Summary
Denne artikel har til formål at give forskere en detaljeret og tilgængelig vejledning til at oprette en spædbarnssvinemodel af hæmoragisk chok.
Abstract
Hæmoragisk chok er en førende årsag til sygelighed og dødelighed hos pædiatriske patienter. Fortolkning af de kliniske indikatorer, der er valideret hos voksne for at vejlede genoplivning og sammenligning mellem forskellige terapier, er vanskelig hos børn på grund af denne populations iboende heterogenitet. Som følge heraf er passende styring af pædiatrisk hæmoragisk shock sammenlignet med voksne stadig ikke veletableret. Desuden udelukker manglen på pædiatriske patienter med hæmoragisk shock udviklingen af klinisk relevante undersøgelser. Af denne grund er en eksperimentel pædiatrisk dyremodel nødvendig for at studere virkningerne af blødning hos børn samt deres reaktion på forskellige terapier. Vi præsenterer en spædbarnsdyrmodel af volumenstyret hæmoragisk chok hos bedøvede unge grise. Blødning induceres ved at trække et tidligere beregnet blodvolumen tilbage, og grisen overvåges efterfølgende og genoplives med forskellige terapier. Her beskriver vi en præcis og meget reproducerbar model af hæmoragisk chok hos umodne svin. Modellen giver hæmodynamiske data, der karakteriserer kompenserende mekanismer, der aktiveres som reaktion på alvorlig blødning.
Introduction
Livstruende blødning på grund af traumer, selvom det er ualmindeligt, er den største dødsårsag hos pædiatriske patienter 1,2. Yderligere årsager til hæmoragisk chok omfatter hæmoragisk feber, gastrointestinal blødning, leverkirurgi og hjertekirurgi, især når kardiopulmonal bypass anvendes3.
I modsætning til den voksne befolkning er der utilstrækkelige data om håndtering af pædiatrisk hæmoragisk shock, som i vid udstrækning er baseret på ekspertudtalelser eller direkte oversat fra voksenpraksis 2,4. Imidlertid er oversættelse af ledelsesstrategier fra voksne muligvis ikke hensigtsmæssig. For eksempel er kliniske indikatorer, der er valideret hos voksne, vanskelige at ekstrapolere til pædiatriske patienter på grund af den fysiologiske heterogenitet, der findes på tværs af grupper i forskellige aldre, og de forskellige skademønstre, der er fremherskende i den pædiatriske population. Derfor er specifikke endepunkter, der ville udløse intervention hos den pædiatriske patient, ikke veldefinerede. Desuden er der ikke nok beviser for de skadelige virkninger, som terapier, der i øjeblikket implementeres hos voksne, kan have på børn 2,4,5.
I lyset af alt dette er der behov for yderligere undersøgelse for at etablere specifikke genoplivningstærskler for hurtig indgriben samt for bedre at bestemme, hvilke er de mest hensigtsmæssige terapier til pædiatrisk hæmoragisk shock. Udviklingen af kvalitets- og klinisk relevante undersøgelser af livstruende blødning hos børn er imidlertid vanskelig på grund af patienternes mangel og den allerede nævnte heterogenitet i den pædiatriske befolkning fra neonatalperioden gennem ungdomsårene.
Den kliniske relevans af hæmoragisk chok ud over vanskelighederne med at udføre kliniske undersøgelser på pædiatriske patienter understreger behovet for prækliniske evalueringer af dyremodeller for at studere patofysiologi efter hæmoragisk chok hos børn samt at sammenligne forskellige terapier. Flere dyremodeller er blevet brugt i vid udstrækning i forskning til at studere hæmoragisk chok 6,7,8,9. På grund af deres anatomiske og fysiologiske ligheder med mennesker er svin højt værdsat i biomedicinsk forskning. Med hensyn til fordelene ved at bruge specifikke spædbarnsmodeller viser beviser, at umodne svinehæmodynamik såvel som åndedræts-, hæmatologiske og metaboliske systemer er meget sammenlignelige med dem hos unge mennesker9. Dette giver en unik mulighed for at simulere et klinisk scenario af hæmoragisk chok hos børn.
I denne model induceres blødning ved at trække et tidligere beregnet blodvolumen tilbage. Derefter overvåges grisen, og forskellige genoplivningsvæsker administreres.
Her beskriver vi en præcis og meget reproducerbar model af hæmoragisk chok hos umodne svin. Modellen giver hæmodynamiske data, der karakteriserer kompenserende mekanismer aktiveret som reaktion på alvorlig blødning.
Protocol
Forsøgene i denne protokol blev godkendt af den institutionelle etiske komité for dyreforskning ved Gregorio Marañón Universitetshospital, Madrid, Spanien, og Rådet for Landbrug og Miljø under Madrids selvstyrende regering (tilladelsesnummer: 12/0013). Europæiske og spanske retningslinjer for etisk pleje og brug af forsøgsdyr blev anvendt gennem hele undersøgelsen. Eksperimenterne blev udført på Institut for Eksperimentel Medicin og Kirurgi, Gregorio Marañón Universitetshospital, Madrid, Spanien.
BEMÆRK: Den valgte dyremodel bestod af sunde 2-3 måneder gamle (8-12 kg) minigrise (Sus scrofa domestica). Minigrise er resultatet af en krydsning af tre forskellige racer, der gør dem velegnede til biomedicinsk forskning. Dyrene er næsten identiske linjer og leveres af et specifikt autoriseret avlsanlæg i Madrid (IMIDRA), som holder vedligeholdelsen af tre homozygote genetiske linjer i renhed. Han- og hundyr blev brugt om hverandre. Dyrene blev fodret med en standard svinediæt og observeret i mindst 2 dage for at sikre et godt helbred. Mad, men ikke vand, blev trukket tilbage natten før procedurerne for at reducere risikoen for aspiration. Et typisk eksperiment kræver ca. 6 timer at gennemføre, herunder 30 minutter til anæstesiinduktion og kirurgisk forberedelse, 60 minutter til instrumentering, 30 minutter til genopretning, 60 minutter til blødningsinduktion og posterior stabilisering, 30 minutter til genoplivning og 120 minutter til opfølgning.
