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Expression de transgènes dans l’urothélium vésical natif par transduction médiée par adénovirus

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64584
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Des méthodes sont décrites pour la génération de grandes quantités d’adénovirus recombinants, qui peuvent ensuite être utilisés pour transduire l’urothélium de rongeur natif permettant l’expression de transgènes ou la régulation négative de produits géniques endogènes.

Abstract

En plus de former une barrière à haute résistance, l’urothélium qui tapisse le bassinet du rein, les uretères, la vessie et l’urètre proximal est supposé détecter et transmettre des informations sur son environnement aux tissus sous-jacents, favorisant ainsi la fonction et le comportement de miction. La perturbation de la barrière urothéliale, ou de sa fonction sensorielle/transductrice, peut entraîner une maladie. L’étude de ces événements complexes est entravée par le manque de stratégies simples pour modifier l’expression des gènes et des protéines dans l’urothélium. Les méthodes décrites ici permettent aux chercheurs de générer de grandes quantités d’adénovirus à titre élevé, qui peuvent ensuite être utilisés pour transduire l’urothélium des rongeurs avec une grande efficacité et d’une manière relativement simple. Les ADNc et les petits ARN interférents peuvent être exprimés par transduction adénovirale, et l’impact de l’expression transgénique sur la fonction urothéliale peut être évalué 12 h à plusieurs jours plus tard. Ces méthodes ont une large applicabilité aux études de biologie urothéliale normale et anormale utilisant des modèles animaux de souris ou de rats.

Introduction

L’urothélium est l’épithélium spécialisé qui tapisse le bassinet du rein, les uretères, la vessie et l’urètre proximal1. Il comprend trois strates : une couche de cellules parapluies hautement différenciées et polarisées, souvent binucléées, dont les surfaces apicales baignent dans l’urine ; une couche cellulaire intermédiaire avec une population de cellules binucléées amplifiant le transit qui peut donner naissance à des cellules parapluies superficielles en réponse à leur perte aiguë; et une seule couche de cellules basales, dont un sous-ensemble fonctionne comme des cellules souches qui peuvent régénérer la totalité de l’urothélium en réponse à une lésion chronique. Les cellules parapluies sont principalement responsables de la formation de la barrière urothéliale à haute résistance, dont les composants comprennent une membrane apicale (riche en cholestérol et en cérébrosides) avec une faible perméabilité à l’eau et aux solutés, et un complexe jonctionnel apical à haute résistance (composé de jonctions serrées, de jonctions adhérentes, de desmosomes et d’un cycle actomyosine associé)1 . La surface apicale de la cellule parapluie et son anneau jonctionnel se dilatent pendant le remplissage de la vessie et reviennent rapidement à leur état pré-rempli après l’évacuation de 1,2,3,4,5. En plus de son rôle dans la fonction de barrière, on suppose également que l’urothélium a des fonctions sensorielles et transductrices qui lui permettent de détecter les changements dans le milieu extracellulaire (p. ex. étirement) et de transmettre cette information par la libération de médiateurs (y compris l’ATP, l’adénosine et l’acétylcholine) aux tissus sous-jacents, y compris les processus nerveux afférents sous-urothéliaux 6,7,8 . Des preuves récentes de ce rôle sont trouvées chez les souris dépourvues d’expression urothéliale de Piezo1 et Piezo2, ce qui entraîne une altération de la fonction de miction9. De plus, les rats surexprimant la protéine CLDN2 formant des pores à jonction serrée dans la couche cellulaire parapluie développent une inflammation et une douleur analogues à celles observées chez les patients atteints de cystite interstitielle10. On suppose que la perturbation de la fonction sensorielle/transductrice urothéliale ou de la barrière peut contribuer à plusieurs troubles de la vessie 6,11.

Une meilleure compréhension de la biologie de l’urothélium dans les états normaux et pathologiques dépend de la disponibilité d’outils qui permettront aux chercheurs de réguler facilement à la baisse l’expression des gènes endogènes ou de permettre l’expression des transgènes dans le tissu natif. Alors qu’une approche pour réguler à la baisse l’expression des gènes consiste à générer des souris knockout urothéliales conditionnelles, cette approche dépend de la disponibilité de souris avec des allèles floxés, nécessite beaucoup de travail et peut prendre des mois ou des années pour compléter12. Il n’est donc pas surprenant que les chercheurs aient mis au point des techniques pour transfecter ou transduire l’urothélium, ce qui peut conduire à des résultats sur une échelle de temps plus courte. Les méthodes publiées pour la transfection comprennent l’utilisation de lipides cationiques13, d’oligodésoxynucléotides phosphorothioés antisens14 ou d’acides nucléiques antisens attachés à la protéine TAT du VIH pénétrant le peptide11-mère 15. Cependant, ce protocole met l’accent sur l’utilisation de la transduction médiée par l’adénoviral, une méthodologie bien étudiée qui est efficace pour la livraison de gènes à un large éventail de cellules, qui a été testée dans de nombreux essais cliniques et, plus récemment, a été utilisée pour administrer l’ADNc codant pour la protéine de capside COVID-19 aux receveurs d’une variante du vaccin COVID-1916, 17. Pour une description plus complète du cycle de vie de l’adénovirus, des vecteurs adénoviraux et des applications cliniques des adénovirus, le lecteur est invité à consulter la référence17.

Une étape importante dans l’utilisation des adénovirus pour transduire l’urothélium a été un rapport de Ramesh et al. qui a montré de courts prétraitements avec des détergents, y compris le N-dodécyl-β-D-maltoside (DDM) considérablement amélioré la transduction de l’urothélium par un adénovirus codant β-galactosidase18. En utilisant cette étude de preuve de principe comme guide, la transduction médiée par adénoviral de l’urothélium a maintenant été utilisée pour exprimer une variété de protéines, y compris les GTPases de la famille Rab, les facteurs d’échange guanine-nucléotide, les fragments moteurs de myosine, les claudines associées à la jonction serrée formant des pores et ADAM17 10,19,20,21,22 . La même approche a été adaptée pour exprimer de petits ARN interférents (siRNA), dont les effets ont été sauvés par la co-expression de variantes résistantes au siRNA du transgène22. Le protocole décrit ici comprend des méthodes générales pour générer de grandes quantités d’adénovirus hautement concentrés, une exigence pour ces techniques, ainsi que des adaptations des méthodes de Ramesh et al.18 pour exprimer les transgènes dans l’urothélium avec une grande efficacité.

