Biology

激光消融和活体显微镜研究肠道重塑

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/64756

Dimitrios Laskaris*^1,2, Maria Azkanaz*^1,2, Mijke A. de Vreij-Kruidenier³, Doreen van Rijswoud-Ram³, Hendrik A. Messal^1,2, Jacco van Rheenen^1,2

¹Department of Molecular Pathology, The Netherlands Cancer Institute, ²Oncode Institute, ³Animal Laboratory Facility, The Netherlands Cancer Institute

* These authors contributed equally

Summary

在这里，我们提出了一种在激光诱导的伤口时获得肠道图像的方法。通过将小鼠肠道暴露于多光子激光下，局部诱导单个或多个隐窝的丢失。通过在几个月内对受损区域进行重复成像，可以捕获肠道恢复的实时动态。

Abstract

研究体内肠道恢复是一项精湛的技术挑战。缺乏纵向成像协议阻碍了对协调肠道再生的细胞和组织规模动力学的更深入的了解。在这里，我们描述了一种活体显微镜方法，该方法在单个隐窝尺度上局部诱导组织损伤，并遵循活小鼠肠上皮的再生反应。单个隐窝或较大的肠野被高强度多光子红外激光以时间和空间控制的方式消融。随后的长期重复活体成像能够随着时间的推移跟踪受损区域，并允许在数周内监测组织恢复期间的隐窝动力学。在激光诱导的损伤下，在邻近组织中观察到隐窝重塑事件，例如隐窝裂变、融合和消失。该协议能够在稳态和病理生理环境中研究隐窝动力学，例如衰老和肿瘤起始。

Introduction

肠道上皮内壁不断受到胃酸、毒素和微生物群的挑战，这些物质可能导致上皮屏障破坏。肠道结构和组织组织专门用于不断自我更新和修复损伤。小肠的单层上皮组织成隐窝绒毛单位¹。在体内平衡中，位于隐窝底部的自我更新的Lgr5⁺肠道干细胞产生分化的后代。分化的子细胞以传送带方式行进到绒毛轴的尖端，在那里它们脱落，以便在3-5天内补充肠内壁²^，³。从长远来看，并非所有Lgr5⁺细胞对组织更新的贡献都相同，因为这也取决于细胞逆带向隐窝底部移动的能力（即逆行）⁴^，⁵。事实上，在通过例如辐射消融Lgr5⁺细胞时，隐窝基部外的祖细胞进入基底以去分化和补充干细胞库⁶，⁷^，⁸。

急性炎症可导致Lgr5⁺干细胞丢失9^，¹⁰。除了干细胞丢失外，许多外部因素还会导致隐窝鳞片上皮的急性损伤。辐射、化学治疗和抗生素已被证明会损伤肠隐窝和绒毛¹¹。较大的隐窝和绒毛区域可能受到细菌、病毒和寄生虫感染的影响¹².肠道具有通过隐窝裂变（将一个隐窝分成两个）从隐窝规模的内部和外部损伤中恢复的显着能力¹³。受伤后，与损伤相邻区域的地穴会发生裂变以补充地穴数量。这种现象也发生在体内平衡^期间，尽管程度较小，14^，¹⁵。为了抵消体内平衡期间隐窝数量的潜在增加，隐窝也可以融合（将两个隐窝合并为一个）¹⁶^，¹⁷。隐窝融合是否也在受伤后重建隐窝数量方面发挥作用尚不清楚。此外，这一过程的动态和调节因素仍有待阐明。

损伤模型对于研究体内组织再生是必不可少的。各种损伤模型已被用于研究肠道组织再生。以前的实验策略采用高剂量辐射来消耗干细胞池¹⁸ 或用葡聚糖硫酸钠（DSS）治疗以诱导小鼠的慢性和急性结肠炎和隐窝丢失¹⁹^，²⁰。通过遗传或光学手段进行的单细胞消融已被用于细化组织损伤，并被认为是解开干细胞和祖细胞的作用²¹^，²² 和研究血管再生²³的有吸引力的工具。此外，已经开发出一种活检损伤系统，以在几个隐窝和绒毛²⁴的更大区域引起损伤。重要的是，对破坏性损伤的反应可能沿肠道近端-远端轴而变化，如辐射报道的那样，辐射在小肠中造成的损害比在结肠中造成的损害更大²⁵。这突出了对控制破坏性损伤程度及其在肠道中的定位的靶向方法的需求。

损伤程度和恢复通常通过静态方法进行评估，这提供了有关组织恢复动态的有限信息。活体显微镜（IVM）为量化许多器官的干细胞行为、上皮重塑和再生开辟了独特的机会26，27，^28，²⁹，30，并为肠道生物学提供了有影响力的见解4，5，²¹，³¹^，³²，³³，³⁴^，35^，³⁶.

