Summary
Denne artikkelen tar sikte på å gi forskere en detaljert og tilgjengelig guide for å sette opp en spedbarnsmodell av hemorragisk sjokk.
Abstract
Hemoragisk sjokk er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet hos pediatriske pasienter. Tolkning av de kliniske indikatorene validert hos voksne for å veilede gjenoppliving og sammenligning mellom ulike terapier er vanskelig hos barn på grunn av den iboende heterogeniteten til denne populasjonen. Som et resultat, sammenlignet med voksne, er hensiktsmessig behandling av pediatrisk hemorragisk sjokk fortsatt ikke godt etablert. I tillegg utelukker mangelen på pediatriske pasienter med hemorragisk sjokk utviklingen av klinisk relevante studier. Av denne grunn er en eksperimentell pediatrisk dyremodell nødvendig for å studere effekten av blødning hos barn, samt deres respons på ulike terapier. Vi presenterer en spedbarnsmodell for volumkontrollert hemoragisk sjokk hos bedøvede unge griser. Blødning induseres ved å trekke et tidligere beregnet blodvolum, og grisen overvåkes deretter og gjenopplives med forskjellige terapier. Her beskriver vi en presis og svært reproduserbar modell for hemoragisk sjokk hos umodne svin. Modellen gir hemodynamiske data som karakteriserer kompenserende mekanismer som aktiveres ved alvorlig blødning.
Introduction
Livstruende blødning på grunn av traumer, selv om det er uvanlig, er den viktigste dødsårsaken hos pediatriske pasienter 1,2. Ytterligere årsaker til hemoragisk sjokk inkluderer hemoragisk feber, gastrointestinal blødning, leverkirurgi og hjertekirurgi, spesielt når kardiopulmonal bypass brukes3.
I motsetning til den voksne befolkningen er det utilstrekkelige data om behandling av pediatrisk hemorragisk sjokk, som i stor grad er basert på ekspertuttalelser eller direkte oversatt fra voksenpraksis 2,4. Det kan imidlertid hende at oversettelse av ledelsesstrategier fra voksne ikke er hensiktsmessig. For eksempel er kliniske indikatorer validert hos voksne vanskelige å ekstrapolere til pediatriske pasienter på grunn av den fysiologiske heterogeniteten som er tilstede på tvers av grupper i ulike aldre og de forskjellige skademønstrene som er dominerende i den pediatriske populasjonen. Følgelig er spesifikke endepunkter som ville utløse intervensjon hos den pediatriske pasienten ikke godt definert. Videre er det ikke nok bevis på de skadelige effektene som terapier som for tiden implementeres hos voksne, kan ha på barn 2,4,5.
I lys av alt dette er det nødvendig med ytterligere undersøkelser for å etablere spesifikke gjenopplivingsterskler for rask intervensjon, samt for bedre å bestemme hvilke som er de mest hensiktsmessige terapiene for pediatrisk hemorragisk sjokk. Imidlertid er utviklingen av kvalitet og klinisk relevante studier av livstruende blødning hos barn vanskelig, på grunn av mangel på pasienter og den allerede nevnte heterogeniteten i den pediatriske befolkningen fra nyfødtperioden gjennom ungdomsårene.
Den kliniske relevansen av hemorragisk sjokk, i tillegg til vanskelighetene med å utføre kliniske studier på pediatriske pasienter, understreker behovet for prekliniske evalueringer på dyremodeller for å studere patofysiologi etter hemorragisk sjokk hos barn, samt å sammenligne ulike terapier. Flere dyremodeller har blitt mye brukt i forskning for å studere hemoragisk sjokk 6,7,8,9. På grunn av deres anatomiske og fysiologiske likheter med mennesker, er griser høyt verdsatt i biomedisinsk forskning. Når det gjelder fordelene ved å bruke spesifikke spedbarnsmodeller, viser bevis at umoden svinehemodynamikk, så vel som respiratoriske, hematologiske og metabolske systemer, er svært sammenlignbare med de hos unge mennesker9. Dette gir en unik mulighet til å simulere et klinisk scenario av hemorragisk sjokk hos barn.
I denne modellen induseres blødning ved å trekke ut et tidligere beregnet blodvolum. Deretter overvåkes grisen, og forskjellige gjenopplivningsvæsker administreres.
Her beskriver vi en presis og svært reproduserbar modell for hemoragisk sjokk hos umodne svin. Modellen gir hemodynamiske data som karakteriserer kompenserende mekanismer aktivert som respons på alvorlig blødning.
Protocol
Forsøkene i denne protokollen ble godkjent av den institusjonelle etiske komiteen for dyreforskning ved Gregorio Marañón universitetssykehus, Madrid, Spania, og landbruks- og miljørådet i Madrid autonome regjering (tillatelsesnummer: 12/0013). Europeiske og spanske retningslinjer for etisk omsorg og bruk av forsøksdyr ble brukt gjennom hele studien. Forsøkene ble utført ved Institutt for eksperimentell medisin og kirurgi, Gregorio Marañón universitetssykehus, Madrid, Spania.
MERK: Den valgte dyremodellen besto av friske 2-3 måneder gamle (8-12 kg) minigriser (Sus scrofa domestica). Minigriser er resultatet av en krysning av tre forskjellige raser som gjør dem egnet for biomedisinsk forskning. Dyrene er nesten identiske linjer og er levert av et spesielt autorisert avlsanlegg i Madrid (IMIDRA), som holder vedlikeholdet av tre homozygote genetiske linjer i renhet. Hann- og hunndyr ble brukt om hverandre. Dyrene ble fôret med et standard svineholdig kosthold og observert i minst 2 dager for å sikre god helse. Mat, men ikke vann, ble trukket tilbake kvelden før inngrepene for å redusere aspirasjonsrisikoen. Et typisk eksperiment krever ca. 6 timer for å fullføre, inkludert 30 minutter for anestesiinduksjon og kirurgisk forberedelse, 60 min for instrumentering, 30 min for gjenoppretting, 60 min for blødningsinduksjon og bakre stabilisering, 30 min for gjenopplivning og 120 minutter for oppfølging.
