Summary
Här presenterar vi en metod för att få bilder av tarmen vid laserinducerad sårbildning. Genom att exponera mustarmen för en multifotonlaser induceras förlusten av en enda eller flera kryptor lokalt. Genom att upprepade gånger avbilda det skadade området under månader fångas realtidsdynamiken i tarmåterhämtningen.
Abstract
Att undersöka tarmåterhämtning in vivo är en utsökt teknisk utmaning. Brist på longitudinella avbildningsprotokoll har förhindrat djupare insikter i cell- och vävnadsskaldynamiken som orkestrerar tarmregenerering. Här beskriver vi en intravital mikroskopimetod som lokalt inducerar vävnadsskada på en enda kryptskala och följer tarmepitelets regenerativa respons hos levande möss. Enstaka kryptor eller större tarmfält ablerades av en högintensiv multifotoninfraröd laser på ett tids- och rymdkontrollerat sätt. Efterföljande långvarig repetitiv intravital avbildning möjliggjorde spårning av de skadade områdena över tid och möjliggjorde övervakning av kryptdynamik under vävnadsåtervinning under en period av flera veckor. Kryptombyggnadshändelser som kryptklyvning, fusion och försvinnande observerades i den närliggande vävnaden vid laserinducerad skada. Detta protokoll möjliggör studier av kryptdynamik både i homeostatiska och patofysiologiska inställningar, såsom åldrande och tumörinitiering.
Introduction
Tarmens epitelfoder utmanas ständigt av magsyror, toxiner och mikrobiota som kan orsaka störningar i epitelbarriären. Tarmstruktur och vävnadsorganisation är specialiserade för att ständigt självförnya och reparera skador. Tunntarmens enkelskiktade epitel är organiserat i krypt-villusenheter1. Vid homeostas ger självförnyande Lgr5+ intestinala stamceller som finns vid basen av kryptan upphov till differentierad avkomma. De differentierade dottercellerna reser till spetsen av villusaxeln på ett transportbandssätt, där de kastas så att tarmfodret fylls på 3-5 dagar 2,3. På lång sikt bidrar inte alla Lgr5+-celler lika mycket till vävnadsförnyelse, eftersom detta också beror på cellernas förmåga att röra sig mot transportbandet mot kryptans bas (dvs. retrograd rörelse)4,5. Vid ablation av Lgr5+ celler genom exempelvis strålning flyttar stamceller utanför kryptans bas in i basen för att dedifferentiera och fylla på stamcellspoolen 6,7,8.
Akut inflammation kan orsaka förlust av Lgr5+ stamceller 9,10. Förutom stamcellsförlust kan många yttre faktorer orsaka akut skada på epitelet på kryptskalan. Strålning, kemiska behandlingar och antibiotika har visat sig skada tarmkrypter och villi11. Större fält av krypter och villi kan påverkas av bakteriella, virala och parasitiska infektioner12. Tarmen har en anmärkningsvärd förmåga att återhämta sig från inre och yttre skador på kryptskalan genom kryptklyvning (en uppdelning av en krypta i två)13. Vid sårning genomgår krypter i området intill skadan klyvning för att fylla på kryptnumren. Detta fenomen förekommer också, men i mindre utsträckning, under homeostas14,15. För att motverka en potentiell ökning av kryptantalet under homeostas kan krypter också smälta (slå samman två krypter till en)16,17. Huruvida kryptfusion också spelar en roll för att återupprätta kryptnummer efter sårning är okänt. Dessutom återstår dynamiken och regleringsfaktorerna i denna process att klarlägga.
Skademodeller är oumbärliga för att studera vävnadsregenerering in vivo. Olika skademodeller har använts för att studera tarmvävnadsregenerering. Tidigare experimentella strategier använde högdosstrålning för att tömma stamcellspooler18 eller behandling med dextransulfatnatrium (DSS) för att inducera kronisk och akut kolit och kryptförlust hos möss19,20. Encellsablation med genetiska eller optiska medel har använts för att förfina vävnadsskador och anses vara ett attraktivt verktyg för att särskilja stam- och stamcellernas roll 21,22 och studera vaskulär regenerering23. Dessutom har ett biopsiskadesystem utvecklats för att inducera skador i större fält av flera krypter och villi24. Viktigt är att svaret på den skadliga förolämpningen kan variera längs tarmens proximala-distala axel, som rapporterats för strålning, vilket orsakade mer skada i tunntarmen än i tjocktarmen25. Detta belyser behovet av riktade metoder som kontrollerar både omfattningen av den skadliga förolämpningen och dess lokalisering i tarmkanalen.
