Summary
Dieser Artikel zielt darauf ab, Forschern einen detaillierten und zugänglichen Leitfaden an die Hand zu geben, um ein Modell des hämorrhagischen Schocks für Säuglinge zu erstellen.
Abstract
Der hämorrhagische Schock ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei pädiatrischen Patienten. Die Interpretation der klinischen Indikatoren, die bei Erwachsenen validiert wurden, um die Wiederbelebung und den Vergleich zwischen verschiedenen Therapien zu steuern, ist bei Kindern aufgrund der inhärenten Heterogenität dieser Population schwierig. Infolgedessen ist die angemessene Behandlung des pädiatrischen hämorrhagischen Schocks im Vergleich zu Erwachsenen immer noch nicht gut etabliert. Darüber hinaus schließt der Mangel an pädiatrischen Patienten mit hämorrhagischem Schock die Entwicklung klinisch relevanter Studien aus. Aus diesem Grund ist ein experimentelles pädiatrisches Tiermodell notwendig, um die Auswirkungen von Blutungen bei Kindern sowie deren Ansprechen auf verschiedene Therapien zu untersuchen. Wir stellen ein Säuglingsmodell des volumenkontrollierten hämorrhagischen Schocks bei anästhesierten Jungschweinen vor. Die Blutung wird durch Entnahme eines zuvor berechneten Blutvolumens ausgelöst und das Schwein anschließend mit verschiedenen Therapien überwacht und wiederbelebt. Hier beschreiben wir ein präzises und hochreproduzierbares Modell des hämorrhagischen Schocks bei unreifen Schweinen. Das Modell liefert hämodynamische Daten, die Kompensationsmechanismen charakterisieren, die als Reaktion auf schwere Blutungen aktiviert werden.
Introduction
Lebensbedrohliche Blutungen aufgrund eines Traumas sind zwar selten, aber die häufigste Todesursache bei pädiatrischen Patienten 1,2. Weitere Ursachen für einen hämorrhagischen Schock sind hämorrhagisches Fieber, gastrointestinale Blutungen, Leberoperationen und Herzoperationen, insbesondere wenn ein kardiopulmonaler Bypass verwendet wird3.
Im Gegensatz zur erwachsenen Bevölkerung gibt es nur unzureichende Daten zur Behandlung des pädiatrischen hämorrhagischen Schocks, die weitgehend auf Expertenmeinungen beruhen oder direkt aus der Erwachsenenpraxis übernommen wurden 2,4. Die Übertragung von Managementstrategien von Erwachsenen ist jedoch möglicherweise nicht angemessen. Zum Beispiel sind klinische Indikatoren, die bei Erwachsenen validiert wurden, aufgrund der physiologischen Heterogenität, die in Gruppen unterschiedlichen Alters vorhanden ist, und der unterschiedlichen Verletzungsmuster, die in der pädiatrischen Population vorherrschen, schwierig auf pädiatrische Patienten zu extrapolieren. Folglich sind die spezifischen Endpunkte, die eine Intervention beim pädiatrischen Patienten auslösen würden, nicht gut definiert. Darüber hinaus gibt es nicht genügend Evidenz für die schädlichen Auswirkungen, die derzeit bei Erwachsenen durchgeführte Therapien auf Kinder haben können 2,4,5.
Vor diesem Hintergrund sind weitere Untersuchungen erforderlich, um spezifische Wiederbelebungsschwellen für eine schnelle Intervention festzulegen und besser zu bestimmen, welche Therapien für den pädiatrischen hämorrhagischen Schock am besten geeignet sind. Die Entwicklung qualitativ hochwertiger und klinisch relevanter Studien zu lebensbedrohlichen Blutungen bei Kindern ist jedoch aufgrund des Mangels an Patienten und der bereits erwähnten Heterogenität in der pädiatrischen Population von der Neugeborenenperiode bis zur Adoleszenz schwierig.
Die klinische Relevanz des hämorrhagischen Schocks sowie die Schwierigkeiten bei der Durchführung klinischer Studien an pädiatrischen Patienten unterstreichen die Notwendigkeit präklinischer Bewertungen an Tiermodellen, um die Pathophysiologie nach hämorrhagischem Schock bei Kindern zu untersuchen und verschiedene Therapien zu vergleichen. Mehrere Tiermodelle wurden in der Forschung häufig verwendet, um den hämorrhagischen Schock zu untersuchen 6,7,8,9. Aufgrund ihrer anatomischen und physiologischen Ähnlichkeiten mit dem Menschen werden Schweine in der biomedizinischen Forschung sehr geschätzt. In Bezug auf die Vorteile der Verwendung spezifischer Säuglingsmodelle zeigt sich, dass die Hämodynamik von unreifen Schweinen sowie das Atmungs-, Hämatologie- und Stoffwechselsystem in hohem Maße mit denen bei jungen Menschen vergleichbar sind9. Dies bietet eine einzigartige Gelegenheit, ein klinisches Szenario eines hämorrhagischen Schocks bei Kindern zu simulieren.