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Protocol

Les expériences impliquant la génération d’adénovirus, qui nécessite une certification BSL2, ont été réalisées avec l’approbation des bureaux de santé et de sécurité environnementales de l’Université de Pittsburgh et du comité institutionnel de biosécurité. Toutes les expériences sur les animaux effectuées, y compris la transduction adénovirale (qui nécessite une certification ABSL2), ont été effectuées conformément aux directives / règlements pertinents de la politique du service de santé publique sur les soins et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire et de la loi sur le bien-être des animaux, et sous l’approbation du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh. Des gants, une protection oculaire et une tenue appropriée sont portés pour toutes les procédures impliquant des virus recombinants. Tout déchet liquide ou solide doit être éliminé comme décrit ci-dessous. La litière des animaux après la transduction, et toute carcasse d’animaux qui en résulte, doivent être traitées comme des matières biologiques dangereuses et éliminées conformément aux politiques de l’établissement.

1. Préparation des stocks d’adénovirus à titre élevé

NOTE: La transduction efficace des vessies de rongeurs dépend de l’utilisation de souches virales purifiées et concentrées, généralement 1 x 107 à 1 x 108 particules virales infectieuses (IVP) par μL. Cette partie du protocole est axée sur la génération de stocks d’adénovirus à titre élevé à partir de préparations virales existantes. Toutes les étapes doivent être effectuées dans une hotte de culture cellulaire à l’aide de réactifs et d’outils stériles. Alors que les souches disponibles d’adénovirus utilisées aujourd’hui sont défectueuses de réplication, la plupart des institutions exigent une approbation pour utiliser des adénovirus et de l’ADN recombinant. Cela comprend souvent la désignation d’une salle de culture cellulaire en tant qu’installation approuvée par BSL2 pour produire et amplifier les adénovirus. Certaines considérations générales comprennent l’utilisation de masques, de protections oculaires, de gants et de vêtements appropriés à toutes les étapes de la production et de la purification du virus. Lors de la centrifugation, les capuchons de sécurité sont recommandés si les tubes de centrifugation manquent de bouchons étanches. Tous les matériaux non jetables, y compris les bouchons de sécurité des centrifugeuses, les bouteilles et les rotors potentiellement contaminés, sont traités avec une solution antivirale (voir le tableau des matériaux), puis rincés à l’eau ou à l’éthanol à 70 %. Les déchets liquides sont traités en ajoutant de l’eau de Javel à une concentration finale de 10 % (v/v). L’élimination de ces déchets liquides dépendra des politiques institutionnelles. Les déchets solides sont généralement éliminés dans des déchets biologiques dangereux.