Skadeomfattning och återhämtning har konventionellt bedömts med statiska medel, vilket ger begränsad information om dynamiken i vävnadsåtervinning. Intravital mikroskopi (IVM) har öppnat unika möjligheter att kvantifiera stamcellsbeteende, epitelremodellering och regenerering i många organ 26,27,28,29,30, och har gett effektfulla insikter i tarmbiologi 4,5,21,31,32,33,34, 35,36.
Här beskriver vi en metod för att orsaka spatiotemporalt definierad tarmskada och fånga återhämtningen av tarmepitelslemhinnan. Vi använder två fotonbaserade laserablationer för att skada tarmkrypter och följer den omedelbara sårresponsen och den långsiktiga återhämtningen genom repetitiv intravital mikroskopi. Vårt protokoll gör det möjligt att kartlägga den regenerativa ombyggnaden av tarmvävnadsarkitekturen som svar på lokal vävnadsskada. Kryptdynamik, inklusive fissions- och fusionshändelser, kan lätt kvantifieras och spåras över tiden. Tillämpningen av laserablation och repetitiv intravital avbildning kan användas som en plattform för att undersöka vävnadsskaldynamiken i tarmarkitekturen under homeostas och patofysiologi, såsom tumörinitiering.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs i denna studie utfördes i enlighet med riktlinjerna och godkännandet av Animal Welfare Body (AWB) vid Netherlands Cancer Institute (NKI).
OBS: Rådfråga institutets djurförsöksnämnd innan du utför några djurförsök.
1. Förberedelse för operation och intravital avbildning
- Prekirurgiska behandlingar
- Inducera 8-12 veckor gamla K19-CreERT237: Rosa26-mTmG 38 och Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: Rosa26-konfetti39 möss genom att injicera tamoxifen upplöst i solrosolja intraperitonealt 4-6 veckor före operationen (figur 1).
- Applicera analgesi. Injicera 200 μl buprenorfin (0,1 mg/kg kroppsvikt) utspätt i NaCl 0,9 % per 30 g mus subkutant 30 min före operation. Administrera karprofen (0,067 mg / ml) i en flaska innehållande 125 ml icke-surgjort autoklaverat dricksvatten 24 timmar före operationen. Alternativt administrera en karprofeninjektion subkutant (5 mg/kg) 30 minuter före operationens början.
- Förberedelse för operation
- Introducera autoklaverade sterila kirurgiska verktyg i biohazardskåpet.
- Slå på värmedynan och ställ in temperaturen på 37 °C.
- Förberedelse för intravital avbildning
- Slå på mikroskopets temperaturkontrollerade kammare minst 4 timmar före avbildning för att ge tillräckligt med tid för temperaturstabilisering.
OBS: Den tid som behövs kan variera beroende på vilken maskin som används. - Håll temperaturen inne i klimatkammaren stabil vid 37 °C.
- Slå på tvåfotonmikroskopet, skannern och lasern.
- Starta bildprogramvaran.
- Ställ in laserns våglängd till 960 nm och öppna slutaren.
- Slå på mikroskopets temperaturkontrollerade kammare minst 4 timmar före avbildning för att ge tillräckligt med tid för temperaturstabilisering.
2. Kirurgi och intravital avbildning
- Kirurgisk exponering av tarmen
- Bedöva musen med 2% -3% isofluran och placera den på en värmedyna, täckt med en steril trasa. Kontrollera anestesidjupet genom att bedöma andningsfrekvensen och andningskvaliteten (ett andetag / sekund) och genom att kontrollera musens reflex.
- Täck musens ögon med ögonsalva.
- Injicera 200 μl förvärmd steril saltlösning subkutant.
- Raka buken och ta bort håret. Byt den sterila duken i operationsområdet.
- Sätt i en rektal sond för att övervaka musens temperatur.
OBS: Temperaturen bör vara ca 37 °C. - Sätt på ett nytt par sterila handskar.
- Rengör det kirurgiska området på ett cirkulärt sätt med alternerande skrubb av antiseptisk lösning följt av 80% etanol tre gånger. Ta bort överskott av etanol med en steril bomullspinne.