1. Anestesi, intubasjon og mekanisk ventilasjon
- Premedisinere grisen med en intramuskulær injeksjon av ketamin (10 mg/kg) og atropin (0,02 mg/kg) i den laterale delen av nakken, bak øret eller i bakre femoralregion.
MERK: Antikolinerge legemidler, som atropin, er nyttige da svin kan sikle for mye under anestesi10. Vår erfaring er at denne dosen ketamin er nok til å redusere stress og induserer adekvat sedasjon og smertestillende hos gris uten bivirkninger. Men hvis dyret ikke er riktig sedert eller hvis avstanden fra huset til operasjonssalen er lang, kan en annen dose ketamin (10 mg / kg) administreres trygt.
FORSIKTIG: Hansker er nødvendig ved håndtering av dyr. - Transporter det bedøvede dyret til operasjonen og legg det på et kirurgisk bord utstyrt med et varmeteppe.
- Mål perifer oksygenmetning (Sp02) med en sensor festet til grisens øre og start kontinuerlig elektrokardiografisk (EKG) overvåking med tre avledninger.
- Desinfiser huden med minst 3 vekslende runder med povidon-jod eller klorhexidinskrubb og alkohol. Sett inn et perifert venekateter (22-24 G) i ørevenen. Desinfiser huden tidligere med en antiseptisk løsning.
- Indusere anestesi ved intravenøs injeksjon av fentanyl (5 μg/kg), propofol (4 mg/kg) og atrakurium (0,5 mg/kg). Når spontan pust forsvinner og fravær av reflekser er bekreftet, plasser dyret i dorsalliggende stilling og start umiddelbart håndposemaskeventilasjon med en hundemaske med fraksjon av inspirert oksygen (Fi02) satt til 100%.
MERK: For å redusere risikoen for utilsiktet bevissthet relatert til bruk av nevromuskulære blokkere, bør anestetika med kjent effekt hos svin og med doser på høyere grense brukes for å sikre et tilstrekkelig anestesinivå. I tillegg overvåker du kontinuerlig kardiovaskulære tegn som hjertefrekvens, blodtrykk og kroppstemperatur, og administrerer nevromuskulære blokkere bare når tilbaketrekningsreflekser er fraværende (pedaluttak, palpebrale reflekser og kjevetonus) og muskeltonen er avslappet. - Utfør endotrakeal intubasjon. Minst to operatører er nødvendig for denne prosedyren.
- Sørg for at det grunnleggende utstyret og kirurgiske verktøyene som trengs for endotrakeal intubasjon er klare: bind gasbind for å åpne munnen og sikre røret, veterinær laryngoskop med et rett blad mellom 17 og 25 cm langt, et felles endotrakealrør (ID 4-5), stylet, sprøyte med luft og tape.
- Trekk tungen litt ut og hold kjeven åpen ved hjelp av slipsgasbind plassert bak øvre og nedre hjørnetenner.
- Utfør en laryngoskopi, og når epiglottis er synlig, bruk spissen av laryngoskopet til å trykke epiglottis oppover mot tungen.
MERK: Hvis epiglottis sitter fast i den myke ganen, kan den forskjøves dorsalt med tuppen av røret. Operatør 1 utfører trinn 1.6.2 mens operatør 2 utfører trinn 1.6.3. - Når stemmebåndene er visualisert, forsiktig fremme røret med liten rotasjon inn i luftrøret.
MERK: Det smaleste punktet i luftrøret er på subglottisk nivå. Hvis rørinnsetting er vanskelig, prøv en liten rotasjon eller et mindre rør. - Fjern stiletten og bruk en 5 ml sprøyte til å blåse opp mansjetten.
- Sørg for plassering av endotrakealrøret ved å observere symmetrisk bryststigning, tilstrekkelig oksygenmetning (95% -100%), og en riktig bølgeform og endevanns CO2 (EtCO2) lesing.
FORSIKTIG: Griser er svært utsatt for laryngospasme og ødem i strupeslimhinnen, og larynxperforasjon kan til og med oppstå etter flere intubasjonsforsøk eller hvis sedasjonen er utilstrekkelig10.
- Etter bekreftet intubasjon starter mekanisk ventilasjon med mekanisk respirator med respirasjonsfrekvens på 20 pust per minutt, tidalvolum på 8 ml/kg, FiO2 på 40 % og positivt endeekspiratorisk trykk på 4 cm H2O. Juster ventilasjonen for å oppnå et partialtrykk av karbondioksid (PaCO2) mellom 35 og 45 mmHg.
- Oppretthold dyp anestesi gjennom hele forsøket via en kontinuerlig infusjon av fentanyl (10 μg / kg / time), propofol (10 mg / kg / time) og atrakurium (2 mg / kg / time).
2. Instrumentering
- Forbered lårbenet for kateterisering av fartøyet. Bruk bandasjer til å trekke bena tilbake og desinfisere lyskeområdet med minst 3 alternerende runder med povidon-jod eller klorhexidinskrubb og alkohol.
- Vurder lårbenene med en ultralyd og bruk Doppler-teknikken for å skille mellom arterien og venen. Avhengig av størrelsen på venen, sett inn et 5,5-7,5 fransk (F) sentralt venekateter med tre porter i en av lårbenene under kontinuerlig ultralydvisning og ved hjelp av Seldinger-teknikken11,12.
