Summary
Este artigo tem como objetivo fornecer aos pesquisadores um guia detalhado e acessível para a montagem de um modelo infantil suíno de choque hemorrágico.
Abstract
O choque hemorrágico é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes pediátricos. A interpretação dos indicadores clínicos validados em adultos para orientar a ressuscitação e a comparação entre diferentes terapias é difícil em crianças devido à heterogeneidade inerente a essa população. Como resultado, em comparação com adultos, o manejo adequado do choque hemorrágico pediátrico ainda não está bem estabelecido. Além disso, a escassez de pacientes pediátricos com choque hemorrágico impede o desenvolvimento de estudos clinicamente relevantes. Por esta razão, um modelo animal pediátrico experimental é necessário para estudar os efeitos da hemorragia em crianças, bem como sua resposta a diferentes terapias. Apresentamos um modelo animal infantil de choque hemorrágico controlado a volume em porcos jovens anestesiados. A hemorragia é induzida pela retirada de um volume sanguíneo previamente calculado, e o porco é posteriormente monitorado e ressuscitado com diferentes terapias. Descrevemos um modelo preciso e altamente reprodutível de choque hemorrágico em suínos imaturos. O modelo fornece dados hemodinâmicos que caracterizam mecanismos compensatórios que são ativados em resposta a hemorragias graves.
Introduction
A hemorragia com risco de vida devido a trauma, embora incomum, é a principal causa de morte em pacientes pediátricos 1,2. Causas adicionais de choque hemorrágico incluem febre hemorrágica, sangramento gastrointestinal, cirurgia hepática e cirurgia cardíaca, especialmente quando a circulação extracorpórea é usada3.
Ao contrário da população adulta, não há dados suficientes sobre o manejo do choque hemorrágico pediátrico, que é amplamente baseado em opiniões de especialistas ou traduzido diretamente da prática adulta 2,4. No entanto, a tradução de estratégias de manejo de adultos pode não ser apropriada. Por exemplo, indicadores clínicos validados em adultos são difíceis de extrapolar para pacientes pediátricos devido à heterogeneidade fisiológica presente entre grupos de diferentes idades e aos diferentes padrões de lesão predominantes na população pediátrica. Consequentemente, os desfechos específicos que desencadeariam a intervenção no paciente pediátrico não estão bem definidos. Além disso, não há evidências suficientes sobre os efeitos deletérios que as terapias atualmente implementadas em adultos podem ter em crianças 2,4,5.
Diante de tudo isso, mais investigações são necessárias para estabelecer limiares de ressuscitação específicos para pronta intervenção, bem como para melhor determinar quais são as terapias mais adequadas para o choque hemorrágico pediátrico. No entanto, o desenvolvimento de estudos de qualidade e clinicamente relevantes sobre hemorragia com risco de vida em crianças é difícil, devido à escassez de pacientes e à heterogeneidade já mencionada na população pediátrica desde o período neonatal até a adolescência.
A relevância clínica do choque hemorrágico, além das dificuldades na realização de estudos clínicos em pacientes pediátricos, enfatizam a necessidade de avaliações pré-clínicas em modelos animais para estudar a fisiopatologia após choque hemorrágico em crianças, bem como para comparar diferentes terapias. Vários modelos animais têm sido amplamente utilizados em pesquisas para o estudo do choque hemorrágico6,7,8,9. Devido às suas semelhanças anatômicas e fisiológicas com os seres humanos, os suínos são altamente valorizados na pesquisa biomédica. Em relação às vantagens do uso de modelos infantis específicos, evidências mostram que a hemodinâmica de suínos imaturos, bem como os sistemas respiratório, hematológico e metabólico, são altamente comparáveis aos de humanosjovens9. Isso confere uma oportunidade única de simular um quadro clínico de choque hemorrágico em crianças.
Nesse modelo, a hemorragia é induzida pela retirada de um volume sanguíneo previamente calculado. Posteriormente, o porco é monitorado e diferentes fluidos de ressuscitação são administrados.
Descrevemos um modelo preciso e altamente reprodutível de choque hemorrágico em suínos imaturos. O modelo fornece dados hemodinâmicos que caracterizam mecanismos compensatórios ativados em resposta a hemorragia grave.
Protocol
Os experimentos deste protocolo foram aprovados pelo Comitê de Ética Institucional em Pesquisa Animal do Hospital Universitário Gregorio Marañón, Madri, Espanha, e pelo Conselho de Agricultura e Meio Ambiente do Governo Autônomo de Madri (número de licença: 12/0013). Diretrizes europeias e espanholas para cuidados éticos e uso de animais de experimentação foram aplicadas durante todo o estudo. Os experimentos foram realizados no Departamento de Medicina e Cirurgia Experimental do Hospital Universitário Gregorio Marañón, Madri, Espanha.