OBS: Det är viktigt att övervaka musen för hypotermi vid denna tidpunkt. - Täck musen med ett sterilt kirurgiskt draperi.
- Kontrollera musens reflex.
- Gör ett ~ 10 mm vertikalt mittlinjesnitt genom huden med en steril skalpell.
- Klipp linea alba med sax för att separera rectus abdominis musklerna och öppna buken.
- Hitta musens cecum med sterila bomullspinnar dränkta i steril förvärmd saltlösning för att använda den som referenspunkt.
- Gör ett litet snitt i en bit steril gasbindning, våt den i förvärmd steril saltlösning och placera den ovanför snittet.
- Ta ut tarmen med sterila bomullspinnar dränkta i förvärmd steril saltlösning. Håll tarmen hydratiserad genom att tillsätta steril förvärmd saltlösning.
- Placera en steril skräddarsydd bildkammare bredvid musen.
- Överför musen till den förvärmda sterila bildboxen.
- Placera tarmen på det sterila glaset i bildboxen. Placera musens huvud inuti bildrutans inandningsrör, såsom visas i figur 1.
- Säkra musen vid behov med steril flexibel film och tejp.
- Placera bildboxen som innehåller musen i mikroskopkammaren.
- Intravital avbildning
- Övervaka musen under avbildning genom att kontrollera frekvensen och djupet av andning och temperatur via en rektal sond var 15: e minut. Andelen isofluran bör hållas mellan 1%-2%. Justera vid behov.
- Hitta en region i tarmen med hjälp av mikroskopets okular.
- Få en vidvinkelvy av området av intresse med hjälp av mikroskopets interna kamera, som visas i figur 2A.
- Avbilda området av intresse med hjälp av 960 nm laser i multifotonmikroskopet. Justera lasereffekten och våglängden enligt fluoroforerna som används i experimentet.
- Skaffa en 10-20 steg z-stack med 3 μm av regionen av intresse.
- Laser ablation
- Välj en enda position eller flera positioner från panelen som avbildats tidigare.
- Använd blekpunktskalibreringsfunktionen i bildåtergivningsprogrammet med en zoom på 32 och 124 x 124 pixlars upplösning med en skanningshastighet på 400 Hz, med hjälp av den dubbelriktade skanningsegenskapen i 3–10 sekunder, beroende på skadans storlek. Initieringen av skador i kryptområdet kan erkännas av en ökning av autofluorescens i både de gröna och röda kanalerna.
- Upprepa föregående två steg för flera regioner i samma mus.
- Efter ablation, skaffa z-staplar av de skadade områdena för att bekräfta skadans plats och omfattning.
- Stängning av operationsområdet
- Placera musen, medan den fortfarande är under anestesi, i ett sterilt sutureringsområde.
- Sätt in den exponerade tarmen tillbaka i buken med sterila bomullspinnar dränkta i förvärmd steril saltlösning.
- Suturera linea alba genom att utföra en enkel kontinuerlig sutur med en absorberbar 5-0 sutur. Stäng suturens extremiteter med kirurgiska knutar.
- Upprepa samma steg med hudskiktet.
- Stäng av isofluranstationen och rengör och sterilisera bildboxen och inlägget.
- Rengör operationsverktygen med det kirurgiska instrumentets rengöringsmedel, enzymatiska rengöringsmedel och smörjmedel för kirurgiska instrument. När de torkas, sterilisera operationsverktygen tillsammans med operationsboxen i autoklaven.
- Vård efter operation
- Låt musen återhämta sig från operationen medan buren placeras på värmedynan i ~ 1 timme.
OBS: Placera musen med andra burkamrater om möjligt. Ensamt boende är inte nödvändigt för återhämtning. - Kontrollera musens temperatur var 15: e minut under återhämtningen.
- Injicera 200 μl buprenorfin (0,1 mg/kg kroppsvikt) utspätt i NaCl 0,9 % per 30 g mus subkutant 6-12 timmar efter operationen.
- Administrera karprofen (0,067 mg / ml) i en flaska innehållande 125 ml icke-surgjort autoklaverat dricksvatten i 72 timmar efter operationen.
- Väg musen och övervaka välfärden varje dag i 1 vecka efter operationen.
- Låt musen återhämta sig från operationen medan buren placeras på värmedynan i ~ 1 timme.