- Umiddelbart etter plassering av sentralt venekateter, koble til et transdusersystem for å måle det sentrale venetrykket.
- Sørg for at en elektrolytt med glukoseinfusjon (20 ml/time) er koblet til en av sentrallinjeportene, og at en saltvannsinfusjon (5 ml/time) infunderes via den gjenværende porten for å forhindre okklusjon av kateteret.
- Bruk samme teknikk for å kanylere den motsatte lårarterien med et 4 F arterielt kateter spesielt designet for overvåking av hjerteutgang. Utfør en blodgasstest for å etablere riktig posisjon av kateteret hvis ultralydbekreftelse ikke er mulig.
MERK: Ved betydelig spasme eller hematom, kryss over til den kontralaterale lårarterien. - Når arterielle kateter er satt inn, kobler du arterielle ledninger til hjerteutgangsovervåkingssystemet og arteriell transduser direkte til skjermporten. Koble samtidig den venøse måleenheten på skjermen til den sentrale venetransduseren.
MERK: Hjerteutgangsmåleren som brukes i dette eksperimentet, er angitt i materialfortegnelsen. For oppsett, kalibrering og målinger, se produsentens instruksjoner13. - Sørg for at både venøse og arterielle transdusere er kalibrert til null.
- Eksponer venstre arteria carotis interna og venstre vena jugularis eksterna via cut-down-teknikken.
- Sørg for at nødvendig utstyr og kirurgiske verktøy er tilgjengelige: skalpell, stump spiss kirurgisk saks, vevtang, liten selvholdende vevsretractor, nålholder, kirurgiske bytter, sutur med nål, en 18 G IV kanyle, en 5 F kateterkappe med en introduksjon og en Seldinger føringstråd.
- Med dyret i dorsal liggende stilling, desinfiser nakkehuden med en antiseptisk løsning.
- Bruk en skalpell for å lage et ~ 10 cm venstre paratrakealt snitt, som krysser en linje mellom manubrium og kjevevinkelen.
- For å eksponere den ytre vena jugularis, dissekere vevet lateralt til SCM og isolere venen fra den omkringliggende fascia.
- Etter å ha blitt isolert, bruk to ikke-absorberbare silkessuturer (USP-0) sløyfet rundt venen for å fikse fartøyet før punkteringen.
- Snitt venen med en venflonnål (18 G). Når du er inne i venen, trekk nålen inn og sett føringsledningen gjennom Venflon-røret.
- Fjern Venflon-røret og sett kappen med introduksjonen (5 F) over ledningen. Etter innsetting, fjern både introduksjonen og ledningen.
- Skyll hylsene umiddelbart etter innsetting med 0,9 % NaCl (5 ml/time) for å forhindre trombedannelse.
- Bind den proksimale silkesuturen rundt sliren for å fikse den. Deretter fester du håndtaket på skjeden til SCM og lukker huden med stifter.
- Etter kirurgisk forberedelse, la dyrene stabilisere seg i 30 minutter før du oppnår baseline overvåkingsverdier og blodprøver.
- Hold blodtemperaturen på 37-39 °C ved hjelp av et varmeteppe og en overliggende varmer gjennom hele forsøket.
MERK: Temperaturen måles med en termistor plassert på termodilusjonens arterielle kateterspiss.
3. Hemodynamisk og perfusjonsovervåking
- Overvåk EKG, perifer oksygenmetning, respiratorisk volum og trykk og Fi02.
- Koble et spirometer mellom endotrakealrøret og en multiparametermonitor for å måle kvalitativ og kvantitativ EtC02.
MERK: Hvis du vil ha mer informasjon om multiparametermonitoren, kan du se materialfortegnelsen. - Bruk nær-infrarød spektroskopi (NIRS) for å overvåke hjernevevets oksygeneringsindeks (bTOI) og splanchnic tissue oxygenation index (aTOI). Plasser sensorene på huden på pannen og den fremre bukveggen (subhepatisk region).
MERK: Ikke plasser hjernesensoren i midtlinjen, da den kan være forurenset med det øvre sagittale sinusveneblodet14. - Koble blodstrømssonden festet til den indre halspulsåren til en strømningsmonitor for å måle carotisblodstrømmen (CaBF).
- Plasser en laser Doppler-sensor over huden på den fremre bukveggen for kontinuerlig måling av kutan tissulær blodstrøm (CuTBF).
MERK: Hvis du vil ha mer informasjon om sensorene for carotis og kutan tissulær blåsestrøm, kan du se materialfortegnelsen. - Registrer følgende parametere ved baseline og hvert 30. minutt: blodtemperatur, inspiratorisk tidevannsvolum, EtCO2, hjerterytme, hjertefrekvens (HR), systolisk og diastolisk blodtrykk, gjennomsnittlig arterielt blodtrykk (MAP), sjokkindeks (HR/systolisk blodtrykk)15, sentralt venetrykk, hjerteindeks (KI), global endediastolisk volumindeks (GEDVI), slagvolumindeks (SVI), venstre ventrikkelkontraktilitet (Dt/Dpmax), systemisk vaskulær motstandsindeks (SVRI), ekstravaskulær lungevannindeks (ELWI), trykkpulsvariasjon (PPV), perifer hemoglobinmetning, sentralvenøs metning (ScvO2), cerebral (bTOI) og splanknisk (aTOI) vevsoksygeneringsindeks av NIRS, CaBF og CuTBF.