在这里，我们描述了一种引起时空定义的肠道损伤并捕获肠上皮衬里的恢复的方法。我们利用两个基于光子的激光消融来损伤肠隐窝，并通过重复的活体显微镜跟踪即时伤口反应和长期恢复。我们的协议允许人们绘制肠道组织结构的再生重塑以响应局部组织损伤。隐窝动力学，包括裂变和聚变事件，可以很容易地随着时间的推移进行量化和跟踪。激光消融和重复活体成像的应用可用作研究体内平衡和病理生理学（如肿瘤起始）期间肠道结构的组织尺度动力学的平台。

Protocol

本研究中描述的所有动物实验均按照荷兰癌症研究所（NKI）动物福利机构（AWB）的指导方针和批准进行。

注意：在进行任何动物实验之前，请咨询研究所的动物伦理委员会。

1. 手术准备和活体成像

术前治疗
1. 诱导8-12周龄K19-CreERT2³⁷：Rosa26-mTmG 38和Lgr5eGFP-IRES-CreERT2¹⁸：通过在手术前4-6周腹膜内注射溶解在葵花籽油中的他莫昔芬³⁹小鼠（图1）。
2. 应用镇痛药。手术前30分钟皮下注射200μL丁丙诺啡（0.1mg / kg体重），每30g小鼠用NaCl稀释0.9%。手术前24小时在装有125mL非酸化高压灭菌饮用水的瓶子中施用卡洛芬（0.067mg / mL）。或者，在手术开始前30分钟皮下注射卡洛芬（5mg / kg）。
手术准备
1. 在生物危害柜中引入高压灭菌无菌手术工具。
2. 打开加热垫并将温度设置为37°C。
活体成像的准备
1. 在成像前至少4小时打开显微镜的温度控制室，以留出足够的时间进行温度稳定。
  注意：所需时间可能因所使用的机器而异。
2. 保持气候室内温度稳定在37°C。
3. 打开双光子显微镜、扫描仪和激光。
4. 启动成像软件。
5. 将激光波长调整到 960 nm 并打开快门。