1. Anæstesi, intubation og mekanisk ventilation
- Præmedicinere grisen med en intramuskulær injektion af ketamin (10 mg / kg) og atropin (0,02 mg / kg) i det laterale område af nakken, bag øret eller i den bageste lårbensregion.
BEMÆRK: Antikolinerge lægemidler, såsom atropin, er nyttige, da svin kan spytte overdrevent under anæstesi10. Efter vores erfaring er denne dosis ketamin tilstrækkelig til at reducere stress og inducerer tilstrækkelig sedation og analgesi hos svin uden bivirkninger. Men hvis dyret ikke er ordentligt bedøvet, eller hvis afstanden fra huset til operationsstuen er lang, kan en anden dosis ketamin (10 mg / kg) administreres sikkert.
FORSIGTIG: Handsker er nødvendige ved håndtering af dyr. - Transport det bedøvede dyr til operationsstuen og læg det på et kirurgisk bord forsynet med et varmetæppe.
- Mål perifer iltmætning (Sp02) med en sensor, der er klippet til grisens øre, og start kontinuerlig tre-bly elektrokardiografisk (EKG) overvågning.
- Desinficer huden med mindst 3 vekslende runder povidon-jod eller chlorhexidinskrubbe og alkohol. Indsæt et perifert venekateter (22-24 G) i ørevenen. Desinficer huden på forhånd med en antiseptisk opløsning.
- Inducer anæstesi ved en intravenøs injektion af fentanyl (5 μg / kg), propofol (4 mg / kg) og atracurium (0,5 mg / kg). Når spontan vejrtrækning forsvinder, og fraværet af reflekser er bekræftet, skal du placere dyret i rygliggende stilling og straks indlede ventilation af håndtaskemaske med en hundemaske med en brøkdel af inspireret ilt (Fi02) indstillet til 100%.
BEMÆRK: For at reducere risikoen for utilsigtet bevidsthed i forbindelse med brugen af neuromuskulære blokkere bør anæstetiske midler med kendt effektivitet hos svin og med doser på den højere grænse anvendes for at sikre et tilstrækkeligt anæstesiniveau. Derudover skal du løbende overvåge kardiovaskulære tegn såsom puls, blodtryk og kropstemperatur og kun administrere neuromuskulære blokkere, når abstinensreflekser er fraværende (pedaltilbagetrækning, palpebrale reflekser og kæbetone) og muskeltonus er afslappet. - Udfør endotracheal intubation. Der kræves mindst to operatører til denne procedure.
- Sørg for, at det grundlæggende udstyr og kirurgiske værktøjer, der er nødvendige for endotracheal intubation, er klar: binde gaze for at åbne munden og fastgøre røret, veterinærlaryngoskop med et lige blad mellem 17 og 25 cm langt, et fælles endotrakealt rør (ID 4-5), stylet, sprøjte med luft og tape.
- Træk tungen lidt ud og hold kæben åben ved hjælp af slipsbind placeret bag de øvre og nedre hundetænder.
- Udfør en laryngoskopi, og når epiglottis er synlig, skal du bruge spidsen af laryngoskopet til at trykke epiglottis opad mod bunden af tungen.
BEMÆRK: Hvis epiglottis sidder fast i den bløde gane, kan den forskydes dorsalt med spidsen af røret. Operatør 1 udfører trin 1.6.2, mens operatør 2 udfører trin 1.6.3. - Når stemmebåndene er visualiseret, skal du forsigtigt føre røret med let rotation ind i luftrøret.
BEMÆRK: Det smalleste punkt i luftrøret er på det subglottiske niveau. Hvis det er vanskeligt at indsætte rør, kan du prøve let rotation eller et mindre rør. - Fjern stylet og brug en 5 ml sprøjte til at puste manchetten op.
- Sørg for placering af endotrachealrøret ved at observere symmetrisk bryststigning, tilstrækkelig iltmætning (95% -100%) og en korrekt bølgeform og slutvands CO2 (EtCO2) aflæsning.
FORSIGTIG: Svin er meget modtagelige for laryngospasme og ødem i strubehovedets slimhinde, og larynxperforering kan endda forekomme efter flere forsøg på intubation, eller hvis sedation er utilstrækkelig10.
- Efter bekræftelse af intubation påbegyndes mekanisk ventilation ved hjælp af en mekanisk ventilator med en respirationsfrekvens på 20 vejrtrækninger pr. minut, tidevandsvolumen på 8 ml / kg, FiO2 på 40% og positivt slutekspiratorisk tryk på 4 cm H2O. Juster ventilationen for at opnå et partialtryk af kuldioxid (PaCO2) mellem 35 og 45 mmHg.
- Oprethold dyb anæstesi under hele eksperimentet via en kontinuerlig infusion af fentanyl (10 μg / kg / time), propofol (10 mg / kg / time) og atracurium (2 mg / kg / time).
2. Instrumentering
- Forbered lårbensområdet til karkateterisering. Brug bandager til at trække benene tilbage og desinficere lyskeområdet med mindst 3 skiftende runder povidon-jod eller chlorhexidinskrubbe og alkohol.