- For å oppnå CI-verdier, fyll 5 ml boluser med 0,9 % normalt saltvann ved en temperatur under 8 °C gjennom det sentrale venekateteret. Registrer gjennomsnittet av to påfølgende tiltak.
- Bestem arterielle og venøse blodgassprofiler og laktatkonsentrasjon hvert 30. minutt ved å trekke 0,3 ml blod fra lårbenene. Utfør standard fullstendige blodtellinger, koagulasjonsstudier og biokjemi ved baseline, etter blødningsinduksjon og ved slutten av forsøket.
- Etter hver blodtrekking, skyll slangene med 0,5 ml 100 IE/ml heparin.
4. Hemorragisk sjokk induksjon
- Når en steady state er oppnådd etter at instrumentering og baseline data er samlet, indusere hypovolemisk sjokk ved å trekke 30 ml / kg blod fra halsvenen over 30 minutter.
- Tillat en 30 min periode for stabilisering. Ikke gjør gjenopplivningsinnsats i denne perioden for å etterligne forsinkelsen i ankomst av akuttmedisinske team.
5. Infusjon og oppfølging
- Etter stabiliseringsperioden, tilsett en bolus av en volumekspander eller et vasoaktivt middel over en periode på 30 minutter.
MERK: Eksempler på volumutvidere og vasoaktive midler testet er normal saltvann, hypertonisk albumin, angiotensin og terlipressin. I denne studien ble det brukt 30 ml/kg normalt saltvann (NS) (n = 13), 15 ml/kg 5 % albumin pluss 3 % hypertont saltvann (AHS) (n = 13), eller en enkelt intravenøs bolus på 15 μg/kg terlipressin pluss 15 ml/kg 5 % albumin pluss 3 % hypertont saltvann (TAHS) (n = 13). - Etter infusjonen, følg opp dyret i 120 minutter. Registrer de hemodynamiske parametrene og ta blodprøver hvert 30. minutt for arterielle og venøse blodgassprofiler og bestemmelse av laktatkonsentrasjon. Ikke gjør gjenopplivningsinnsats i denne perioden.
6. Slutten av forsøket og eutanasi
- Når eksperimentet er fullført, bruk en beroligende overdose (5 μg / kg fentanyl og 10 mg / kg propofol) og en intravenøs injeksjon av kaliumklorid (2 mEq / kg) for å ofre alle vellykket gjenopplivede dyr.
- Bekreft fraværet av sirkulasjon av asystole eller pulsløs elektrisk aktivitet på en kontinuerlig EKG-skjerm, fraværet av pulsatil strømning under invasiv arteriell trykkovervåking og fraværet av andre vitale tegn.
- Hvis arterielt blodtrykk i løpet av oppfølgingsperioden faller under 25 mmHg, ofre dyret for å unngå ytterligere lidelse.
Representative Results
Den presenterte modellen har blitt brukt i flere eksperimenter for å studere makrosirkulasjons- og mikrosirkulasjonsendringer etter hemorragisk sjokk og påfølgende gjenopplivning, sammenligning av forskjellige væsker og vasoaktive stoffer16,17,18,19.
Med tanke på responsen på sjokk, har denne modellen konsekvent vist at en kontrollert blødning gir markerte endringer i hemodynamiske parametere, så vel som i cerebral og vevsperfusjon.
Etter seponering av volum påvises signifikant takykardi og reduksjon i MAP, CI, SVI, blodvolumparametere (GEDVI og ITBI) og carotisarteriell blodstrøm, sammen med økning i systemisk vaskulær resistensindeks (figur 1 og figur 2).
Når det gjelder systemiske perfusjonsparametere, øker laktat signifikant, mens ScvO2, CuTBF og bTO reduseres (figur 3). Variasjoner i sentralt venetrykk, Dt/Dpmax og ELWer vanligvis ikke registrert.
Når det gjelder laboratorieparametere, reduseres ikke hemoglobininnhold og hematokrit før væsker er administrert. Albuminkonsentrasjonen minker, og troponinnivået øker betydelig etter kontrollert blødning. Andre parametere, inkludert kjernetemperatur, PaO2, PaCO2, arteriell oksygenmetning, EtCO2, elektrolytter og nyre- og leverfunksjonsparametere, forblir vanligvis stabile.
Foruten sin nytte i å analysere kardiovaskulære og biokjemiske responser på sjokk, har denne modellen vist seg å lykkes diskriminere mellom forskjellige gjenopplivningsvæsker.
I tidligere studier har vi hatt som mål å avgjøre om, i en spedbarnsdyrmodell av hemorragisk sjokk, bruk av en lavere voluminfusjon av hypertoniske væsker - alene eller kombinert med forskjellige vasopressorer - ville forbedre globale hemodynamiske og perfusjonsparametere sammenlignet med vanlig saltvann.
Som rapportert tidligere har vi konsekvent observert at infusjon av hypertoniske væsker gir en lignende respons på infusjonen av to ganger volumet av isotonisk væske16,17,18.
Mer spesifikt ga bruk av albumin pluss hypertont saltvann en større og lengre volumutvidelse enn vanlig saltvann eller hypertont saltvann alene, med signifikante forskjeller i HR, SVI og PPV, og fravær av et progressivt fall etter volumutvidelse i blodtrykk og GEDVI, som observert i de andre gruppene (figur 1 og figur 2). Videre har vi også observert en større forbedring av perfusjonsparametrene med hypertont albumin, representert som en større økning av bTOI og CaBF, og en større reduksjon av laktatnivået enn de andre gruppene sammenlignet med begynnelsen av væskeekspansjonen (figur 3). Vi tror at denne forskjellen kan være sekundær til albuminets evne til å øke blodvolumet og forbli i lengre tid i det intravaskulære rommet enn vanlig saltvann. Interessant nok har vi sett at tilsetningen av en enkelt bolus av terlipressin i begynnelsen av væskegjenopplivning ga lignende resultater som de som ble observert i den hypertoniske albumingruppen, uten noen ekstra fordeler når det gjelder hemodynamiske eller perfusjonsparametere17,18.