OBS: O modelo animal escolhido consistiu de miniporcos (Sus scrofa domestica) saudáveis de 2-3 meses de idade (8-12 kg). Os miniporcos são o resultado de um cruzamento de três raças diferentes que os tornam adequados para pesquisas biomédicas. Os animais são de linhagens quase idênticas e são fornecidos por um criadouro especificamente autorizado em Madri (IMIDRA), que mantém a manutenção de três linhagens genéticas homozigotas em pureza. Animais machos e fêmeas foram utilizados de forma intercambiável. Os animais foram alimentados com uma dieta padrão para suínos e observados por um período mínimo de 2 dias para garantir boa saúde. Alimentos, mas não água, foram retirados na noite anterior aos procedimentos para reduzir o risco de aspiração. Um experimento típico requer aproximadamente 6 h para ser concluído, incluindo 30 min para indução anestésica e preparação cirúrgica, 60 min para instrumentação, 30 min para recuperação, 60 min para indução de hemorragia e estabilização posterior, 30 min para ressuscitação e 120 min para acompanhamento.
1. Anestesia, intubação e ventilação mecânica
- Pré-medicar o porco com uma injeção intramuscular de cetamina (10 mg/kg) e atropina (0,02 mg/kg) na região lateral do pescoço, atrás da orelha ou na região femoral posterior.
NOTA: Drogas anticolinérgicas, como a atropina, são úteis, pois suínos podem salivar excessivamente sob anestesia10. Em nossa experiência, essa dose de cetamina é suficiente para reduzir o estresse e induz sedação e analgesia adequadas em suínos sem efeitos adversos. No entanto, se o animal não estiver sedado adequadamente ou se a distância do alojamento até a sala de cirurgia for longa, outra dose de cetamina (10 mg/kg) pode ser administrada com segurança.
CUIDADO: Luvas são necessárias ao manusear animais. - Transporte o animal sedado até a sala de cirurgia e coloque-o em uma mesa cirúrgica provida de manta térmica.
- Medir a saturação periférica de oxigênio (Sp02) com um sensor acoplado à orelha do porco e iniciar a monitorização eletrocardiográfica (ECG) contínua de três derivações.
- Desinfete a pele com pelo menos 3 rodadas alternadas de esfoliação com iodopovidona ou clorexidina e álcool. Insira um cateter venoso periférico (22-24 G) na veia do ouvido. Desinfete a pele previamente com uma solução antisséptica.
- Induzir anestesia por injeção venosa de fentanil (5 μg/kg), propofol (4 mg/kg) e atracúrio (0,5 mg/kg). Uma vez que a respiração espontânea desaparece e a ausência de reflexos é confirmada, colocar o animal na decúbito dorsal e iniciar imediatamente a ventilação da máscara com uma máscara de cão com fração inspirada de oxigênio (Fi02) fixada em 100%.
OBS: Para reduzir o risco de consciência acidental relacionado ao uso de bloqueadores neuromusculares, agentes anestésicos com eficácia conhecida em suínos e com doses no limite superior devem ser utilizados para garantir um nível adequado de anestesia. Além disso, monitore continuamente sinais cardiovasculares, como frequência cardíaca, pressão arterial e temperatura corporal, e administre bloqueadores neuromusculares apenas quando os reflexos de retirada estiverem ausentes (retirada do pedal, reflexos palpebrais e tônus mandibular) e o tônus muscular estiver relaxado. - Realizar intubação endotraqueal. Pelo menos dois operadores são necessários para este procedimento.
- Certifique-se de que os equipamentos básicos e as ferramentas cirúrgicas necessárias para a intubação endotraqueal estejam prontos: gaze de amarração para abrir a boca e fixar o tubo, laringoscópio veterinário com lâmina reta entre 17 e 25 cm de comprimento, tubo endotraqueal comum (ID 4-5), estilete, seringa com ar e fita adesiva.
- Puxe a língua levemente e mantenha a mandíbula aberta usando gaze de gravata colocada atrás dos dentes caninos superiores e inferiores.
- Realizar uma laringoscopia e, uma vez que a epiglote é visível, usar a ponta do laringoscópio para pressionar a epiglote para cima em direção à base da língua.
NOTA: Se a epiglote estiver presa ao palato mole, ela pode ser deslocada dorsalmente com a ponta do tubo. O operador 1 executa a etapa 1.6.2 enquanto o operador 2 executa a etapa 1.6.3. - Uma vez visualizadas as pregas vocais, avançar suavemente o tubo com ligeira rotação para dentro da traqueia.
NOTA: O ponto mais estreito da traqueia está no nível subglótico. Se a inserção do tubo for difícil, tente uma ligeira rotação ou um tubo menor. - Retire o estilete e use uma seringa de 5 mL para inflar o manguito.
- Assegurar a colocação do tubo endotraqueal observando elevação torácica simétrica, saturação adequada de oxigênio (95%-100%) e leitura adequada da forma de onda e do CO2 expirado final (EtCO2).