In diesem Modell wird die Blutung durch Entnahme eines zuvor berechneten Blutvolumens induziert. Anschließend wird das Schwein überwacht und verschiedene Beatmungsflüssigkeiten verabreicht.
Hier beschreiben wir ein präzises und hochreproduzierbares Modell des hämorrhagischen Schocks bei unreifen Schweinen. Das Modell liefert hämodynamische Daten, die Kompensationsmechanismen charakterisieren, die als Reaktion auf schwere Blutungen aktiviert werden.
Protocol
Die Versuche in diesem Protokoll wurden von der Institutionellen Ethikkommission für Tierversuche des Universitätskrankenhauses Gregorio Marañón, Madrid, Spanien, und dem Rat für Landwirtschaft und Umwelt der Autonomen Regierung von Madrid genehmigt (Genehmigungsnummer: 12/0013). Während der gesamten Studie wurden europäische und spanische Richtlinien für ethische Pflege und die Verwendung von Versuchstieren angewendet. Die Experimente wurden in der Abteilung für experimentelle Medizin und Chirurgie des Universitätsklinikums Gregorio Marañón in Madrid, Spanien, durchgeführt.
HINWEIS: Das gewählte Tiermodell bestand aus gesunden, 2-3 Monate alten (8-12 kg) Minischweinen (Sus scrofa domestica). Minischweine sind das Ergebnis einer Kreuzung von drei verschiedenen Rassen, die sie für die biomedizinische Forschung geeignet machen. Bei den Tieren handelt es sich um nahezu identische Linien, die von einer speziell autorisierten Zuchtanlage in Madrid (IMIDRA) zur Verfügung gestellt werden, die die Pflege von drei homozygoten genetischen Linien in Reinheit hält. Männliche und weibliche Tiere wurden abwechselnd verwendet. Die Tiere wurden mit einem Standardfutter für Schweine gefüttert und mindestens 2 Tage lang beobachtet, um eine gute Gesundheit zu gewährleisten. Die Nahrung, aber nicht das Wasser, wurde in der Nacht vor den Eingriffen zurückgezogen, um das Risiko einer Aspiration zu verringern. Ein typisches Experiment dauert ca. 6 Stunden, davon 30 Minuten für die Anästhesieeinleitung und die chirurgische Vorbereitung, 60 Minuten für die Instrumentierung, 30 Minuten für die Genesung, 60 Minuten für die Blutungsinduktion und die posteriore Stabilisierung, 30 Minuten für die Wiederbelebung und 120 Minuten für die Nachsorge.
1. Anästhesie, Intubation und mechanische Beatmung
- Das Schwein wird mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin (10 mg/kg) und Atropin (0,02 mg/kg) in den seitlichen Bereich des Halses, hinter dem Ohr oder in den hinteren Oberschenkelbereich vorbehandelt.
HINWEIS: Anticholinergika wie Atropin sind nützlich, da Schweine unter Narkose übermäßig speicheln können10. Unserer Erfahrung nach reicht diese Dosis Ketamin aus, um Stress zu reduzieren und eine angemessene Sedierung und Analgesie bei Schweinen ohne Nebenwirkungen zu induzieren. Wenn das Tier jedoch nicht ordnungsgemäß sediert ist oder wenn der Weg vom Stall zum Operationssaal lang ist, kann eine weitere Dosis Ketamin (10 mg/kg) sicher verabreicht werden.
ACHTUNG: Beim Umgang mit Tieren sind Handschuhe erforderlich. - Transportieren Sie das sedierte Tier in den Operationssaal und legen Sie es auf einen Operationstisch, der mit einer wärmenden Decke versehen ist.
- Messen Sie die periphere Sauerstoffsättigung (Sp02) mit einem Sensor, der am Ohr des Schweins befestigt ist, und leiten Sie eine kontinuierliche elektrokardiographische Überwachung (EKG) mit drei Ableitungen ein.
