uso da GFP também permite que o investigador confirme que a transdução está funcionando. A análise por imunofluorescência confirmou ainda a expressão exógena de CLDN2 em células uroteliais transduzidas com cDNA de Cldn2 (sinal vermelho na Figura 2D). Além disso, semelhante à CLDN2 endógena (não mostrada), a CLDN2 expressa está localizada nas tight junctions marcadas com TJP1, bem como nas superfícies basolaterais das células guarda-chuva (a CLDN2 é marcada em verde na Figura 2E)10. No caso da expressão de CLDN2, ela foi mais alta um dia após a transdução, mas depois desapareceu, e foi pouco detectável após 15 dias.

Uma segunda consideração é, quais tipos de células serão alvo da transdução adenoviral. Enquanto em ratos é possível transduzir principalmente a camada celular guarda-chuva19, em camundongos, todas as camadas do urotélio podem ser transduzidas, embora a transdução das camadas intermediária e basal das células possa ser variável. É importante ressaltar que, em toda a parede vesical, apenas o urotélio é transduzido e nenhum outro tecido é alvo do adenovírus instilado (Figura 3).

Enquanto as análises de células transduzidas podem ser realizadas em nível de célula única, ao explorar um fenótipo global da bexiga, deve-se transduzir a maioria das células uroteliais. Assim, é importante definir a eficiência da transdução (ou seja, qual fração de células uroteliais é transduzida). Por exemplo, no caso do adenovírus que expressa Cldn2, >95% das células guarda-chuva foram transduzidas (ver Figura 2D). Um exemplo adicional é o campo de imagem mostrado na Figura 3, onde a contagem do número de células guarda-chuva transduzidas (neste caso, expressando o sensor Ca2+ GCAMP5G), revela uma eficiência que se aproxima de 95%. No entanto, deve-se examinar as células em campos aleatórios tomados ao longo da parede da bexiga para obter uma estimativa precisa e imparcial da eficiência da transdução.

