Summary
Эта статья направлена на то, чтобы предоставить исследователям подробное и доступное руководство по созданию модели геморрагического шока у новорожденных свиней.
Abstract
Геморрагический шок является ведущей причиной заболеваемости и смертности у пациентов детского возраста. Интерпретация клинических показателей, валидированных у взрослых, для руководства реанимационными мероприятиями и сравнения различных методов лечения у детей затруднена из-за присущей этой популяции гетерогенности. В результате, по сравнению со взрослыми, надлежащее лечение геморрагического шока у детей до сих пор не налажено. Кроме того, нехватка педиатрических пациентов с геморрагическим шоком исключает проведение клинически значимых исследований. По этой причине для изучения последствий кровотечения у детей, а также их реакции на различные методы лечения необходима экспериментальная модель на педиатрических животных. Представлена модель геморрагического шока с контролем объема у молодых свиней, находящихся под наркозом. Кровотечение вызывается забором ранее рассчитанного объема крови, после чего свинья находится под наблюдением и реанимируется с помощью различных методов лечения. В данной работе мы описываем точную и высоковоспроизводимую модель геморрагического шока у незрелых свиней. Модель дает гемодинамические данные, характеризующие компенсаторные механизмы, которые активируются в ответ на тяжелое кровотечение.
Introduction
Опасное для жизни кровоизлияние вследствие травмы, хотя и встречается редко, является основной причиной смерти у пациентов детского возраста 1,2. Дополнительные причины геморрагического шока включают геморрагическую лихорадку, желудочно-кишечное кровотечение, операции на печени и операции, особеннопри использовании искусственного кровообращения.
В отличие от взрослого населения, недостаточно данных по ведению геморрагического шока у детей, которые в значительной степени основаны на экспертных мнениях или непосредственно переведены из взрослой практики 2,4. Тем не менее, перевод стратегий управления от взрослых может быть нецелесообразным. Например, клинические показатели, валидированные у взрослых, трудно экстраполировать на пациентов детского возраста из-за физиологической гетерогенности, присутствующей в группах разного возраста, и различных моделей травм, преобладающих в педиатрической популяции. Следовательно, конкретные конечные точки, которые могли бы спровоцировать вмешательство у педиатрического пациента, четко не определены. Кроме того, нет достаточных доказательств того, что терапия, применяемая в настоящее время у взрослых, может оказывать на детей 2,4,5.
В связи со всем этим необходимы дальнейшие исследования для установления специфических порогов реанимации для оперативного вмешательства, а также для лучшего определения наиболее подходящих методов лечения геморрагического шока у детей. Тем не менее, разработка качественных и клинически значимых исследований угрожающих жизни кровоизлияний у детей затруднена из-за нехватки пациентов и уже упомянутой гетерогенности в педиатрической популяции от неонатального периода до подросткового возраста.
Клиническая значимость геморрагического шока, в дополнение к трудностям в проведении клинических исследований на педиатрических пациентах, подчеркивает необходимость доклинических оценок на животных моделях для изучения патофизиологии после геморрагического шока у детей, а также для сравнения различных методов лечения. Несколько животных моделей широко использовались в исследованиях для изучения геморрагического шока 6,7,8,9. Благодаря своему анатомическому и физиологическому сходству с человеком, свиньи высоко ценятся в биомедицинских исследованиях. Что касается преимуществ использования конкретных моделей младенцев, то имеющиеся данные показывают, что гемодинамика неполовозрелых свиней, а также дыхательная, гематологическая и метаболическая системы весьма сопоставимы с таковыми у молодых людей9. Это дает уникальную возможность смоделировать клинический сценарий геморрагического шока у детей.
В этой модели кровоизлияние вызывается изъятием ранее рассчитанного объема крови. Затем свинья находится под наблюдением и вводится различные реанимационные жидкости.
В данной работе мы описываем точную и высоковоспроизводимую модель геморрагического шока у незрелых свиней. Модель дает гемодинамические данные, характеризующие компенсаторные механизмы, активируемые в ответ на тяжелое кровотечение.
Protocol
Эксперименты, предусмотренные этим протоколом, были одобрены Комитетом по институциональной этике исследований на животных Университетской больницы им. Грегорио Мараньона, Мадрид, Испания, и Советом по сельскому хозяйству и окружающей среде автономного правительства Мадрида (номер разрешения: 12/0013). На протяжении всего исследования применялись европейские и испанские рекомендации по этичному уходу и использованию экспериментальных животных. Эксперименты проводились в отделении экспериментальной медицины и хирургии Университетской больницы Грегорио Мараньона, Мадрид, Испания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранная модель состояла из здоровых 2-3-месячных (8-12 кг) минипигов (Sus scrofa domestica). Минипиги являются результатом скрещивания трех разных пород, что делает их пригодными для биомедицинских исследований. Животные являются почти идентичными линиями и поставляются специально уполномоченным питомником в Мадриде (IMIDRA), который поддерживает поддержание трех гомозиготных генетических линий в чистоте. Мужские и женские животные использовались как взаимозаменяемые. Животных кормили стандартной свиной диетой и наблюдали за ними в течение как минимум 2 дней, чтобы обеспечить хорошее здоровье. Пища, но не вода, была отменена в ночь перед процедурами, чтобы снизить риск аспирации. Типичный эксперимент занимает около 6 часов, в том числе 30 минут на индукцию анестезии и хирургическую подготовку, 60 минут на инструментирование, 30 минут на восстановление, 60 минут на индукцию кровотечения и заднюю стабилизацию, 30 минут на реанимацию и 120 минут на последующее наблюдение.