  1. Culture de cellules HEK293T
    1. Décongeler un flacon congelé de cellules HEK293T dans un bain-marie à 37 °C et utiliser une pipette de 5 ml pour transférer les cellules dans une boîte de culture cellulaire de 15 cm de diamètre. À l’aide d’une pipette de 25 mL, ajouter lentement 20 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin et d’antibiotique pénicilline/streptomycine (DMEM-FBS-PS) dans la boîte. Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C gazé avec 5% (v/v) de CO2 jusqu’à ce qu’elles atteignent 80%-90% de confluence (~2 x 107 cellules).
    2. À l’aide d’une pipette en verre fixée à une source sous vide, aspirer le milieu, puis rincer les cellules en transférant 20 mL de PBS stérile (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO 4, 136,9 mM NaCl et 8,9 mM Na2HPO4) dans la boîte à l’aide d’une pipette de 25 mL. Aspirer le PBS usé, puis utiliser une pipette de 5 mL pour transférer 3 mL de solution tiède (37 °C) de protéinase (voir le tableau des matières) dans la boîte, en incubant la capsule dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que les cellules se détachent (~3-4 min).
      REMARQUE: Une protéolyse efficace peut être mieux évaluée en inclinant lentement la boîte d’avant en arrière à la recherche de la libération des cellules de toutes les parties de la boîte dans le liquide en mouvement. Les cellules HEK293T sont sensibles au traitement prolongé par la protéinase et mourront si elles sont laissées plus de quelques minutes dans une solution de protéinase.
    3. Utilisez une pipette de 10 mL pour transférer 7 mL de DMEM-FBS-PS dans la boîte des cellules détachées, puis utilisez la même pipette pour aspirer les cellules et le milieu. Transférer les cellules en suspension dans un tube conique de 50 mL, puis granuler les cellules en centrifugeant la suspension dans une centrifugeuse clinique à basse vitesse à 200 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette en verre fixée à une source de vide. Utilisez une pipette de 25 mL pour remettre en suspension la pastille de cellule dans 15 mL de DMEM-FBS-PS.
    4. Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire à chacune des quinze boîtes de 15 cm contenant 19 mL de DMEM-FBS-PS.
    5. Cultiver les cellules dans un incubateur de culture tissulaire jusqu’à ce qu’elles atteignent 85% à 90% de confluence (~3-4 jours).
  2. Préparer une solution virale diluée
    1. Ajouter ~1,5 x 10 9 à 3 x 109 IVP d’un stock de virus existant (5-10 IVP/cellule) dans un tube conique de 50 mL rempli de 45 mL de DMEM sans FBS ou antibiotiques.
      REMARQUE: Il est possible d’utiliser une concentration plus faible du virus (1-5 IVP / cellule); Cependant, il faudra plus de temps pour que la production de virus s’ensuive.
  3. Infectez les cellules cultivées avec le virus.
    1. À l’aide d’une pipette en verre fixée à une source de vide, aspirer le milieu des cellules presque confluentes à l’étape 1.1.5.
    2. Utiliser une pipette de 25 mL pour transférer 3,0 mL de solution virale diluée (préparée à l’étape 1.2.1) dans chaque boîte de culture cellulaire. Ensuite, utilisez une pipette de 10 mL pour ajouter 7,0 mL de milieu DMEM (sans FBS ou antibiotiques) à chaque boîte. Incuber pendant 60 minutes dans un incubateur de culture cellulaire, puis ajouter 10 ml de DMEM contenant 20% (v/v) FBS et 2x PS à chaque boîte.
      REMARQUE: L’utilisation de l’une des 15 boîtes comme plaque de contrôle (dans laquelle le virus n’est pas ajouté) facilite l’identification de l’arrondi cellulaire induit par le virus et de la mort dans les cellules infectées à l’étape suivante.
    3. Incuber les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 2 à 4 jours jusqu’à ce que la majorité d’entre elles commencent à s’arrondir et que >60% des cellules se soient détachées.
      REMARQUE: Si vous utilisez un titre inférieur du virus, la mort cellulaire peut prendre jusqu’à une semaine. Si la mort cellulaire ne se produit pas dans la semaine, il est probable que le processus devra être répété en utilisant un titre plus élevé du virus.
  4. Récupérer le virus des lysats cellulaires
    1. Utilisez un grattoir de cellules pour gratter le fond de chaque boîte, libérant les cellules attachées dans le milieu.
    2. À l’aide d’une pipette de 25 mL, recueillir et regrouper le milieu, les cellules et les débris cellulaires de chaque boîte de culture cellulaire dans un tube de culture cellulaire conique de 50 mL.
      REMARQUE: Pour économiser des ressources, le milieu de deux boîtes peut être combiné en un tube de 50 mL.
    3. Ensemencer le matériau cellulaire par centrifugation à l’aide d’une centrifugeuse de table à basse vitesse : 5 min à température ambiante à 3 000 x g. Utilisez une pipette en verre fixée à un dispositif à vide pour aspirer le surnageant.
    4. Utiliser une pipette de 10 mL, combinée à une trituration, pour regrouper toute la matière granulée obtenue dans un total de 7 mL de Tris-HCl 100 mM de pH 7,4 filtré stérile contenant 10 mM d’EDTA (solution de Tris-EDTA). Transférer le matériel mis en commun dans un tube conique de culture cellulaire stérile de 15 ml et le placer sur de la glace.
      REMARQUE: À ce stade, la préparation du virus peut être congelée à -80 ° C indéfiniment.
  5. Préparer des lysats cellulaires
    1. Effectuer trois cycles de gel-décongélation pour perturber les cellules restantes et ainsi libérer davantage les particules virales formées. Congeler le matériau mélangé à l’étape 1.4.4 en immergeant le tube dans de l’azote liquide (~30-60 s). Décongeler rapidement l’échantillon en plaçant le tube dans un incubateur à 37 °C. Tourbillonner l’échantillon pendant 15 s, puis répéter la procédure de congélation et de décongélation rapides 2x supplémentaires.
      REMARQUE: La solution virale peut être rapidement décongelée à 37 ° C dans un bain-marie, mais la prudence est de mise car les variations de température peuvent provoquer la fissuration du tube, libérant la solution virale dans le bain-marie. Pour éviter que cela ne se produise, placez le tube contenant le surnageant viral dans un tube plus grand, qui est ensuite placé dans le bain-marie.
    2. Utilisez une pipette de 10 ml pour transférer le matériau cellulaire congelé trois fois dans un tube centrifuge ultrarapide. Centrifuger le matériau dans le tube pendant 30 min à 4 °C à une centrifugeuse à 4 °C à ~18 500 x g.
    3. Récupérez le surnageant riche en virus ~7 mL à l’aide d’une pipette de 10 mL et transférez-le dans un tube conique de 15 mL. Conservez l’échantillon sur la glace jusqu’à l’étape suivante.
      REMARQUE : À ce stade, envisagez de conserver une partie aliquote du surnageant viral non purifié comme préambule pour commencer une nouvelle préparation virale (ou comme sauvegarde). Conserver cette partie aliquote à -80 °C.
  6. Isoler et purifier le virus par centrifugation à gradient de densité.
    1. Préparer un gradient discontinu de CsCl dans un tube à ultracentrifugation transparent à paroi mince PET de 12 ml (voir le tableau des matières) ou l’équivalent. Utilisez une seringue de 3 mL munie d’une aiguille de 18 G pour introduire délicatement 2,5 mL de solution de CsCl à 1,4 g/mL dans le fond du tube, puis utilisez une nouvelle seringue/aiguille pour la superposer avec 2,5 mL de solution de CsCl à 1,25 g/mL.
      REMARQUE: Laisser tomber des solutions directement sur une couche préexistante entraînera un mélange important et indésirable. Au lieu de cela, placez la partie biseautée de l’aiguille contre le bord du tube, puis appuyez très lentement sur le piston de la seringue, en augmentant la position de l’aiguille lorsque la solution remplit le tube.
    2. Chargez les ~7 mL de surnageant viral sur le dessus du gradient de la même manière à l’aide d’une seringue de 10 mL. S’il y a plus de 2-3 mm d’espace entre le surnageant viral et le haut du tube, ajouter une solution supplémentaire de Tris-EDTA pour remplir le tube jusqu’à ce qu’il ne reste que 2-3 mm d’espace.
    3. Faire un tube d’équilibre préparé de la même manière, contenant des couches de CsCl, mais remplaçant le surnageant viral par une solution de Tris-EDTA.
      NOTE: Les deux tubes doivent avoir des poids identiques (et des densités similaires) pour éviter une situation de charge déséquilibrée potentiellement dangereuse dans l’ultracentrifugeuse.
  7. Isoler le virus à l’aide de l’ultracentrifugation à débit.
    1. Chargez les gradients formés aux étapes 1.6.2-1.6.3 dans les godets d’un rotor SW41 ou équivalent. Vissez les bouchons de godet, placez le rotor dans une ultracentrifugeuse (prérefroidi à 4 °C) et centrifugez pendant 1 h à ~150 000 x g.
    2. Pendant la centrifugation, équilibrer la colonne décrite à l’étape 1.9.1 ci-dessous.
  8. Récupérer des particules virales isolées
    1. À la fin de l’étape de centrifugation, détachez soigneusement les godets du rotor et, dans une hotte de culture cellulaire, retirez les bouchons du godet, puis retirez les tubes et placez-les dans une grille.
    2. Recueillir le matériau à bandes, riche en particules virales, qui flotte à l’interface entre la solution de CsCl à 1,25 g/mL et 1,4 g/mL. En tenant le tube contenant le gradient sur la moitié inférieure d’une boîte de culture cellulaire (qui attrapera les matières renversées), utilisez une aiguille de 1 pouce de 18 G fixée à une seringue de 3 ml pour percer soigneusement le tube, juste en dessous du virus à bandes. Aspirez lentement le virus, qui est généralement récupéré dans ~ 1 mL.
    3. Retirez l’aiguille du tube, ce qui aura pour conséquence que le matériau restant dans le gradient s’écoulera du tube dans la moitié inférieure de la boîte de culture cellulaire (tout liquide doit être traité comme un déchet dangereux).
    4. Transférer la solution virale dans la seringue dans un tube microcentrifuge stérile sur de la glace.
      REMARQUE: Lors de la récupération du virus à cette étape, placez l’aiguille de manière à ce que la lumière de l’aiguille soit orientée vers le haut avec l’aiguille s’ouvrant quelques mm en dessous de la bande riche en virus. Éviter la contamination par la fine bande de virus mal assemblés qui est parfois observée à 2-3 mm au-dessus du virus à bandes (voir la fine flèche noire à la figure 1A).
  9. Retirer CsCl de l’échantillon par filtration sur gel.
    1. Équilibrer une colonne-10 (préemballée avec Sephadex G-25M), fixée à un support de support, avec 50 mL de PBS filtré stérile de 0,2 μm contenant 10% (v/v) de glycérol.
      NOTE: L’étape d’équilibrage initiale prend 2-3 heures et est nécessaire pour assurer le lavage complet des agents de conservation utilisés par le fabricant pour stabiliser la colonne.
    2. Laisser la solution de lavage reculer sous la fritte (un disque protecteur de matériau blanc au sommet du milieu de la colonne), puis transférer délicatement la solution virale purifiée recueillie à l’étape 1.8 vers le haut de la colonne. Laissez la solution riche en virus reculer sous la fritte, puis commencez à remplir la colonne de PBS-glycérol.
      REMARQUE: Une fonction de la fritte est d’empêcher la colonne de s’assécher. En conséquence, de courts délais sont tolérés avant que plus d’éluant ne soit ajouté à la colonne.
    3. Recueillir l’éluat dans 12 tubes microcentrifugés stériles, 0,5 mL par fraction.
  10. Déterminez le rendement viral.
    1. Déterminer les fractions virales maximales à l’aide de la spectrophotométrie. Préparer une dilution de 1:100 de chaque fraction dans du PBS et mesurer les DO260 dans un spectrophotomètre, en utilisant une dilution de 1:100 du tampon seul comme blanc. Les particules virales doivent éluer dans le volume vide, en commençant par la fraction 6. Regrouper les fractions contenant les lectures de DO260 les plus élevées.
    2. Effectuer une dilution de 1:100 des fractions virales regroupées et remesurer la DO260. Calculer la concentration finale de particules virales et le nombre de PIV dans les fractions regroupées à l’aide de la formule suivante: Particules virales par mL = DO260 × 100 (ceci corrige le facteur de dilution) × 1012. Une estimation générale est que 1% des particules virales sont IVP, en tant que telles: IVP/mL = DO 260 × 100 × 1010 ou IVP/μL = DO260 × 100 ×10 7.
  11. Aliquote les fractions virales regroupées (contenant 5 x 107 à 1 x 108 IVP) dans des tubes de microcentrifugation stériles ou des cryovials. Conserver les échantillons à -80 °C.