CUIDADO: Os suínos são muito suscetíveis ao laringoespasmo e edema da mucosa laríngea, podendo ocorrer até mesmo perfuração laríngea após várias tentativas de intubação ou se a sedação forinadequada10.
- Após a confirmação da intubação, iniciar a ventilação mecânica com frequência respiratória de 20 incursões respiratórias por minuto, volume corrente de 8 mL/kg, FiO2 de 40% e pressão expiratória final positiva de 4 cm H2O. Ajustar a ventilação para atingir uma pressão parcial de dióxido de carbono (PaCO2) entre 35 e 45 mmHg.
- Manter anestesia profunda durante todo o experimento através de infusão contínua de fentanil (10 μg/kg/h), propofol (10 mg/kg/h) e atracúrio (2 mg/kg/h).
2. Instrumentação
- Preparar a área femoral para cateterização do vaso. Use bandagens para puxar as pernas para trás e desinfetar a área inguinal com pelo menos 3 rodadas alternadas de iodopovidona ou esfoliação de clorexidina e álcool.
- Avalie os vasos femorais com ultrassonografia e use a técnica Doppler para distinguir entre a artéria e a veia. Dependendo do tamanho da veia, inserir cateter venoso central 5,5-7,5 French (F) com três orifícios em uma das veias femorais sob visão ultrassonográfica contínua e pela técnica de Seldinger11,12.
- Imediatamente após a colocação do cateter venoso central, conecte um sistema transdutor para medir a pressão venosa central.
- Certifique-se de que um eletrólito com infusão de glicose (20 mL/h) esteja conectado a um dos orifícios da linha central e que uma infusão de soro fisiológico de manutenção (5 mL/h) seja infundida através do orifício restante para evitar a oclusão do cateter.
- Utilizar a mesma técnica para canular a artéria femoral oposta com um cateter arterial 4 F projetado especificamente para monitorização do débito cardíaco. Realizar um exame de gasometria para estabelecer a posição correta do cateter se a confirmação ultrassonográfica não for possível.
NOTA: Em caso de espasmo ou hematoma significativo, cruzar para a artéria femoral contralateral. - Uma vez inserido o cateter arterial, conecte o fio arterial do sistema monitor de débito cardíaco e o transdutor arterial diretamente ao orifício do monitor. Conectar simultaneamente a unidade de medida venosa do monitor ao transdutor venoso central.
NOTA: O monitor de débito cardíaco utilizado neste experimento é especificado na Tabela de Materiais. Para configuração, calibração e medidas, consulte as instruções do fabricante13. - Certifique-se de que os transdutores venosos e arteriais estejam calibrados para zero.
- Expor a artéria carótida interna esquerda e a veia jugular externa esquerda pela técnica de corte.
- Certifique-se de que os equipamentos e ferramentas cirúrgicas necessários estejam disponíveis: bisturi, tesoura cirúrgica de ponta romba, pinça de tecido, afastador de tecido pequeno auto-retentor, porta-agulha, trocas cirúrgicas, sutura com agulha, uma cânula IV 18 G, uma bainha de cateter 5 F com introdutor e um fio-guia Seldinger.
- Com o animal em decúbito dorsal, desinfete a pele do pescoço com uma solução antisséptica.
- Use um bisturi para fazer uma incisão paratraqueal esquerda de ~10 cm, cortando uma linha entre o manúbrio e o ângulo da mandíbula.
- Para expor a veia jugular externa, dissecar o tecido lateralmente ao ECM e isolar a veia da fáscia circundante.
- Após o isolamento, utilizar duas suturas de seda inabsorvíveis (USP-0) em loop ao redor da veia para fixação do vaso antes da punção.
- Incisar a veia com uma agulha Venflon (18 G). Uma vez dentro da veia, retraia a agulha e insira o fio-guia através do tubo de Venflon.
- Retire o tubo Venflon e insira a bainha com o introdutor (5 F) sobre o fio. Após a inserção, retire o introdutor e o fio.
- Imediatamente após a inserção, enxaguar as bainhas com NaCl 0,9% (5 mL/h) para evitar a formação de trombo.
- Amarre a sutura proximal de seda ao redor da bainha para fixá-la. Depois disso, prenda a alça da bainha ao SCM e feche a pele com grampos.
- Após a preparação cirúrgica, permitir que os animais estabilizem por 30 minutos antes de obter os valores basais de monitoramento e amostras de sangue.
- Manter a temperatura do sangue em 37-39 °C usando uma manta térmica e um aquecedor aéreo durante todo o experimento.
NOTA: A temperatura é medida com um termistor localizado na ponta do cateter arterial de termodiluição.
3. Monitorização hemodinâmica e perfusional
- Monitorar o ECG, a saturação periférica de oxigênio, os volumes e pressões respiratórias e Fi02.
- Conectar um espirômetro entre o tubo endotraqueal e um monitor multiparamétrico para medir a EtC02 qualitativa e quantitativa.