1. Анестезия, интубация и искусственная вентиляция легких
- Премедикируйте свинью внутримышечными инъекциями кетамина (10 мг/кг) и атропина (0,02 мг/кг) в латеральную область шеи, за ухом или в заднюю бедренную область.
ПРИМЕЧАНИЕ: Антихолинергические препараты, такие как атропин, полезны, так как свиньи могут чрезмерно выделять слюну под наркозом10. По нашему опыту, этой дозы кетамина достаточно для снижения стресса и вызывает адекватную седацию и анальгезию у свиней без побочных эффектов. Однако, если животное не получает надлежащих седативных препаратов или если расстояние от корпуса до операционной большое, можно безопасно ввести еще одну дозу кетамина (10 мг/кг).
ВНИМАНИЕ: При обращении с животными необходимы перчатки. - Транспортируйте животное, находящееся под седативными препаратами, в операционную и положите его на операционный стол с согревающим одеялом.
- Измерьте периферическое насыщение кислородом (Sp02) с помощью датчика, прикрепленного к уху свиньи, и начните непрерывный электрокардиографический мониторинг (ЭКГ) в трех отведениях.
- Продезинфицируйте кожу не менее чем 3 чередующимися циклами повидон-йодного или хлоргексидинового скраба и спиртом. Введите катетер периферических вен (22-24 G) в ушную вену. Предварительно продезинфицируйте кожу антисептическим раствором.
- Анестезия вызывается внутривенной инъекцией фентанила (5 мкг/кг), пропофола (4 мг/кг) и атракурия (0,5 мг/кг). Как только спонтанное дыхание исчезнет и подтвердится отсутствие рефлексов, поместите животное в спинное лежачее положение и немедленно начните вентиляцию легких с помощью маски для собаки с долей вдыхаемого кислорода (Fi02), установленной на 100%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы снизить риск случайного осознания, связанного с использованием нервно-мышечных блокаторов, следует использовать анестетики с известной эффективностью у свиней и с дозами, превышающими верхний предел, чтобы обеспечить адекватный уровень анестезии. Кроме того, постоянно контролируйте сердечно-сосудистые признаки, такие как частота сердечных сокращений, артериальное давление и температура тела, и назначайте нервно-мышечные блокаторы только тогда, когда отсутствуют рефлексы отмены (отказ от педали, пальпебральные рефлексы и тонус челюсти) и мышечный тонус расслаблен. - Провести эндотрахеальную интубацию. Для этой процедуры необходимо как минимум два оператора.
- Убедитесь, что основное оборудование и хирургические инструменты, необходимые для эндотрахеальной интубации, готовы: завязать марлю, чтобы открыть рот и зафиксировать трубку, ветеринарный ларингоскоп с прямым лезвием длиной от 17 до 25 см, общую эндотрахеальную трубку (ID 4-5), стилет, шприц с воздухом и клейкую ленту.
- Слегка вытяните язык и держите челюсть открытой, используя марлевую повязку, расположенную за верхними и нижними клыками.
- Выполните ларингоскопию и, как только надгортанник станет виден, кончиком ларингоскопа надавите на надгортанник вверх к основанию языка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если надгортанник прилип к мягкому нёбу, он может быть смещен дорсально кончиком трубки. Оператор 1 выполняет шаг 1.6.2, а оператор 2 — шаг 1.6.3. - Как только голосовые связки будут визуализированы, осторожно продвигайте трубку с небольшим вращением в трахею.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самое узкое место трахеи находится на подсвязочном уровне. Если введение трубки затруднено, попробуйте небольшое вращение или трубку меньшего размера. - Извлеките стилет и с помощью шприца объемом 5 мл надуйте манжету.
- Обеспечьте установку эндотрахеальной трубки, наблюдая за симметричным подъемом грудной клетки, адекватным насыщением кислородом (95%-100%) и правильной формой волны и показаниями CO2 (EtCO2) в конце выдоха.
ВНИМАНИЕ: Свиньи очень восприимчивы к ларингоспазму и отеку слизистой оболочки гортани, и перфорация гортани может даже возникнуть после нескольких попыток интубации или при недостаточной седации10.
- После подтверждения интубации начать искусственную вентиляцию легких с использованием аппарата искусственной вентиляции легких с частотой дыхания 20 вдохов в минуту, дыхательным объемом 8 мл/кг, FiO2 40% и положительным давлением в конце выдоха 4 см H2O. Отрегулируйте вентиляцию для достижения парциального давления углекислого газа (PaCO2) в диапазоне от 35 до 45 мм рт.
- Поддерживайте глубокую анестезию на протяжении всего эксперимента путем непрерывной инфузии фентанила (10 мкг/кг/ч), пропофола (10 мг/кг/ч) и атракурия (2 мг/кг/ч).
2. Контрольно-измерительные приборы
- Подготовьте бедренную область к катетеризации сосудов. Используйте бинты, чтобы отвести ноги назад, и продезинфицируйте паховую область не менее 3 чередующимися циклами скраба с повидон-йодом или хлоргексидином и спиртом.
- Оцените бедренные сосуды с помощью УЗИ и используйте технику допплерографии, чтобы отличить артерию от вены. В зависимости от размера вены вводят 5,5-7,5 френч (F) центральный венозный катетер с тремя портами в одну из бедренных вен при непрерывном ультразвуковом исследовании и по методике Зельдингера11,12.