2. Transduction de la vessie de rongeur

NOTE: Si cette technique est nouvelle à la fois, il est recommandé de limiter le nombre d’animaux transduits en même temps à 2-4. Cela peut être accompli en échelonnant les heures de début pour chaque animal, en particulier pendant le traitement aux détergents à l’étape 2.2, puis l’incubation du virus à l’étape 2.3. Les enquêteurs expérimentés peuvent transduire jusqu’à six animaux à la fois.

  1. Cathétériser la vessie
    1. Anesthésiez les souris femelles C57Bl/6J (généralement âgées de 8 à 10 semaines, ~20 à 25 g) ou les rats Sprague Dawley femelles (généralement âgés de 2 à 3 mois, ~250 g) à l’aide d’un vaporisateur muni d’un cône nasal. Calibrer le vaporisateur pour produire 3,0 % (v/v) d’isoflurane, 97 % (v/v) O 2 pour les souris ou 4,0 % (v/v) d’isoflurane, 96 % (v/v) O2 pour les rats. Confirmez que les animaux sont anesthésiés en s’assurant qu’ils ne répondent pas au pincement des orteils (généralement après 1 à 2 minutes).
    2. Maintenez la température corporelle de l’animal en plaçant les animaux sur un coussin chauffant. Surveillez l’animal tout au long du protocole de transduction pour vous assurer qu’il est anesthésié et qu’il ne ressent aucune douleur pendant cette procédure.
    3. Réduire l’isoflurane à 1,5 % (v/v) pour les souris ou à 2,0 % (v/v) pour les rats et maintenir les animaux sous anesthésie pendant toute la durée du protocole.
    4. Pour éviter d’introduire de l’air dans la vessie, remplissez la partie du cathéter en plastique d’un cathéter IV (voir le tableau des matériaux) et le moyeu associé avec du PBS stérile à l’aide d’une pipette de transfert.
    5. Avec l’animal en décubitus dorsal, écouvillonner le méat externe avec de l’alcool à 70% et insérer le cathéter stérile dans le méat externe, puis dans l’urètre, puis dans la vessie.
      1. Pour effectuer cette tâche, utilisez une pince fine pour saisir doucement le tissu formant le méat externe et l’étendre verticalement, loin de l’animal. En utilisant l’autre main, insérez soigneusement le cathéter verticalement d’environ 3-4 mm dans le méat urétral (un monticule de chair juste au-dessus de l’ouverture du vagin). Ensuite, en raison d’une courbure de l’urètre, abaissez le cathéter, inséré dans le méat externe, vers la queue de l’animal, ce qui facilite son entrée dans la partie de l’urètre qui passe sous l’os pubien, et finalement dans la vessie.
        . REMARQUE: Surtout dans le cas de la souris, le cathéter peut être trop long et pas plus de 1,0 à 1,1 cm de celui-ci doit être inséré dans l’animal. Sinon, des dommages à la muqueuse de la vessie s’ensuivront. Pour éviter cela, marquez le cathéter ~1 cm sous son extrémité, puis n’insérez pas le cathéter au-delà de ce marquage.
    6. Laissez l’urine dans la vessie s’écouler. Enlevez toute urine résiduelle en effectuant la manœuvre de Credé: masser et appuyer doucement sur la bosse de la vessie dans la région abdominale inférieure.
  2. Rendre l’urothélium réceptif à la transduction en le traitant avec une solution détergente.
    1. Lavez la vessie de souris ou de rat en attachant une seringue stérile de 1 mL remplie de PBS au moyeu du cathéter. Injectez 100 μL de PBS stérile dans la vessie de souris (ou 450 μL dans le cas de la vessie de rat). Détachez la seringue de l’ajustement du cathéter et laissez le PBS s’égoutter. Si nécessaire, effectuez la manœuvre de Crede pour éliminer l’excès de liquide vésical.
    2. Instiller 100 μL de N-dodécyl-β-D-maltoside (DDM) à 0,1 % (p/v) (dissous dans du PBS et stérilisé par filtre à 0,2 μm) dans la vessie de souris à l’aide d’une seringue stérile de 1 mL. Retenir le DDM dans la vessie pendant 10 min en laissant la seringue en place. Chez le rat, le volume de DDM est augmenté à 450 μL.
    3. Retirez le DDM de la vessie en détachant la seringue et en la laissant s’écouler. Effectuez la manœuvre de Crede si nécessaire.
  3. Introduisez le virus dans la vessie.
    1. Fixer une seringue stérile de 1 mL au moyeu du cathéter et instiller 0,5 x 107 à 1 x 108 IVP d’adénovirus (préparé à l’étape 1), dilué dans 100 μL de PBS stérile pour les souris ou 450 μL pour les rats, dans la vessie. Laissez la seringue attachée au cathéter pour empêcher la solution virale de s’échapper.
    2. Après 30 min, détachez la seringue et laissez la solution virale évacuer la vessie sur une serviette jetable. Épongez toute solution virale résiduelle avec une lingette absorbante, jetez le tampon et essuyez les déchets biologiques dangereux.
      REMARQUE: Le glycérol est cytotoxique. En tant que tel, le volume maximal de solution virale instillée chez la souris est limité à 5 μL (qui, une fois dilué dans 100 μL de PBS, entraînerait une concentration finale de glycérol de ~0,5% [v / v]). De plus, il est possible d’améliorer l’efficacité de la transduction en augmentant le nombre de PIV instillées et en prolongeant l’incubation du virus à 45 min.
    3. Étape facultative : La vessie peut être rincée avec du PBS comme décrit à l’étape 2.2.1 ci-dessus; toutefois, cela n’est pas obligatoire.
  4. Laissez l’animal récupérer.
    1. Cesser l’écoulement de l’isoflurane et permettre à l’animal de récupérer et d’être complètement mobile avant de le remettre dans sa cage, en particulier si les animaux sont logés en groupe.
      REMARQUE: Comme la transduction virale en soi ne provoque pas de symptômes ou de douleurs observables des voies urinaires inférieures, il n’est généralement pas nécessaire de traiter après une intervention chirurgicale. Toutefois, si le transgène codé est toxique, une analgésie postopératoire ou des antibiotiques peuvent être nécessaires selon les exigences de l’établissement.
  5. Analyser les effets de l’expression transgénique 12-72 h après le traitement en utilisant des méthodes telles que l’hybridation in situ de l’ARNm, le transfert Western ou l’immunofluorescence 9,10,23 (voir les résultats représentatifs).