3. Repetitiv kirurgi och intravital avbildning
- Kirurgi
- Vid den andra tidpunkten (minst 1 vecka efter den första bildsessionen) upprepar du steg 1.1.2, 1.2, 1.3 och 2.1.
- Intravital avbildning
- Upprepa steg 2.2.1-2.2.3.
- Använd blodkärlsmönstret för att hitta samma intressanta regioner som avbildas vid den första tidpunkten.
- Upprepa steg 2.2.4 och 2.2.5.
- Stängning av operationsområdet
- Upprepa steg 2.4.1.
- Om musen inte är avsedd att avbildas vid en annan tidpunkt, offra musen genom att utföra cervikal dislokation under terminal anestesi. Annars fortsätter du med nästa steg.
OBS: Enligt riktlinjerna i EU-direktiv 2010/63 / EU, bilaga IV, är cervikal dislokation en acceptabel metod. - Upprepa steg 2.4.2-2.4.6.
- Vård efter operation
- Upprepa steg 2.5.1-2.5.5.
Representative Results
För att demonstrera vilken typ av resultat som kan erhållas från laserablationsmetoden i kombination med intravital avbildning utförde vi ett experiment som visas i figur 1. Först injicerade vi K19-CreERT2; mTmG (K19cre-mTmG) och Lgr5eGFP-IRES-CreERT2; Rosa26-konfetti (Lgr5cre-konfetti) möss med tamoxifen för att stokastiskt märka celler med en av konfettifärgerna (eller grönt fluorescerande protein [GFP] i fallet med mTmG-möss). K19-cre inducerar härstamningsspårning från alla epitelceller, medan Lgr5-cre inducerar spårning från stamceller endast 8,18,37. Tamoxifeninjektionen administrerades 4-6 veckor före operationen och den första bildsessionen för att erhålla krypter där alla celler är monoklonala för en viss färg. Robust identifiering av samma vävnadsregioner under flera veckor är avgörande för att spåra ödet för samma krypter över tiden. Inneboende vävnadsarkitektoniska egenskaper, såsom vaskulaturen, kan användas som tillförlitliga vävnadslandmärken och spelades här in med mikroskopets interna kamera. Dessutom hjälpte märkning av en liten del av krypter med (minst två) olika färger att känna igen samma krypter i varje bildsession och följa deras beteende under den regenerativa processen efter laserskador. Vid kirurgisk exponering av musens tarm och förvärv av både kamera- och fluorescerande bilder av området av intresse (figur 2A) kan blekpunktsinställningar för multifotonlasern användas för att ablatera en eller flera krypter (figur 2B, C). Initieringen av skador kan kännas igen av en ökning av autofluorescens i både de gröna och röda kanalerna. För att studera dynamiken i kryptåtervinning upprepades kirurgi och avbildningsproceduren veckor / månader efter den första bildsessionen och vävnadens inneboende strukturer (vaskulatur och mönster av klonalt märkta krypter) användes som landmärken för att hitta exakt samma plats för skadan (figur 2). När denna metod tillämpades på Lgr5Cre-konfettimöss, där Lgr5-eGFP uttrycks på ett ojämnt sätt, kunde förändringar i kryptantal och former efter laserinducerad skada fångas (figur 3). Medan vissa regioner inte visade några förändringar i antalet krypter och strukturen (figur 3B), visade andra regioner omfattande kryptoombyggnad, vilket ses i antalet kryptfissions- och fusionshändelser (figur 3C) och förlusten av krypter 2 veckor efter den laserinducerade skadan (figur 3D). Genom att introducera olika storlekar av skador och kvantifiera fissions-, fusions- och försvinnandehändelser efter ablation, som i exemplet som visas i (figur 3E), kan dynamiken i skadeinducerad regenerering kartläggas i olika musmodeller.