- Vurder lårbenskarrene med en ultralyd og brug Doppler-teknikken til at skelne mellem arterien og venen. Afhængigt af venens størrelse indsættes et 5,5-7,5 fransk (F) centralt venekateter med tre porte i en af lårbensvenerne under kontinuerlig ultralydsvisning og ved hjælp af Seldinger-teknikken11,12.
- Umiddelbart efter placering af centralt venekateter tilsluttes et transducersystem til måling af det centrale venetryk.
- Sørg for, at en elektrolyt med glucoseinfusion (20 ml/time) er forbundet til en af de centrale ledningsporte, og at en vedligeholdelsessaltvandsinfusion (5 ml/time) infunderes via den resterende port for at forhindre okklusion af kateteret.
- Brug den samme teknik til at kannulere den modsatte lårbensarterie med et 4 F arterielt kateter, der er specielt designet til overvågning af hjerteudgang. Udfør en blodgastest for at fastslå kateterets korrekte position, hvis ultralydsbekræftelse ikke er mulig.
BEMÆRK: I tilfælde af signifikant spasme eller hæmatom, krydse over til den kontralaterale lårbensarterie. - Når arteriekateteret er indsat, skal du forbinde arterieledningen i hjerteudgangsmonitorsystemet og arterietransduceren direkte til monitorporten. Tilslut skærmens venøse måleenhed samtidigt til den centrale venetransducer.
BEMÆRK: Den hjerteudgangsmonitor, der anvendes i dette eksperiment, er specificeret i materialetabellen. For opsætning, kalibrering og målinger, se producentens instruktioner13. - Sørg for, at både venøse og arterielle transducere er kalibreret til nul.
- Udsæt den venstre indre halspulsåre og venstre ydre jugularvene via cut-down teknikken.
- Sørg for, at det nødvendige udstyr og kirurgiske værktøjer er tilgængelige: skalpel, kirurgisk saks med stump spids, vævspincet, lille selvbevarende vævsretraktor, nåleholder, kirurgisk udskiftning, sutur med nål, en 18 G IV-kanyle, en 5 F-kateterskede med en introducer og en Seldinger-styretråd.
- Med dyret i dorsal liggende stilling desinficeres nakkehuden med en antiseptisk opløsning.
- Brug en skalpel til at lave et ~ 10 cm venstre paratracheal snit, der skærer en linje mellem manubriumet og kæbens vinkel.
- For at udsætte den ydre jugular vene, dissekere vævet lateralt til SCM og isolere venen fra den omgivende fascia.
- Efter at være isoleret, brug to ikke-absorberbare silkesuturer (USP-0) sløjfet rundt om venen for at fiksere beholderen inden punkteringen.
- Skær venen med en Venflon-nål (18 G). Når du er inde i venen, skal du trække nålen tilbage og indsætte styretråden gennem Venflon-røret.
- Fjern Venflon-røret, og indsæt kappen med introduktionen (5 F) over ledningen. Efter indsættelse skal du fjerne både introduktionen og ledningen.
- Umiddelbart efter isætning skylles kapperne med 0,9 % NaCl (5 ml/time) for at forhindre dannelse af trombose.
- Bind den proksimale silkesutur rundt om kappen for at rette den. Derefter fastgøres kappehåndtaget til SCM og lukker huden med hæfteklammer.
- Efter kirurgisk forberedelse lades dyrene stabilisere sig i 30 minutter, før baseline-overvågningsværdierne og blodprøverne opnås.
- Hold blodtemperaturen på 37-39 °C ved hjælp af et termisk tæppe og en overliggende varmer under hele eksperimentet.
BEMÆRK: Temperaturen måles med en termistor placeret ved termofortyndingens arterielle kateterspids.
3. Hæmodynamisk og perfusionsovervågning
- Overvåg EKG, perifer iltmætning, åndedrætsvolumen og tryk og Fi02.
- Tilslut et spirometer mellem endotrachealrøret og en multiparametermonitor for at måle kvalitativ og kvantitativ EtC02.
BEMÆRK: For mere information om multiparametermonitoren, se materialetabellen. - Brug nær-infrarød spektroskopi (NIRS) til at overvåge hjernens vævs iltningsindeks (bTOI) og splanchnic tissue oxygenation index (aTOI). Placer sensorerne på pandens hud og den forreste abdominalvæg (subhepatisk region).
BEMÆRK: Anbring ikke hjernesensoren i midterlinjen, da den kan være forurenet med det overlegne sagittale sinus venøse blod14. - Tilslut blodgennemstrømningssonden, der er fastgjort til den indre halspulsåre, til en flowmonitor for at måle carotisblodgennemstrømningen (CaBF).
- Placer en laser Doppler-sensor over huden på den forreste abdominalvæg til kontinuerlig måling af den kutane tissulære blodgennemstrømning (CuTBF).
BEMÆRK: For mere information om carotis og kutane tissulære blæseflowsensorer, se materialetabellen. - Registrer følgende parametre ved baseline og hvert 30. minut: blodtemperatur, inspiratorisk tidevandsvolumen, EtCO2, hjerterytme, puls (HR), systolisk og diastolisk blodtryk, gennemsnitligt arterielt blodtryk (MAP), chokindeks (HR/systolisk blodtryk)15, centralt venetryk, hjerteindeks (CI), globalt slutdiastolisk volumenindeks (GEDVI), slagvolumenindeks (SVI), kontraktilitet i venstre ventrikel (Dt/Dpmax), systemisk vaskulært resistensindeks (SVRI), ekstravaskulært lungevandindeks (ELWI), trykpulsvariation (PPV), perifer hæmoglobinmætning, central venøs mætning (ScvO2), cerebral (bTOI) og splanchnic (aTOI) vævsiltningsindeks af NIRS, CaBF og CuTBF.
