Summary
هنا ، نقدم طريقة للحصول على صور للأمعاء عند الجرح الناجم عن الليزر. من خلال تعريض أمعاء الفأر لليزر متعدد الفوتونات ، يتم إحداث فقدان سرداب (سرداب) واحد أو عدة مرات محليا. من خلال تصوير المنطقة المتضررة بشكل متكرر على مدار أشهر ، يتم التقاط ديناميكيات الوقت الفعلي للتعافي المعوي.
Abstract
التحقيق في الانتعاش المعوي في الجسم الحي هو تحد تقني رائع. أدى الافتقار إلى بروتوكولات التصوير الطولي إلى منع رؤى أعمق في ديناميكيات مقياس الخلايا والأنسجة التي تنظم تجديد الأمعاء. هنا ، نصف طريقة الفحص المجهري داخل الجسم التي تحفز محليا تلف الأنسجة على مقياس سرداب واحد وتتبع الاستجابة التجديدية لظهارة الأمعاء في الفئران الحية. تم استئصال الخبايا المفردة أو الحقول المعوية الأكبر بواسطة ليزر الأشعة تحت الحمراء متعدد الفوتونات عالي الكثافة بطريقة يتم التحكم فيها زمانيا ومكانيا. مكن التصوير اللاحق المتكرر على المدى الطويل داخل الجسم من تتبع المناطق المتضررة بمرور الوقت وسمح بمراقبة ديناميكيات القبو أثناء استعادة الأنسجة على مدى عدة أسابيع. لوحظت أحداث إعادة تشكيل القبو مثل انشطار القبو والاندماج والاختفاء في الأنسجة المجاورة عند التلف الناجم عن الليزر. يتيح هذا البروتوكول دراسة ديناميكيات القبو في كل من الإعدادات الاستتبابية والفيزيولوجية المرضية ، مثل الشيخوخة وبدء الورم.
Introduction
يتم تحدي البطانة الظهارية للأمعاء باستمرار بواسطة أحماض المعدة والسموم والميكروبات التي يمكن أن تسبب اضطرابا في الحاجز الظهاري. البنية المعوية وتنظيم الأنسجة متخصصة في التجديد الذاتي وإصلاح الأضرار باستمرار. يتم تنظيم ظهارة أحادية الطبقة من الأمعاء الدقيقة في وحدات سردابالزغابات 1. في الاتزان الداخلي ، تؤدي الخلايا الجذعية المعوية Lgr5 + ذاتية التجديد الموجودة في قاعدة القبو إلى ذرية متباينة. تنتقل الخلايا الابنة المتمايزة إلى طرف محور الزغابات بطريقة الحزام الناقل ، حيث يتم إلقاؤها بحيث يتم تجديد بطانة الأمعاء في 3-5 أيام 2,3. على المدى الطويل ، لا تساهم جميع خلايا Lgr5 + بالتساوي في تجديد الأنسجة ، لأن هذا يعتمد أيضا على قدرة الخلايا على التحرك ضد الحزام الناقل نحو قاعدة القبو (أي الحركة التراجعية)4,5. في الواقع ، عند استئصال خلايا Lgr5 + عن طريق الإشعاع ، على سبيل المثال ، تنتقل الخلايا السلفية خارج قاعدة القبو إلى القاعدة لإلغاء التمايز وتجديد تجمع الخلايا الجذعية6،7،8.
يمكن أن يسبب الالتهاب الحاد فقدان الخلايا الجذعية Lgr5 + 9,10. بالإضافة إلى فقدان الخلايا الجذعية ، يمكن أن تسبب العديد من العوامل الخارجية أضرارا حادة للظهارة على نطاق القبو. ثبت أن الإشعاع والعلاجات الكيميائية والمضادات الحيوية تصيب الخبايا المعويةوالزغابات 11. يمكن أن تتأثر الحقول الأكبر من الخبايا والزغابات بالعدوى البكتيرية والفيروسية والطفيلية12. تمتلك الأمعاء قدرة ملحوظة على التعافي من التلف الداخلي والخارجي على نطاق القبو عن طريق انشطار القبو (تقسيم سرداب واحد إلى قسمين)13. عند الإصابة ، تخضع الخبايا في المنطقة المجاورة للضرر للانشطار لتجديد أرقام القبوات. تحدث هذه الظاهرة أيضا ، وإن كان بدرجة أقل ، أثناء التوازن14,15. لموازنة الزيادة المحتملة في أعداد الأكواخ أثناء التوازن ، يمكن للخبايا أيضا دمج (دمج سربيتين في واحد)16,17. من غير المعروف ما إذا كان اندماج الشفرة يلعب أيضا دورا في إعادة إنشاء أرقام الخوادم بعد الإصابة. وعلاوة على ذلك، لا يزال يتعين توضيح الديناميات والعوامل التنظيمية لهذه العملية.