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Representative Results

Préparation du virus
Un exemple de purification virale par centrifugation à gradient de densité est présenté à la figure 1A. La bande rose clair, située à l’interface du matériel cellulaire chargé et de la couche de CsCl de 1,25 g/mL, est principalement composée de cellules perturbées et de leurs débris (voir la flèche magenta à la figure 1A). Il tire sa couleur rosâtre de la petite quantité de milieu de culture qui est reprise de l’étape 1.5 du protocole. Les particules virales d’intérêt, qui apparaissent sous la forme d’une bande blanche laiteuse, se trouvent à l’interface des solutions de CsCl à 1,25 g/mL et de CsCl à 1,40 g/mL (voir flèche jaune sur la figure 1A). On peut également observer une bande de matériau qui flotte de 2 à 3 mm au-dessus des particules virales enrichies (voir fine flèche noire sur la figure 1A). Il comprend des virus et des débris non assemblés, contient peu de PIV et doit être évité lors du prélèvement de l’échantillon de virus.

La figure 1B illustre une purification plus poussée du virus et de l’échange tampon à l’aide d’une colonne PD10, et les lectures de DO260 des fractions résultantes après élution sont indiquées à la figure 1C. Le volume vide de ces colonnes est d’environ 3 mL, et donc le virus commence à apparaître dans la fraction 6 et culmine dans la fraction 9. Dans cette expérience, les fractions 6-9 ont été regroupées. Bien que les fractions 6 et 7 soient relativement faibles en particules virales, elles contiennent suffisamment de virus pour mériter une récupération, et elles servent à diluer les fractions de titre très élevées à une concentration plus raisonnable. Les fractions 10-12 n’ont pas été incluses car l’augmentation de la DO260 dans la fraction 11 indique la présence possible d’un deuxième pic de contamination, ce qui est observé de manière variable dans ces préparations. La fraction combinée aura généralement 1 x 107 à 1 x 108 IVP/μL, et le rendement attendu serait de l’ordre de 1 x 10 10 à 2 x10 11 IVP totale. C’est une quantité suffisante de virus pour effectuer des centaines de transductions. Bien qu’il soit possible de titrer le virus par dosage de la plaque ou par comptage de colonies de cellules exprimant des protéines fluorescentes22, la règle du 1 % est suffisante dans la plupart des cas. Cette règle stipule que 1% des particules virales purifiées, estimées en mesurant les DO260 de l’échantillon, sont des PIV. Les aliquotes du virus stockées à -80 °C ont une durée de conservation de 2 à 5 ans, bien que l’infectiosité diminue à long terme. Les parties aliquotes décongelées du virus peuvent être recongelées à -80 °C une fois sans perte significative d’infectiosité. Cependant, la décongélation et la congélation répétées ont un impact négatif sur l’infectiosité virale.

Transduction de la vessie
Une première étape importante lors de l’évaluation de l’impact de la transduction consiste à confirmer l’expression du transgène. Cela peut être évalué à l’aide de plusieurs techniques, y compris des outils qui détectent l’ARNm (p. ex., RNAScope), l’analyse par transfert Western ou l’utilisation de l’immunofluorescence 9,10,23. La figure 2 est un exemple d’urothélium de souris qui a été transduit avec un adénovirus codant pour l’hormone de croissance humaine marquée à l’épitope V5 (V5-hGH)23. Cette protéine est emballée dans des vésicules discoïdales / fusiformes et peut être exocytée pendant le remplissage de la vessie19,23. L’analyse par transfert Western des lysats urothéliaux a révélé l’expression de V5-hGH dans l’urothélium des vessies transduites, mais pas dans les vessies non transduites (Figure 2A). L’expression a également été confirmée par immunofluorescence, dans ce cas en utilisant des anticorps qui ont reconnu l’hGH ou le marqueur d’épitope V5 (les vessies non transduites manquaient de signal, non représenté) (Figure 2B).

Un autre exemple est la transduction de la vessie de rat avec un virus codant pour CLDN2, une protéine 24,25 associée à la jonction serréeformant des pores. CLDN2 augmente le flux paracellulaire de cations (y compris K+) et sa surexpression entraîne une inflammation et le développement de douleurs viscérales10. L’analyse par transfert Western a confirmé l’expression de CLND2 dans les vessies de rats transduites avec l’adénovirus codant pour Cldn2, mais pas dans celles transduites avec un virus témoin codant pour la GFP (figure 2C). En général, la GFP n’est pas considérée comme toxique lorsqu’elle est exprimée dans les cellules et sert donc de contrôle utile. L’utilisation de la GFP permet également à l’investigateur de confirmer que la transduction fonctionne. L’analyse par immunofluorescence a confirmé l’expression exogène de CLDN2 dans les cellules parapluies urothéliales transduites avec le virus codant pour l’ADNc Cldn2 (signal rouge sur la figure 2D). De plus, comme pour le CLDN2 endogène (non illustré), le CLDN2 exprimé est localisé aux jonctions serrées marquées par TJP1, ainsi qu’aux surfaces basolatérales des cellules parapluies (CLDN2 est marqué en vert dans la figure 2E)10. Dans le cas de l’expression CLDN2, elle était la plus élevée un jour après la transduction, mais elle s’est ensuite estompée et était à peine détectable après 15 jours.