- Сразу после установки центрального венозного катетера подключите систему датчиков для измерения центрального венозного давления.
- Убедитесь, что электролит с инфузией глюкозы (20 мл/ч) подключен к одному из портов центрального катетера, а поддерживающая инфузия физиологического раствора (5 мл/ч) вводится через оставшийся порт, чтобы предотвратить окклюзию катетера.
- Используйте ту же технику для канюляции противоположной бедренной артерии с помощью артериального катетера 4 F, специально разработанного для мониторинга сердечного выброса. Проведите анализ газов крови, чтобы установить правильное положение катетера, если ультразвуковое подтверждение невозможно.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае значительного спазма или гематомы перейдите на контралатеральную бедренную артерию. - После введения артериального катетера подключите артериальный провод системы мониторинга сердечного выброса и артериальный датчик непосредственно к порту монитора. Одновременно подключите венозный измерительный блок монитора к центральному венозному датчику.
ПРИМЕЧАНИЕ: Монитор сердечного выброса, используемый в этом эксперименте, указан в таблице материалов. Сведения о настройке, калибровке и измерениях см. в инструкциях производителя13. - Убедитесь, что венозный и артериальный датчики откалиброваны до нуля.
- Обнажение левой внутренней сонной артерии и левой наружной яремной вены с помощью техники разреза.
- Обеспечьте наличие необходимого оборудования и хирургических инструментов: скальпель, хирургические ножницы с тупым наконечником, тканевые щипцы, небольшой самоудерживающийся тканевый ретрактор, иглодержатель, хирургические замены, шов с иглой, одна внутривенная канюля 18 G, одна катетерная оболочка 5 F с интродьюсером и одна направляющая проволока Seldinger.
- Когда животное находится в спинном лежачем положении, продезинфицируйте кожу шеи антисептическим раствором.
- С помощью скальпеля сделайте левый паратрахеальный разрез ~10 см, разделив пополам линию между манубриумом и углом челюсти.
- Чтобы обнажить наружную яремную вену, рассекают ткань латерально от СКМ и изолируют вену от окружающей фасции.
- После изоляции используйте два нерассасывающихся шелковых шва (USP-0), обернутых вокруг вены, чтобы зафиксировать сосуд до пункции.
- Разрежьте вену иглой Venflon (18 G). Оказавшись внутри вены, втяните иглу и введите направляющую проволоку через трубку Venflon.
- Снимите трубку Venflon и вставьте оболочку с интродьюсером (5 F) поверх проволоки. После установки снимите проводник и провод.
- Сразу после введения промыть оболочки 0,9% NaCl (5 мл/ч), чтобы предотвратить образование тромбов.
- Завяжите проксимальный шелковый шов вокруг влагалища, чтобы зафиксировать его. После этого закрепите ручку ножен на СКМ и закройте обшивку скобами.
- После хирургической подготовки дайте животным стабилизироваться в течение 30 минут, прежде чем получить исходные значения мониторинга и образцы крови.
- Поддерживайте температуру крови на уровне 37-39 °C, используя термоодеяло и верхнюю грелку на протяжении всего эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура измеряется термистором, расположенным на кончике артериального катетера терморазведения.
3. Гемодинамический и перфузионный мониторинг
- Контролируйте ЭКГ, периферическую насыщенность кислородом, дыхательные объемы и давление, а также Fi02.
- Подключите спирометр между эндотрахеальной трубкой и многопараметрическим монитором для измерения качественного и количественного EtC02.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации о многопараметрическом мониторе см. Таблицу материалов. - Используйте ближнюю инфракрасную спектроскопию (NIRS) для мониторинга индекса оксигенации тканей головного мозга (bTOI) и индекса оксигенации спланхнических тканей (aTOI). Поместите датчики на кожу лба и переднюю брюшную стенку (подпеченочная область).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не размещайте датчик головного мозга по средней линии, так как он может быть загрязнен венозной кровью верхнего сагиттального синуса14. - Подключите датчик кровотока, прикрепленный к внутренней сонной артерии, к монитору потока для измерения сонного кровотока (CaBF).
- Поместите лазерный допплеровский датчик на кожу передней брюшной стенки для непрерывного измерения кожного тканевого кровотока (CuTBF).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации о датчиках потока удара по сонной и кожной тканевой артериям см. Таблицу материалов. - Регистрируйте следующие параметры на исходном уровне и каждые 30 минут: температуру крови, дыхательный объем вдоха, EtCO2, сердечный ритм, частоту сердечных сокращений (ЧСС), систолическое и диастолическое артериальное давление, среднее артериальное давление (MAP), индекс шока (ЧСС/систолическое артериальное давление)15, центральное венозное давление, сердечный индекс (CI), общий индекс конечного диастолического объема (GEDVI), индекс ударного объема (SVI), сократимость левого желудочка (Dt/Dpmax), индекс системного сосудистого сопротивления (SVRI), внесосудистый индекс воды в легких (ELWI), вариация пульса давления (PPV), насыщение периферического гемоглобина, центральное венозное насыщение (ScvO2), церебральный (bTOI) и спланхнический (aTOI) тканевой оксигенации по NIRS, CaBF и CuTBF.
- Для получения значений ДИ необходимо ввести 5 мл болюса 0,9% физиологического раствора при температуре ниже 8 °C через центральный венозный катетер. Запишите среднее арифметическое двух последовательных измерений.