Observação : para obter mais informações sobre o monitor multiparâmetro, consulte a tabela de materiais. - Use espectroscopia no infravermelho próximo (NIRS) para monitorar o índice de oxigenação do tecido cerebral (bTOI) e o índice de oxigenação do tecido esplâncnico (aTOI). Coloque os sensores na pele da testa e na parede abdominal anterior (região sub-hepática).
OBS: Não colocar o sensor cerebral na linha média, pois ele pode estar contaminado com o sangue venoso do seio sagital superior14. - Conecte a sonda de fluxo sanguíneo conectada à artéria carótida interna a um monitor de fluxo para medir o fluxo sanguíneo carotídeo (CaBF).
- Colocar um sensor laser Doppler sobre a pele da parede abdominal anterior para medida contínua do fluxo sanguíneo tecidual cutâneo (CuTBF).
NOTA: Para obter mais informações sobre os sensores de fluxo de sopro tecidual carotídeo e cutâneo, consulte a Tabela de Materiais. - Registrar os seguintes parâmetros no início do estudo e a cada 30 min: temperatura arterial, volume corrente inspiratório, EtCO2, ritmo cardíaco, frequência cardíaca (FC), pressões arteriais sistólica e diastólica, pressão arterial média (PAM), índice de choque (FC/pressão arterial sistólica)15, pressão venosa central, índice cardíaco (IC), índice de volume diastólico final global (GEDVI), índice de volume sistólico (IVS), contratilidade ventricular esquerda (Dt/Dpmax), índice de resistência vascular sistêmica (IRVS), índice de água extravascular pulmonar (ELWI), variação de pulso pressórico (VPP), saturação periférica de hemoglobina, índice de saturação venosa central (SvcO2), cerebral (bTOI) e esplâncnico (aTOI) por NIRS, CaBF e CuTBF.
- Para a obtenção dos valores de IC, infundir bolus de 5 mL de solução fisiológica a 0,9% a uma temperatura inferior a 8 °C através do cateter venoso central. Registre a média de duas medidas consecutivas.
- Determinar os perfis gasométricos arterial e venoso e a concentração de lactato a cada 30 min, retirando 0,3 mL de sangue dos vasos femorais. Realizar hemogramas completos padrão, estudos de coagulação e bioquímica no início do estudo, após a indução da hemorragia e no final do experimento.
- Após cada coleta de sangue, lavar as linhas com 0,5 mL de 100 UI/mL de heparina.
4. Indução de choque hemorrágico
- Uma vez que um estado estacionário é alcançado após a instrumentação e os dados basais foram coletados, induzir choque hipovolêmico retirando 30 mL/kg de sangue da veia jugular durante 30 minutos.
- Aguarde um período de 30 min para estabilização. Não faça esforços de ressuscitação durante este período para emular o atraso na chegada das equipes médicas de emergência.
5. Infusão e seguimento
- Após o período de estabilização, infundir um bolus de um expansor de volume ou um agente vasoativo durante um período de 30 min.
NOTA: Exemplos de expansores de volume e agentes vasoativos testados são soro fisiológico, albumina hipertônica, angiotensina e terlipressina. Neste estudo, foram utilizados 30 mL/kg de solução salina normal (NS) (n = 13), 15 mL/kg de albumina a 5% mais solução hipertônica a 3% (AHS) (n = 13) ou um único bolus intravenoso de 15 μg/kg de terlipressina mais 15 mL/kg de albumina a 5% mais solução hipertônica a 3% (TAHS) (n = 13). - Após a infusão, acompanhar o animal por 120 min. Registrar os parâmetros hemodinâmicos e obter amostras de sangue a cada 30 min para gasometria arterial e venosa e determinação da concentração de lactato. Não faça esforços de ressuscitação durante este período.
6. Fim da experiência e eutanásia
- Uma vez concluído o experimento, use uma overdose de sedativos (5 μg/kg de fentanil e 10 mg/kg de propofol) e uma injeção intravenosa de cloreto de potássio (2 mEq/kg) para sacrificar todos os animais ressuscitados com sucesso.
- Confirmar a ausência de circulação por assistolia ou atividade elétrica sem pulso em um eletrocardiograma contínuo, a ausência de fluxo pulsátil durante a monitorização invasiva da pressão arterial e a ausência de outros sinais vitais.
- Se, durante o período de acompanhamento, a pressão arterial diminuir abaixo de 25 mmHg, sacrificar o animal para evitar mais sofrimento.
Representative Results
O modelo apresentado tem sido utilizado com sucesso em diversos experimentos para estudar alterações macrocirculatórias e microcirculatórias após choque hemorrágico e posterior ressuscitação, comparando diferentes fluidos e drogas vasoativas16,17,18,19.
Considerando a resposta ao choque, esse modelo tem consistentemente demonstrado que uma hemorragia controlada produz alterações marcantes nos parâmetros hemodinâmicos, bem como na perfusão cerebral e tecidual.