لا غنى عن نماذج الإصابة لدراسة تجديد الأنسجة في الجسم الحي. تم استخدام نماذج إصابة مختلفة لدراسة تجديد الأنسجة المعوية. استخدمت الاستراتيجيات التجريبية السابقة جرعة عالية من الإشعاع لاستنفاد تجمعات الخلايا الجذعية18 أو العلاج بكبريتات ديكستران الصوديوم (DSS) للحث على التهاب القولون المزمن والحاد وفقدان القبو في الفئران19,20. تم استخدام الاجتثاث أحادي الخلية بالوسائل الوراثية أو البصرية لتحسين تلف الأنسجة ويعتبر أداة جذابة لفصل دور الخلايا الجذعية والسلفية21،22 ودراسة تجديد الأوعية الدموية23. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير نظام إصابة الخزعة لإحداث ضرر في حقول أكبر للعديد من الخبايا والزغابات24. الأهم من ذلك ، أن الاستجابة للإهانة الضارة قد تختلف على طول المحور القريب البعيد للأمعاء ، كما ورد للإشعاع ، والذي تسبب في أضرار في الأمعاء الدقيقة أكثر من القولون25. هذا يسلط الضوء على الحاجة إلى طرق مستهدفة تتحكم في كل من مدى الإهانة الضارة وتوطينها في الأمعاء.
تم تقييم مدى الضرر والتعافي تقليديا بوسائل ثابتة ، والتي توفر معلومات محدودة حول ديناميكيات استعادة الأنسجة. فتح الفحص المجهري داخل الجسم (IVM) فرصا فريدة لقياس سلوك الخلايا الجذعية ، وإعادة تشكيل الظهارة ، والتجديد في العديد من الأعضاء 26،27،28،29،30 ، وقدم رؤى مؤثرة في بيولوجيا الأمعاء4،5،21،31،32،33،34 ، 35,36.
هنا ، نصف طريقة لإحداث تلف معوي محدد زمانيا مكانيا والتقاط استعادة البطانة الظهارية المعوية. نحن نستخدم اثنين من الاجتثاث بالليزر القائم على الفوتون لإتلاف الخبايا المعوية ومتابعة الاستجابة الفورية للجرح والتعافي على المدى الطويل عن طريق الفحص المجهري المتكرر داخل الجسم. يسمح بروتوكولنا للمرء برسم خريطة لإعادة التشكيل التجديدي لبنية الأنسجة المعوية استجابة لتلف الأنسجة المحلية. يمكن قياس ديناميات القبو ، بما في ذلك أحداث الانشطار والاندماج ، وتتبعها بسهولة بمرور الوقت. يمكن استخدام تطبيق الاستئصال بالليزر والتصوير المتكرر داخل الجسم كمنصة للتحقيق في ديناميكيات الأنسجة في بنية الأمعاء أثناء التوازن والفيزيولوجيا المرضية ، مثل بدء الورم.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية وموافقة هيئة رعاية الحيوان (AWB) التابعة لمعهد السرطان الهولندي (NKI).
ملاحظة: استشر لجنة أخلاقيات الحيوان في المعهد قبل إجراء أي تجارب على الحيوانات.
1. التحضير للجراحة والتصوير داخل الجسم
- علاجات ما قبل الجراحة
- حث K19-CreERT237 البالغ من العمر 8-12 أسبوعا: Rosa26-mTmG 38 و Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: Rosa26-Confetti39 الفئران عن طريق حقن عقار تاموكسيفين المذاب في زيت عباد الشمس داخل الصفاق قبل 4-6 أسابيع من الجراحة (الشكل 1).
- تطبيق تسكين. حقن 200 ميكرولتر من البوبرينورفين (0.1 ملغم / كغم من وزن الجسم) المخفف في كلوريد الصوديوم 0.9٪ لكل 30 جم فأر تحت الجلد قبل 30 دقيقة من الجراحة. تطبيق كاربروفين (0.067 ملغم/مل) في زجاجة تحتوي على 125 مل من ماء الشرب المعقم غير المحمض قبل 24 ساعة من الجراحة. بدلا من ذلك، يتم تطبيق حقن كاربروفين تحت الجلد (5 ملغ/كغ) قبل 30 دقيقة من بدء الجراحة.
- التحضير للجراحة
- إدخال أدوات جراحية معقمة معقمة في خزانة المخاطر البيولوجية.
- قم بتشغيل وسادة التدفئة واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
- التحضير للتصوير داخل الجسم
- قم بتشغيل غرفة المجهر التي يتم التحكم في درجة حرارتها قبل 4 ساعات على الأقل من التصوير لإتاحة الوقت الكافي لتثبيت درجة الحرارة.
ملاحظة: يمكن أن يختلف الوقت اللازم حسب الجهاز المستخدم. - حافظ على درجة الحرارة داخل غرفة المناخ مستقرة عند 37 درجة مئوية.
- قم بتشغيل المجهر ثنائي الفوتون والماسح الضوئي والليزر.
- قم بتشغيل برنامج التصوير.
- اضبط الطول الموجي لليزر على 960 نانومتر وافتح الغالق.
- قم بتشغيل غرفة المجهر التي يتم التحكم في درجة حرارتها قبل 4 ساعات على الأقل من التصوير لإتاحة الوقت الكافي لتثبيت درجة الحرارة.
2. الجراحة والتصوير داخل الجسم
- التعرض الجراحي للأمعاء
- تخدير الماوس باستخدام 2٪ -3٪ إيزوفلوران ووضعه على وسادة تدفئة مغطاة بقطعة قماش معقمة. تحقق من عمق التخدير عن طريق تقييم وتيرة وجودة التنفس (نفس واحد / ثانية) وعن طريق التحقق من رد فعل الماوس.
- تغطية عيون الماوس مع مرهم العين.
- حقن 200 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم قبل التسخين تحت الجلد.
- حلق البطن وإزالة الشعر. تغيير قطعة القماش المعقمة في منطقة الجراحة.