Figur 1: Hemodynamiske parametere. (A) Utvikling av hjertefrekvens, (B) gjennomsnittlig arterielt trykk, (C) hjerteindeks ved baseline (t0') og (D) systemisk vaskulær motstandsindeks ved baseline (t0'). I løpet av forsøket: slutten av kontrollert blødning (Shock30'); begynnelsen av infusjonen, 30 minutter etter avsluttet kontrollert blødning (Res0'); slutten av infusjonen (Res30'); oppfølging 30 minutter etter avsluttet infusjon (Obs30'); oppfølging 60 minutter etter avsluttet infusjon (Obs60'); oppfølging 90 minutter etter avsluttet infusjon (Obs90'). (*) Signifikant forskjell (p < 0,05) fra baseline, samme gruppe. (‡) p < 0,05 fra blødning, samme gruppe. (#) p < 0,05 fra gruppe NS. Forkortelser: NS = normal saltvann; AHS = hypertonisk saltvannsalbumin; TAHS = terlipressin pluss hypertonisk saltvannsalbumin. Data er presentert som gjennomsnitt og standardavvik. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Urbano et al.17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Blodvolumparametere. (A) Utvikling av slagvolumindeks, (B) pulstrykkvariasjon og (C) global endediastolisk volumindeks ved baseline (t0'). I løpet av forsøket: slutten av kontrollert blødning (Shock30'); begynnelsen av infusjonen, 30 minutter etter avsluttet kontrollert blødning (Res0'); slutten av infusjonen (Res30'); oppfølging 30 minutter etter avsluttet infusjon (Obs30'); oppfølging 60 minutter etter avsluttet infusjon (Obs60'); oppfølging 90 minutter etter avsluttet infusjon (Obs90'). (*) Signifikant forskjell (p < 0,05) fra baseline, samme gruppe. (‡) p < 0,05 fra blødning, samme gruppe. (#) p < 0,05 fra gruppe NS. Forkortelser: NS = normal saltvann; AHS = hypertonisk saltvannsalbumin; TAHS = terlipressin pluss hypertonisk saltvannsalbumin. Data er presentert som gjennomsnitt og standardavvik. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Urbano et al.17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Systemiske perfusjonsparametere. (A) Utvikling av arterielt blodlaktat, (B) oksygenmetning i sentralvenøst blod og (C) oksygeneringsindeks for hjernevev ved baseline (t0'). I løpet av forsøket: slutten av kontrollert blødning (Shock30'); begynnelsen av infusjonen, 30 minutter etter avsluttet kontrollert blødning (Res0'); slutten av infusjonen (Res30'); oppfølging 30 minutter etter avsluttet infusjon (Obs30'); oppfølging 60 minutter etter avsluttet infusjon (Obs60'); oppfølging 90 minutter etter avsluttet infusjon (Obs90'). (*) Signifikant forskjell (p < 0,05) fra baseline, samme gruppe. (‡) p < 0,05 fra blødning, samme gruppe. (#) p < 0,05 fra gruppe NS. Data er presentert som gjennomsnitt og standardavvik. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Urbano et al.17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Utførelse av prosedyrer på unge griser kan være komplisert og potensielt livstruende på grunn av visse anatomiske og fysiologiske egenskaper hos disse dyrene. For å oppnå konsistente resultater og redusere tap av dyr, er det noen kritiske skritt som bør vurderes nøye. For det første er det viktig å oppnå et tilstrekkelig nivå av sedasjon for å minimere dyrestressresponsen, som, hvis den er overdreven, kan endre resultatene på grunn av endogen katekolaminfrigivelse. Det er også viktig å unngå forsinkelser mellom intramuskulær injeksjon og intubasjon, da dyr kan utvikle en alvorlig stressrespons med takykardi og irreversibel metabolsk acidose som kan utløse slutten av forsøket. Selv om andre grupper bruker inhalasjonsanestetika med gode resultater20,21, foretrekker vi intravenøse medisiner, da inhalasjonsberoligende midler ikke tillater måling av respiratorisk gassutveksling med indirekte kalorimetri. Vår erfaring er at en kombinasjon av propofol og fentanyl er effektiv og har svært få bivirkninger. Forsiktig temperaturstyring gjennom hele forsøket er et annet viktig aspekt ved protokollen, da raske temperaturendringer kan påvirke dyrets hemodynamiske respons på støt, forfalske resultatene eller til slutt føre til at forsøket mislykkes.