- Каждые 30 мин определяют газовый профиль артериальной и венозной крови и концентрацию лактата, беря 0,3 мл крови из бедренных сосудов. Выполняйте стандартные общие анализы крови, исследования коагуляции и биохимию на исходном уровне, после индукции кровотечения и в конце эксперимента.
- После каждого забора крови промывайте катера 0,5 мл 100 МЕ/мл гепарина.
4. Индукция геморрагического шока
- После достижения стабильного состояния после сбора инструментальных и исходных данных вызывают гиповолемический шок путем забора 30 мл/кг крови из яремной вены в течение 30 мин.
- Подождите 30 минут для стабилизации. Не предпринимайте реанимационных мероприятий в этот период, чтобы имитировать задержку прибытия бригад скорой медицинской помощи.
5. Инфузия и последующее наблюдение
- После периода стабилизации в течение 30 минут вводите болюсный расширитель объема или вазоактивное средство.
ПРИМЕЧАНИЕ: Примерами тестируемых расширителей объема и вазоактивных агентов являются физиологический раствор, гипертонический альбумин, ангиотензин и терлипрессин. В данном исследовании использовали 30 мл/кг физиологического раствора (NS) (n = 13), 15 мл/кг 5% альбумина плюс 3% гипертонический физиологический раствор (AHS) (n = 13) или однократное внутривенное болюсное введение 15 мкг/кг терлипрессина плюс 15 мл/кг 5% альбумина плюс 3% гипертонического физиологического раствора (TAHS) (n = 13). - После инфузии наблюдайте за животным в течение 120 минут. Регистрируйте гемодинамические параметры и каждые 30 минут берите образцы крови для определения газового профиля артериальной и венозной крови и концентрации лактата. Не предпринимать реанимационных усилий в этот период.
6. Окончание эксперимента и эвтаназия
- После завершения эксперимента используют седативную передозировку (5 мкг/кг фентанила и 10 мг/кг пропофола) и внутривенную инъекцию хлорида калия (2 мг-экв/кг), чтобы принести в жертву всех успешно реанимированных животных.
- Подтвердите отсутствие кровообращения асистолией или безимпульсной электрической активностью на непрерывном дисплее ЭКГ, отсутствие пульсирующего потока при инвазивном мониторинге артериального давления и отсутствие других жизненно важных показателей.
- Если в течение периода наблюдения артериальное давление снижается ниже 25 мм рт.ст., пожертвуйте животное, чтобы избежать дальнейших страданий.
Representative Results
Представленная модель была успешно использована в нескольких экспериментах для изучения макроциркуляторных и микроциркуляторных изменений после геморрагического шока и последующей реанимации путем сравнения различных жидкостей и вазоактивных препаратов16,17,18,19.
Рассматривая реакцию на шок, эта модель последовательно показывала, что контролируемое кровоизлияние вызывает выраженные изменения в гемодинамических параметрах, а также в церебральной и тканевой перфузии.
После отмены объема выявляются выраженная тахикардия и снижение MAP, CI, SVI, показателей объема крови (GEDVI и ITBI), артериального кровотока сонной артерии, а также повышение индекса системного сосудистого сопротивления (рис. 1 и рис. 2).
Что касается системных параметров перфузии, лактат значительно увеличивается, в то время как ScvO2, CuTBF и bTO снижаются (рис. 3). Колебания центрального венозного давления, Dt/Dpmax и ELW обычно не регистрируются.
Что касается лабораторных показателей, то содержание гемоглобина и гематокрит не снижаются до тех пор, пока не будут введены жидкости. Концентрация альбумина снижается, а уровень тропонина значительно повышается после контролируемого кровоизлияния. Другие параметры, включая внутреннюю температуру, PaO2, PaCO2, насыщение артериальной крови кислородом, EtCO2, электролиты, а также параметры функции почек и печени, обычно остаются стабильными.
Помимо своей полезности для анализа сердечно-сосудистых и биохимических реакций на шок, было показано, что эта модель успешно различает различные реанимационные жидкости.
В предыдущих исследованиях мы стремились определить, улучшит ли в модели геморрагического шока на младенческих животных использование инфузии гипертонических жидкостей в меньшем объеме — отдельно или в сочетании с различными вазопрессорами — улучшение глобальных параметров гемодинамики и перфузии по сравнению с обычным физиологическим раствором.
Как сообщалось ранее, мы постоянно наблюдали, что инфузия гипертонических жидкостей вызывает аналогичную реакцию на инфузию в два раза большего объема изотонической жидкости16,17,18.
В частности, использование альбумина в сочетании с гипертоническим физиологическим раствором приводило к большему и более длительному увеличению объема, чем обычный физиологический раствор или только гипертонический физиологический раствор, со значительными различиями в ЧСС, SVI и PPV, а также к отсутствию прогрессирующего падения после увеличения объема артериального давления и GEDVI, как это наблюдалось в других группах (Рисунок 1 и Рисунок 2). Кроме того, мы также наблюдали большее улучшение параметров перфузии при приеме гипертонического альбумина, что выражалось в большем увеличении bTOI и CaBF, а также в большем снижении уровня лактата по сравнению с началом расширения жидкости (рис. 3). Мы полагаем, что эта разница может быть вторичной по отношению к способности альбумина увеличивать объем крови и оставаться в течение более длительного периода времени во внутрисосудистом компартменте, чем обычный физиологический раствор. Интересно, что мы видели, что добавление однократного болюса терлипрессина в начале инфузионной реанимации давало результаты, аналогичные тем, которые наблюдались в группе гипертонического альбумина, без каких-либо дополнительных преимуществ с точки зрения параметров гемодинамики или перфузии17,18.