- أدخل مسبار المستقيم لمراقبة درجة حرارة الماوس.
ملاحظة: يجب أن تكون درجة الحرارة حوالي 37 درجة مئوية. - ارتد زوجا جديدا من القفازات المعقمة.
- نظف المنطقة الجراحية بطريقة دائرية باستخدام مقشرات متناوبة من محلول مطهر متبوعة بنسبة 80٪ إيثانول ثلاث مرات. إزالة الإيثانول الزائد مع مسحة القطن معقمة.
ملاحظة: من الأهمية بمكان مراقبة الماوس لانخفاض حرارة الجسم في هذه المرحلة. - تغطية الماوس مع ستارة جراحية معقمة.
- تحقق من رد فعل الماوس.
- قم بعمل شق خط الوسط العمودي ~ 10 مم عبر الجلد باستخدام مشرط معقم.
- شق خط ألبا باستخدام مقص لفصل عضلات البطن المستقيمة وفتح البطن.
- ابحث عن الأعور للفأر باستخدام مسحات قطنية معقمة مبللة بمحلول ملحي معقم تم تسخينه مسبقا لاستخدامه كنقطة مرجعية.
- قم بعمل قطع صغير في قطعة من الشاش المعقم ، بللها في محلول ملحي معقم مسخن مسبقا ، وضعه فوق الشق.
- أخرج الأمعاء بمسحات قطنية معقمة مبللة بمحلول ملحي معقم تم تسخينه مسبقا. حافظ على رطوبة الأمعاء عن طريق إضافة محلول ملحي معقم تم تسخينه مسبقا.
- ضع غرفة تصوير معقمة حسب الطلب بجوار الماوس.
- انقل الماوس إلى صندوق التصوير المعقم المسخن مسبقا.
- ضع الأمعاء على الزجاج المعقم لصندوق التصوير. ضع رأس الفأرة داخل أنبوب الاستنشاق في صندوق التصوير، كما هو موضح في الشكل 1.
- إذا لزم الأمر ، قم بتأمين الماوس بفيلم وشريط مرن معقمين.
- ضع صندوق التصوير الذي يحتوي على الماوس في غرفة المجهر.
- التصوير داخل الجسم
- راقب الماوس أثناء التصوير عن طريق التحقق من تواتر وعمق التنفس ودرجة الحرارة عبر مسبار المستقيم كل 15 دقيقة. يجب أن تبقى نسبة الأيزوفلوران بين 1٪ -2٪. اضبط إذا لزم الأمر.
- ابحث عن منطقة في الأمعاء باستخدام عدسة المجهر.
- احصل على رؤية واسعة المجال لمنطقة الاهتمام باستخدام الكاميرا الداخلية للمجهر ، كما هو موضح في الشكل 2A.
- تخيل منطقة الاهتمام باستخدام ليزر 960 نانومتر للمجهر متعدد الفوتونات. اضبط طاقة الليزر والطول الموجي وفقا للفلوروفورات المستخدمة في التجربة.
- الحصول على 10-20 خطوة z-stack من 3 ميكرومتر من المنطقة ذات الاهتمام.
- الاجتثاث بالليزر
- اختر موضع واحد أو مواضع متعددة من اللوحة التي تم تصويرها سابقا.
- استخدم وظيفة معايرة نقطة التبييض في برنامج التصوير عند تكبير 32 و 124 × 124 بكسل مع سرعة مسح 400 هرتز ، باستخدام خاصية المسح ثنائي الاتجاه لمدة 3-10 ثوان ، اعتمادا على حجم الضرر المستهدف. يمكن التعرف على بدء الضرر في منطقة القبو من خلال زيادة التألق الذاتي في كل من القنوات الخضراء والحمراء.
- كرر الخطوتين السابقتين لمناطق متعددة في نفس الماوس.
- بعد الاجتثاث ، احصل على مداخن z للمناطق المتضررة لتأكيد موقع ومدى الضرر.
- إغلاق موقع الجراحة
- ضع الفأر ، بينما لا يزال تحت التخدير ، في منطقة خياطة معقمة.
- أدخل الأمعاء المكشوفة مرة أخرى في البطن باستخدام مسحات قطنية معقمة مبللة بمحلول ملحي معقم مسخن مسبقا.
- خياطة خط ألبا عن طريق إجراء خياطة مستمرة بسيطة باستخدام خياطة قابلة للامتصاص 5-0. أغلق أطراف الخيط بعقدة جراحية.
- كرر نفس الخطوة مع طبقة الجلد.
- قم بإيقاف تشغيل محطة الأيزوفلوران وتنظيف وتعقيم صندوق التصوير والبطانة.
- نظف أدوات الجراحة باستخدام منظف الأدوات الجراحية والمنظف الأنزيمي ومواد تشحيم الأدوات الجراحية. عند التجفيف ، قم بتعقيم أدوات الجراحة مع صندوق الجراحة في الأوتوكلاف.
- رعاية ما بعد الجراحة
- دع الفأر يتعافى من الجراحة أثناء وضع القفص على وسادة التدفئة لمدة ~ 1 ساعة.
ملاحظة: ضع الماوس مع زملاء القفص الآخرين إن أمكن. السكن الانفرادي ليس ضروريا للتعافي. - تحقق من درجة حرارة الماوس كل 15 دقيقة أثناء الاسترداد.