Figur 1: Schematisk representation av experimentuppställningen. In vivo-märkning av tarmceller uppnås genom att injicera tamoxifen intraperitonealt i genetiskt modifierade musmodeller för att inducera Cre-medierad rekombination i tarmkrypter. Efter dagar eller veckor (när krypterna är monoklonala för en viss färg) exponeras tarmen kirurgiskt och utsätts för laserablation med hjälp av ett multifotonmikroskop med en temperaturkontrollerad kammare. Omfattningen av kryptskador karakteriseras omedelbart efter ablation och musen får återhämta sig från proceduren. Upprepad kirurgisk exponering och IVM används för att övervaka tarmåterhämtning över tid. Mönstret och fördelningen av blodvaskulaturen och olika färgade krypter används för att hitta tillbaka samma regioner veckor eller månader efter ablation. Kryptombyggnad (t.ex. fission eller fusion) kan observeras på platsen för skador veckor efter ablation. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Longitudinell avbildning av vävnadsregenerering vid laserinducerad skada i tarmen. När tarmen är placerad på exakt samma sätt kan blodkärlen i tarmen användas som en karta för att hitta och avbilda exakt samma regioner. (A) Kameraöversiktsbilder av tarmen. Streckade vita linjer representerar mönstret av vaskulaturen som gränsar till skadestället (vit låda), som används som ett landmärke för att hitta samma laserablerade region vid en annan tidpunkt. De två nedre bilderna visar den inzoomade vyn av den vita rutan. Pilen visar den exakta platsen för laserablation dag 1 och 1 månad senare. (B) Fluorescerande bilder av en enda kryptskada fångad av multifotonmikroskop. Pilen i den blå rutan visar platsen för skadan dag 1 och 1 månad senare. (C) Fluorescerande bilder av ett skadat fält av krypter. Pilarna i den blå rutan markerar skadans område dag 1 och 1 månad senare. Skalstänger: 1 mm (A, överst); 0,25 mm (A, botten); 200 μm (stor översikt B och C); och 50 μm (zoomade bilder B och C). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Intravital avbildning av kryptöden efter laserablation. (A) Med hjälp av konfettimodellen kan krypter märkta med olika färger följas över tid för att kartlägga återhämtningsdynamiken. Den vita pilen visar platsen för laserablation. Den gula rutan representerar en angränsande region (<100 μm från skadeplatsen), medan de blå och lila rutorna representerar regioner långt (>100 μm) från det laserablerade området. Olika regenereringssätt observeras. (B) Vissa regioner förblir oförändrade som i den lila rutan. (C) Andra regioner uppvisar ombyggnad av kryptor i form av kryptklyvning eller fusion; De streckade vita linjerna och pilarna visar kryptklyvningshändelser och de orange streckade linjerna och pilarna visar kryptfusionshändelser. (D) I vissa regioner observeras kryptförsvinnande, som i den gula rutan där kryptan markerad med en orange streckad linje försvann. (E) Ett kvantifieringsexempel som visar antalet kryptoombyggnadshändelser som observerats i angränsande områden (dvs. mindre än 100 μm) och långt från (dvs. mer än 100 μm) skadeplatsen. Skalstänger: 200 μm (A); 50 μm (B-D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Detta protokoll kombinerar mikroskopisk laserablation och longitudinell intravital mikroskopi för att följa tarmregenerering från tidigt skadesvar till långvarig vävnadsremodellering. Tekniken har etablerats i strikt överensstämmelse med etiska överväganden för att inducera och avbilda mikroskopisk laserablation, och när den följs exakt kommer den att upprätthålla djurens välbefinnande. Under operationen är det viktigt att se till att tarmens integritet är väl bevarad. Detta kan uppnås genom att försiktigt hantera vävnaden med sterila våta bomullspinne, vilket förhindrar blödning eller uttorkning av vävnaden. Omfattningen av laserinducerad mikroskopisk skada bör också bedömas noggrant genom att avbilda de olika tarmskikten i området efter laserablation. Om forskaren vill anpassa frekvensen av de försökssteg som beskrivs i detta protokoll, bör institutets djurförsöksetiska kommitté rådfrågas före försöket för att fastställa konsekvenserna för välbefinnandet.
Repetitiv intravital mikroskopi gör det möjligt att övervaka vävnadsåtervinning i samma mus över tiden. Upprepad kirurgisk exponering av tarmen ger lätt optisk tillgång till hela tarmkanalen. Vävnadens inneboende egenskaper, såsom vaskulaturen, fungerar som landmärken för att identifiera samma tarmregioner i varje bildsession. Således kan samma vävnadsregion avbildas under flera veckor, vilket gör det möjligt att kvantifiera långvarig vävnadsregenerering i samma tarmområde i samma mus. Den spatiotemporala kontrollen som erbjuds av den kombinerade kirurgiska och avbildningsmetoden ger fördelen att samma organ kan avbildas under både homeostatiska och regenererande förhållanden i samma mus, vilket står i kontrast till tidigare helorganskademodeller där kontroller och regenererande prover härstammar från olika möss 11,12,18,19,20 . Därför minimerar vår experimentella inställning det nödvändiga antalet djur som behövs för experimentet och minskar variationen inom djur.