Figure 1
Figura 1: Purificação do adenovírus. (A) As partículas de adenovírus produzidas por células HEK293T infectadas foram purificadas por centrifugação em um gradiente descontínuo de CsCl composto por uma camada de 1,4 g/mL de CsCl, uma camada de 1,25 g/mL de CsCl e uma camada de amostra (S) diluída em solução de Tris-EDTA. O material celular (seta rosa) acumula-se na interface S/1,25, enquanto o adenovírus purificado flutua na interface 1,25/1,4 (seta amarela). Uma pequena faixa de vírus mal montada flutua acima deste último (seta preta fina). (B) A banda rica em adenovírus no gradiente é recuperada com agulha e o ClCs é removido do adenovírus por filtração em gel usando uma coluna PD10 preenchida com Sephadex G25 balanceada com PBS contendo glicerol a 10,0% (v/v). A superfície do Sephadex é protegida por uma frita plástica porosa. (C) Frações de 0,5 mL foram coletadas da coluna PD10. As frações OD260 foram medidas em espectrofotômetro e os valores plotados. Frações ricas em vírus eluem no volume vazio, que começa na fração 6 e se estende até a fração 9. As frações agrupadas para este experimento representativo são sombreadas em azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Transdução do urotélio vesical de roedores com adenovírus que codificam V5-hGH ou CLDN2. (A) O urotélio de camundongo foi deixado não transduzido (UT) ou transduzido com adenovírus que codificam o epítopo V5 marcado com hormônio do crescimento humano (hGH). Após 24 h, as bexigas foram recuperadas, lisados uroteliais foram preparados e submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio e a expressão de V5-hGH confirmada usando western blots sondados com um anticorpo contra hGH. (B) Detecção de V5-hGH em urotélio de camundongo seccionado e corado usando anticorpos contra hGH (verde) ou o epítopo V5 (vermelho) e anticorpos secundários marcados com fluoróforos. A imunofluorescência foi captada por microscopia confocal. As amostras foram contracoradas com TO-PRO3 para marcar núcleos. (C-F) O urotélio de rato foi transduzido com um vírus que codifica CLDN2 de rato (nome comum claudina-2) ou GFP (proteína fluorescente verde de nome comum) como controle. (C) Detecção de CLDN2 exógena por western blotting usando um anticorpo novamente CLDN2. Note-se que a CLDN2 endógena é expressa em baixos níveis e não é detectada neste experimento. (D) A transdução da camada de células guarda-chuva é revelada por imunofluorescência e microscopia confocal. As bordas da célula são reveladas pela co-coloração do tecido com FITC-faloidina, que marca o citoesqueleto da actina cortical. (E) Detecção de CLDN2 e TJP1 exógenos (nome comum ZO1) por imunofluorescência e microscopia confocal de urotélio montado inteiro ou seccionado transversalmente. Pequenas setas brancas indicam a localização da junção apertada e pequenas pontas de seta magenta marcam a localização de acúmulos intracelulares de CLDN2 no citoplasma celular. Estes foram previamente revelados como CLDN2 associados a Golgi10. (F) Após a transdução, os animais foram eutanasiados nos dias indicados após a infecção. A expressão exógena de CLDN2 foi detectada usando western blotting. Os animais que expressaram GFP foram eutanasiados após o 1º dia. Os dados da Figura 2C-E foram modificados de Montalbetti et al.10 e são reproduzidos com permissão da American Physiological Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Eficiência da transdução adenoviral. O urotélio da bexiga de camundongo foi transduzido com um adenovírus que codifica o sensor de cálcio GCaMP5G. Os painéis superiores mostram coloração para GCaMP5G (detectado usando um anticorpo para proteína fluorescente verde; GFP, verde), os painéis do meio mostram a distribuição dos núcleos corados com DAPI (azul) e actina marcada com rodamina-faloidina (vermelho), e os painéis inferiores são uma fusão dos três sinais. As pontas de seta brancas no painel inferior são as raras células guarda-chuva que não são transduzidas. A eficiência geral da transdução de células guarda-chuva nesta imagem é de ~95%. Note que apenas o urotélio é transduzido. As regiões encaixotadas são ampliadas nos painéis à direita. A região da caixa 1 compreende principalmente células transduzidas guarda-chuva. A região do quadro 2 é o urotélio mostrando transdução eficiente das células guarda-chuva, mas transdução menos eficiente das camadas celulares subjacentes. LP = lâmina própria; EM = muscular externa; Se = serosa; Ut = urotélio. As imagens foram adquiridas em microscópio confocal (ver Tabela de Materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Enquanto Ramesh e col. estavam focados no desenvolvimento de estratégias para o uso da transdução adenoviral no tratamento do câncer de bexiga18, relatos mais recentes demonstraram a utilidade dessas técnicas no estudo da biologia/fisiologia e fisiopatologia urotelial normal 10,18,19,20,21 . As características importantes dessa abordagem incluem: (i) Em toda a parede da bexiga de roedores, apenas o urotélio é transduzido 10,19,20,21,22. No caso de ratos, a transdução é principalmente limitada à camada de células guarda-chuva, enquanto em camundongos, a totalidade do urotélio pode ser direcionada; (ii) Essa abordagem pode ser usada para expressar proteínas ou siRNAs 10,19,20,21,22; (iii) A eficiência da transdução pode aproximar-se de 70%-95% (por exemplo, ver Figura 3)18,20; (iv) Um dia após a transdução, a ultraestrutura do urotélio, a integridade do tecido, a presença de uma barreira de alta resistência (avaliada pela medida da resistência transepitelial) e a expressão de marcadores de diferenciação urotelial são "normais"10,19. O único efeito morfológico observado até agora é uma diminuição no diâmetro da célula guarda-chuva (quando visto de cima); entretanto, retornam ao seu tamanho normal após 3-4 dias10,19; (v) O urotélio pode ser transduzido com até três adenovírus diferentes simultaneamente18; (vi) A expressão transgênica pode ser alterada pela titulação do número de PIV, o que afeta a quantidade de expressão proteica, alongamento ou encurtamento do tempo de incubação antes do sacrifício do animal, ou uso de diferentes promotores, como um sistema tet-regulado (tet-off)19. Neste último caso, pode-se co-expressar um vírus que codifica o transativador/tet-repressor e, em seguida, modular a expressão do transgene alterando a concentração de doxiciclina na dieta do animal.