- For at opnå CI-værdier tilføres 5 ml boluser med 0,9% normalt saltvand ved en temperatur under 8 °C gennem det centrale venekateter. Registrer gennemsnittet af to på hinanden følgende foranstaltninger.
- Bestem arteriel og venøs blodgasprofil og laktatkoncentration hvert 30. minut ved at trække 0,3 ml blod fra lårbenene. Udfør standard komplette blodtællinger, koagulationsundersøgelser og biokemi ved baseline, efter blødningsinduktion og ved afslutningen af eksperimentet.
- Efter hver blodtrækning skylles linjerne med 0,5 ml 100 IE / ml heparin.
4. Hæmoragisk chokinduktion
- Når en steady state er opnået efter instrumentering og baseline data er blevet indsamlet, inducere hypovolemisk shock ved at trække 30 ml / kg blod fra halsvenen over 30 min.
- Tillad en 30 minutters periode til stabilisering. Foretag ikke genoplivningsindsats i denne periode for at efterligne forsinkelsen i ankomsten af akutmedicinske hold.
5. Infusion og opfølgning
- Efter stabiliseringsperioden tilføres en bolus af en volumenekspander eller et vasoaktivt middel over en periode på 30 minutter.
BEMÆRK: Eksempler på testede volumenekspandere og vasoaktive midler er normalt saltvand, hypertonisk albumin, angiotensin og terlipressin. I denne undersøgelse blev der anvendt 30 ml / kg normalt saltvand (NS) (n = 13), 15 ml / kg 5% albumin plus 3% hypertonisk saltvand (AHS) (n = 13) eller en enkelt intravenøs bolus på 15 μg / kg terlipressin plus 15 ml / kg 5% albumin plus 3% hypertonisk saltvand (TAHS) (n = 13). - Efter infusionen følges dyret i 120 min. Registrer de hæmodynamiske parametre og få blodprøver hvert 30. minut til arterielle og venøse blodgasprofiler og bestemmelse af laktatkoncentration. Foretag ikke genoplivningsindsats i denne periode.
6. Afslutning af eksperimentet og eutanasi
- Når forsøget er afsluttet, anvendes en beroligende overdosis (5 μg/kg fentanyl og 10 mg/kg propofol) og en intravenøs injektion af kaliumchlorid (2 mEq/kg) for at aflive alle dyr, der er genoplivet med succes.
- Bekræft fraværet af cirkulation med asystol eller pulsløs elektrisk aktivitet på et kontinuerligt EKG-display, fraværet af pulsatilstrøm under invasiv arteriel trykovervågning og fraværet af andre vitale tegn.
- Hvis arterielt blodtryk i løbet af opfølgningsperioden falder under 25 mmHg, skal du ofre dyret for at undgå yderligere lidelse.
Representative Results
Den præsenterede model er med succes blevet anvendt i flere eksperimenter til at studere makrocirkulatoriske og mikrocirkulatoriske ændringer efter hæmoragisk chok og efterfølgende genoplivning, sammenligning af forskellige væsker og vasoaktive lægemidler16,17,18,19.
I betragtning af reaktionen på chok har denne model konsekvent vist, at en kontrolleret blødning producerer markante ændringer i hæmodynamiske parametre såvel som i cerebral og vævsperfusion.
Efter volumenudtagning påvises signifikant takykardi og et fald i MAP, CI, SVI, blodvolumenparametre (GEDVI og ITBI) og carotisarteriel blodgennemstrømning sammen med en stigning i systemisk vaskulært resistensindeks (figur 1 og figur 2).
Med hensyn til systemiske perfusionsparametre øges laktat betydeligt, mens ScvO2, CuTBF og bTO falder (figur 3). Variationer i det centrale venetryk, Dt/Dpmax og ELWregistreres normalt ikke.
Hvad angår laboratorieparametre, falder hæmoglobinindholdet og hæmatokrit ikke, før væsker er blevet administreret. Albuminkoncentrationen falder, og troponinniveauerne stiger signifikant efter kontrolleret blødning. Andre parametre, herunder kernetemperatur, PaO2, PaCO2, arteriel iltmætning, EtCO2, elektrolytter og nyre- og leverfunktionsparametre, forbliver normalt stabile.
Udover dets anvendelighed til at analysere de kardiovaskulære og biokemiske reaktioner på chok, har denne model vist sig at skelne mellem forskellige genoplivningsvæsker.
I tidligere undersøgelser har vi haft til formål at afgøre, om brugen af en infusion af hypertoniske væsker alene eller kombineret med forskellige vasopressorer i en spædbarnsdyrmodel med hæmoragisk chok ville forbedre globale hæmodynamiske og perfusionsparametre sammenlignet med normalt saltvand.
Som tidligere rapporteret har vi konsekvent observeret, at infusionen af hypertoniske væsker producerer et lignende respons på infusionen af to gange volumenet isotonisk væske16,17,18.
Mere specifikt producerede brugen af albumin plus hypertonisk saltvand en større og længere volumenudvidelse end normalt saltvand eller hypertonisk saltvand alene med signifikante forskelle i HR, SVI og PPV og fraværet af et progressivt fald efter volumenudvidelse i blodtryk og GEDVI, som observeret i de andre grupper (figur 1 og figur 2). Desuden har vi også observeret en større forbedring af perfusionsparametre med hypertonisk albumin, repræsenteret som en større stigning i bTOI og CaBF, og et større fald i laktatniveauer end de andre grupper sammenlignet med begyndelsen af væskeudvidelsen (figur 3). Vi mener, at denne forskel kan være sekundær i forhold til albumins evne til at øge blodvolumen og forblive i længere tid i det intravaskulære rum end normalt saltvand. Interessant nok har vi set, at tilsætningen af en enkelt bolus terlipressin i begyndelsen af væskegenoplivning gav lignende resultater som dem, der blev observeret i den hypertoniske albumingruppe uden yderligere fordele med hensyn til hæmodynamiske eller perfusionsparametre17,18.