2. 手术和活体成像

肠道手术暴露
1. 使用2%-3%异氟醚麻醉小鼠并将其放在加热垫上，用无菌布覆盖。通过评估呼吸频率和质量（一次呼吸/秒）和检查鼠标的反射来检查麻醉深度。
2. 用眼药膏覆盖小鼠的眼睛。
3. 皮下注射 200 μL 预热的无菌盐水。
4. 剃掉腹部并去除毛发。更换手术区域的无菌布。
5. 插入直肠探头以监测小鼠的温度。
  注意：温度应约为37°C。
6. 戴上一副新的无菌手套。
7. 用消毒液交替擦洗，然后用80%乙醇洗涤三次，以圆形方式清洁手术区域。用无菌棉签去除多余的乙醇。
  注意：此时监测鼠标体温过低至关重要。
8. 用无菌手术布覆盖小鼠。
9. 检查鼠标的反射。
10. 使用无菌手术刀在皮肤上做一个~10毫米的垂直中线切口。
11. 用剪刀切开白线，分离腹直肌并打开腹部。
12. 使用浸泡在无菌预热盐水中的无菌棉签找到小鼠的盲肠，将其用作参考点。
13. 在一块无菌纱布上做一个小切口，用预热的无菌盐水润湿，然后将其放在切口上方。
14. 用浸泡在预热无菌盐水中的无菌棉签取出肠道。通过添加无菌预热盐水来保持肠道水分。
15. 在鼠标旁边放置一个无菌定制成像室。
16. 将鼠标转移到预热的无菌成像盒中。
17. 将肠放在成像盒的无菌玻璃上。将鼠标头放在成像盒的吸入管内，如图 1所示。
18. 如有必要，用无菌柔性薄膜和胶带固定鼠标。
19. 将装有鼠标的成像盒放入显微镜室中。
活体成像
1. 通过每15分钟通过直肠探头检查呼吸的频率和深度以及温度，在成像过程中监测小鼠。异氟醚的百分比应保持在1%-2%之间。根据需要进行调整。
2. 使用显微镜的目镜找到肠道中的一个区域。
3. 使用显微镜的内部摄像头获得感兴趣区域的广角视图，如图 2A所示。
4. 使用多光子显微镜的960 nm激光对感兴趣区域进行成像。根据实验中使用的荧光团调整激光功率和波长。
5. 获取 3 μm 感兴趣区域的 10-20 步 z 堆栈。
激光烧蚀
1. 从之前成像的磁贴中选择单个位置或多个位置。
2. 使用成像软件中的漂白点校准功能，缩放分辨率为 32 和 124 x 124 像素，扫描速度为 400 Hz，使用双向扫描属性 3-10 秒，具体取决于目标损坏的大小。隐窝区域损伤的开始可以通过绿色和红色通道中自发荧光的增加来识别。
3. 对同一鼠标中的多个区域重复前两个步骤。
4. 消融后，获取受损区域的 z 堆栈以确认损坏的位置和程度。
手术部位闭合
1. 将小鼠在麻醉下置于无菌缝合区域。
2. 使用浸有预热无菌盐水的无菌棉签将暴露的肠插入腹部。
3. 通过使用可吸收的5-0缝合线进行简单的连续缝合来缝合白线。用手术结关闭缝合线的四肢。
4. 对皮肤层重复相同的步骤。
5. 关闭异氟醚工作站，清洁和消毒成像盒和镶嵌物。
6. 使用手术器械清洁剂、酶清洁剂和手术器械润滑剂清洁手术工具。干燥后，将手术工具与高压灭菌器中的手术盒一起消毒。
术后护理
1. 让小鼠从手术中恢复，同时将笼子放在加热垫上~1小时。
  注意：如果可能，将鼠标与其他笼子伙伴放在一起。恢复不需要单独住房。
2. 在恢复过程中每15分钟检查一次鼠标的温度。
3. 手术后6-12小时皮下注射200μL丁丙诺啡（0.1mg / kg体重），每30g小鼠用NaCl稀释0.9%。
4. 在装有125mL非酸化高压灭菌饮用水的瓶子中施用卡洛芬（0.067mg / mL）手术后72小时。
5. 在手术后1周内每天称量小鼠并监测福利。

3. 重复手术和活体成像

手术
1. 在第二个时间点（第一次成像会话后至少 1 周），重复步骤 1.1.2、1.2、1.3 和 2.1。
活体成像
1. 重复步骤 2.2.1-2.2.3。
2. 使用血管模式找到在第一个时间点成像的相同感兴趣区域。
3. 重复步骤 2.2.4 和 2.2.5。
手术部位闭合
1. 重复步骤 2.4.1。
2. 如果小鼠不打算在另一个时间点成像，则通过在终末麻醉下进行颈椎脱位来牺牲小鼠。否则，请继续执行下一步。
  注意：根据欧盟指令2010/63 / EU附录IV的指南，颈椎脱位是一种可接受的方法。
3. 重复步骤 2.4.2-2.4.6。
术后护理
1. 重复步骤 2.5.1-2.5.5。