- حقن 200 ميكرولتر من البوبرينورفين (0.1 ملغم / كغم من وزن الجسم) المخفف في كلوريد الصوديوم 0.9٪ لكل 30 جم فأر تحت الجلد بعد 6-12 ساعة من الجراحة.
- تطبيق كاربروفين (0.067 ملغم/مل) في عبوة تحتوي على 125 مل من مياه الشرب غير الحمضية لمدة 72 ساعة بعد الجراحة.
- وزن الماوس ومراقبة الرفاهية كل يوم لمدة 1 أسبوع بعد الجراحة.
- دع الفأر يتعافى من الجراحة أثناء وضع القفص على وسادة التدفئة لمدة ~ 1 ساعة.
3. الجراحة المتكررة والتصوير داخل الجسم
- جراحة
- في النقطة الزمنية الثانية (أسبوع واحد على الأقل بعد جلسة التصوير الأولى) ، كرر الخطوات 1.1.2 و 1.2 و 1.3 و 2.1.
- التصوير داخل الجسم
- كرر الخطوات 2.2.1 إلى 2.2.3.
- استخدم نمط الأوعية الدموية لإيجاد نفس مناطق الاهتمام الموضحة في النقطة الزمنية الأولى.
- كرر الخطوتين 2.2.4 و2.2.5.
- إغلاق موقع الجراحة
- كرر الخطوة 2.4.1.
- إذا لم يكن من المفترض تصوير الفأر في نقطة زمنية أخرى ، فقم بالتضحية بالماوس عن طريق إجراء خلع عنق الرحم تحت التخدير النهائي. خلاف ذلك ، تابع مع الخطوة التالية.
ملاحظة: وفقا للمبادئ التوجيهية لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63 / EU ، الملحق الرابع ، يعد خلع عنق الرحم طريقة مقبولة. - كرر الخطوات 2.4.2-2.4.6.
- رعاية ما بعد الجراحة
- كرر الخطوات 2.5.1-2.5.5.
Representative Results
لتوضيح نوع النتائج التي يمكن الحصول عليها من طريقة الاستئصال بالليزر جنبا إلى جنب مع التصوير داخل الجسم ، أجرينا تجربة كما هو موضح في الشكل 1. أولا ، قمنا بحقن K19-CreERT2 ؛ mTmG (K19cre-mTmG) و Lgr5eGFP-IRES-CreERT2 ؛ Rosa26-Confetti (Lgr5cre-Confetti) الفئران مع عقار تاموكسيفين لتسمية الخلايا بشكل عشوائي بأحد ألوان النثار (أو بروتين الفلورسنت الأخضر [GFP] في حالة الفئران mTmG). يحفز K19-cre تتبع النسب من جميع الخلايا الظهارية ، بينما يحفز Lgr5-cre التتبع من الخلايا الجذعية فقط8،18،37. تم إعطاء حقن عقار تاموكسيفين قبل 4-6 أسابيع من الجراحة وجلسة التصوير الأولى من أجل الحصول على خبايا تكون فيها جميع الخلايا وحيدة النسيلة للون معين. يعد التحديد القوي لمناطق الأنسجة نفسها على مدى عدة أسابيع أمرا ضروريا لتتبع مصير نفس الخبايا بمرور الوقت. يمكن استخدام السمات المعمارية للأنسجة المتأصلة ، مثل الأوعية الدموية ، كمعالم نسيجية موثوقة ، وتم تسجيلها هنا بالكاميرا الداخلية للمجهر. بالإضافة إلى ذلك ، ساعد وضع علامة على جزء صغير من الخبايا بلونين مختلفين (على الأقل) في التعرف على نفس الخبايا في كل جلسة تصوير ومتابعة سلوكها أثناء عملية التجدد بعد تلف الليزر. عند تعريض أمعاء الفأر جراحيا والحصول على كل من صور الكاميرا والفلورسنت للمنطقة محل الاهتمام (الشكل 2 أ) ، يمكن استخدام إعدادات نقطة التبييض لليزر متعدد الفوتونات لاستئصال واحد أو أكثر من الخبايا (الشكل 2B ، C). يمكن التعرف على بدء الضرر من خلال زيادة التألق الذاتي في كل من القنوات الخضراء والحمراء. لدراسة ديناميكيات استعادة القبو ، تم تكرار إجراء الجراحة والتصوير بعد أسابيع / أشهر من جلسة التصوير الأولى وتم استخدام الهياكل المتأصلة في الأنسجة (الأوعية الدموية وأنماط الخبايا ذات العلامات المستنسخة) كمعالم للعثور على نفس الموقع بالضبط للإصابة (الشكل 2). عندما تم تطبيق هذه الطريقة في الفئران Lgr5Cre-Confetti ، حيث يتم التعبير عن Lgr5-eGFP بطريقة غير مكتملة ، يمكن التقاط التغييرات في أرقام وأشكال القبو بعد الضرر الناجم عن الليزر (الشكل 3). في حين أن بعض المناطق لم تظهر أي تغييرات في عدد وهيكل الخبايا (الشكل 3B) ، أظهرت مناطق أخرى إعادة تشكيل واسعة النطاق للسرداب ، كما هو موضح في عدد أحداث انشطار القبو والاندماج (الشكل 3C) وفقدان الخبايا بعد أسبوعين من الإصابة التي يسببها الليزر (الشكل 3D). من خلال إدخال أحجام مختلفة من الضرر وتحديد أحداث الانشطار والاندماج والاختفاء بعد الاجتثاث ، كما في المثال الموضح في (الشكل 3E) ، يمكن تعيين ديناميكيات التجدد الناجم عن الإصابة في نماذج الفئران المختلفة.