Após a retirada do volume, são detectadas taquicardia significativa e diminuição da PAM, IC, SVI, parâmetros de volemia (GEDVI e ITBI) e fluxo sanguíneo arterial carotídeo, além de aumento do índice de resistência vascular sistêmica (Figura 1 e Figura 2).
Em relação aos parâmetros de perfusão sistêmica, o lactato aumenta significativamente, enquanto a SvcO2, CuTBF e bTO diminuem (Figura 3). Variações na pressão venosa central, Dt/Dpmáx e VLP geralmente não são registradas.
Quanto aos parâmetros laboratoriais, o conteúdo de hemoglobina e hematócrito não diminuem até a administração de líquidos. A concentração de albumina diminui e os níveis de troponina aumentam significativamente após hemorragia controlada. Outros parâmetros, incluindo temperatura central, PaO2, PaCO2, saturação arterial de oxigênio, EtCO2, eletrólitos e parâmetros de função renal e hepática, geralmente permanecem estáveis.
Além de sua utilidade na análise das respostas cardiovasculares e bioquímicas ao choque, esse modelo demonstrou discriminar com sucesso diferentes fluidos de ressuscitação.
Em estudos anteriores, objetivamos determinar se, em um modelo animal infantil de choque hemorrágico, o uso de uma infusão de menor volume de fluidos hipertônicos - isoladamente ou combinada com diferentes vasopressores - melhoraria os parâmetros hemodinâmicos e perfusionais globais quando comparado ao soro fisiológico.
Como relatado anteriormente, temos consistentemente observado que a infusão de fluidos hipertônicos produz uma resposta semelhante à infusão de duas vezes o volume de líquido isotônico16,17,18.
Mais especificamente, o uso de albumina associada à solução salina hipertônica produziu expansão volêmica maior e mais longa do que a solução salina normal ou solução salina hipertônica isolada, com diferenças significativas na FC, IVS e VPP, e ausência de queda progressiva após expansão volêmica da pressão arterial e do GEDVI, como observado nos demais grupos (Figura 1 e Figura 2). Além disso, também observamos uma maior melhora dos parâmetros de perfusão com albumina hipertônica, representada por um maior aumento da TOI e do CaBF, e uma maior diminuição dos níveis de lactato do que os outros grupos em comparação com o início da expansão hídrica (Figura 3). Acreditamos que essa diferença possa ser secundária à capacidade da albumina de aumentar o volume sanguíneo e permanecer por um período maior de tempo dentro do compartimento intravascular do que a solução salina normal. Curiosamente, vimos que a adição de um único bolus de terlipressina no início da ressuscitação volêmica produziu resultados semelhantes aos observados no grupo albumina hipertônica, sem benefícios extras em termos de parâmetros hemodinâmicos ou de perfusão17,18.
Figura 1: Parâmetros hemodinâmicos. (A) Evolução da frequência cardíaca, (B) pressão arterial média, (C) índice cardíaco basal (t0') e (D) índice de resistência vascular sistêmica basal (t0'). Ao longo do experimento: término do sangramento controlado (Shock30'); início da infusão, 30 min após o término do sangramento controlado (Res0'); fim da infusão (Res30'); seguimento 30 min após o término da infusão (Obs30'); seguimento 60 min após o término da infusão (Obs60'); seguimento 90 min após o término da infusão (Obs90'). (*) Houve diferença significativa (p < 0,05) em relação aos valores basais, mesmo grupo. (‡) p < 0,05 de hemorragia, mesmo grupo. (#) p < 0,05 do grupo NS. Abreviações: NS = soro fisiológico; AHS = albumina salina hipertônica; TAHS = terlipressina mais albumina salina hipertônica. Os dados são apresentados como média e desvio padrão. Esse número é adaptado com permissão de Urbano et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Parâmetros da volemia. (A) Evolução do índice de volume sistólico, (B) variação da pressão de pulso e (C) índice de volume diastólico final global basal (t0'). Ao longo do experimento: término do sangramento controlado (Shock30'); início da infusão, 30 min após o término do sangramento controlado (Res0'); fim da infusão (Res30'); seguimento 30 min após o término da infusão (Obs30'); seguimento 60 min após o término da infusão (Obs60'); seguimento 90 min após o término da infusão (Obs90'). (*) Diferença significativa (p < 0,05) em relação ao grupo basal, mesmo grupo. (‡) p < 0,05 de hemorragia, mesmo grupo. (#) p < 0,05 do grupo NS. Abreviações: NS = soro fisiológico; AHS = albumina salina hipertônica; TAHS = terlipressina mais albumina salina hipertônica. Os dados são apresentados como média e desvio padrão. Esse número é adaptado com permissão de Urbano et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Parâmetros de perfusão sistêmica. (A) Evolução do lactato sanguíneo arterial, (B) saturação venosa central de oxigênio e (C) índice de oxigenação do tecido cerebral basal (t0'). Ao longo do experimento: término do sangramento controlado (Shock30'); início da infusão, 30 min após o término do sangramento controlado (Res0'); fim da infusão (Res30'); seguimento 30 min após o término da infusão (Obs30'); seguimento 60 min após o término da infusão (Obs60'); seguimento 90 min após o término da infusão (Obs90'). (*) Diferença significativa (p < 0,05) em relação ao grupo basal, mesmo grupo. (‡) p < 0,05 de hemorragia, mesmo grupo. (#) p < 0,05 do grupo NS. Os dados são apresentados como média e desvio padrão. Esse número é adaptado com permissão de Urbano et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