Une deuxième considération est de savoir quels types de cellules seront ciblés par la transduction adénovirale. Alors que chez le rat, il est possible de transduire principalement la couche de cellules parapluie19, chez la souris, toutes les couches de l’urothélium peuvent être transduites, bien que la transduction des couches cellulaires intermédiaires et basales puisse être variable. Fait important, dans l’ensemble de la paroi de la vessie, seul l’urothélium est transduit et aucun autre tissu n’est ciblé par l’adénovirus instillé (Figure 3).

Alors que les analyses des cellules transduites peuvent être effectuées au niveau de la cellule unique, lors de l’exploration d’un phénotype global de la vessie, il faut transduire la majorité des cellules urothéliales. Il est donc important de définir l’efficacité de la transduction (c’est-à-dire quelle fraction des cellules urothéliales est transduite). Par exemple, dans le cas de l’adénovirus exprimant Cldn2, >95% des cellules parapluies ont été transduites (voir Figure 2D). Un autre exemple est le champ d’image illustré à la figure 3, où le comptage du nombre de cellules parapluies transduites (dans ce cas, exprimant le capteur Ca2+ GCAMP5G), révèle une efficacité qui approche les 95%. Cependant, il faut examiner les cellules dans des champs aléatoires prélevés dans toute la paroi de la vessie pour obtenir une estimation précise et impartiale de l’efficacité de la transduction.

Figure 1
Figure 1 : Purification de l’adénovirus. (A) Les particules d’adénovirus produites par les cellules HEK293T infectées ont été purifiées par centrifugation sur un gradient discontinu de CsCl composé d’une couche de CsCl de 1,4 g/mL, d’une couche de CsCl de 1,25 g/mL et d’une couche d’échantillon (S) diluée dans une solution de Tris-EDTA. Le matériel cellulaire (flèche rose) s’accumule à l’interface S/1.25, tandis que l’adénovirus purifié flotte à l’interface 1.25/1.4 (flèche jaune). Une petite bande de virus mal assemblés flotte au-dessus de ce dernier (fine flèche noire). (B) La bande riche en adénovirus dans le gradient est récupérée à l’aide d’une aiguille, et la CsCl est éliminée de l’adénovirus par filtration sur gel à l’aide d’une colonne PD10 remplie de Sephadex G25 équilibrée avec du PBS contenant 10,0% (v/v) de glycérol. La surface du Sephadex est protégée par une fritte poreuse en plastique. (C) Des fractions, 0,5 mL, ont été recueillies dans la colonne PD10. Les OD260 des fractions ont été mesurées dans un spectrophotomètre et les valeurs ont été tracées. Les fractions riches en virus éluent dans le volume vide, qui commence à la fraction 6 et s’étend à la fraction 9. Les fractions regroupées pour cette expérience représentative sont ombrées en bleu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Transduction de l’urothélium vésical de rongeurs avec des adénovirus codant pour V5-hGH ou CLDN2. (A) L’urothélium de souris a été laissé non transduit (UT) ou transduit avec des adénovirus codant pour l’épitope V5 marqué hormone de croissance humaine (hGH). Après 24 h, les vessies ont été récupérées, des lysats urothéliaux ont été préparés et soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium, et l’expression de V5-hGH a été confirmée à l’aide de Western blots sondés avec un anticorps contre hGH. (B) Détection de V5-hGH chez l’urothélium de souris sectionné et coloré à l’aide d’anticorps dirigés contre l’hGH (vert) ou l’épitope V5 (rouge) et d’anticorps secondaires marqués au fluorophore. L’immunofluorescence a été capturée par microscopie confocale. Les échantillons ont été contre-colorés avec TO-PRO3 pour marquer les noyaux. (C-F) L’urothélium de rat a été transduit avec un virus codant pour le rat CLDN2 (nom commun claudin-2) ou GFP (nom commun protéine fluorescente verte) comme témoin. (C) Détection de CLDN2 exogène par transfert Western à l’aide d’un anticorps à nouveau CLDN2. Notez que le CLDN2 endogène est exprimé à de faibles niveaux et n’est pas détecté dans cette expérience. (D) La transduction de la couche de cellules parapluies est révélée par immunofluorescence et microscopie confocale. Les frontières de la cellule sont révélées en cocolorant le tissu avec FITC-phalloïdine, qui marque le cytosquelette d’actine corticale. (E) Détection des CLDN2 et TJP1 exogènes (nom commun ZO1) par immunofluorescence et microscopie confocale de l’urothélium monté ou en coupe transversale. De petites flèches blanches indiquent l’emplacement de la jonction serrée et de petites pointes de flèches magenta marquent l’emplacement des accumulations intracellulaires de CLDN2 dans le cytoplasme cellulaire. Ceux-ci se sont révélés être CLDN210 associés à Golgi. (F) Après la transduction, les animaux ont été euthanasiés les jours indiqués après l’infection. L’expression exogène de CLDN2 a été détectée par transfert Western. Les animaux exprimant une GFP ont été euthanasiés après le jour 1. Les données de la figure 2C-E ont été modifiées à partir de Montalbetti et al.10 et sont reproduites avec la permission de l’American Physiological Society. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Efficacité de la transduction adénovirale. L’urothélium de la vessie de souris a été transduit avec un adénovirus codant pour le capteur de calcium GCaMP5G. Les panneaux supérieurs montrent une coloration pour GCaMP5G (détectée à l’aide d’un anticorps contre la protéine fluorescente verte; GFP, vert), les panneaux du milieu montrent la distribution des noyaux colorés DAPI (bleu) et de l’actine marquée à la rhodamine-phalloïdine (rouge), et les panneaux inférieurs sont une fusion des trois signaux. Les pointes de flèches blanches dans le panneau inférieur sont les rares cellules parapluie qui ne sont pas transduites. L’efficacité globale de la transduction des cellules parapluies dans cette image est de ~95%. Notez que seul l’urothélium est transduit. Les régions encadrées sont agrandies dans les panneaux à droite. La région de l’encadré 1 comprend principalement des cellules parapluies transduites. La région de l’encadré 2 est l’urothélium montrant une transduction efficace des cellules parapluies, mais une transduction moins efficace des couches cellulaires sous-jacentes. LP = lamina propria; ME = musculeuse externe; Se = séreuse; Ut = urothélium. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal (voir le tableau des matériaux). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Alors que Ramesh et coll. se concentraient sur l’élaboration de stratégies pour utiliser la transduction adénovirale dans le traitement du cancer de la vessie 18, des rapports plus récents ont démontré l’utilité de ces techniques dans l’étude de la biologie, de la physiologie urothéliale normale et de la physiopathologie 10,18,19,20,21 . Les caractéristiques importantes de cette approche sont les suivantes : (i) Dans l’ensemble de la paroi vésicale du rongeur, seul l’urothélium est transduit 10,19,20,21,22. Dans le cas des rats, la transduction est principalement limitée à la couche de cellules parapluie, tandis que chez la souris, la totalité de l’urothélium peut être ciblée; (ii) Cette approche peut être utilisée pour exprimer des protéines ou des siRNAs 10,19,20,21,22; iii) L’efficacité de la transduction peut approcher 70 % à 95 % (voir par exemple la figure 3)18,20; (iv) Un jour après la transduction, l’ultrastructure de l’urothélium, l’intégrité du tissu, la présence d’une barrière de haute résistance (évaluée en mesurant la résistance trans-épithéliale) et l’expression des marqueurs de différenciation urothéliale sont « normales »10,19. Le seul effet morphologique noté jusqu’à présent est une diminution du diamètre des cellules parapluies (vu d’en haut); cependant, ils reviennent à leur taille normale après 3-4 jours10,19; v) L’urothélium peut être transduit avec jusqu’à trois adénovirus différents simultanément18; (vi) L’expression transgénique peut être modifiée en titrant le nombre de PIV, ce qui affecte la quantité d’expression protéique, en allongeant ou en raccourcissant le temps d’incubation avant que l’animal ne soit sacrifié, ou en utilisant différents promoteurs tels qu’un système régulé par le têt (tet-off)19. Dans ce dernier cas, on peut co-exprimer un virus codant pour le transactivateur/têt-répresseur, puis moduler l’expression du transgène en modifiant la concentration de doxycycline dans l’alimentation de l’animal.