Рисунок 1: Гемодинамические параметры. (A) Эволюция частоты сердечных сокращений, (B) среднее артериальное давление, (C) сердечный индекс на исходном уровне (t0') и (D) системный индекс сосудистого сопротивления на исходном уровне (t0'). На протяжении всего эксперимента: окончание контролируемого кровотечения (Shock30'); начало инфузии, через 30 мин после окончания контролируемого кровотечения (Res0'); окончание инфузии (Res30'); последующее наблюдение через 30 мин после окончания инфузии (Obs30'); последующее наблюдение через 60 мин после окончания инфузии (Obs60'); последующее наблюдение через 90 мин после окончания инфузии (Obs90'). (*) Достоверное отличие (р < 0,05) от исходного уровня в той же группе. (‡) р < 0,05 от кровоизлияния той же группы. (#) p < 0,05 из группы NS. Сокращения: NS = физиологический раствор нормальный; AHS = гипертонический физиологический альбумин; TAHS = терлипрессин плюс гипертонический физиологический альбумин. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. Этот рисунок адаптирован с разрешения Urbano et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Параметры объема крови. (A) Эволюция индекса ударного объема, (B) вариации пульсового давления и (C) глобального индекса конечного диастолического объема на исходном уровне (t0'). На протяжении всего эксперимента: окончание контролируемого кровотечения (Shock30'); начало инфузии, через 30 мин после окончания контролируемого кровотечения (Res0'); окончание инфузии (Res30'); последующее наблюдение через 30 мин после окончания инфузии (Obs30'); последующее наблюдение через 60 мин после окончания инфузии (Obs60'); последующее наблюдение через 90 мин после окончания инфузии (Obs90'). (*) Достоверное отличие (р < 0,05) от исходного уровня в той же группе. (‡) р < 0,05 от кровоизлияния той же группы. (#) p < 0,05 из группы NS. Сокращения: NS = физиологический раствор нормальный; AHS = гипертонический физиологический альбумин; TAHS = терлипрессин плюс гипертонический физиологический альбумин. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. Этот рисунок адаптирован с разрешения Urbano et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Параметры системной перфузии. (А) Эволюция лактата артериальной крови, (Б) насыщение кислородом центральной венозной крови и (В) индекс оксигенации тканей головного мозга на исходном уровне (t0'). На протяжении всего эксперимента: окончание контролируемого кровотечения (Shock30'); начало инфузии, через 30 мин после окончания контролируемого кровотечения (Res0'); окончание инфузии (Res30'); последующее наблюдение через 30 мин после окончания инфузии (Obs30'); последующее наблюдение через 60 мин после окончания инфузии (Obs60'); последующее наблюдение через 90 мин после окончания инфузии (Obs90'). (*) Достоверное отличие (р < 0,05) от исходного уровня в той же группе. (‡) р < 0,05 от кровоизлияния той же группы. (#) p < 0,05 из группы NS. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. Этот рисунок адаптирован с разрешения Urbano et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Проведение процедур на молодняке свиней может быть сложным и потенциально опасным для жизни из-за определенных анатомических и физиологических особенностей этих животных. Для достижения стабильных результатов и снижения потерь животных необходимо тщательно продумать несколько важных шагов. Во-первых, достижение адекватного уровня седации необходимо для минимизации стрессовой реакции животного, которая, будучи чрезмерной, может изменить результаты из-за эндогенного высвобождения катехоламинов. Также важно избегать задержек между внутримышечной инъекцией и интубацией, так как у животных может развиться тяжелая реакция на стресс с тахикардией и необратимым метаболическим ацидозом, которые могут ускорить окончание эксперимента. Несмотря на то, что в других группах используются ингаляционные анестетики с хорошими результатами20,21, мы предпочитаем внутривенные препараты, так как ингаляционные седативные препараты не позволяют измерять дыхательный газообмен с помощью непрямой калориметрии. По нашему опыту, комбинация пропофола и фентанила эффективна и имеет очень мало побочных эффектов. Тщательное управление температурой на протяжении всего эксперимента является еще одним ключевым аспектом протокола, поскольку быстрые изменения температуры могут значительно повлиять на гемодинамическую реакцию животного на шок, фальсифицируя результаты или, в конечном итоге, приводя к провалу эксперимента.