Embora o protocolo geral seja relativamente simples, existem algumas etapas críticas que devem ser consideradas ao realizar esses experimentos. Uma delas é a disponibilidade de estoques de vírus de alto título que são de pureza razoável. Os adenovírus podem ser obtidos de fornecedores comerciais, de núcleos institucionais de produção de vírus, de outros pesquisadores ou podem ser produzidos internamente. Neste último, recomenda-se o sistema AdEasy do laboratório Bert Vogelstein, pois seus componentes podem ser adquiridos da Addgene, e os adenovírus gerados por essa abordagem funcionam bem na transdução urotelial4. Essa técnica permite gerar adenovírus que codificam cDNAs de até 8 Kb usando o plasmídeo de empacotamento pAdEasy-1 (a inserção substitui os genes virais E1 e E3), as células bacterianas pAdEasy-1 (que codificam os genes adenovirais necessários para produzir vírus) e a produção de adenovírus com defeito de replicação em células HEK293T (que expressam a proteína viral E1 necessária). No entanto, a substituição do plasmídeo de empacotamento pAdEasy-1 pelo plasmídeo de embalagem pAdEasy-2 aumenta o tamanho da embalagem em mais 2,7 kB, mas requer o uso de uma linhagem celular diferente (células 911 da retina embrionárias humanas transformadas em E1), pois os vírus não possuem o gene inicial E4, além de E1 e E34. A expressão de siRNAs pode ser realizada usando vários sistemas, incluindo o pAdloss, que é descrito em detalhes em Kasahara et al.26. Embora possa ser possível usar meio de cultura de células rico em vírus para transduzir o urotélio, esse método pode não ser confiável. Em vez disso, a amplificação de vírus em larga escala, purificação de gradiente de CsCl, seguida de filtração em gel, fornece a maneira mais confiável de gerar grandes quantidades de vírus de alto título. A relativa estabilidade do vírus a -80 °C, juntamente com rendimentos relativamente grandes de vírus, torna esta uma maneira ideal de ter um estoque consistente de vírus que pode ser usado em um grande número de experimentos.

Etapas críticas adicionais neste protocolo incluem aquelas associadas ao protocolo de transdução. Estes incluem o uso de PBS (sem cátions divalentes) como agente de lavagem e diluente, e o uso de detergente DDM. Como o complexo juncional é dependente de Ca2+ para o funcionamento adequado, PBS provavelmente promove a entrada viral rompendo a barreira associada à junção. O DDM também é fundamental; como Ramesh e col. relataram, a eficiência da transdução de adenovírus é extremamente baixa na ausência de tratamento com detergente18. No entanto, o modo de ação do detergente não é claro. Uma incubação de 10 min com DDM é ideal, mas esta pode ser encurtada para 5 min; no entanto, não é recomendado que a incubação se estenda além de 10 minutos, pois o detergente pode causar danos inesperados aos tecidos subjacentes. A quantidade de vírus utilizada é um parâmetro crítico, com concentrações mais altas geralmente levando a maiores quantidades de expressão de transgenes e maiores eficiências de transdução. No entanto, a concentração viral ideal que fornece a melhor combinação de expressão, eficiência e fenótipo deve ser determinada empiricamente. Como concentração inicial, recomenda-se um intervalo de 5,0 x 106 a 2,0 x 107 IVP por animal. Dependendo da proteína a ser expressa, isso resulta em eficiências na faixa de 70%-95% 10,19,20,21,22; no entanto, alguns construtos GTPase dominante-negativo são menos eficientes (30%-50%) e requerem uma abordagem de análise unicelular 4,20. Essas diferenças de eficiência podem refletir o turnover do transgene, sua toxicidade ou a pureza e o rendimento do vírus usado para transdução. Este último pode ser descartado pela realização de ensaios em placa. Embora não seja hipercrítico, o tempo que o vírus permanece na bexiga deve ser longo o suficiente para que o vírus se ligue ao seu receptor CXADR. Tempos inferiores a 30 min podem diminuir a eficiência da transdução, enquanto estender o período de incubação para 45 min pode aumentar a eficiência; no entanto, isso pode ser transgene-dependente. A última etapa crítica deste protocolo é determinar quanto tempo o animal ficará retido antes que um fenótipo seja avaliado. Os transgenes exibem a maior expressão após 1-2 dias19, mas a expressão pode diminuir depois disso. No caso dos siRNAs, depende da taxa de turnover da própria proteína. Por exemplo, ao expressar siRNAs que têm como alvo a expressão de Rab11a, uma GTPase da família Rab, a regulação negativa eficiente só é observada 72 h após a transdução23. Assim, proteínas de vida longa (com meias-vidas medidas em dias) podem não ser alvos adequados usando essa abordagem.