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للإعداد التجريبي. يتم وضع العلامات في الجسم الحي للخلايا المعوية عن طريق حقن عقار تاموكسيفين داخل الصفاق في نماذج الفئران المعدلة وراثيا للحث على إعادة التركيب بوساطة Cre في الخبايا المعوية. بعد أيام أو أسابيع (عندما تكون الخبايا وحيدة النسيلة للون معين) ، تتعرض الأمعاء جراحيا وتخضع للاستئصال بالليزر باستخدام مجهر متعدد الفوتون مع غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها. يتميز مدى تلف القبو مباشرة بعد الاجتثاث ويسمح للماوس بالتعافي من الإجراء. يستخدم التعرض الجراحي المتكرر و IVM لمراقبة التعافي المعوي بمرور الوقت. يتم استخدام نمط وتوزيع الأوعية الدموية والخبايا الملونة المختلفة للعثور على نفس المناطق بعد أسابيع أو أشهر من الاستئصال. يمكن ملاحظة إعادة تشكيل القبو (على سبيل المثال ، الانشطار أو الاندماج) في موقع التلف بعد أسابيع من الاستئصال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التصوير الطولي لتجديد الأنسجة عند حدوث تلف ناتج عن الليزر في الأمعاء. عندما توضع الأمعاء بالطريقة نفسها بالضبط، يمكن استخدام الأوعية الدموية في الأمعاء كخريطة لإيجاد المناطق نفسها وتصويرها. أ: صور عامة بالكاميرا للأمعاء. تمثل الخطوط البيضاء المتقطعة نمط الأوعية الدموية المجاورة لموقع التلف (الصندوق الأبيض) ، وتستخدم كمعلم للعثور على نفس المنطقة المستبذلة بالليزر في نقطة زمنية أخرى. تظهر الصورتان السفليتان طريقة العرض المكبرة للمربع الأبيض. يصور السهم الموقع الدقيق للاستئصال بالليزر في اليوم 1 والشهر الأول بعد ذلك. (ب) صور فلورية لتلف سرداب واحد تم التقاطه بواسطة مجهر متعدد الفوتونات. يظهر السهم الموجود في المربع الأزرق موقع الضرر في اليوم 1 وبعد شهر واحد. (ج) صور فلورية لحقل تالف من الخبايا. تشير الأسهم الموجودة في المربع الأزرق إلى منطقة الضرر في اليوم 1 وبعد شهر واحد. قضبان المقياس: 1 مم (A ، أعلى) ؛ 0.25 مم (أ ، أسفل) ؛ 200 ميكرومتر (نظرة عامة كبيرة B و C) ؛ و 50 ميكرومتر (الصور المكبرة B و C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التصوير داخل الجسم لمصائر القبو بعد الاستئصال بالليزر. (أ) باستخدام نموذج النثار ، يمكن تتبع الخبايا الموسومة بألوان مختلفة بمرور الوقت لرسم خريطة لديناميكيات الاسترداد. يصور السهم الأبيض موقع الاجتثاث بالليزر. يمثل الصندوق الأصفر منطقة مجاورة (<100 ميكرومتر من موقع التلف) ، بينما يمثل الصندوقان الأزرق والأرجواني مناطق بعيدة (>100 ميكرومتر) عن المنطقة المستأصلة بالليزر. لوحظت طرق مختلفة للتجديد. (ب) تظل بعض المناطق دون تغيير كما في المربع الأرجواني. (ج) تظهر مناطق أخرى إعادة تشكيل القبو في شكل انشطار أو اندماج سردائي؛ تصور الخطوط والسهام البيضاء المتقطعة أحداث انشطار القبو والخطوط والسهام البرتقالية المتقطعة أحداث اندماج السرداب. (د) في بعض المناطق ، لوحظ اختفاء القبو ، كما هو الحال في المربع الأصفر حيث اختفى القبو المظلل بخط برتقالي متقطع. (ه) مثال على القياس الكمي الذي يبين عدد أحداث إعادة تشكيل القبو التي لوحظت في المناطق المجاورة (أي أقل من 100 ميكرومتر) وبعيدة عن (أي أكثر من 100 ميكرومتر) موقع الضرر. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر (أ) ؛ 50 ميكرومتر (B-D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يجمع هذا البروتوكول بين الاستئصال المجهري بالليزر والفحص المجهري الطولي داخل الجسم لمتابعة تجديد الأمعاء من الاستجابة المبكرة للتلف إلى إعادة تشكيل الأنسجة على المدى الطويل. تم تأسيس هذه التقنية في الالتزام الصارم بالاعتبارات الأخلاقية للحث على الاستئصال بالليزر المجهري وتصويره ، وعند اتباعها بدقة ستحافظ على رفاهية الحيوان. أثناء الجراحة ، من المهم التأكد من الحفاظ على سلامة الأمعاء بشكل جيد. يمكن تحقيق ذلك عن طريق التعامل بلطف مع الأنسجة باستخدام مسحات قطنية مبللة معقمة ، مما يمنع النزيف أو الجفاف من الأنسجة. يجب أيضا تقييم مدى الضرر المجهري الناجم عن الليزر بعناية عن طريق تصوير الطبقات المعوية المختلفة للمنطقة بعد الاستئصال بالليزر. إذا رغب الباحث في تكييف وتيرة الخطوات التجريبية الموضحة في هذا البروتوكول ، فيجب استشارة لجنة أخلاقيات الحيوان في المعهد قبل التجربة لتحديد النتيجة على الرفاهية.