Еще одной важной частью инструментальной аппаратуры является интубация, учитывая особенности анатомии свиней и их восприимчивость к ларингоспазму. Поэтому процедуру должен выполнять, по крайней мере, один оператор с предыдущим опытом, а также целесообразно использование стилета и мышечной релаксации10,22. Катетеризация сосудов также может быть сложной задачей из-за небольшого размера животных. Для доступа к бедренной кости предпочтительна пункция под контролем УЗИ, так как сосуды расположены глубоко, обычно имеют небольшой диаметр и имеют различное направление и положение22. Для цервикального доступа мы используем хирургический доступ, позволяющий установить датчик сонного кровотока, но также возможен ультразвуковой метод23,24. Канюляция наружной яремной вены обычно предпочтительна из-за ее большего диаметра, поверхностного расположения и меньшего числа окружающих структур22. Катетеры следует промывать сразу после введения физиологическим раствором, чтобы предотвратить окклюзию. Мы не используем гепарин, чтобы избежать изменений свертываемости крови. Кроме того, первоначально мы избегали введения инфузий глюкозы, чтобы предотвратить потенциальное искажение гемодинамического ответа при введении дополнительных жидкостей, но мы обнаружили, что у животных развивалась тяжелая и ранняя гипогликемия. Наконец, даже при анестезии и менее инвазивных методах, используемых в настоящее время, инструментарий вызывает значительную стрессовую реакцию у животных, поэтому желательно оставить достаточно времени для восстановления, прежде чем приступать к забору крови. Что касается индукции геморрагического шока, мы рекомендуем удаление 30 мл/кг, так как это вызывает значительный патофизиологический ответ с отличными показателями выживаемости. По нашему опыту, детеныши свиней плохо переносят большие объемы кровопотери, и смертность высока. Также важен постепенный забор крови, так как быстрое удаление может привести к выраженной гемодинамической нестабильности и ранней гибели животного.
Несмотря на то, что исследователям доступно большое разнообразие видов и экспериментальных моделей, идеальная модель геморрагического шока у животных — простая, легко воспроизводимая и точно воспроизводимая клиническая ситуация — по-прежнему представляет собой проблему. Модели мелких животных, в первую очередь мышей и крыс, используются для изучения патофизиологических механизмов шока. Однако их небольшие размеры значительно усложняют выполнение хирургических процедур и процедур забора образцов. Более крупные животные, такие как собаки и свиньи, дороже и сложнее в обращении, но их размер и физиологическое сходство с людьми делают их более подходящими для доклинической оценки стратегий лечения. Тем не менее, использование собак в прошлом и до сих пор сомнительно с этической точки зрения. Они не дают никаких преимуществ перед свиньями в качестве экспериментальных моделей животных, а их интеллект и особые двусторонние отношения между людьми и собаками ставят их на более высокое положение в филогенетической шкале 6,7,8.
Учитывая все это, взрослые свиньи широко используются для сердечно-сосудистых исследований из-за их сходства с физиологией, размером и анатомией взрослого человека, которая лучше, чем у большинства видов. Однако, как было хорошо установлено в литературе, существуют значительные различия между взрослыми и детьми с точки зрения сердечно-сосудистой системы, объема крови, регуляции температуры и реакции на шок 2,3,4. В то же время данные показывают, что эти различия также применимы к свиньям, и было обнаружено, что поросята имеют сердечно-сосудистый, цереброваскулярный, гематологический и электролитный профили, очень похожие на таковые у педиатрических пациентов 9,25. Наконец, помимо этих анатомических и физиологических различий между взрослыми и младенцами обоих видов, использование моделей детенышей животных, особенно минипигов, дает возможность протестировать те же устройства, которые используются в реальных клинических условиях для мониторинга. Во многих случаях надежность этих устройств оказалась низкой из-за простой адаптации взрослых алгоритмов, датчиков или весов. Все эти аспекты подтверждают важность разработки конкретных педиатрических моделей животных и их актуальность с точки зрения трансляционной полезности для педиатрических клинических условий.
Помимо типа животного, существуют три основные модели, обычно используемые при изучении геморрагического шока: контролируемое кровоизлияние — либо по объему, либо по давлению — и неконтролируемое кровотечение. Протокол, представленный в этой статье, описывает модель кровоизлияния фиксированного объема, в которой фиксированный объем крови, обычно рассчитываемый в процентах от массы тела, удаляется в течение периода времени, установленного наблюдателем. Напротив, в моделях кровотечения с фиксированным давлением животным дают кровь до заранее определенного MAP, который затем поддерживается периодическим кровотечением или инфузиями жидкости в течение определенного периода времени, в зависимости от вида животных и степени или исхода шока. Модели геморрагического шока с фиксированным объемом и фиксированным давлением позволяют изучать патофизиологические изменения, вызванные шоком, в контролируемых условиях, что дает явное преимущество с точки зрения воспроизводимости и стандартизации. Однако их основным ограничением является то, что они не позволяют изучать влияние различных стратегий реанимации на активное кровотечение, где агрессивная инфузионная реанимация перед хирургическим контролем кровотечения, как известно, увеличивает кровотечение и снижает выживаемость из-за торможения образования тромба и повышения среднего артериального давления. Модели неконтролируемого кровоизлияния, вызванного стандартизированной сосудистой травмой – раздавливанием/разрывом печени и селезенки, повреждением артерии или ампутацией придатка – были предложены для лучшего отражения клинической ситуации, тем самым позволяя лучше понять эффекты различных стратегий инфузионной реанимации и других вмешательств, таких как гипотермия и кровоостанавливающие препараты. Однако, несмотря на клиническую значимость, эти модели неконтролируемого кровотечения имеют некоторые явные недостатки с точки зрения стандартизации и воспроизводимости. Учитывая все это, кажется, что идеальной модели не существует, и поэтому исследования в этой области должны уравновешивать клиническую значимость с экспериментальной стандартизацией и надежностью 6,7,8,9,26.
Модель, описанная в этом исследовании, может предложить широкий потенциал применения в сердечно-сосудистых исследованиях, таких как изучение эндотелиальной дисфункции и изменений микроциркуляции18 во время шока, а также валидация различных систем гемодинамического мониторинга. Кроме того, он может быть использован и в других областях исследований, позволяя изучать эндокринные или иммунные реакции после сильного кровотечения, а также определять побочные эффекты различных жидкостей и вазопрессоров. Однако, что касается исследований различных стратегий реанимации, целесообразно изучить их эффекты на моделях неконтролируемого кровотечения, прежде чем внедрять изменения в клинических условиях 7,26.