En annen viktig del av instrumentering er intubasjon, gitt særegenheter ved svinens anatomi og deres følsomhet for laryngospasme. Derfor bør prosedyren utføres av minst en operatør med tidligere erfaring, og bruk av en stylet og muskelavslapping er tilrådelig10,22. Kateterisering av fartøy kan også være utfordrende på grunn av den lille størrelsen på dyrene. For femoral tilgang er en sonografistyrt punktering å foretrekke, da karene ligger dypt, vanligvis har små diametre, og viser forskjellige kurs og posisjoner22. For cervikal tilgang bruker vi kirurgisk tilgang for å tillate plassering av carotisstrømningssonden, men ultralydteknikken er også mulig23,24. Cannulation av den ytre jugularvenen er vanligvis foretrukket på grunn av dens bredere diameter, dens overfladiske plassering og lavere antall omkringliggende strukturer22. Katetre skal skylles umiddelbart etter innsetting med saltoppløsninger for å forhindre okklusjon. Vi bruker ikke heparin for å unngå koagulasjonsendringer. I utgangspunktet unngikk vi også administrering av glukoseinfusjoner for å forhindre potensiell forvrengning av den hemodynamiske responsen ved administrering av ekstra væsker, men vi fant at dyr utviklet alvorlig og tidlig hypoglykemi. Til slutt, selv med anestesi og de mindre invasive teknikkene som brukes i dag, genererer instrumentering en betydelig stressrespons hos dyr, så det er ønskelig å gi nok tid til utvinning før du starter fjerning av blod. Ved induksjon av hemoragisk sjokk anbefaler vi fjerning av 30 ml/kg, da dette gir en signifikant patofysiologisk respons med utmerket overlevelse. Vår erfaring er at svin ikke tåler større blodtap, og dødeligheten er høy. Gradvis tilbaketrekking av blod er også viktig, da rask fjerning kan føre til alvorlig hemodynamisk ustabilitet og tidlig død av dyret.
Selv om det finnes et bredt utvalg av arter og eksperimentelle modeller tilgjengelig for forskere, representerer den ideelle modellen for dyrehemorragisk sjokk-enkel, lett reproduserbar og nøyaktig replikering av den kliniske situasjonen fortsatt en utfordring. Små dyremodeller - primært mus og rotter - brukes til å undersøke de patofysiologiske mekanismene for sjokk. Imidlertid kompliserer deres lille størrelse betydelig utførelsen av kirurgiske og prøvetakingsprosedyrer. Større dyr, som hunder og griser, er dyrere og komplekse å håndtere, men deres størrelse og fysiologiske likheter med mennesker gjør dem mer egnet for preklinisk evaluering av behandlingsstrategiene. Imidlertid er bruken av hunder i fortiden og fortsatt i dag etisk tvilsom. De gir ingen fordel over griser som eksperimentelle dyremodeller, og deres intelligens og det spesielle bilaterale forholdet mellom mennesker og hunder plasserer dem i en høyere posisjon i den fylogenetiske skalaen 6,7,8.
I lys av alt dette har voksne svin blitt mye brukt til kardiovaskulær forskning på grunn av deres likheter med voksen menneskelig fysiologi, størrelse og anatomi, noe som er bedre enn de fleste arter. Imidlertid, som det har blitt godt etablert i litteraturen, er det signifikante forskjeller mellom menneskelige voksne og pediatriske pasienter når det gjelder kardiovaskulærsystemet, blodvolum, temperaturregulering og respons på sjokk 2,3,4. Samtidig viser bevis at disse forskjellene også gjelder for svin, og gris har vist seg å ha kardiovaskulære, cerebrovaskulære, hematologiske og elektrolyttprofiler som ligner på de hos pediatriske menneskelige pasienter 9,25. Til slutt, utover disse anatomiske og fysiologiske forskjellene mellom voksne og spedbarn i begge arter, gir bruk av spedbarnsdyrmodeller, spesielt minigriser, muligheten til å teste de samme enhetene som brukes i den virkelige kliniske innstillingen for overvåking. I mange tilfeller har påliteligheten til disse enhetene vist seg å være lav på grunn av en enkel tilpasning av voksenalgoritmer, sensorer eller skalaer. Alle disse aspektene støtter viktigheten av å utvikle spesifikke pediatriske dyremodeller og deres relevans når det gjelder translasjonell nytte for den pediatriske kliniske innstillingen.
Foruten typen dyr er det tre grunnleggende modeller som vanligvis brukes i studiet av hemorragisk sjokk: kontrollert blødning - enten i volum eller trykk - og ukontrollert blødning. Protokollen som presenteres i denne artikkelen beskriver en blødningsmodell med fast volum, der et fast blodvolum, vanligvis beregnet av prosentandelen kroppsvekt, fjernes over en tidsperiode fastsatt av observatøren. Tvert imot, i modeller med fast trykkblødning, bløder dyr til et forhåndsbestemt MAP, som deretter opprettholdes med periodiske blødninger eller væskeinfusjoner i en spesifisert periode, avhengig av dyreart og graden eller utfallet av sjokk. Både hemorragiske sjokkmodeller med fast volum og fast trykk tillater studier av sjokkinduserte patofysiologiske endringer under kontrollerte forhold, noe som gir en klar fordel når det gjelder reproduserbarhet og standardisering. Imidlertid er deres hovedbegrensning at de ikke tillater studier av effekten av forskjellige gjenopplivingsstrategier på aktiv blødning, hvor aggressiv væskeredning før kirurgisk kontroll av blødning er kjent for å øke blødning og redusere overlevelse på grunn av inhibering av trombusdannelsen og økningen i gjennomsnittlig blodtrykk. Ukontrollerte blødningsmodeller indusert av et standardisert vaskulært traume - knus / lacerasjon av lever og milt, arterieskade eller amputasjon av et vedlegg - har blitt foreslått for bedre å reflektere den kliniske situasjonen, og dermed tillate en bedre forståelse av effekten av ulike væskegjenopplivningsstrategier og andre intervensjoner, som hypotermi og hemostatiske produkter. Til tross for at de er klinisk mest relevante, utøver disse ukontrollerte blødningsmodellene noen klare ulemper når det gjelder standardisering og reproduserbarhet. I lys av alt dette ser det ut til at den ideelle modellen ikke eksisterer, og derfor må forskning på dette feltet balansere klinisk relevans med eksperimentell standardisering og pålitelighet 6,7,8,9,26.