- Desinfizieren Sie die Haut mit mindestens 3 abwechselnden Runden Povidon-Jod- oder Chlorhexidin-Peeling und Alkohol. Führen Sie einen peripheren Venenkatheter (22-24 G) in die Ohrvene ein. Desinfizieren Sie die Haut vorher mit einer antiseptischen Lösung.
- Eine Anästhesie wird durch eine intravenöse Injektion von Fentanyl (5 μg/kg), Propofol (4 mg/kg) und Atracurium (0,5 mg/kg) eingeleitet. Sobald die Spontanatmung verschwindet und das Fehlen von Reflexen bestätigt ist, bringen Sie das Tier in die Rückenliegeposition und leiten Sie sofort die Beatmung der Handtaschenmaske mit einer Hundemaske ein, deren Anteil an eingeatmetem Sauerstoff (Fi02) auf 100 % eingestellt ist.
HINWEIS: Um das Risiko eines versehentlichen Bewusstseins im Zusammenhang mit der Anwendung von neuromuskulären Blockern zu verringern, sollten Anästhetika mit bekannter Wirksamkeit bei Schweinen und mit Dosen über dem höheren Grenzwert verwendet werden, um ein angemessenes Maß an Anästhesie zu gewährleisten. Überwachen Sie außerdem kontinuierlich kardiovaskuläre Symptome wie Herzfrequenz, Blutdruck und Körpertemperatur und verabreichen Sie neuromuskuläre Blocker nur dann, wenn Entzugsreflexe fehlen (Pedalrückzug, Lidreflexe und Kiefertonus) und der Muskeltonus entspannt ist. - Führen Sie eine endotracheale Intubation durch. Für dieses Verfahren werden mindestens zwei Bediener benötigt.
- Stellen Sie sicher, dass die Grundausstattung und die chirurgischen Instrumente, die für die endotracheale Intubation benötigt werden, bereit sind: Bindegaze, um den Mund zu öffnen und den Schlauch zu sichern, Veterinärlaryngoskop mit einer geraden Klinge zwischen 17 und 25 cm Länge, ein gewöhnlicher Endotrachealtubus (ID 4-5), Stilett, Spritze mit Luft und Klebeband.
- Ziehen Sie die Zunge leicht heraus und halten Sie den Kiefer mit Bindegaze offen, die hinter den oberen und unteren Eckzähnen platziert ist.
- Führen Sie eine Laryngoskopie durch und drücken Sie, sobald die Epiglottis sichtbar ist, mit der Spitze des Laryngoskops die Epiglottis nach oben in Richtung Zungengrund.
HINWEIS: Wenn die Epiglottis am weichen Gaumen klebt, kann sie mit der Spitze der Röhre dorsal verschoben werden. Operator 1 führt Schritt 1.6.2 aus, während Operator 2 Schritt 1.6.3 ausführt. - Sobald die Stimmbänder sichtbar sind, schieben Sie den Schlauch vorsichtig mit leichter Drehung in die Luftröhre vor.
HINWEIS: Die schmalste Stelle der Luftröhre befindet sich auf subglottischer Ebene. Wenn das Einführen des Röhrchens schwierig ist, versuchen Sie es mit einer leichten Drehung oder einem kleineren Röhrchen. - Entfernen Sie das Mandrin und verwenden Sie eine 5-ml-Spritze, um die Manschette aufzublasen.
- Stellen Sie sicher, dass der Endotrachealtubus platziert wird, indem Sie auf eine symmetrische Anhebung des Brustkorbs, eine ausreichende Sauerstoffsättigung (95%-100%) und eine korrekte Wellenform und Endtidal-CO2 ( EtCO2)-Messung achten.
VORSICHT: Schweine sind sehr anfällig für Laryngospasmus und Ödeme der Kehlkopfschleimhaut, und eine Kehlkopfperforation kann sogar nach mehreren Intubationsversuchen oder bei unzureichender Sedierung auftreten10.
- Nach Bestätigung der Intubation wird eine mechanische Beatmung mit einem mechanischen Beatmungsgerät mit einer Atemfrequenz von 20 Atemzügen pro Minute, einem Tidalvolumen von 8 ml/kg, einem FiO2 von 40 % und einem positiven endexspiratorischen Druck von 4 cm H2O eingeleitet. Stellen Sie die Belüftung so ein, dass ein Kohlendioxidpartialdruck (PaCO2) zwischen 35 und 45 mmHg erreicht wird.
- Halten Sie während des gesamten Experiments eine tiefe Anästhesie durch eine kontinuierliche Infusion von Fentanyl (10 μg/kg/h), Propofol (10 mg/kg/h) und Atracurium (2 mg/kg/h) aufrecht.