Protokollfelsökning bör börja med en genomgång av mus- och tarmhanteringstekniken och en kontroll av mikroskopiutrustning och inställningar. Det finns många kritiska steg i detta protokoll som kräver extra uppmärksamhet. För det första, för att säkerställa djurens välbefinnande och kontinuerlig hög datakvalitet, måste allt arbete utföras i en ren steril miljö med aseptisk teknik, och mustemperaturen bör bibehållas under operationen och varje bildbehandling. Att hålla vävnaden hydratiserad med steril, förvärmd saltlösning under avbildning är viktigt och förhindrar vävnadsfibros.
För att säkerställa att experimentet utförs på ett reproducerbart sätt är det viktigt att rikta in lasrarna före användning för optimal inlärning och att mäta effekten från multifotonlasern i början av varje session. Parametrar som typ av objektiv, förstoring, uppehållstid, lasereffekt och våglängd påverkar omfattningen av mikroskopisk laserablation och bör beaktas. I denna studie utförs både laserablation och avbildning med en lasereffekt på 1,2 W (ut ur linsen) vid en våglängd på 960 nm genom ett Fluotar VISIR 25x/0,95 WATER-mål. Ändring av våglängd eller optiska skanningsegenskaper påverkar omfattningen av mikroskopiska skador. En lägre våglängd (t.ex. 840 nm) innebär fotoner med högre energi och ofta i en högre utmatning från lasern och kan förbättra mikroskopisk skada. En högre zoom resulterar i mer energi per region, och därför mindre tid att ablatera krypter och vice versa. Pixelns uppehållstid kan också ökas eller minskas för att ändra ablationshastigheten och skadans omfattning. När den avbildade vävnaden inte är stabil (t.ex. på grund av peristaltiska rörelser) måste ablation utföras snabbt. För detta ändamål bör ablationshastigheten optimeras genom att till exempel öka zoomen och/eller laserutgången.
Att hitta samma tarmregion under flera bildsessioner är ett annat kritiskt steg som måste utföras korrekt för att säkerställa experimentets framgång. För att göra det måste tarmen placeras på exakt samma sätt vid alla tidpunkter. Vi rekommenderar att alltid använda blindtarmen som referenspunkt för att hitta samma regioner i tunntarmen och tjocktarmen. Att försiktigt sträcka vävnaden av intresse med bomullspinne säkerställer att regionen av intresse ligger inom räckvidden för det objektiva arbetsavståndet och maximerar antalet regioner som kan spåras tillbaka. Dessutom rekommenderar vi att du alltid ablaterar och avbildar flera mikroskopiska positioner i varje mus för att ta hänsyn till regioner som kanske inte lokaliseras tillbaka i en senare bildsession. Om regionerna inte kan hittas, även om tarmens positionering är korrekt, kan det hjälpa till att flytta musen och ändra orienteringen av det utsatta området. Att spåra krypter över tid kan vara besvärligt för experiment där större tarmfält i flera intilliggande kryptor ableras. Sådana skadliga förolämpningar kan framkalla vävnadsombyggnad bortom epitelmonoskiktet, vilket kan kulminera i modifiering av vävnadens landmärken som används för spårning av regionen över tiden. Att välja landmärken på tillräckligt avstånd till den skadade platsen och fånga större synfält som överträffar det skadade området med flera hundra mikrometer ökar chansen för framgångsrika långsiktiga experiment. Förutom felaktig positionering av tarmen på mikroskopstadiet kan peristaltiska rörelser i mag-tarmkanalen störa avbildning. Detta problem kan förbättras på två sätt. Om rörelsefrekvensen inte är för hög kan processen upprepas i samma region med ökad exponeringstid. Alternativt kan högre mängder anestesi användas för att minska peristaltiken. Vi rekommenderar att man begränsar högre doser isofluran till korta justeringar. Sammantaget bör bildsessionerna hållas så korta som möjligt, optimalt under 3 timmar, för att säkerställa snabb återhämtning.