Modellen beskrevet i denne studien kan tilby brede potensielle anvendelser i kardiovaskulær forskning, for eksempel undersøkelse av endoteldysfunksjon og mikrosirkulasjonsendringer18 under sjokk, samt validering av forskjellige hemodynamiske overvåkingssystemer. Videre kan den også brukes i andre forskningsfelt, slik at studiet av endokrine eller immunresponser etter alvorlig blødning, samt bestemmelse av bivirkninger av forskjellige væsker og vasopressorer. Når det gjelder forskningen på ulike gjenopplivingsstrategier, anbefales det imidlertid å studere effektene i ukontrollerte blødningsmodeller før man implementerer endringer i klinisk setting 7,26.
Foruten vanskeligheten med å ekstrapolere resultatene til det virkelige liv, har denne modellen andre begrensninger. Til å begynne med er det noen forvirrende variabler relatert til det eksperimentelle oppsettet, for eksempel bruk av bedøvelsesmidler eller mekanisk ventilasjon, som kan dempe de fysiologiske responsene under sjokk og komplisere tolkningen av resultatene. Dessuten kan instrumenteringsstressrespons på dyrene og temperaturkontroll påvirke makro- og mikrosirkulasjonen gjennom ulike mekanismer. En annen viktig begrensning av denne modellen - relatert til eksperimentelle nødvendigheter og tilgjengelighet av ressurser - er den begrensede posttraumatiske observasjonsperioden, noe som ytterligere begrenser studiet av de langsiktige konsekvensene av hemorragisk sjokk. I tillegg, til tross for de fysiologiske likhetene mellom mennesker og griser, er det noen forskjeller mellom arter som bør vurderes. Koagulasjonssystemet ser for eksempel ut til å være mer effektivt hos svin27,28. Også laktat- og succinatplasmanivåene varierer mellom arter, og griser har basal alkalose, noe som kan føre til en underestimering av effekten av blødning på syrebasebalanse29. Til slutt er det også velkjent at betennelses- og immunresponsene, samt noen vasopressorreseptorer, er forskjellige hos svin9. Spesifikke dyreforskjeller må også vurderes som påvirkende faktorer. Flere studier har indikert kjønnsforskjeller når det gjelder mottakelighet for sjokk, med kvinner som har en betydelig overlevelsesfordel over menn 6,9. Likevel, i forsøkene som ble utført i denne studien, bruker vi dyr fra samme aldersgruppe og med lignende genetisk bakgrunn for å minimere den potensielle variasjonen som er forbundet med arter.
Avslutningsvis gir denne artikkelen en praktisk og trinnvis veiledning for å sette opp en svinemodell av pediatrisk hemoragisk sjokk. Sammenlignet med andre eksisterende modeller er dette en pålitelig og lett å følge protokoll med bred anvendelighet i biomedisinsk forskning, enten for undersøkelse av patofysiologiske responser etter alvorlig blødning eller for evaluering av ulike gjenopplivingsstrategier.
Disclosures
Forfatterne av dette arbeidet har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne studien er finansiert av Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) gjennom prosjektet "PI20/01706" og medstiftet av EU. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet. Vi vil gjerne vise takknemlighet til alle våre kolleger fra Gregorio Marañón pediatrisk intensivavdeling og fra Gregorio Marañón eksperimentelle institutt, for uten deres arbeid ville dette prosjektet ikke vært mulig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADA swabs | Albino Dias de Andrade, S.A. | 300575750400 | Non-woven swabs |
| Alaris SE | Carefusion | N/A | Volumetric infusion pump |
| Atracurium | Aspen Pharma Trading Limited. Dublin, Ireland | N/A | Muscle relaxant |
| Atropine 1 mg/mL | B. Braun | 481377/1013 | |
| Barrier adhesive aperture drape | Mölnlycke | 63621 | |
| BD emerald syringe 5 mL, 10 mL, 20 mL | Becton Dickinson S.A | https://www.bd.com/en-eu/offerings/capabilities/syringes-and-needles/injection-syringes/bd-emerald-3-piece-syringe | various options available |
| BLF21A laser doppler monitor | Transonic Systems Inc. | BLF21A | Skin blood flow monitor |
| BlueSensor NF ECG electrodes | Ambu | NF-50-A/12 | |
| Check-Flo performer introducer set 5Fr | Cook Medical | G12018 | Vascular Sheath |
| Datex ohmeda S5 | GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland | M1162897 | Hemodynamic monitor |
| Fentanyl 0.05 mg/mL | Kern Pharma | N/A | Anesthesia |
| GE Vivid S5 | GE Healthcare | S series | Ultrasound machine |
| Introcan Safety 18 G, 22 G, 24 G | B. Braun | Introcan series | Safety intravenous catheter |
| INVOS cerebral/somatic oximetry adult sensors | Medtronic PLC, USA | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry/invos-cerebral-somatic-oximetry-adult-sensors.html | |
| INVOS OXIMETER cerebral/somatic | Somanetics | 08-10566 | Regional oxygenation monitor |
| Ketamin 50 mg/mL | Pfizer, S.L. | 47034 | Sedation |
| Leon plus | Heinen + Löwenstein | N/A | Ventilator |
| Life scope VS | Nihon Kohden | N/A | Bedside monitor |
| Miller laryngoscope blade 12″ | Jorgensen Labs, USA | J0449F | Laryngoscope |
| Multi-lumen central venous catheterization set 7 French, 3 lumen, 30 cm | Arrow | CS-14703 | Central venous catheter |
| Nellcor WarmTouch 5300A | Covidien | Thermal blancket | |
| Nitrile gloves | Medihands | KS-ST RT021 | Single use gloves |
| Pediatric SomaSensor INVOS cerebral/somatic | Covidien | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry.html | Disposable regional oxygen saturation sensor |
| PICCO monitoring kit | Pulsion Medical Systems | PV8215 | |
| PICCO thermodilution catheter 5F/20 cm | Pulsion Medical Systems | N/A | |
| Propofol Lipoven 10 mg/mL | Fresenius Kabi, Spain | N/A | Anesthesia |
| Pulse contour cardiac output (PiCCO2) | Pulsion Medical Systems | N/A | Hemodynamic monitor |
| Rüsch flexislip | Teleflex Medical | 503700 | Endotracheal tube stylet |
| Softa swabs | B. Braun | 19579 | Alcohol pads |
| Surgical silk sutures USP 0 | Aragó, Barcelona, Spain. | 6245 | |
| TruWave pressure monitoring set | Edwards | T001767A | Pressure monitoring set |
| Ultrasound transmission gel | Ultragel Hungary 2000 Kft. | UC260 |
References
- Disease Control and Prevention (CDC). Vital signs: Unintentional injury deaths among persons aged 0-19 years-United States, 2000-2009. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 61, 270-276 (2012).