2. Instrumentierung
- Bereiten Sie den Oberschenkelbereich für die Gefäßkatheterisierung vor. Verwenden Sie Bandagen, um die Beine nach hinten zu ziehen und desinfizieren Sie den Leistenbereich mit mindestens 3 abwechselnden Runden Povidon-Jod- oder Chlorhexidin-Peeling und Alkohol.
- Beurteilen Sie die Oberschenkelgefäße mit einem Ultraschall und verwenden Sie die Dopplertechnik, um zwischen der Arterie und der Vene zu unterscheiden. Abhängig von der Größe der Vene wird ein zentraler Venenkatheter mit drei Ports in einer der Oberschenkelvenen unter kontinuierlicher Ultraschallbetrachtung und unter Verwendung der Seldinger-Technik eingeführt11,12.
- Schließen Sie unmittelbar nach dem Legen des zentralen Venenkatheters ein Schallkopfsystem an, um den zentralen Venendruck zu messen.
- Stellen Sie sicher, dass ein Elektrolyt mit Glukoseinfusion (20 ml/h) an einen der zentralen Anschlüsse angeschlossen ist und dass eine Erhaltungssalzinfusion (5 ml/h) über den verbleibenden Anschluss infundiert wird, um einen Verschluss des Katheters zu verhindern.
- Verwenden Sie die gleiche Technik, um die gegenüberliegende Oberschenkelarterie mit einem 4-F-arteriellen Katheter zu kanülieren, der speziell für die Überwachung des Herzzeitvolumens entwickelt wurde. Führen Sie einen Blutgastest durch, um die korrekte Position des Katheters festzustellen, wenn eine Ultraschallbestätigung nicht möglich ist.
HINWEIS: Im Falle eines signifikanten Spasmus oder Hämatoms auf die kontralaterale Oberschenkelarterie übergehen. - Sobald der arterielle Katheter eingeführt ist, schließen Sie den arteriellen Draht des Herzzeitvolumenmonitorsystems und den arteriellen Schallkopf direkt an den Monitoranschluss an. Verbinden Sie gleichzeitig die venöse Messeinheit des Monitors mit dem zentralen Venenschallkopf.
HINWEIS: Der in diesem Experiment verwendete Herzzeitvolumenmonitor ist in der Materialtabelle angegeben. Informationen zur Einrichtung, Kalibrierung und Messung finden Sie in der Herstelleranleitung13. - Stellen Sie sicher, dass sowohl die venösen als auch die arteriellen Schallköpfe auf Null kalibriert sind.
- Legen Sie die linke innere Halsschlagader und die linke äußere Halsschlagader mit der Cut-Down-Technik frei.
- Stellen Sie sicher, dass die erforderlichen Geräte und chirurgischen Instrumente zur Verfügung stehen: Skalpell, chirurgische Schere mit stumpfer Spitze, Gewebezange, kleiner selbsthaltender Geweberetraktor, Nadelhalter, chirurgischer Austausch, Naht mit Nadel, eine 18 G IV-Kanüle, eine 5-F-Katheterhülle mit Einführhilfe und ein Seldinger-Führungsdraht.
- Wenn sich das Tier in der Rückenliegeposition befindet, desinfizieren Sie die Halshaut mit einer antiseptischen Lösung.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um einen ~10 cm langen linken paratrachealen Schnitt zu machen, indem Sie eine Linie zwischen dem Manubrium und dem Kieferwinkel halbieren.
- Um die Vena jugularis externa freizulegen, wird das Gewebe lateral des SCM präpariert und die Vene von der umgebenden Faszie isoliert.
- Verwenden Sie nach der Isolierung zwei nicht resorbierbare Seidennähte (USP-0), die um die Vene geschlungen werden, um das Gefäß vor der Punktion zu fixieren.
- Schneiden Sie die Vene mit einer Venflonnadel (18 g) ein. Sobald Sie sich in der Vene befinden, ziehen Sie die Nadel zurück und führen Sie den Führungsdraht durch den Venflonschlauch ein.
- Entfernen Sie den Venflonschlauch und führen Sie die Hülle mit der Einführhilfe (5 F) über den Draht ein. Entfernen Sie nach dem Einsetzen sowohl die Einführhilfe als auch den Draht.
- Unmittelbar nach dem Einführen die Hüllen mit 0,9 % NaCl (5 ml/h) spülen, um die Bildung von Thrombus zu verhindern.