Bien que le protocole global soit relativement simple, certaines étapes critiques doivent être prises en compte lors de la réalisation de ces expériences. L’un d’eux est la disponibilité de stocks de virus à titre élevé qui sont d’une pureté raisonnable. Les adénovirus peuvent être obtenus auprès de fournisseurs commerciaux, de noyaux de production de virus institutionnels, d’autres chercheurs, ou ils peuvent être produits à l’interne. Dans ce dernier cas, le système AdEasy du laboratoire Bert Vogelstein est recommandé car ses composants peuvent être achetés auprès d’Addgene, et les adénovirus générés à l’aide de cette approche fonctionnent bien dans la transduction urothéliale4. Cette technique permet de générer des adénovirus codant pour des ADNc aussi gros que 8 Kb en utilisant le plasmide d’emballage pAdEasy-1 (l’insert remplace les gènes viraux E1 et E3), les cellules bactériennes pAdEasy-1 (qui codent les gènes adénoviraux nécessaires à la production du virus) et la production d’adénovirus défectueux de réplication dans les cellules HEK293T (qui expriment la protéine virale E1 requise). Cependant, le remplacement du plasmide d’emballage pAdEasy-1 par le plasmide d’emballage pAdEasy-2 augmente la taille de l’emballage de 2,7 ko supplémentaires, mais nécessite l’utilisation d’une lignée cellulaire différente (cellules 911 rétiniennes embryonnaires humaines transformées en E1) car les virus manquent du gène précoce E4 en plus de E1 et E34. L’expression des siARN peut être réalisée à l’aide de plusieurs systèmes, y compris pAdloss, qui est décrit en détail dans Kasahara et al.26. Bien qu’il soit possible d’utiliser un milieu de culture cellulaire riche en virus pour transduire l’urothélium, cette méthode peut être peu fiable. Au lieu de cela, l’amplification virale à grande échelle, la purification du gradient CsCl, suivie de la filtration sur gel, constituent le moyen le plus fiable de générer de grandes quantités de virus à titre élevé. La stabilité relative du virus à -80 °C, associée à des rendements relativement importants de virus, en fait un moyen idéal d’avoir un stock constant de virus qui peut être utilisé sur un grand nombre d’expériences.

D’autres étapes critiques de ce protocole comprennent celles associées au protocole de transduction. Il s’agit notamment de l’utilisation de PBS (sans cations divalents) comme agent de lavage et diluant, et de l’utilisation de détergent DDM. Comme le complexe jonctionnel dépend de Ca2+ pour son bon fonctionnement, PBS favorise probablement l’entrée virale en perturbant la barrière associée à la jonction. La DDM est également essentielle; comme Ramesh et al. l’ont signalé, l’efficacité de la transduction de l’adénovirus est extrêmement faible en l’absence de traitement par détergent18. Cependant, le mode d’action du détergent n’est pas clair. Une incubation de 10 minutes avec DDM est idéale, mais elle peut être réduite à 5 min; Cependant, il n’est pas recommandé que l’incubation dure au-delà de 10 minutes, car le détergent peut causer des dommages inattendus aux tissus sous-jacents. La quantité de virus utilisée est un paramètre critique, des concentrations plus élevées conduisant généralement à de plus grandes quantités d’expression transgénique et à une plus grande efficacité de transduction. Cependant, la concentration optimale du virus qui donne la meilleure combinaison d’expression, d’efficacité et de phénotype doit être déterminée empiriquement. Comme concentration initiale, une plage de 5,0 x 106 à 2,0 x 107 IVP par animal est recommandée. Selon la protéine exprimée, il en résulte des rendements compris entre 70% et 95% 10,19,20,21,22; cependant, certaines constructions de GTPase dominante-négative sont moins efficaces (30%-50%) et nécessitent une approche d’analyse monocellulaire 4,20. Ces différences d’efficacité peuvent refléter le renouvellement du transgène, sa toxicité ou la pureté et le rendement du virus utilisé pour la transduction. Ce dernier peut être exclu en effectuant des tests de plaque. Bien qu’il ne soit pas hypercritique, le temps que le virus reste dans la vessie doit être suffisamment long pour que le virus puisse se fixer à son récepteur CXADR. Des temps inférieurs à 30 minutes peuvent réduire l’efficacité de la transduction, tandis que prolonger la période d’incubation à 45 minutes peut augmenter l’efficacité; Cependant, cela peut dépendre des transgènes. La dernière étape critique de ce protocole consiste à déterminer combien de temps l’animal sera détenu avant qu’un phénotype ne soit évalué. Les transgènes présentent l’expression la plus élevée après 1-2 jours19, mais l’expression peut diminuer après cela. Dans le cas des siRNA, cela dépend du taux de renouvellement de la protéine elle-même. Par exemple, lors de l’expression de siRNA qui ciblent l’expression de Rab11a, une GTPase de la famille Rab, une régulation négative efficace n’est observée que 72 h après la transduction23. Ainsi, les protéines à longue durée de vie (dont la demi-vie est mesurée en jours) peuvent ne pas être des cibles appropriées en utilisant cette approche.