يسمح الفحص المجهري المتكرر داخل الجسم بمراقبة استعادة الأنسجة في نفس الماوس بمرور الوقت. التعرض الجراحي المتكرر للأمعاء يمنح بسهولة الوصول البصري إلى القناة المعوية بأكملها. تعمل السمات المتأصلة في الأنسجة ، مثل الأوعية الدموية ، كمعالم لتحديد نفس المناطق المعوية في كل جلسة تصوير. وبالتالي ، يمكن تصوير نفس منطقة الأنسجة على مدى عدة أسابيع ، مما يمكن المرء من تحديد تجديد الأنسجة على المدى الطويل في نفس منطقة الأمعاء في نفس الفأر. يوفر التحكم الزماني المكاني الذي توفره طريقة الجراحة والتصوير المدمجة ميزة أنه يمكن تصوير نفس العضو في ظل ظروف الاستتباب والتجديد في نفس الفأر ، وهو ما يتناقض مع نماذج تلف العضو بالكامل السابقة حيث نشأت عينات التحكم والتجديد من فئران مختلفة11،12،18،19،20 . وبالتالي ، فإن إعدادنا التجريبي يقلل من العدد المطلوب من الحيوانات اللازمة للتجربة ويقلل من التباين داخل الحيوان.
يجب أن يبدأ استكشاف أخطاء البروتوكول وإصلاحها بمراجعة تقنية التعامل مع الماوس والأمعاء ، والتحكم في معدات وإعدادات الفحص المجهري. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التي تتطلب مزيدا من الاهتمام. أولا ، من أجل ضمان رفاهية الحيوان وجودة البيانات العالية المستمرة ، يجب تنفيذ جميع الأعمال في بيئة معقمة نظيفة باستخدام تقنية التعقيم ، ويجب الحفاظ على درجة حرارة الماوس أثناء الجراحة وكل جلسة تصوير. يعد الحفاظ على رطوبة الأنسجة بمحلول ملحي معقم ودافئ مسبقا أثناء التصوير أمرا ضروريا ويمنع تليف الأنسجة.
لضمان إجراء التجربة بطريقة قابلة للتكرار ، من المهم محاذاة الليزر قبل الاستخدام للحصول على الأمثل وقياس خرج الطاقة لليزر متعدد الفوتونات في بداية كل جلسة. معلمات مثل نوع الهدف والتكبير ووقت المسكن وقوة الليزر والطول الموجي لها تأثيرات على مدى الاجتثاث بالليزر المجهري ويجب أخذها في الاعتبار. في هذه الدراسة ، يتم إجراء كل من الاستئصال بالليزر والتصوير بقوة ليزر تبلغ 1.2 واط (خارج العدسة) بطول موجي 960 نانومتر من خلال هدف Fluotar VISIR 25x / 0.95 WATER. يؤثر تغيير الطول الموجي أو خصائص المسح الضوئي على مدى الضرر المجهري. يترجم الطول الموجي المنخفض (مثل 840 نانومتر) إلى فوتونات ذات طاقة أعلى وغالبا في ناتج أعلى من الليزر ، وقد يعزز الضرر المجهري. ينتج عن التكبير العالي المزيد من الطاقة لكل منطقة ، وبالتالي وقت أقل لاستئصال الخبايا ، والعكس صحيح. يمكن أيضا زيادة وقت مسكن البكسل أو تقليله لتغيير سرعة الاجتثاث ومدى الضرر. عندما يكون النسيج المصور غير مستقر (على سبيل المثال ، بسبب الحركات التمعجية) ، يجب إجراء الاستئصال بسرعة. لهذا الغرض ، يجب تحسين سرعة الاجتثاث ، على سبيل المثال ، زيادة التكبير و / أو إخراج الليزر.