A realização de procedimentos em suínos jovens pode ser complexa e potencialmente fatal devido a certas características anatômicas e fisiológicas desses animais. Para alcançar resultados consistentes e reduzir a perda de animais, existem algumas etapas críticas que devem ser cuidadosamente consideradas. Em primeiro lugar, atingir um nível adequado de sedação é essencial para minimizar a resposta do animal ao estresse, que, se excessiva, pode alterar os resultados devido à liberação de catecolaminas endógenas. Também é importante evitar atrasos entre a injeção intramuscular e a intubação, pois os animais podem desenvolver uma resposta severa ao estresse com taquicardia e acidose metabólica irreversível que pode precipitar o final do experimento. Embora outros grupos utilizem anestésicos inalatórios com bons resultados20,21, preferimos medicações venosas, pois os sedativos inalatórios não permitem a mensuração das trocas gasosas respiratórias com calorimetria indireta. Em nossa experiência, a combinação de propofol e fentanil é eficaz e apresenta poucos efeitos adversos. O gerenciamento cuidadoso da temperatura durante todo o experimento é outro aspecto fundamental do protocolo, pois mudanças rápidas de temperatura podem afetar significativamente a resposta hemodinâmica do animal ao choque, falsificando os resultados ou, finalmente, levando ao fracasso do experimento.
Outra parte crucial da instrumentação é a intubação, dadas as particularidades da anatomia suína e sua suscetibilidade ao laringoespasmo. Portanto, o procedimento deve ser realizado por pelo menos um operador com experiência prévia, sendo aconselhável o uso de estilete e relaxamento muscular10,22. O cateterismo dos vasos também pode ser um desafio devido ao pequeno tamanho dos animais. Para o acesso femoral, a punção guiada por ultrassonografia é preferível, pois os vasos são profundos, geralmente têm pequenos diâmetros e apresentam diferentes trajetos eposições22. Para o acesso cervical, utilizamos o acesso cirúrgico para permitir a colocação da sonda de fluxo carotídeo, mas a técnica ultrassonográfica também é viável23,24. A canulação da veia jugular externa é geralmente preferida devido ao seu maior diâmetro, sua localização superficial e menor número de estruturascircunvizinhas22. Os cateteres devem ser lavados imediatamente após a inserção com soluções salinas para evitar a oclusão. Não utilizamos heparina para evitar alterações da coagulação. Inicialmente, também evitamos a administração de infusões de glicose para evitar possíveis distorções da resposta hemodinâmica pela administração de fluidos extras, mas observamos que os animais desenvolveram hipoglicemia grave e precoce. Finalmente, mesmo com a anestesia e as técnicas menos invasivas utilizadas atualmente, a instrumentação gera uma resposta significativa ao estresse nos animais, por isso é desejável deixar tempo suficiente para a recuperação antes de iniciar a remoção do sangue. Em relação à indução do choque hemorrágico, recomendamos a retirada de 30 mL/kg, pois gera uma resposta fisiopatológica significativa com excelentes taxas de sobrevida. Em nossa experiência, os lactentes suínos não toleram maiores quantidades de perda sanguínea, e a mortalidade é alta. A retirada gradual do sangue também é importante, pois a remoção rápida pode resultar em instabilidade hemodinâmica grave e morte precoce do animal.
Embora haja uma grande variedade de espécies e modelos experimentais disponíveis para os pesquisadores, o modelo ideal de choque hemorrágico animal - simples, facilmente reprodutível e replicação precisa da situação clínica - ainda representa um desafio. Modelos de pequenos animais, principalmente camundongos e ratos, são usados para investigar os mecanismos fisiopatológicos do choque. No entanto, seu pequeno tamanho dificulta significativamente a realização de procedimentos cirúrgicos e de amostragem. Animais maiores, como cães e porcos, são mais caros e complexos de manusear, mas seu tamanho e semelhanças fisiológicas com humanos os tornam mais adequados para avaliação pré-clínica das estratégias de tratamento. No entanto, o uso de cães no passado e ainda hoje é eticamente questionável. Eles não oferecem nenhuma vantagem sobre os porcos como modelos animais experimentais, e sua inteligência e a especial relação bilateral entre humanos e cães os situam em uma posição mais elevada na escala filogenética 6,7,8.