Figur 1: Hemodynamiske parametre. (A) Udvikling i hjertefrekvens, (B) gennemsnitligt arterielt tryk, (C) hjerteindeks ved baseline (t0') og (D) systemisk vaskulært resistensindeks ved baseline (t0'). Under hele forsøgets forløb: afslutning af kontrolleret blødning (Shock30'); påbegyndelse af infusionen, 30 minutter efter afslutningen af den kontrollerede blødning (Res0'); afslutning af infusionen (Res30'); opfølgning 30 minutter efter endt infusion (Obs30'); opfølgning 60 minutter efter endt infusion (Obs60'); opfølgning 90 min efter endt infusion (Obs90'). (*) Signifikant forskel (p < 0,05) fra baseline, samme gruppe. (‡) p < 0,05 fra blødning, samme gruppe. (#) p < 0,05 fra gruppe NS. Forkortelser: NS = normalt saltvand; AHS = hypertonisk saltvandsalbumin; TAHS = terlipressin plus hypertonisk saltvandsalbumin. Data præsenteres som middel- og standardafvigelse. Dette tal er tilpasset med tilladelse fra Urbano et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Blodvolumenparametre. (A) Udvikling af slagvolumenindeks, (B) pulstrykvariation og (C) globalt diastolisk volumenindeks ved baseline (t0'). Under hele forsøgets forløb: afslutning af kontrolleret blødning (Shock30'); påbegyndelse af infusionen, 30 minutter efter afslutningen af kontrolleret blødning (Res0'); afslutning af infusionen (Res30'); opfølgning 30 minutter efter endt infusion (Obs30'); opfølgning 60 minutter efter endt infusion (Obs60'); opfølgning 90 min efter endt infusion (Obs90'). (*) Signifikant forskel (p < 0,05) fra baseline, samme gruppe. (‡) p < 0,05 fra blødning, samme gruppe. (#) p < 0,05 fra gruppe NS. Forkortelser: NS = normalt saltvand; AHS = hypertonisk saltvandsalbumin; TAHS = terlipressin plus hypertonisk saltvandsalbumin. Data præsenteres som middel- og standardafvigelse. Dette tal er tilpasset med tilladelse fra Urbano et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Systemiske perfusionsparametre. (A) Udvikling af arteriel blodlaktat, (B) iltmætning i det centrale venøse blod og (C) iltningsindeks for hjernevæv ved baseline (t0'). Under hele forsøgets forløb: afslutning af kontrolleret blødning (Shock30'); påbegyndelse af infusionen, 30 minutter efter afslutningen af kontrolleret blødning (Res0'); afslutning af infusionen (Res30'); opfølgning 30 minutter efter endt infusion (Obs30'); opfølgning 60 minutter efter endt infusion (Obs60'); opfølgning 90 min efter endt infusion (Obs90'). (*) Signifikant forskel (p < 0,05) fra baseline, samme gruppe. (‡) p < 0,05 fra blødning, samme gruppe. (#) p < 0,05 fra gruppe NS. Data præsenteres som middel- og standardafvigelse. Dette tal er tilpasset med tilladelse fra Urbano et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Udførelse af procedurer på unge grise kan være kompleks og potentielt livstruende på grund af visse anatomiske og fysiologiske egenskaber hos disse dyr. For at opnå ensartede resultater og reducere tabet af dyr er der nogle kritiske trin, der bør overvejes nøje. For det første er det vigtigt at opnå et passende niveau af sedation for at minimere dyrets stressrespons, som, hvis det er overdrevent, kan ændre resultaterne på grund af endogen catecholamin frigivelse. Det er også vigtigt at undgå forsinkelser mellem den intramuskulære injektion og intubation, da dyr kan udvikle et alvorligt stressrespons med takykardi og irreversibel metabolisk acidose, der kan fremskynde afslutningen af eksperimentet. Selvom andre grupper bruger inhalerede anæstetika med gode resultater20,21, foretrækker vi intravenøs medicin, da inhalerede beroligende midler ikke tillader måling af respiratorisk gasudveksling med indirekte kalorimetri. Det er vores erfaring, at en kombination af propofol og fentanyl er effektiv og har meget få bivirkninger. Omhyggelig temperaturstyring under hele eksperimentet er et andet vigtigt aspekt af protokollen, da hurtige temperaturændringer kan påvirke dyrets hæmodynamiske reaktion på chok betydeligt, forfalske resultaterne eller i sidste ende føre til, at forsøget mislykkes.