Помимо сложности экстраполяции результатов на реальную жизнь, у этой модели есть и другие ограничения. Начнем с того, что существуют некоторые искажающие переменные, связанные с экспериментальной установкой, такие как использование анестетиков или искусственной вентиляции легких, которые могут ослабить физиологические реакции во время шока и усложнить интерпретацию результатов. Кроме того, реакция приборов на стресс у животных и контроль температуры могут влиять на макро- и микроциркуляцию через различные механизмы. Другим важным ограничением этой модели, связанным с экспериментальной необходимостью и доступностью ресурсов, является ограниченный период посттравматического наблюдения, что еще больше ограничивает изучение отдаленных последствий геморрагического шока. Кроме того, несмотря на физиологическое сходство между людьми и свиньями, существуют некоторые различия между видами, которые следует учитывать. Система свертывания крови, например, оказывается более эффективной у свиней27,28. Кроме того, уровни лактата и сукцината в плазме различаются у разных видов, а у свиней наблюдается базальный алкалоз, что может привести к недооценке влияния кровотечения на кислотно-щелочной баланс2-9. Наконец, также хорошо известно, что воспалительные и иммунные реакции, а также некоторые вазопрессорные рецепторы у свиней9 различны. Специфические различия животных также необходимо рассматривать как влияющие факторы. Несколько исследований показали гендерные различия с точки зрения восприимчивости к шоку, при этом женщины имеют значительное преимущество в выживаемости по сравнению с мужчинами 6,9. Тем не менее, в экспериментах, проведенных в данном исследовании, мы используем животных из одной возрастной группы и со схожим генетическим фоном, чтобы свести к минимуму потенциальную изменчивость, присущую видам.
В заключение, в данной статье представлено практическое и пошаговое руководство по созданию модели геморрагического шока у детей на свиньях. По сравнению с другими существующими моделями, это надежный и простой в использовании протокол с широким применением в биомедицинских исследованиях, как для изучения патофизиологических реакций после тяжелого кровотечения, так и для оценки различных стратегий реанимации.
Disclosures
У авторов данной работы отсутствует какой-либо конфликт интересов.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано Институтом Салуда Карлоса III (ISCIII) в рамках проекта «PI20/01706» и одним из основателей Европейского Союза. Спонсоры не играли никакой роли в планировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Мы хотели бы выразить благодарность всем нашим коллегам из педиатрического отделения интенсивной терапии им. Грегорио Мараньона и Экспериментального института им. Грегорио Мараньона, так как без их работы этот проект был бы невозможен.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADA swabs | Albino Dias de Andrade, S.A. | 300575750400 | Non-woven swabs |
| Alaris SE | Carefusion | N/A | Volumetric infusion pump |
| Atracurium | Aspen Pharma Trading Limited. Dublin, Ireland | N/A | Muscle relaxant |
| Atropine 1 mg/mL | B. Braun | 481377/1013 | |
| Barrier adhesive aperture drape | Mölnlycke | 63621 | |
| BD emerald syringe 5 mL, 10 mL, 20 mL | Becton Dickinson S.A | https://www.bd.com/en-eu/offerings/capabilities/syringes-and-needles/injection-syringes/bd-emerald-3-piece-syringe | various options available |
| BLF21A laser doppler monitor | Transonic Systems Inc. | BLF21A | Skin blood flow monitor |
| BlueSensor NF ECG electrodes | Ambu | NF-50-A/12 | |
| Check-Flo performer introducer set 5Fr | Cook Medical | G12018 | Vascular Sheath |
| Datex ohmeda S5 | GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland | M1162897 | Hemodynamic monitor |
| Fentanyl 0.05 mg/mL | Kern Pharma | N/A | Anesthesia |
| GE Vivid S5 | GE Healthcare | S series | Ultrasound machine |
| Introcan Safety 18 G, 22 G, 24 G | B. Braun | Introcan series | Safety intravenous catheter |
| INVOS cerebral/somatic oximetry adult sensors | Medtronic PLC, USA | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry/invos-cerebral-somatic-oximetry-adult-sensors.html | |
| INVOS OXIMETER cerebral/somatic | Somanetics | 08-10566 | Regional oxygenation monitor |
| Ketamin 50 mg/mL | Pfizer, S.L. | 47034 | Sedation |
| Leon plus | Heinen + Löwenstein | N/A | Ventilator |
| Life scope VS | Nihon Kohden | N/A | Bedside monitor |
| Miller laryngoscope blade 12″ | Jorgensen Labs, USA | J0449F | Laryngoscope |
| Multi-lumen central venous catheterization set 7 French, 3 lumen, 30 cm | Arrow | CS-14703 | Central venous catheter |
| Nellcor WarmTouch 5300A | Covidien | Thermal blancket | |
| Nitrile gloves | Medihands | KS-ST RT021 | Single use gloves |
| Pediatric SomaSensor INVOS cerebral/somatic | Covidien | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry.html | Disposable regional oxygen saturation sensor |
| PICCO monitoring kit | Pulsion Medical Systems | PV8215 | |
| PICCO thermodilution catheter 5F/20 cm | Pulsion Medical Systems | N/A | |
| Propofol Lipoven 10 mg/mL | Fresenius Kabi, Spain | N/A | Anesthesia |
| Pulse contour cardiac output (PiCCO2) | Pulsion Medical Systems | N/A | Hemodynamic monitor |
| Rüsch flexislip | Teleflex Medical | 503700 | Endotracheal tube stylet |
| Softa swabs | B. Braun | 19579 | Alcohol pads |
| Surgical silk sutures USP 0 | Aragó, Barcelona, Spain. | 6245 | |
| TruWave pressure monitoring set | Edwards | T001767A | Pressure monitoring set |
| Ultrasound transmission gel | Ultragel Hungary 2000 Kft. | UC260 |
References
- Disease Control and Prevention (CDC). Vital signs: Unintentional injury deaths among persons aged 0-19 years-United States, 2000-2009. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 61, 270-276 (2012).