Den kombinerade laserablationen och den longitudinella intravitala mikroskopimetoden har flera fördelar jämfört med andra skademodeller. Tidigare (kemiska) skademodeller saknade förmågan att lokalt begränsa den skadliga förolämpningen 6,11,12,19,20. Laserablation övervinner denna brist genom att begränsa skadan till ett definierat område av intresse. Detta gör det möjligt för forskare att kontrollera platsen för skadan, liksom skadans omfattning. Skadornas svårighetsgrad kan moduleras till att ablatera kryptor eller hela mikroskopiska tarmfält för att informera om regenerativa svar på kryptskalan. Förutom rumslig kontroll tillåter laserablation också att exakt tajma skadans början och därigenom överträffa precisionen hos tidigare läkemedels-, kemikalie- och infektionsmodeller 9,10,11,12,19,20. Vårt protokoll bygger vidare på tidigare studier som använt laserinducerad termisk ablation som metod för att inducera lokal skada i tarmen21,23. Tidigare laserinducerade skademodeller avbildade lokala områden i tunntarmen21 eller luminalytan i distala tjocktarmen23. Den kombinerade kirurgiska och laserablationsmetoden gör det möjligt att visualisera tarmepitelet (krypter i synnerhet) med hög upplösning och att utföra laserablation och uppföljningsavbildning av vävnadsåtervinning i vilken position som helst i tunntarmen, blindtarmen och proximal kolon. Det fångar återhämtningen av samma tarmregioner över tiden, vilket gör det möjligt att visualisera olika lager i tarmen (slemhinna, submucosa, muscularis och serosa) enligt experimentuppställningen. Vår teknik är huvudsakligen skräddarsydd för långvarig upprepad avbildning under en period av flera veckor/månader. För att studera krypternas kortsiktiga återhämtningsdynamik (t.ex. under flera på varandra följande dagar efter skada) kan laserablationsmetoden som beskrivs här kombineras med intravital imaging windows27,28,40.
Detta protokoll kan användas för en mängd forskningsansökningar från olika vetenskapliga områden som spänner över regenerering, immunologi och cancerforskning. Longitudinell avbildning av tarmregenerering belyser den cellulära dynamiken som bevarar epitelintegritet och barriärfunktion, möjliggör värdförsvar mot patogener i tarmlumen och som ligger till grund för clearance och spridning av onkogena mutationer. Varje vetenskaplig fråga kommer att ställa unika krav på omfattningen av laserinducerad skada och varaktigheten av avbildning. Fluorescerande reportermöss och injicerade färgämnen kan drastiskt expandera och förfina de data som kan förvärvas genom att tillåta visualisering av vilken cell och struktur som helst av intresse. Till exempel kan en Lgr5-CreERt2: Rosa26-Confetti-mus användas för att visualisera stamcellsavkommor, medan Rosa26-mTmG-reportern informerar om vävnadsarkitektur. Tillsammans gör dessa senaste tekniska framsteg intravitala tarmexperiment ett lukrativt verktyg för att främja vår förståelse av tarmbiologi och sjukdom.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Netherlands Organization of Scientific Research NWO (Vici-bidrag 09150182110004 till J.v.R. och Veni-bidrag 09150161910151 till H.A.M), OCENW. GROOT.2019.085 (till J.v.R), och ett EMBO postdoktoralt stipendium (bidrag ALTF 452-2019 till H.A.M).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
| Autoclave | Certoclav | ||
| Betadine | Mylan | 202809 | |
| Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
| Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
| Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
| Ethanol 80% | homemade | NA | |
| Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
| Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
| Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
| Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
| Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
| Imaging box | Custom made | ||
| Incision film | Nobafilm | 172215 | |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
| Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
| Micropore paper tape | Micropore | ||
| NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
| Needle 25G | BD | 300600 | |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
| Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
| Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
| Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
| Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
| Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
| Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
| Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
| Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
| VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
| Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |
References
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Darwich, A. S., Aslam, U., Ashcroft, D. M., Rostami-Hodjegan, A. Meta-analysis of the turnover of intestinal epithelia in preclinical animal species and humans. Drug Metabolism and Disposition. 42 (12), 2016-2022 (2014).
- Beumer, J., Clevers, H. Regulation and plasticity of intestinal stem cells during homeostasis and regeneration. Development. 143 (20), 3639-3649 (2016).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Azkanaz, M., et al. Retrograde movements determine effective stem cell numbers in the intestine. Nature. 607 (7919), 548-554 (2022).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
- Asfaha, S., et al. Krt19+/Lgr5- cells are radioresistant cancer-initiating stem cells in the colon and intestine. Cell Stem Cell. 16 (6), 627-638 (2015).