Em vista de tudo isso, suínos adultos têm sido amplamente utilizados para pesquisa cardiovascular devido às suas semelhanças com a fisiologia, tamanho e anatomia humana adulta, que é melhor do que a maioria das espécies. Entretanto, como bem estabelecido na literatura, existem diferenças significativas entre pacientes humanos adultos e pediátricos em termos de sistema cardiovascular, volemia, regulação da temperatura e resposta aochoque2,3,4. Ao mesmo tempo, evidências mostram que essas diferenças também se aplicam a suínos, e leitões têm encontrado perfis cardiovasculares, cerebrovasculares, hematológicos e eletrolíticos muito semelhantes aos de pacientes pediátricos humanos 9,25. Finalmente, além dessas diferenças anatômicas e fisiológicas entre adultos e lactentes em ambas as espécies, o uso de modelos animais infantis, especialmente miniporcos, oferece a oportunidade de testar os mesmos dispositivos que são usados no cenário clínico real para monitoramento. Em muitos casos, a confiabilidade desses dispositivos provou ser baixa devido a uma simples adaptação dos algoritmos, sensores ou escalas de adultos. Todos esses aspectos reforçam a importância do desenvolvimento de modelos específicos de animais pediátricos e sua relevância em termos de utilidade translacional para o cenário clínico pediátrico.
Além do tipo de animal, existem três modelos básicos geralmente utilizados no estudo do choque hemorrágico: hemorragia controlada - seja por volume ou pressão - e hemorragia não controlada. O protocolo apresentado neste artigo descreve um modelo de hemorragia de volume fixo, no qual um volume sanguíneo fixo, geralmente calculado pela porcentagem do peso corporal, é removido em um período de tempo definido pelo observador. Ao contrário, em modelos de hemorragia por pressão fixa, os animais são sangrados para uma PAM pré-determinada, que é então mantida com sangramento periódico ou infusões de fluidos durante um período especificado, dependendo da espécie animal e do grau ou resultado do choque. Tanto o modelo de choque hemorrágico de volume fixo quanto o de pressão fixa permitem o estudo das alterações fisiopatológicas induzidas por choque em condições controladas, oferecendo uma clara vantagem em termos de reprodutibilidade e padronização. Entretanto, sua principal limitação é que não permitem o estudo dos efeitos de diferentes estratégias de ressuscitação sobre o sangramento ativo, onde a ressuscitação volêmica agressiva antes do controle cirúrgico da hemorragia é conhecida por aumentar o sangramento e diminuir a sobrevida, devido à inibição da formação do trombo e à elevação da pressão arterial média. Modelos de hemorragia não controlada induzida por um trauma vascular padronizado - esmagamento/laceração do fígado e baço, lesão arterial ou amputação de um apêndice - têm sido sugeridos para refletir melhor a situação clínica, permitindo assim uma melhor compreensão dos efeitos de diferentes estratégias de ressuscitação volêmica e outras intervenções, como hipotermia e produtos hemostáticos. No entanto, apesar de clinicamente mais relevantes, esses modelos de hemorragia não controlada exercem algumas desvantagens claras em termos de padronização e reprodutibilidade. Diante de tudo isso, parece não existir o modelo ideal e, portanto, as pesquisas nessa área devem equilibrar relevância clínica com padronização e confiabilidade experimental6,7,8,9,26.
O modelo descrito neste estudo pode oferecer amplas aplicações potenciais na pesquisa cardiovascular, como a investigação de disfunção endotelial e alterações damicrocirculação18 durante o choque, bem como a validação de diferentes sistemas de monitorização hemodinâmica. Além disso, também pode ser utilizado em outros campos de pesquisa, permitindo o estudo de respostas endócrinas ou imunes após hemorragia grave, bem como a determinação de efeitos colaterais de diferentes fluidos e vasopressores. No entanto, em relação à pesquisa de diferentes estratégias de ressuscitação, é aconselhável estudar seus efeitos em modelos de hemorragia não controlada antes de implementar mudanças no cenário clínico 7,26.
Além da dificuldade de extrapolar os resultados para a vida real, esse modelo apresenta outras limitações. Inicialmente, existem algumas variáveis de confusão relacionadas ao arranjo experimental, como o uso de agentes anestésicos ou ventilação mecânica, que podem atenuar as respostas fisiológicas durante o choque e dificultar a interpretação dos resultados. Além disso, a resposta ao estresse da instrumentação nos animais e o controle da temperatura podem afetar a macro e a microcirculação por diferentes mecanismos. Outra limitação importante desse modelo, relacionada às necessidades experimentais e à disponibilidade de recursos, é o limitado período de observação pós-traumática, o que limita ainda mais o estudo das consequências a longo prazo do choque hemorrágico. Além disso, apesar das semelhanças fisiológicas entre humanos e suínos, existem algumas diferenças entre as espécies que devem ser consideradas. O sistema de coagulação, por exemplo, parece ser mais efetivo em suínos27,28. Além disso, os níveis plasmáticos de lactato e succinato diferem entre as espécies, e os suínos apresentam alcalose basal, o que pode levar a uma subestimação dos efeitos da hemorragia sobre o equilíbrio ácido-básico29. Finalmente, sabe-se também que as respostas inflamatória e imune, bem como alguns receptores vasopressores, são diferentes emsuínos9. Diferenças específicas entre animais também precisam ser consideradas como fatores de influência. Vários estudos têm indicado diferenças de gênero em termos de suscetibilidade ao choque, com as mulheres tendo uma vantagem significativa de sobrevida sobre os homens 6,9. No entanto, nos experimentos realizados neste estudo, utilizamos animais da mesma faixa etária e com histórico genético semelhante para minimizar a potencial variabilidade inerente às espécies.