Representative Results

为了证明激光消融方法结合活体成像可以获得的结果类型，我们进行了如图1所示的实验。首先，我们注射K19-CreERT2;mTmG（K19cre-mTmG）和Lgr5eGFP-IRES-CreERT2;Rosa26-Confetti（Lgr5cre-Confetti）小鼠用他莫昔芬随机标记具有五彩纸屑颜色之一（或mTmG小鼠中的绿色荧光蛋白[GFP]）的细胞。K19-cre诱导所有上皮细胞的谱系追踪，而Lgr5-cre仅诱导干细胞的谱系追踪8，¹⁸^，³⁷。他莫昔芬注射液在手术前4-6周和第一次成像会议前施用，以获得隐窝，其中所有细胞都是某种颜色的单克隆。在数周内对相同的组织区域进行可靠的鉴定对于跟踪相同隐窝随时间推移的命运至关重要。固有的组织结构特征，如脉管系统，可以用作可靠的组织标志，并在这里用显微镜的内部相机记录。此外，用（至少两种）不同的颜色标记一小部分隐窝有助于在每个成像会话中识别相同的隐窝，并在激光损伤后的再生过程中跟踪它们的行为。在手术暴露小鼠肠道并获得感兴趣区域的相机和荧光图像（图2A）后，多光子激光器的漂白点设置可用于消融一个或多个隐窝（图2B，C）。损伤的开始可以通过绿色和红色通道中自发荧光的增加来识别。为了研究隐窝恢复的动力学，在第一次影像学检查后数周/数月重复手术和成像程序，并使用组织固有结构（脉管系统和克隆标记的隐窝模式）作为标志，以找到完全相同的损伤位置（图2）。当这种方法应用于Lgr5Cre-Confetti小鼠时，其中Lgr5-eGFP以斑片方式表达，可以捕获激光诱导损伤后隐窝数量和形状的变化（图3）。虽然一些区域在隐窝的数量和结构上没有变化（图3B），但其他区域显示出广泛的隐窝重塑，如隐窝裂变和聚变事件的数量（图3C）和激光诱导损伤后2周隐窝的丢失（图3D）。通过引入不同大小的损伤并量化消融后的裂变、融合和消失事件，如（图3E）所示的示例所示，可以在不同的小鼠模型中绘制损伤诱导再生的动力学。

图 1：实验设置的示意图。通过在转基因小鼠模型中腹膜内注射他莫昔芬以诱导肠隐窝中Cre介导的重组来实现肠细胞的体内标记。几天或几周后（当隐窝是某种颜色的单克隆时），通过手术暴露肠道并使用带有温控室的多光子显微镜进行激光消融。在消融后立即表征隐窝损伤的程度，并允许小鼠从手术中恢复。反复手术暴露和 IVM 用于监测肠道随时间推移的恢复。血液脉管系统和不同颜色的隐窝的模式和分布用于在消融后数周或数月后找回相同的区域。隐窝重塑（例如裂变或融合）可在消融后数周在损伤部位观察到。请点击此处查看此图的大图。

图2：激光诱导的肠道损伤时组织再生的纵向成像。当肠道以完全相同的方式定位时，肠道的血管可以用作地图来查找和成像完全相同的区域。（A）肠道的相机概览图像。白色虚线表示与损伤部位相邻的脉管系统的图案（白框），用作在另一个时间点上查找相同激光消融区域的地标。下面的两个图像显示了白框的放大视图。箭头描绘了第 1 天和第 1 个月后激光烧蚀的确切位置。（B）多光子显微镜捕获的单个隐窝损伤的荧光图像。蓝色框中的箭头显示了第 1 天和第 1 个月后的损坏部位。（C）受损地穴区域的荧光图像。蓝色框中的箭头标记了第 1 天和第 1 个月后的损坏区域。比例尺：1毫米（A，顶部）;0.25 毫米（A，底部）;200 μm（大概览 B 和 C）;和 50 μm（缩放图像 B 和 C）。请点击此处查看此图的大图。

图 3：激光消融后隐窝命运的活体成像。（A）使用五彩纸屑模型，随着时间的推移，可以跟踪用不同颜色标记的隐窝，以绘制恢复的动态。白色箭头描绘了激光烧蚀的部位。黄色框表示邻近区域（距损坏部位<100 μm），而蓝色和紫色框表示远离激光烧蚀区域（>100 μm）的区域。观察到不同的再生模式。（B）某些区域保持不变，如紫色框中所示。（三）其他地区以隐窝裂变或聚变的形式出现隐窝重塑;白色虚线和箭头描绘了地穴裂变事件，橙色虚线和箭头描绘了地穴融合事件。（D）在某些地区，观察到地穴消失，例如在黄色框中，用橙色虚线突出显示的地穴消失了。（E）一个示例量化，显示在邻近（即小于100μm）和远离（即超过100μm）损伤部位的区域观察到的隐窝重塑事件的数量。比例尺：200 微米（A）;50微米（B-D）。请点击此处查看此图的大图。

Discussion

该方案结合了显微激光消融和纵向活体显微镜检查，以跟踪从早期损伤反应到长期组织重塑的肠道再生。该技术的建立严格遵守伦理考虑，以诱导和成像显微镜激光消融，并且精确遵循将保持动物的健康。在手术过程中，重要的是要确保肠道的完整性得到很好的保存。这可以通过使用无菌湿棉签轻轻处理组织来实现，这可以防止组织出血或干燥。激光诱导的微观损伤的程度也应通过对激光消融后该区域的不同肠层进行成像来仔细评估。如果研究人员希望调整本协议中描述的实验步骤的频率，则应在实验前咨询研究所的动物伦理委员会，以确定对福利的影响。