يعد العثور على نفس المنطقة المعوية خلال جلسات تصوير متعددة خطوة مهمة أخرى يجب تنفيذها بشكل صحيح لضمان نجاح التجربة. للقيام بذلك ، يجب وضع الأمعاء بنفس الطريقة بالضبط في جميع النقاط الزمنية. نوصي دائما باستخدام الأعور كنقطة مرجعية للعثور على نفس المناطق في الأمعاء الدقيقة والكبيرة. يضمن تمديد الأنسجة ذات الأهمية برفق باستخدام مسحات القطن أن تكون منطقة الاهتمام في نطاق مسافة العمل الموضوعية ويزيد من عدد المناطق التي يمكن تتبعها. بالإضافة إلى ذلك ، نوصي دائما باستئصال وتصوير مواضع مجهرية متعددة في كل ماوس لحساب المناطق التي قد لا يتم توطينها مرة أخرى في جلسة تصوير لاحقة. إذا تعذر العثور على المناطق ، على الرغم من أن وضع الأمعاء صحيح ، فقد يساعد ذلك في إعادة وضع الماوس وتغيير اتجاه المنطقة المكشوفة. يمكن أن يكون تتبع الخبايا بمرور الوقت مرهقا للتجارب التي يتم فيها إزالة الحقول المعوية الأكبر للعديد من الخبايا المجاورة. يمكن أن تؤدي مثل هذه الإهانات الضارة إلى إعادة تشكيل الأنسجة خارج الطبقة الظهارية الأحادية ، والتي يمكن أن تتوج بتعديل معالم الأنسجة المستخدمة لتتبع المنطقة بمرور الوقت. إن اختيار المعالم على مسافة كافية من الموقع المتضرر والتقاط مجالات رؤية أكبر تتجاوز المنطقة المتضررة بعدة مئات من الميكرومترات يزيد من فرصة نجاح التجارب طويلة الأجل. بالإضافة إلى الوضع غير الصحيح للأمعاء على مرحلة المجهر ، قد تتداخل الحركات التمعجية في الجهاز الهضمي مع التصوير. يمكن تحسين هذه المشكلة بطريقتين. إذا لم يكن تواتر الحركات مرتفعا جدا ، فقد تتكرر العملية في نفس المنطقة مع زيادة وقت التعرض. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام كميات أكبر من التخدير لتقليل التمعج. نوصي بالحد من جرعات أعلى من الأيزوفلوران إلى تعديلات قصيرة. إجمالا ، يجب أن تبقى جلسات التصوير قصيرة قدر الإمكان ، على النحو الأمثل أقل من 3 ساعات ، لضمان التعافي السريع.
يتميز نهج الاجتثاث بالليزر والفحص المجهري الطولي داخل الجسم بالعديد من المزايا عند مقارنته بنماذج الضرر الأخرى. افتقرت نماذج الضرر (الكيميائية) السابقة إلى القدرة على حصر الإهانة الضارة محليا6،11،12،19،20. يتغلب الاجتثاث بالليزر على هذا القصور من خلال تقييد الضرر بمنطقة اهتمام محددة. وهذا يمكن الباحثين من التحكم في موقع الإصابة ، وكذلك مدى الضرر. يمكن تعديل شدة الضرر لاستئصال الخبايا أو الحقول المعوية المجهرية بأكملها للإبلاغ عن الاستجابات التجديدية على نطاق السرداب. بالإضافة إلى التحكم المكاني ، يسمح الاجتثاث بالليزر أيضا بتحديد وقت ظهور الضرر بدقة ، وبالتالي تجاوز دقة نماذج الأدوية والكيماويات والعدوى السابقة9،10،11،12،19،20. يتوسع بروتوكولنا في الدراسات السابقة التي استخدمت الاستئصال الحراري الناجم عن الليزر كوسيلة لإحداث تلف موضعي في الأمعاء21,23. صورت نماذج الضرر السابقة التي يسببها الليزر المناطق المحلية في الأمعاءالدقيقة 21 أو السطح اللمعي للقولون البعيد23. يتيح نهج الجراحة والاستئصال بالليزر المشترك تصور ظهارة الأمعاء (الخبايا على وجه الخصوص) بدقة عالية ، وإجراء الاستئصال بالليزر ومتابعة تصوير استعادة الأنسجة في أي موضع من الأمعاء الدقيقة والأزعور والقولون القريب. إنه يلتقط استعادة نفس المناطق المعوية بمرور الوقت ، مما يسمح بتصور طبقات مختلفة من الأمعاء (الغشاء المخاطي ، تحت المخاطية ، العضلات ، والأمصال) وفقا للإعداد التجريبي. تم تصميم تقنيتنا بشكل أساسي للتصوير المتكرر طويل المدى لمدة عدة أسابيع / أشهر. لدراسة ديناميكيات الاسترداد قصيرة المدى للخبايا (على سبيل المثال ، لعدة أيام متتالية بعد الضرر) ، يمكن دمج نهج الاجتثاث بالليزر الموصوف هنا مع نوافذ التصوير داخل الجسم27،28،40.
يمكن استخدام هذا البروتوكول للعديد من التطبيقات البحثية من مجالات علمية متنوعة تشمل التجديد والمناعة وأبحاث السرطان. يلقي التصوير الطولي لتجديد الأمعاء الضوء على الديناميات الخلوية التي تحافظ على سلامة الظهارة ووظيفة الحاجز ، وتمكن من الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض في تجويف الأمعاء ، والتي تكمن وراء إزالة وانتشار الطفرات المسرطنة. سيلقي كل سؤال علمي مطالب فريدة على مدى الضرر الناجم عن الليزر ومدة التصوير. يمكن للفئران المراسل الفلورية والأصباغ المحقونة توسيع وتحسين البيانات التي يمكن الحصول عليها بشكل كبير من خلال السماح بتصور أي خلية وبنية ذات أهمية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام ماوس Lgr5-CreERt2: Rosa26-Confetti لتصور ذرية الخلايا الجذعية ، بينما يبلغ مراسل Rosa26-mTmG عن بنية الأنسجة. معا ، تجعل هذه التطورات التكنولوجية الحديثة التجارب المعوية داخل الجسم أداة مربحة لتعزيز فهمنا لبيولوجيا الأمعاء والمرض.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي NWO (منحة Vici 09150182110004 إلى JVR ومنحة Veni 09150161910151 إلى H.A.M) ، OCENW. GROOT.2019.085 (إلى JVR) ، وزمالة EMBO لما بعد الدكتوراه (منحة ALTF 452-2019 إلى H.A.M).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
| Autoclave | Certoclav | ||
| Betadine | Mylan | 202809 | |
| Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
| Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
| Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
| Ethanol 80% | homemade | NA | |
| Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
| Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
| Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
| Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
| Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
| Imaging box | Custom made | ||
| Incision film | Nobafilm | 172215 | |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
| Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
| Micropore paper tape | Micropore | ||
| NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
| Needle 25G | BD | 300600 | |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
| Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
| Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
| Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
| Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
| Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
| Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
| Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
| Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
| VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
| Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |
References
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Darwich, A. S., Aslam, U., Ashcroft, D. M., Rostami-Hodjegan, A. Meta-analysis of the turnover of intestinal epithelia in preclinical animal species and humans. Drug Metabolism and Disposition. 42 (12), 2016-2022 (2014).