En anden afgørende del af instrumentering er intubation i betragtning af de særlige forhold ved svineanatomi og deres modtagelighed for laryngospasme. Derfor bør proceduren udføres af mindst en operatør med tidligere erfaring, og brug af en stylet og muskelafslapning tilrådes10,22. Kateterisering af skibe kan også være udfordrende på grund af dyrenes lille størrelse. Til lårbensadgang foretrækkes en sonografistyret punktering, da karrene er placeret dybt, normalt har små diametre og viser forskellige kurser og positioner22. Til cervikal adgang bruger vi kirurgisk adgang til at tillade placering af carotisflowsonden, men ultralydsteknikken er også mulig23,24. Kanylering af den ydre jugularvene foretrækkes normalt på grund af dens bredere diameter, dens overfladiske placering og lavere antal omgivende strukturer22. Katetre skal skylles umiddelbart efter indsættelse med saltopløsninger for at forhindre okklusion. Vi bruger ikke heparin for at undgå koagulationsændringer. I første omgang undgik vi også administration af glukoseinfusioner for at forhindre potentiel forvrængning af det hæmodynamiske respons ved administration af ekstra væsker, men vi fandt ud af, at dyr udviklede alvorlig og tidlig hypoglykæmi. Endelig, selv med anæstesi og de mindre invasive teknikker, der anvendes i dag, genererer instrumentering et betydeligt stressrespons hos dyr, så det er ønskeligt at forlade tilstrækkelig tid til genopretning, inden man påbegynder fjernelse af blod. Med hensyn til induktion af hæmoragisk chok anbefaler vi fjernelse af 30 ml / kg, da dette genererer en betydelig patofysiologisk respons med fremragende overlevelsesrater. Det er vores erfaring, at spædbørn ikke tåler større mængder blodtab, og dødeligheden er høj. Gradvis tilbagetrækning af blod er også vigtig, da hurtig fjernelse kan resultere i alvorlig hæmodynamisk ustabilitet og tidlig død af dyret.
Selvom der er en bred vifte af arter og eksperimentelle modeller til rådighed for forskere, udgør den ideelle model af dyrs hæmoragisk chok - enkel, let reproducerbar og nøjagtig replikation af den kliniske situation - stadig en udfordring. Små dyremodeller - primært mus og rotter - bruges til at undersøge de patofysiologiske mekanismer for chok. Imidlertid komplicerer deres lille størrelse betydeligt udførelsen af kirurgiske og prøveudtagningsprocedurer. Større dyr, såsom hunde og svin, er dyrere og komplekse at håndtere, men deres størrelse og fysiologiske ligheder med mennesker gør dem mere egnede til præklinisk evaluering af behandlingsstrategierne. Imidlertid er brugen af hunde i fortiden og stadig i dag etisk tvivlsom. De giver ingen fordel i forhold til svin som forsøgsdyremodeller, og deres intelligens og det særlige bilaterale forhold mellem mennesker og hunde placerer dem i en højere position i den fylogenetiske skala 6,7,8.
I lyset af alt dette er voksne svin blevet brugt i vid udstrækning til kardiovaskulær forskning på grund af deres ligheder med voksen menneskelig fysiologi, størrelse og anatomi, hvilket er bedre end de fleste arter. Men som det har været veletableret i litteraturen, er der betydelige forskelle mellem voksne og pædiatriske patienter med hensyn til det kardiovaskulære system, blodvolumen, temperaturregulering og respons på chok 2,3,4. Samtidig viser beviser, at disse forskelle også gælder for svin, og smågrise har vist sig at have kardiovaskulære, cerebrovaskulære, hæmatologiske og elektrolytprofiler, der ligner dem hos pædiatriske humane patienter 9,25. Endelig, ud over disse anatomiske og fysiologiske forskelle mellem voksne og spædbørn i begge arter, giver brugen af dyremodeller, især minigrise, mulighed for at teste de samme enheder, der bruges i den virkelige kliniske indstilling til overvågning. I mange tilfælde har pålideligheden af disse enheder vist sig at være lav på grund af en simpel tilpasning af de voksne algoritmer, sensorer eller skalaer. Alle disse aspekter understøtter vigtigheden af at udvikle specifikke pædiatriske dyremodeller og deres relevans med hensyn til translationel anvendelighed til den pædiatriske kliniske indstilling.
Udover typen af dyr er der tre grundlæggende modeller, der generelt anvendes i undersøgelsen af hæmoragisk chok: kontrolleret blødning - enten efter volumen eller tryk - og ukontrolleret blødning. Protokollen præsenteret i denne artikel beskriver en blødningsmodel med fast volumen, hvor et fast blodvolumen, normalt beregnet ved procentdelen af kropsvægt, fjernes over en tidsperiode, der er fastsat af observatøren. Tværtimod blødes dyrene i blødningsmodeller med fast tryk til en forudbestemt MAP, som derefter opretholdes med periodisk blødning eller væskeinfusioner i en bestemt periode afhængigt af dyrearten og graden eller resultatet af chok. Både hæmoragiske chokmodeller med fast volumen og fast tryk tillader undersøgelse af stødinducerede patofysiologiske ændringer under kontrollerede forhold, hvilket giver en klar fordel med hensyn til reproducerbarhed og standardisering. Imidlertid er deres største begrænsning, at de ikke tillader undersøgelse af virkningerne af forskellige genoplivningsstrategier på aktiv blødning, hvor aggressiv væskegenoplivning før kirurgisk kontrol af blødning vides at øge blødningen og mindske overlevelsen på grund af hæmning af dannelsen af tromben og stigningen i det gennemsnitlige blodtryk. Ukontrollerede blødningsmodeller induceret af et standardiseret vaskulært traume-knusning / laceration af lever og milt, arterieskade eller amputation af et vedhæng - er blevet foreslået for bedre at afspejle den kliniske situation og derved muliggøre en bedre forståelse af virkningerne af forskellige væskegenoplivningsstrategier og andre interventioner, såsom hypotermi og hæmostatiske produkter. På trods af at de er klinisk mest relevante, udøver disse ukontrollerede blødningsmodeller imidlertid nogle klare ulemper med hensyn til standardisering og reproducerbarhed. I lyset af alt dette ser det ud til, at den ideelle model ikke eksisterer, og derfor skal forskning på dette område afbalancere klinisk relevans med eksperimentel standardisering og pålidelighed 6,7,8,9,26.