重复的活体显微镜允许随着时间的推移监测同一只小鼠的组织恢复。肠道的反复手术暴露很容易使整个肠道的光学通道成为可能。组织固有特征（如脉管系统）可作为标志，在每次成像会话中识别相同的肠道区域。因此，可以在数周内对同一组织区域进行成像，这使得人们能够量化同一小鼠同一肠道区域的长期组织再生。手术和成像方法相结合提供的时空控制带来了在同一只小鼠体内稳态和再生条件下对同一器官进行成像的优势，这与以前的全器官损伤模型形成鲜明对比，其中对照和再生样品来自不同的小鼠¹¹，¹²，¹⁸，¹⁹^，²⁰.因此，我们的实验设置最大限度地减少了实验所需的动物数量，并减少了动物内的变化。

方案故障排除应从回顾小鼠和肠道处理技术开始，并控制显微镜设备和设置。该协议中有许多关键步骤需要特别注意。首先，为了确保动物健康和持续的高质量数据，所有工作都需要使用无菌技术在清洁无菌的环境中进行，并且在手术和每次成像过程中应保持小鼠温度。在成像过程中，用无菌的预热盐水保持组织水分至关重要，可以防止组织纤维化。

为了确保实验以可重复的方式进行，重要的是在使用前对准激光器以实现最佳采集，并在每次会话开始时测量多光子激光器的功率输出。物镜类型、放大倍率、停留时间、激光功率和波长等参数会影响显微激光烧蚀的程度，应考虑这些参数。在这项研究中，激光烧蚀和成像都是通过Fluotar VISIR 25x/0.95 WATER物镜在960nm波长下以1.2 W（镜头外）的激光功率进行的。改变波长或光学扫描特性会影响微观损伤的程度。较低的波长（例如840nm）转化为更高能量的光子，并且通常在较高的激光输出中，并且可能增强微观损伤。更高的缩放导致每个区域的能量更多，因此消融隐窝的时间更少，反之亦然。像素停留时间也可以增加或减少，以改变烧蚀速度和损伤程度。当成像组织不稳定时（例如，由于蠕动运动），需要快速进行消融。为此，应通过增加变焦和/或激光输出等方式优化消融速度。

在多次成像会话中发现相同的肠道区域是另一个需要正确执行以确保实验成功的关键步骤。为此，肠道需要在所有时间点以完全相同的方式定位。我们建议始终使用盲肠作为参考点，以找到小肠和大肠中的相同区域。用棉签轻轻拉伸感兴趣的组织，确保感兴趣的区域在目标工作距离的范围内，并最大限度地增加可追溯的区域数量。此外，我们建议始终消融和成像每只小鼠的多个微观位置，以考虑在以后的成像会话中可能无法定位的区域。如果找不到区域，即使肠道的位置是正确的，它也可以帮助重新定位鼠标并改变暴露区域的方向。随着时间的推移跟踪隐窝对于几个相邻隐窝的较大肠野被消融的实验来说可能很麻烦。这种破坏性的损伤可以引起上皮单层以外的组织重塑，最终可能导致用于随着时间的推移跟踪该区域的组织标志物的修改。选择距受损场地足够距离的地标，并捕获比受损区域高出数百微米的更大视野，可以增加长期实验成功的机会。除了肠道在显微镜载物台上的不正确定位外，胃肠道的蠕动运动可能会干扰成像。这个问题可以通过两种方式得到改善。如果运动频率不是太高，则可以在同一区域重复该过程，并增加曝光时间。或者，可以使用更多的麻醉来减少蠕动。我们建议将较高剂量的异氟醚限制在短期调整内。总之，成像过程应尽可能短，最好在3小时以下，以确保快速恢复。