Em conclusão, este artigo fornece um guia prático e passo a passo para a criação de um modelo suíno de choque hemorrágico pediátrico. Comparado a outros modelos existentes, este é um protocolo confiável, de fácil seguimento, com ampla aplicabilidade em pesquisas biomédicas, seja para a investigação de respostas fisiopatológicas após hemorragia grave ou para a avaliação de diferentes estratégias de ressuscitação.
Disclosures
Os autores deste trabalho não têm qualquer conflito de interesses.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pelo Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) através do projeto "PI20/01706" e co-fundado pela União Europeia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito. Gostaríamos de agradecer a todos os nossos colegas da Unidade de Terapia Intensiva Pediátrica Gregorio Marañón e do Instituto Experimental Gregorio Marañón, pois sem o trabalho deles este projeto não teria sido possível.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADA swabs | Albino Dias de Andrade, S.A. | 300575750400 | Non-woven swabs |
| Alaris SE | Carefusion | N/A | Volumetric infusion pump |
| Atracurium | Aspen Pharma Trading Limited. Dublin, Ireland | N/A | Muscle relaxant |
| Atropine 1 mg/mL | B. Braun | 481377/1013 | |
| Barrier adhesive aperture drape | Mölnlycke | 63621 | |
| BD emerald syringe 5 mL, 10 mL, 20 mL | Becton Dickinson S.A | https://www.bd.com/en-eu/offerings/capabilities/syringes-and-needles/injection-syringes/bd-emerald-3-piece-syringe | various options available |
| BLF21A laser doppler monitor | Transonic Systems Inc. | BLF21A | Skin blood flow monitor |
| BlueSensor NF ECG electrodes | Ambu | NF-50-A/12 | |
| Check-Flo performer introducer set 5Fr | Cook Medical | G12018 | Vascular Sheath |
| Datex ohmeda S5 | GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland | M1162897 | Hemodynamic monitor |
| Fentanyl 0.05 mg/mL | Kern Pharma | N/A | Anesthesia |
| GE Vivid S5 | GE Healthcare | S series | Ultrasound machine |
| Introcan Safety 18 G, 22 G, 24 G | B. Braun | Introcan series | Safety intravenous catheter |
| INVOS cerebral/somatic oximetry adult sensors | Medtronic PLC, USA | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry/invos-cerebral-somatic-oximetry-adult-sensors.html | |
| INVOS OXIMETER cerebral/somatic | Somanetics | 08-10566 | Regional oxygenation monitor |
| Ketamin 50 mg/mL | Pfizer, S.L. | 47034 | Sedation |
| Leon plus | Heinen + Löwenstein | N/A | Ventilator |
| Life scope VS | Nihon Kohden | N/A | Bedside monitor |
| Miller laryngoscope blade 12″ | Jorgensen Labs, USA | J0449F | Laryngoscope |
| Multi-lumen central venous catheterization set 7 French, 3 lumen, 30 cm | Arrow | CS-14703 | Central venous catheter |
| Nellcor WarmTouch 5300A | Covidien | Thermal blancket | |
| Nitrile gloves | Medihands | KS-ST RT021 | Single use gloves |
| Pediatric SomaSensor INVOS cerebral/somatic | Covidien | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry.html | Disposable regional oxygen saturation sensor |
| PICCO monitoring kit | Pulsion Medical Systems | PV8215 | |
| PICCO thermodilution catheter 5F/20 cm | Pulsion Medical Systems | N/A | |
| Propofol Lipoven 10 mg/mL | Fresenius Kabi, Spain | N/A | Anesthesia |
| Pulse contour cardiac output (PiCCO2) | Pulsion Medical Systems | N/A | Hemodynamic monitor |
| Rüsch flexislip | Teleflex Medical | 503700 | Endotracheal tube stylet |
| Softa swabs | B. Braun | 19579 | Alcohol pads |
| Surgical silk sutures USP 0 | Aragó, Barcelona, Spain. | 6245 | |
| TruWave pressure monitoring set | Edwards | T001767A | Pressure monitoring set |
| Ultrasound transmission gel | Ultragel Hungary 2000 Kft. | UC260 |
References
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