Modellen beskrevet i denne undersøgelse kan tilbyde brede potentielle anvendelser inden for kardiovaskulær forskning, såsom undersøgelse af endoteldysfunktion og mikrocirkulationsændringer18 under chok samt validering af forskellige hæmodynamiske overvågningssystemer. Desuden kan den også anvendes på andre forskningsområder, hvilket muliggør undersøgelse af endokrine eller immunresponser efter alvorlig blødning samt bestemmelse af bivirkninger af forskellige væsker og vasopressorer. Med hensyn til forskningen i forskellige genoplivningsstrategier anbefales det imidlertid at studere deres virkninger i ukontrollerede blødningsmodeller, inden der implementeres ændringer i den kliniske indstilling 7,26.
Udover vanskeligheden ved at ekstrapolere resultaterne til det virkelige liv, har denne model andre begrænsninger. Til at begynde med er der nogle forvirrende variabler relateret til den eksperimentelle opsætning, såsom brugen af anæstetiske midler eller mekanisk ventilation, der kan dæmpe de fysiologiske reaktioner under stød og komplicere fortolkningen af resultaterne. Desuden kan instrumenteringsstressrespons på dyrene og temperaturkontrol påvirke makro- og mikrocirkulationen gennem forskellige mekanismer. En anden vigtig begrænsning af denne model - relateret til eksperimentelle fornødenheder og tilgængelighed af ressourcer - er den begrænsede posttraumatiske observationsperiode, som yderligere begrænser undersøgelsen af de langsigtede konsekvenser af hæmoragisk chok. På trods af de fysiologiske ligheder mellem mennesker og svin er der desuden nogle forskelle mellem arter, der bør overvejes. Koagulationssystemet synes for eksempel at være mere effektivt hos svin27,28. Også lactat og succinat plasmaniveauer varierer mellem arter, og svin har basal alkalose, hvilket kan føre til en undervurdering af virkningerne af blødning på syre-base balance29. Endelig er det også velkendt, at de inflammatoriske og immunresponser såvel som nogle vasopressorreceptorer er forskellige hos svin9. Specifikke dyreforskelle skal også betragtes som påvirkende faktorer. Flere undersøgelser har indikeret kønsforskelle med hensyn til modtagelighed for chok, hvor kvinder har en betydelig overlevelsesfordel i forhold til mænd 6,9. Ikke desto mindre bruger vi i forsøgene udført i denne undersøgelse dyr fra samme aldersgruppe og med en lignende genetisk baggrund for at minimere den potentielle variabilitet, der er forbundet med arter.
Afslutningsvis giver denne artikel en praktisk og trinvis vejledning til opsætning af en svinemodel af pædiatrisk hæmoragisk shock. Sammenlignet med andre eksisterende modeller er dette en pålidelig og let at følge protokol med bred anvendelighed i biomedicinsk forskning, enten til undersøgelse af patofysiologiske reaktioner efter alvorlig blødning eller til evaluering af forskellige genoplivningsstrategier.
Disclosures
Forfatterne af dette værk har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne undersøgelse er finansieret af Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) gennem projektet "PI20/01706" og medstiftet af Den Europæiske Union. Bidragyderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om udgivelse eller udarbejdelse af manuskriptet. Vi vil gerne vise taknemmelighed over for alle vores kolleger fra Gregorio Marañón Pediatric Intensive Care Unit og fra Gregorio Marañón Experimental Institute, da uden deres arbejde ville dette projekt ikke have været muligt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADA swabs | Albino Dias de Andrade, S.A. | 300575750400 | Non-woven swabs |
| Alaris SE | Carefusion | N/A | Volumetric infusion pump |
| Atracurium | Aspen Pharma Trading Limited. Dublin, Ireland | N/A | Muscle relaxant |
| Atropine 1 mg/mL | B. Braun | 481377/1013 | |
| Barrier adhesive aperture drape | Mölnlycke | 63621 | |
| BD emerald syringe 5 mL, 10 mL, 20 mL | Becton Dickinson S.A | https://www.bd.com/en-eu/offerings/capabilities/syringes-and-needles/injection-syringes/bd-emerald-3-piece-syringe | various options available |
| BLF21A laser doppler monitor | Transonic Systems Inc. | BLF21A | Skin blood flow monitor |
| BlueSensor NF ECG electrodes | Ambu | NF-50-A/12 | |
| Check-Flo performer introducer set 5Fr | Cook Medical | G12018 | Vascular Sheath |
| Datex ohmeda S5 | GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland | M1162897 | Hemodynamic monitor |
| Fentanyl 0.05 mg/mL | Kern Pharma | N/A | Anesthesia |
| GE Vivid S5 | GE Healthcare | S series | Ultrasound machine |
| Introcan Safety 18 G, 22 G, 24 G | B. Braun | Introcan series | Safety intravenous catheter |
| INVOS cerebral/somatic oximetry adult sensors | Medtronic PLC, USA | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry/invos-cerebral-somatic-oximetry-adult-sensors.html | |
| INVOS OXIMETER cerebral/somatic | Somanetics | 08-10566 | Regional oxygenation monitor |
| Ketamin 50 mg/mL | Pfizer, S.L. | 47034 | Sedation |
| Leon plus | Heinen + Löwenstein | N/A | Ventilator |
| Life scope VS | Nihon Kohden | N/A | Bedside monitor |
| Miller laryngoscope blade 12″ | Jorgensen Labs, USA | J0449F | Laryngoscope |
| Multi-lumen central venous catheterization set 7 French, 3 lumen, 30 cm | Arrow | CS-14703 | Central venous catheter |
| Nellcor WarmTouch 5300A | Covidien | Thermal blancket | |
| Nitrile gloves | Medihands | KS-ST RT021 | Single use gloves |
| Pediatric SomaSensor INVOS cerebral/somatic | Covidien | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry.html | Disposable regional oxygen saturation sensor |
| PICCO monitoring kit | Pulsion Medical Systems | PV8215 | |
| PICCO thermodilution catheter 5F/20 cm | Pulsion Medical Systems | N/A | |
| Propofol Lipoven 10 mg/mL | Fresenius Kabi, Spain | N/A | Anesthesia |
| Pulse contour cardiac output (PiCCO2) | Pulsion Medical Systems | N/A | Hemodynamic monitor |
| Rüsch flexislip | Teleflex Medical | 503700 | Endotracheal tube stylet |
| Softa swabs | B. Braun | 19579 | Alcohol pads |
| Surgical silk sutures USP 0 | Aragó, Barcelona, Spain. | 6245 | |
| TruWave pressure monitoring set | Edwards | T001767A | Pressure monitoring set |
| Ultrasound transmission gel | Ultragel Hungary 2000 Kft. | UC260 |
References
- Disease Control and Prevention (CDC). Vital signs: Unintentional injury deaths among persons aged 0-19 years-United States, 2000-2009. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 61, 270-276 (2012).