L’enquêteur doit également être conscient des mises en garde associées à cette approche. Premièrement, son utilité peut être limitée aux rongeurs femelles en raison des difficultés à cathétériser les rongeurs mâles à travers leur pénis. Cependant, il peut être techniquement possible d’effectuer ce protocole chez les hommes en introduisant un cathéter dans le dôme de la vessie, similaire à la préparation employée lors de la réalisation de la cystométrie9. Cela permettrait d’introduire un détergent ou un virus et d’effectuer des lavages au besoin. Une deuxième mise en garde est que la surexpression des protéines peut épuiser les voies et les ressources cellulaires, ce qui peut conduire à des événements tels que l’agrégation des protéines, l’activation des voies de stress cellulaire et la mort27. Ainsi, il est généralement sage de limiter l’expression transgénique à des niveaux non toxiques (à moins bien sûr que ce ne soit l’intention de l’expression transgénique), comme évalué à l’aide de marqueurs de stress cellulaire et de mort cellulaire. Une troisième mise en garde est que dans certains contextes, l’expression à long terme de l’adénovirus peut déclencher des réponses immunitaires28. Bien qu’il n’y ait aucune preuve que la transduction adénovirale de l’urothélium en soi stimule les réponses immunitaires10, elle est transgénique-dépendante et, comme indiqué ci-dessus, la surexpression de CLDN2 conduit à la cystite.

Actuellement, les chercheurs disposent d’une variété de méthodes qu’ils peuvent utiliser pour moduler l’expression des gènes et des protéines dans l’urothélium, y compris l’utilisation de souris knockout urothéliales transgéniques ou conditionnelles, l’utilisation de réactifs de transfection ou l’utilisation de la transduction adénovirale. Cette dernière méthode, objet de ce protocole, est relativement facile, efficace et reproductible. Outre le coût initial des réactifs de culture cellulaire nécessaires pour générer les stocks de virus, la très grande quantité de virus produite (suffisante pour effectuer des centaines de transductions) se traduit par un coût relativement faible par animal. La transduction adénovirale peut être exploitée pour étudier la biologie urothéliale. Par exemple, la transduction adénovirale a été utilisée pour définir l’importance des GTPases de la famille Rho et de la famille Rab, des facteurs d’échange guanine-nucléotide, des fragments moteurs de myosine et d’ADAM17 dans l’exocytose et l’endocytose 10,19,20,21,22, et la transduction adénovirale a récemment été utilisée pour étudier la mécanotransduction urothéliale9 . De même, la transduction adénovirale peut être pertinente lors de l’exploration et du traitement de maladies humaines. Par exemple, Ramesh et al. ont initialement proposé la transduction adénovirale pourrait être un moyen utile de cibler les cellules tumorales18. Bien que leurs études soient davantage une approche de preuve de principe, on peut imaginer que l’expression de toxines dans les cellules cancéreuses ou l’expression d’épitopes qui pourraient être reconnus par le système immunitaire seraient des stratégies utiles. La transduction adénovirale peut également être utile pour comprendre les maladies où la surexpression ou la sous-expression des produits géniques conduit à la maladie. À titre d’exemple, les biopsies de la vessie de patients atteints de cystite interstitielle présentent une augmentation de 90 fois de l’expression de CLDN2 29. Fait intéressant, la surexpression de CLDN2 par transduction adénovirale reproduit de nombreux symptômes de cette maladie chez le rat10. Ainsi, CLDN2 pourrait être une cible dans le traitement des patients atteints de ce trouble.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention de projet pilote par l’intermédiaire de P30DK079307 (à M.G.D.), subvention NIH R01DK119183 (à G.A. et M.D.C.), NIH subvention R01DK129473 (à G.A.), un prix de développement de carrière de l’American Urology Association et une subvention de la Fondation Winters (à N.M.), par les noyaux d’imagerie rénale Cell Physiology and Model Organisms du Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), et par S10OD028596 (à G.A.), qui a financé l’achat du système confocal utilisé pour capturer certaines des images présentées dans ce manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4488 sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube ThermoFisher 06-752 PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352097 sterile
18 G needle BD  305196 18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4489 sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube Falcon (Corning) 352098 sterile
5 mL pipette Corning Costar (Millipore Sigma) CLS4487 sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide Henry Schein 6400012 Anti-viral solution
Cell culture dish - 15 cm Falcon (Corning) 353025 sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper Sarstedt 893.1832 handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl Millipore Sigma C-4306 Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose) Gibco (ThermoFisher) 11965092 with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA Millipore Sigma EDS Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum  Hyclone (Cytiva) SH30070.03 defined serum
Glass pipette Fisher Scientific 13-678-20A 5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol Millipore Sigma G-5516 Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells ATCC CRL-3216 HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane Covetrus 29405
IV catheter - mouse Smith Medical Jelco 3063 24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter - rat Smith Medical Jelco 3060 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl Millipore Sigma P-9541 Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4 Millipore Sigma P5655 Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O Millipore Sigma 431478  ≥ 99.99%
NaCl Millipore Sigma S3014 Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside  Millipore Sigma D4641  ≥ 98%
Nose cone for multiple animals custom designed commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column  GE Healthcare 17-085-01 Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) Gibco (ThermoFisher) 15070063 100x concentrated solution
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer
Stand and clamp Fisher Scientific 14-679Q and 05-769-8FQ available from numerous suppliers
Sterile filter unit Fisher Scientific (Nalgene) 09-740-65B 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) Fisher Scientific  SLGV004SL Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge Eppendorf  5810R with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL) BD  309628 1-mL syringe Luer-lok tip - sterile
Syringe (3 mL) BD  309656 3-mL syringe slip tip - sterile
Table-top centrifuge (low speed) Eppendorf  5702 with swinging bucket rotor
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base Millipore Sigma 648310-M Molecular Biology grade 
TrypLE select protease solution Gibco (ThermoFisher) 12604013 TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-80 XP with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer  General Anesthetic Services, Inc. Tec 3 Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer VWR 10153-838 analog vortex mixer

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References

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Biologie numéro 188
Expression de transgènes dans l’urothélium vésical natif par transduction médiée par adénovirus
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Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, … More

Ruiz, W. G., Clayton, D. R., Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction. J. Vis. Exp. (188), e64584, doi:10.3791/64584 (2022).

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