与其他损伤模型相比，联合激光消融和纵向活体显微镜方法具有几个优点。以前的（化学）损伤模型缺乏局部限制破坏性侮辱⁶，¹¹，¹²，¹⁹^，²⁰的能力。激光烧蚀通过将损伤限制在确定的感兴趣区域来克服这一缺点。这使研究人员能够控制受伤的位置以及损伤程度。损伤严重程度可以调节为消融隐窝或整个微观肠野，以告知隐窝尺度的再生反应。除了空间控制之外，激光烧蚀还可以精确地确定损伤的发生时间，从而超越以前的药物、化学和感染模型⁹、10^、¹¹、¹²、¹⁹^、²⁰ 的精度。我们的协议扩展了以前的研究，这些研究使用激光诱导热消融作为诱导肠道局部损伤的方法²¹^，²³。以前的激光诱导损伤模型对小肠²¹或远端结肠²³的管腔表面的局部区域进行成像。手术和激光消融方法相结合，可以高分辨率地可视化肠上皮（特别是隐窝），并在小肠、盲肠和近端结肠的任何位置进行组织恢复的激光消融和后续成像。它捕获相同肠道区域随时间的恢复，允许根据实验设置可视化肠道的不同层（粘膜、粘膜下层、肌肉和血清）。我们的技术主要用于数周/数月的长期重复成像。为了研究隐窝的短期恢复动态（例如，损伤后连续几天），这里描述的激光消融方法可以与活体成像窗口²⁷，²⁸^，⁴⁰相结合。

该协议可用于来自不同科学领域的多种研究应用，涵盖再生、免疫学和癌症研究。肠道再生的纵向成像揭示了保持上皮完整性和屏障功能的细胞动力学，使宿主能够防御肠腔中的病原体，以及致癌突变清除和扩散的基础。每个科学问题都会对激光诱导的损伤程度和成像持续时间提出独特的要求。荧光报告小鼠和注射的染料可以通过允许任何感兴趣的细胞和结构的可视化来大幅扩展和完善可以获取的数据。例如，Lgr5-CreERt2：Rosa26-Confetti小鼠可用于可视化干细胞后代，而Rosa26-mTmG报告基因则告知组织结构。总之，这些最新的技术进步使活体肠道实验成为促进我们对肠道生物学和疾病的理解的有利可图的工具。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了荷兰科学研究组织NWO（Vici赠款09150182110004 J.v.R.和Veni赠款09150161910151 H.A.M.）的支持，OCENW。GROOT.2019.085（致J.V.R）和EMBO博士后奖学金（授予ALTF 452-2019授予H.A.M）。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia induction box	Veterinary Technics
Autoclave	Certoclav
Betadine	Mylan	202809
Diaper (underpad)	Absorin comfort
Dumont forceps	Fine Scientific Tools	11255-20 or 11272-40	Inox, style #55, used to hold the peritoneum
Enzymatic instrument cleaner	Roboz	EC-1000
Ethanol 80%	homemade	NA
Eye ointment	Duratears Z (Alcon)	288/28282-6
Fine Scissors Straight 9 cm	Fine Scientific Tools	14060-09	Used to cut skin and peritoneum of the mouse
Gauze 5 cmX5 cm	Cutisoft (Bsn medical)	45847-00
Graefe Forceps Curved Serrated	Fine Scientific Tools	11051-10	Used to hold the skin
Hartman Hemostat Straight	Fine Scientific Tools	13002-10	Used for suturing
Heating pad	Comfort	T5-5000
Imaging box	Custom made
Incision film	Nobafilm	172215
Inverted multi-photon microscope with automated stage	Leica Microsystems	NA
Isoflurane (vetflurane)	Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands	305788
Isoflurane vaporizer	Penlon sigma delta
Micropore paper tape	Micropore
NaCl 0.9%	Braun		Other brands available
Needle 25G	BD	300600
Paper tape tesa	Tesa	NA
Parafilm	Bemis	PM-994	semi-transparent tape
Razor blades	Supermax stainless steel		Other brands available
Rectal probe	Kent Scientific	20250-91
Rimadyl Cattle (carprofen)	Zoetis B.V	Registration# REG NL 10130
Student Fine Scissors Straight 11.5 cm	Fine Scientific Tools	91460-11	Used to cut gauze
Surgical instrument cleaner	Roboz	IC-1000
Surgical instrument lubricant	Roboz	IL-1000
Syringes (1 ml)	BD	303172	Other brands available
Tamoxifen	Sigma	T5648
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride)	Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare	Registration# RVG 08725
Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle	Ethicon	V292ZH
VirkonS	Bio-services		antiseptic solution
Wooden cotton swab (sterile)	Klinion	531530	Other brands available