- Russell, R. T., et al. Pediatric traumatic hemorrhagic shock consensus conference recommendations. The Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 94, S2-S10 (2023).
- Leonard, J. C., et al. Life-threatening bleeding in children: A prospective observational study. Critical Care Medicine. 49 (11), 1943-1954 (2021).
- Cannon, J. W.
- Dehmer, J. J., Adamson, W. T. Massive transfusion and blood product use in the pediatric trauma patient. Seminars in Pediatric Surgery. 19 (4), 286-291 (2010).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: a review. European Surgical Research. 50 (2), 57-70 (2013).
- Moochhala, S., Wu, J., Lu, J. Hemorrhagic shock: an overview of animal models. Frontiers in Bioscience. 14 (12), 4631-4639 (2009).
- Lomas-Niera, J. L., Perl, M., Chung, C. S., Ayala, A. Shock and hemorrhage: an overview of animal models. Shock. 24, 33-39 (2005).
- Hildebrand, F., Andruszkow, H., Huber-Lang, M., Pape, H. C., van Griensven, M. Combined hemorrhage/trauma models in pigs-current state and future perspectives. Shock. 40 (4), 247-273 (2013).
- Chum, H., Pacharinsak, C.
- Leibowitz, A., Oren-Grinberg, A., Matyal, R. Ultrasound guidance for central venous access: Current evidence and clinical recommendations. Journal of Intensive Care Medicine. 35 (3), 303-321 (2020).
- Lockwood, J., Desai, N.
- Operator's Manual PiCCO2. Version 3.1. Pulsion Medical Systems. , Available from: https://www.manualslib.com/manual/2821743/Pulsion-Picco2.html#manual (2013).
- Operations Manual INVOS ® System, Model 5100C. Medtronic. , Available from: http://www.wemed1.com/downloads/dl/files/id/7947/product/10495/manual_for_mo_s_5100c.pdf (2013).
- Acker, S. N., Ross, J. T., Partrick, D. A., Tong, S., Bensard, D. D. Pediatric specific shock index accurately identifies severely injured children. Journal of Pediatric Surgery. 50 (2), 331-334 (2015).
- Urbano, J., et al. Comparison of normal saline, hypertonic saline and hypertonic saline colloid resuscitation fluids in an infant animal model of hypovolemic shock. Resuscitation. 83 (9), 1159-1165 (2012).
- Urbano, J., et al. Comparison of normal saline, hypertonic saline albumin and terlipressin plus hypertonic saline albumin in an infant animal model of hypovolemic shock. PLoS One. 10 (3), e0121678 (2015).
- González, R., et al. Microcirculatory alterations during haemorrhagic shock and after resuscitation in a paediatric animal model. Injury. 47 (2), 335-341 (2016).
- López-Herce, J., Rupérez, M., Sánchez, C., García, C., García, E. Haemodynamic response to acute hypovolaemia, rapid blood volume expansion and adrenaline administration in an infant animal model. Resuscitation. 68 (2), 259-265 (2006).
- Gil-Anton, J., et al. Addition of terlipressin to initial volume resuscitation in a pediatric model of hemorrhagic shock improves hemodynamics and cerebral perfusion. PLoS One. 15 (7), e0235084 (2020).
- Williams, A. M., et al. Complete and partial aortic occlusion for the treatment of hemorrhagic shock in swine. Journal of Visualized Experiments. (138), e58284 (2018).
- Schüttler, D., et al. A practical guide to setting up pig models for cardiovascular catheterization, electrophysiological assessment, and heart disease research. Lab Animal. 51 (2), 46-67 (2022).
- Chiesa, O. A., et al. Minimally invasive ultrasound-guided technique for central venous catheterization via the external jugular vein in pigs. American Journal of Veterinary Research. 82 (9), 760-769 (2021).
- Anderson, J. H., et al. Ultrasound guided percutaneous common carotid artery access in piglets for intracoronary stem cell infusion. Laboratory Animals. 52 (1), 88-92 (2018).
- Hughes, H. C.
- Mayer, A. R., et al. A systematic review of large animal models of combined traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 104, 160-177 (2019).
- Velik-Salchner, C., et al. Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood. Thrombosis Research. 117 (5), 597-602 (2006).
- Siller-Matula, J. M., Plasenzotti, R., Spiel, A., Quehenberger, P., Jilma, B.
- Reisz, J. A., et al. All animals are equal but some animals are more equal than others: Plasma lactate and succinate in hemorrhagic shock-A comparison in rodents, swine, nonhuman primates, and injured patients. The Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 84 (3), 537-541 (2018).