O investigador também deve estar ciente das ressalvas associadas a essa abordagem. Primeiro, sua utilidade pode ser limitada a roedores fêmeas devido à dificuldade em cateterizar roedores machos através de seu pênis. Entretanto, pode ser tecnicamente possível realizar esse protocolo em homens introduzindo um cateter na cúpula vesical, semelhante ao preparo empregado na realização da cistometria9. Isso permitiria introduzir um detergente ou um vírus e realizar lavagens conforme necessário. Uma segunda ressalva é que a superexpressão de proteínas pode esgotar vias e recursos celulares, o que pode levar a eventos como agregação proteica, ativação de vias de estresse celular e morte27. Assim, é geralmente sensato limitar a expressão de transgenes a níveis não tóxicos (a menos que, é claro, essa seja a intenção da expressão de transgenes), conforme avaliado usando marcadores de estresse celular e morte celular. Uma terceira ressalva é que, em alguns cenários, a expressão de adenovírus em longo prazo pode desencadear respostas imunes28. Embora não haja evidências de que a transdução adenoviral do urotélio per se estimule respostas imunes10, isso é transgene-dependente e, como observado acima, a superexpressão de CLDN2 leva à cistite.

Atualmente, os pesquisadores têm uma variedade de métodos que podem usar para modular a expressão gênica e proteica no urotélio, incluindo o uso de camundongos knockout uroteliais transgênicos ou condicionais, uso de reagentes de transfecção ou uso de transdução adenoviral. Este último método, objeto deste protocolo, é relativamente fácil, eficiente e reprodutível. Além do gasto inicial de reagentes de cultura de células necessários para gerar os estoques de vírus, a quantidade muito grande de vírus produzida (suficiente para realizar centenas de transduções), resulta em um custo relativamente baixo por animal. A transdução adenoviral pode ser explorada para estudar a biologia urotelial. Por exemplo, a transdução adenoviral foi usada para definir a importância das GTPases da família Rho e da família Rab, fatores de troca guanina-nucleotídeos, fragmentos motores de miosina e ADAM17 na exocitose e endocitose 10,19,20,21,22, e a transdução adenoviral foi recentemente usada para estudar mecanotransdução urotelial9 . Da mesma forma, a transdução adenoviral pode ser relevante ao explorar e tratar doenças humanas. Por exemplo, Ramesh e col. propuseram inicialmente que a transdução adenoviral pode ser uma maneira útil de atingir célulastumorais18. Embora seus estudos fossem mais uma abordagem de prova de princípio, pode-se imaginar que a expressão de toxinas em células cancerosas ou a expressão de epítopos que poderiam ser reconhecidos pelo sistema imunológico seriam estratégias úteis. A transdução adenoviral também pode ser útil na compreensão de doenças em que a superexpressão ou subexpressão de produtos gênicos leva à doença. Como exemplo, biópsias de bexigas de pacientes com cistite intersticial exibem um aumento de 90 vezes na expressão de CLDN2 29. Curiosamente, a superexpressão de CLDN2 usando transdução adenoviral replica muitos dos sintomas dessa doença em ratos10. Assim, a CLDN2 poderia ser um alvo no tratamento de pacientes com esse transtorno.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por um prêmio de projeto piloto através de P30DK079307 (para M.G.D.), NIH grant R01DK119183 (para G.A. e M.D.C.), NIH grant R01DK129473 (para G.A.), um prêmio American Urology Association Career Development e um grant Winters Foundation (para N.M.), pelo Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores do Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), e pelo S10OD028596 (para G.A.), que financiou a compra do sistema confocal utilizado para capturar algumas das imagens apresentadas neste manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

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Biologia Edição 188
Expressão de Transgenes no Urotélio da Bexiga Nativa utilizando Transdução Mediada por Adenovírus
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Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, … More

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

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