- Russell, R. T., et al. Pediatric traumatic hemorrhagic shock consensus conference recommendations. The Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 94, S2-S10 (2023).
- Leonard, J. C., et al. Life-threatening bleeding in children: A prospective observational study. Critical Care Medicine. 49 (11), 1943-1954 (2021).
- Cannon, J. W.
- Dehmer, J. J., Adamson, W. T. Massive transfusion and blood product use in the pediatric trauma patient. Seminars in Pediatric Surgery. 19 (4), 286-291 (2010).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: a review. European Surgical Research. 50 (2), 57-70 (2013).
- Moochhala, S., Wu, J., Lu, J. Hemorrhagic shock: an overview of animal models. Frontiers in Bioscience. 14 (12), 4631-4639 (2009).
- Lomas-Niera, J. L., Perl, M., Chung, C. S., Ayala, A. Shock and hemorrhage: an overview of animal models. Shock. 24, 33-39 (2005).
- Hildebrand, F., Andruszkow, H., Huber-Lang, M., Pape, H. C., van Griensven, M. Combined hemorrhage/trauma models in pigs-current state and future perspectives. Shock. 40 (4), 247-273 (2013).
- Chum, H., Pacharinsak, C.
- Leibowitz, A., Oren-Grinberg, A., Matyal, R. Ultrasound guidance for central venous access: Current evidence and clinical recommendations. Journal of Intensive Care Medicine. 35 (3), 303-321 (2020).
- Lockwood, J., Desai, N.
- Operator's Manual PiCCO2. Version 3.1. Pulsion Medical Systems. , Available from: https://www.manualslib.com/manual/2821743/Pulsion-Picco2.html#manual (2013).
- Operations Manual INVOS ® System, Model 5100C. Medtronic. , Available from: http://www.wemed1.com/downloads/dl/files/id/7947/product/10495/manual_for_mo_s_5100c.pdf (2013).
- Acker, S. N., Ross, J. T., Partrick, D. A., Tong, S., Bensard, D. D. Pediatric specific shock index accurately identifies severely injured children. Journal of Pediatric Surgery. 50 (2), 331-334 (2015).
- Urbano, J., et al. Comparison of normal saline, hypertonic saline and hypertonic saline colloid resuscitation fluids in an infant animal model of hypovolemic shock. Resuscitation. 83 (9), 1159-1165 (2012).
- Urbano, J., et al. Comparison of normal saline, hypertonic saline albumin and terlipressin plus hypertonic saline albumin in an infant animal model of hypovolemic shock. PLoS One. 10 (3), e0121678 (2015).
- González, R., et al. Microcirculatory alterations during haemorrhagic shock and after resuscitation in a paediatric animal model. Injury. 47 (2), 335-341 (2016).
- López-Herce, J., Rupérez, M., Sánchez, C., García, C., García, E. Haemodynamic response to acute hypovolaemia, rapid blood volume expansion and adrenaline administration in an infant animal model. Resuscitation. 68 (2), 259-265 (2006).
- Gil-Anton, J., et al. Addition of terlipressin to initial volume resuscitation in a pediatric model of hemorrhagic shock improves hemodynamics and cerebral perfusion. PLoS One. 15 (7), e0235084 (2020).
- Williams, A. M., et al. Complete and partial aortic occlusion for the treatment of hemorrhagic shock in swine. Journal of Visualized Experiments. (138), e58284 (2018).
- Schüttler, D., et al. A practical guide to setting up pig models for cardiovascular catheterization, electrophysiological assessment, and heart disease research. Lab Animal. 51 (2), 46-67 (2022).
- Chiesa, O. A., et al. Minimally invasive ultrasound-guided technique for central venous catheterization via the external jugular vein in pigs. American Journal of Veterinary Research. 82 (9), 760-769 (2021).
- Anderson, J. H., et al. Ultrasound guided percutaneous common carotid artery access in piglets for intracoronary stem cell infusion. Laboratory Animals. 52 (1), 88-92 (2018).
- Hughes, H. C.
- Mayer, A. R., et al. A systematic review of large animal models of combined traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 104, 160-177 (2019).
- Velik-Salchner, C., et al. Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood. Thrombosis Research. 117 (5), 597-602 (2006).
- Siller-Matula, J. M., Plasenzotti, R., Spiel, A., Quehenberger, P., Jilma, B.
- Reisz, J. A., et al. All animals are equal but some animals are more equal than others: Plasma lactate and succinate in hemorrhagic shock-A comparison in rodents, swine, nonhuman primates, and injured patients. The Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 84 (3), 537-541 (2018).