- Binde die proximale Seidennaht um die Hülle zusammen, um sie zu fixieren. Befestigen Sie danach den Griff der Hülle am SCM und verschließen Sie die Haut mit Klammern.
- Lassen Sie die Tiere nach der chirurgischen Vorbereitung 30 Minuten lang stabilisieren, bevor Sie die Ausgangswerte und Blutproben erhalten.
- Halten Sie die Bluttemperatur während des gesamten Experiments mit einer Wärmedecke und einem Oberkopfwärmer bei 37-39 °C.
HINWEIS: Die Temperatur wird mit einem Thermistor gemessen, der sich an der Spitze des arteriellen Thermodilutionskatheters befindet.
3. Hämodynamik und Perfusionsüberwachung
- Überwachen Sie das EKG, die periphere Sauerstoffsättigung, das Atemvolumen und den Atemdruck sowie Fi02.
- Schließen Sie ein Spirometer zwischen dem Endotrachealtubus und einem Multiparameter-Monitor an, um qualitatives und quantitatives EtC02 zu messen.
HINWEIS: Weitere Informationen zum Multiparameter-Monitor finden Sie in der Materialtabelle. - Verwenden Sie Nahinfrarotspektroskopie (NIRS), um den Oxygenierungsindex des Gehirngewebes (bTOI) und den Splanchnischen Gewebeoxygenierungsindex (aTOI) zu überwachen. Platzieren Sie die Sensoren auf der Haut der Stirn und der vorderen Bauchdecke (subhepatische Region).
HINWEIS: Platzieren Sie den Gehirnsensor nicht in der Mittellinie, da er mit dem venösen Blut des oberen Sagittalsinus14 verunreinigt sein kann. - Schließen Sie die an der inneren Halsschlagader befestigte Blutflusssonde an einen Durchflussmonitor an, um den Blutfluss der Halsschlagader (CaBF) zu messen.
- Platzieren Sie einen Laser-Doppler-Sensor über der Haut der vorderen Bauchdecke, um den kutanen Tissularblutfluss (CuTBF) kontinuierlich zu messen.
HINWEIS: Weitere Informationen zu den Strömungssensoren für Halsschlagader und Hautknochen finden Sie in der Materialtabelle. - Aufzeichnung der folgenden Parameter zu Studienbeginn und alle 30 Minuten: Bluttemperatur, inspiratorisches Tidalvolumen, EtCO2, Herzrhythmus, Herzfrequenz (HR), systolischer und diastolischer Blutdruck, mittlerer arterieller Blutdruck (MAP), Schockindex (HR/systolischer Blutdruck)15, zentralvenöser Blutdruck, Herzindex (CI), globaler enddiastolischer Volumenindex (GEDVI), Schlaganfallvolumenindex (SVI), linksventrikuläre Kontraktilität (Dt/Dpmax), systemischer vaskulärer Widerstandsindex (SVRI), extravaskulärer Lungenwasserindex (ELWI), Druckimpulsvariation (PPV), periphere Hämoglobinsättigung, zentralvenöse Sättigung (ScvO2), zerebraler (bTOI) und splanchnischer (aTOI) Gewebeoxygenierungsindex durch NIRS, CaBF und CuTBF.
- Um CI-Werte zu erhalten, infundieren Sie 5 ml Boli mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung bei einer Temperatur unter 8 °C durch den zentralen Venenkatheter. Notieren Sie den Durchschnitt von zwei aufeinanderfolgenden Messgrößen.
- Bestimmen Sie die arteriellen und venösen Blutgasprofile und die Laktatkonzentration alle 30 Minuten, indem Sie 0,3 ml Blut aus den Oberschenkelgefäßen entnehmen. Führen Sie standardmäßige Blutbilder, Gerinnungsuntersuchungen und Biochemie zu Studienbeginn, nach Blutungsinduktion und am Ende des Experiments durch.
- Nach jeder Blutentnahme werden die Leitungen mit 0,5 ml 100 I.E./ml Heparin gespült.
4. Induktion des hämorrhagischen Schocks
- Sobald ein stabiler Zustand erreicht ist, nachdem die Instrumentierung und die Ausgangsdaten gesammelt wurden, wird ein hypovolämischer Schock eingeleitet, indem 30 ml/kg Blut über 30 Minuten aus der Halsvene entnommen werden.
- Warten Sie 30 Minuten zur Stabilisierung. Führen Sie in dieser Zeit keine Wiederbelebungsbemühungen durch, um die Verzögerung beim Eintreffen von medizinischen Notfallteams nachzuahmen.