- Schmitt, M., et al. Paneth cells respond to inflammation and contribute to tissue regeneration by acquiring stem-like features through SCF/c-Kit signaling. Cell Reports. 24 (9), 2312-2328 (2018).
- Davidson, L. A., et al. Alteration of colonic stem cell gene signatures during the regenerative response to injury. Biochimica et Biophysica Acta. 1822 (10), 1600-1607 (2012).
- Ijiri, K., Potten, C. S. Further studies on the response of intestinal crypt cells of different hierarchical status to eighteen different cytotoxic agents. British Journal of Cancer. 55 (2), 113-123 (1987).
- Andersson-Rolf, A., Zilbauer, M., Koo, B. K., Clevers, H. Stem cells in repair of gastrointestinal epithelia. Physiology. 32 (4), 278-289 (2017).
- Totafurno, J., Bjerknes, M., Cheng, H. The crypt cycle. Crypt and villus production in the adult intestinal epithelium. Biophysical Journal. 52 (2), 279-294 (1987).
- Dekaney, C. M., Gulati, A. S., Garrison, A. P., Helmrath, M. A., Henning, S. J. Regeneration of intestinal stem/progenitor cells following doxorubicin treatment of mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (3), G461-G470 (2009).
- Cairnie, A. B., Millen, B. H. Fission of crypts in the small intestine of the irradiated mouse. Cell and Tissue Kinetics. 8 (2), 189-196 (1975).
- Bruens, L., Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J., Snippert, H. J. In vivo imaging reveals existence of crypt fission and fusion in adult mouse intestine. Gastroenterology. 153 (3), 674-677 (2017).
- Baker, A. M., et al. Crypt fusion as a homeostatic mechanism in the human colon. Gut. 68 (11), 1986-1993 (2019).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118 (2), 229-241 (2004).
- Choi, J., et al. Intestinal crypts recover rapidly from focal damage with coordinated motion of stem cells that is impaired by aging. Scientific Reports. 8 (1), 10989 (2018).
- Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
- Choi, M., Yun, S. H. In vivo femtosecond endosurgery: an intestinal epithelial regeneration-after-injury model. Optics Express. 21 (25), 30842-30848 (2013).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (1), 256-261 (2009).
- Hua, G., et al. Distinct levels of radioresistance in Lgr5+ colonic epithelial stem cells versus Lgr5+ small intestinal stem cells. Cancer Research. 77 (8), 2124-2133 (2017).
- Rompolas, P., et al. Live imaging of stem cell and progeny behaviour in physiological hair-follicle regeneration. Nature. 487 (7408), 496-499 (2012).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917 (2014).
- Rakhilin, N., et al. An intravital window to image the colon in real time. Nature Communications. 10 (1), 5647 (2019).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16 (1), 239-262 (2021).
- Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
- Krndija, D., et al. Active cell migration is critical for steady-state epithelial turnover in the gut. Science. 365 (6454), 705-710 (2019).
- Bruens, L., et al. Calorie restriction increases the number of competing stem cells and decreases mutation retention in the intestine. Cell Reports. 32 (3), 107937 (2020).
- Bietar, B., Zhou, J., Lehmann, C. Utility of intestinal intravital microscopy for the study of CNS injury-induced immunodepression syndrome (CIDS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 79 (1), 137-147 (2021).
- Erreni, M., Doni, A., Weigert, R. Method for acute intravital imaging of the large intestine in live mice. Methods in Molecular Biology. 2304, 285-299 (2021).
- Hiltensperger, M., et al. Skin and gut imprinted helper T cell subsets exhibit distinct functional phenotypes in central nervous system autoimmunity. Nature Immunology. 22 (7), 880-892 (2021).
- Martínez-Sánchez, L. D. C., et al. Epithelial RAC1-dependent cytoskeleton dynamics controls cell mechanics, cell shedding and barrier integrity in intestinal inflammation. Gut. 72 (2), 275-294 (2022).
- Means, A. L., Xu, Y., Zhao, A., Ray, K. C., Gu, G. A CK19(CreERT) knockin mouse line allows for conditional DNA recombination in epithelial cells in multiple endodermal organs. Genesis. 46 (6), 318-323 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