- Beumer, J., Clevers, H. Regulation and plasticity of intestinal stem cells during homeostasis and regeneration. Development. 143 (20), 3639-3649 (2016).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Azkanaz, M., et al. Retrograde movements determine effective stem cell numbers in the intestine. Nature. 607 (7919), 548-554 (2022).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
- Asfaha, S., et al. Krt19+/Lgr5- cells are radioresistant cancer-initiating stem cells in the colon and intestine. Cell Stem Cell. 16 (6), 627-638 (2015).
- Schmitt, M., et al. Paneth cells respond to inflammation and contribute to tissue regeneration by acquiring stem-like features through SCF/c-Kit signaling. Cell Reports. 24 (9), 2312-2328 (2018).
- Davidson, L. A., et al. Alteration of colonic stem cell gene signatures during the regenerative response to injury. Biochimica et Biophysica Acta. 1822 (10), 1600-1607 (2012).
- Ijiri, K., Potten, C. S. Further studies on the response of intestinal crypt cells of different hierarchical status to eighteen different cytotoxic agents. British Journal of Cancer. 55 (2), 113-123 (1987).
- Andersson-Rolf, A., Zilbauer, M., Koo, B. K., Clevers, H. Stem cells in repair of gastrointestinal epithelia. Physiology. 32 (4), 278-289 (2017).
- Totafurno, J., Bjerknes, M., Cheng, H. The crypt cycle. Crypt and villus production in the adult intestinal epithelium. Biophysical Journal. 52 (2), 279-294 (1987).
- Dekaney, C. M., Gulati, A. S., Garrison, A. P., Helmrath, M. A., Henning, S. J. Regeneration of intestinal stem/progenitor cells following doxorubicin treatment of mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (3), G461-G470 (2009).
- Cairnie, A. B., Millen, B. H. Fission of crypts in the small intestine of the irradiated mouse. Cell and Tissue Kinetics. 8 (2), 189-196 (1975).
- Bruens, L., Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J., Snippert, H. J. In vivo imaging reveals existence of crypt fission and fusion in adult mouse intestine. Gastroenterology. 153 (3), 674-677 (2017).
- Baker, A. M., et al. Crypt fusion as a homeostatic mechanism in the human colon. Gut. 68 (11), 1986-1993 (2019).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118 (2), 229-241 (2004).
- Choi, J., et al. Intestinal crypts recover rapidly from focal damage with coordinated motion of stem cells that is impaired by aging. Scientific Reports. 8 (1), 10989 (2018).
- Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
- Choi, M., Yun, S. H. In vivo femtosecond endosurgery: an intestinal epithelial regeneration-after-injury model. Optics Express. 21 (25), 30842-30848 (2013).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (1), 256-261 (2009).
- Hua, G., et al. Distinct levels of radioresistance in Lgr5+ colonic epithelial stem cells versus Lgr5+ small intestinal stem cells. Cancer Research. 77 (8), 2124-2133 (2017).
- Rompolas, P., et al. Live imaging of stem cell and progeny behaviour in physiological hair-follicle regeneration. Nature. 487 (7408), 496-499 (2012).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917 (2014).
- Rakhilin, N., et al. An intravital window to image the colon in real time. Nature Communications. 10 (1), 5647 (2019).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16 (1), 239-262 (2021).
- Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
- Krndija, D., et al. Active cell migration is critical for steady-state epithelial turnover in the gut. Science. 365 (6454), 705-710 (2019).
- Bruens, L., et al. Calorie restriction increases the number of competing stem cells and decreases mutation retention in the intestine. Cell Reports. 32 (3), 107937 (2020).
- Bietar, B., Zhou, J., Lehmann, C. Utility of intestinal intravital microscopy for the study of CNS injury-induced immunodepression syndrome (CIDS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 79 (1), 137-147 (2021).
- Erreni, M., Doni, A., Weigert, R. Method for acute intravital imaging of the large intestine in live mice. Methods in Molecular Biology. 2304, 285-299 (2021).
- Hiltensperger, M., et al. Skin and gut imprinted helper T cell subsets exhibit distinct functional phenotypes in central nervous system autoimmunity. Nature Immunology. 22 (7), 880-892 (2021).
- Martínez-Sánchez, L. D. C., et al. Epithelial RAC1-dependent cytoskeleton dynamics controls cell mechanics, cell shedding and barrier integrity in intestinal inflammation. Gut. 72 (2), 275-294 (2022).
- Means, A. L., Xu, Y., Zhao, A., Ray, K. C., Gu, G. A CK19(CreERT) knockin mouse line allows for conditional DNA recombination in epithelial cells in multiple endodermal organs. Genesis. 46 (6), 318-323 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