- Russell, R. T., et al. Pediatric traumatic hemorrhagic shock consensus conference recommendations. The Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 94, S2-S10 (2023).
- Leonard, J. C., et al. Life-threatening bleeding in children: A prospective observational study. Critical Care Medicine. 49 (11), 1943-1954 (2021).
- Cannon, J. W.
- Dehmer, J. J., Adamson, W. T. Massive transfusion and blood product use in the pediatric trauma patient. Seminars in Pediatric Surgery. 19 (4), 286-291 (2010).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: a review. European Surgical Research. 50 (2), 57-70 (2013).
- Moochhala, S., Wu, J., Lu, J. Hemorrhagic shock: an overview of animal models. Frontiers in Bioscience. 14 (12), 4631-4639 (2009).
- Lomas-Niera, J. L., Perl, M., Chung, C. S., Ayala, A. Shock and hemorrhage: an overview of animal models. Shock. 24, 33-39 (2005).
- Hildebrand, F., Andruszkow, H., Huber-Lang, M., Pape, H. C., van Griensven, M. Combined hemorrhage/trauma models in pigs-current state and future perspectives. Shock. 40 (4), 247-273 (2013).
- Chum, H., Pacharinsak, C.
- Leibowitz, A., Oren-Grinberg, A., Matyal, R. Ultrasound guidance for central venous access: Current evidence and clinical recommendations. Journal of Intensive Care Medicine. 35 (3), 303-321 (2020).
- Lockwood, J., Desai, N.
- Operator's Manual PiCCO2. Version 3.1. Pulsion Medical Systems. , Available from: https://www.manualslib.com/manual/2821743/Pulsion-Picco2.html#manual (2013).
- Operations Manual INVOS ® System, Model 5100C. Medtronic. , Available from: http://www.wemed1.com/downloads/dl/files/id/7947/product/10495/manual_for_mo_s_5100c.pdf (2013).
- Acker, S. N., Ross, J. T., Partrick, D. A., Tong, S., Bensard, D. D. Pediatric specific shock index accurately identifies severely injured children. Journal of Pediatric Surgery. 50 (2), 331-334 (2015).
- Urbano, J., et al. Comparison of normal saline, hypertonic saline and hypertonic saline colloid resuscitation fluids in an infant animal model of hypovolemic shock. Resuscitation. 83 (9), 1159-1165 (2012).
- Urbano, J., et al. Comparison of normal saline, hypertonic saline albumin and terlipressin plus hypertonic saline albumin in an infant animal model of hypovolemic shock. PLoS One. 10 (3), e0121678 (2015).
- González, R., et al. Microcirculatory alterations during haemorrhagic shock and after resuscitation in a paediatric animal model. Injury. 47 (2), 335-341 (2016).
- López-Herce, J., Rupérez, M., Sánchez, C., García, C., García, E. Haemodynamic response to acute hypovolaemia, rapid blood volume expansion and adrenaline administration in an infant animal model. Resuscitation. 68 (2), 259-265 (2006).
- Gil-Anton, J., et al. Addition of terlipressin to initial volume resuscitation in a pediatric model of hemorrhagic shock improves hemodynamics and cerebral perfusion. PLoS One. 15 (7), e0235084 (2020).
- Williams, A. M., et al. Complete and partial aortic occlusion for the treatment of hemorrhagic shock in swine. Journal of Visualized Experiments. (138), e58284 (2018).
- Schüttler, D., et al. A practical guide to setting up pig models for cardiovascular catheterization, electrophysiological assessment, and heart disease research. Lab Animal. 51 (2), 46-67 (2022).
- Chiesa, O. A., et al. Minimally invasive ultrasound-guided technique for central venous catheterization via the external jugular vein in pigs. American Journal of Veterinary Research. 82 (9), 760-769 (2021).
- Anderson, J. H., et al. Ultrasound guided percutaneous common carotid artery access in piglets for intracoronary stem cell infusion. Laboratory Animals. 52 (1), 88-92 (2018).
- Hughes, H. C.
- Mayer, A. R., et al. A systematic review of large animal models of combined traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 104, 160-177 (2019).
- Velik-Salchner, C., et al. Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood. Thrombosis Research. 117 (5), 597-602 (2006).
- Siller-Matula, J. M., Plasenzotti, R., Spiel, A., Quehenberger, P., Jilma, B.
- Reisz, J. A., et al. All animals are equal but some animals are more equal than others: Plasma lactate and succinate in hemorrhagic shock-A comparison in rodents, swine, nonhuman primates, and injured patients. The Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 84 (3), 537-541 (2018).