5. Infusion und Nachsorge
- Nach der Stabilisierungsphase wird über einen Zeitraum von 30 Minuten ein Bolus eines Volumenexpanders oder eines vasoaktiven Mittels infundiert.
HINWEIS: Beispiele für getestete Volumenexpander und vasoaktive Wirkstoffe sind normale Kochsalzlösung, hypertones Albumin, Angiotensin und Terlipressin. In dieser Studie wurden 30 ml/kg normale Kochsalzlösung (NS) (n = 13), 15 ml/kg 5 % Albumin plus 3 % hypertone Kochsalzlösung (AHS) (n = 13) oder ein einzelner intravenöser Bolus von 15 μg/kg Terlipressin plus 15 ml/kg 5 % Albumin plus 3 % hypertone Kochsalzlösung (TAHS) (n = 13) verwendet. - Nach der Infusion wird das Tier 120 Minuten lang beobachtet. Zeichnen Sie die hämodynamischen Parameter auf und entnehmen Sie alle 30 Minuten Blutproben für arterielle und venöse Blutgasprofile und die Bestimmung der Laktatkonzentration. Führen Sie in dieser Zeit keine Wiederbelebungsmaßnahmen durch.
6. Ende des Experiments und Euthanasie
- Nach Beendigung des Versuchs ist eine Überdosierung des Beruhigungsmittels (5 μg/kg Fentanyl und 10 mg/kg Propofol) und eine intravenöse Injektion von Kaliumchlorid (2 mEq/kg) durchzuführen, um alle erfolgreich wiederbelebten Tiere zu töten.
- Bestätigen Sie das Fehlen von Zirkulation durch Asystolie oder pulslose elektrische Aktivität auf einer kontinuierlichen EKG-Anzeige, das Fehlen eines pulsierenden Flusses während der invasiven arteriellen Drucküberwachung und das Fehlen anderer Vitalparameter.
- Wenn der arterielle Blutdruck während der Nachbeobachtungszeit unter 25 mmHg sinkt, opfern Sie das Tier, um weiteres Leiden zu vermeiden.
Representative Results
Das vorgestellte Modell wurde erfolgreich in mehreren Experimenten eingesetzt, um makrozirkulatorische und mikrozirkulatorische Veränderungen nach hämorrhagischem Schock und anschließender Reanimation zu untersuchen, wobei verschiedene Flüssigkeiten und vasoaktive Medikamente verglichen wurden16,17,18,19.
Betrachtet man die Reaktion auf einen Schock, so hat dieses Modell immer wieder gezeigt, dass eine kontrollierte Blutung deutliche Veränderungen der hämodynamischen Parameter sowie der Hirn- und Gewebedurchblutung hervorruft.
Nach Volumenentzug werden eine signifikante Tachykardie und eine Abnahme der MAP-, CI-, SVI-, Blutvolumenparameter (GEDVI und ITBI) und des Blutflusses der Halsschlagader sowie ein Anstieg des systemischen Gefäßwiderstandsindex festgestellt (Abbildung 1 und Abbildung 2).
In Bezug auf die systemischen Perfusionsparameter steigt das Laktat signifikant an, während ScvO2, CuTBF und bTO abnehmen (Abbildung 3). Schwankungen des zentralvenösen Drucks, Dt/Dpmax und ELW werden in der Regel nicht registriert.
Was die Laborparameter betrifft, so nehmen Hämoglobingehalt und Hämatokrit erst nach der Verabreichung von Flüssigkeiten ab. Die Albuminkonzentration nimmt ab und der Troponinspiegel steigt nach kontrollierter Blutung signifikant an. Andere Parameter wie Kerntemperatur, PaO2, PaCO2, arterielle Sauerstoffsättigung, EtCO2, Elektrolyte sowie Nieren- und Leberfunktionsparameter bleiben in der Regel stabil.
Neben seiner Nützlichkeit bei der Analyse der kardiovaskulären und biochemischen Reaktionen auf einen Schock hat sich gezeigt, dass dieses Modell erfolgreich zwischen verschiedenen Wiederbelebungsflüssigkeiten unterscheiden kann.
In früheren Studien wollten wir herausfinden, ob in einem Säuglingsmodell des hämorrhagischen Schocks die Verwendung einer Infusion hypertoner Flüssigkeiten mit geringerem Volumen - allein oder in Kombination mit verschiedenen Vasopressoren - die globalen hämodynamischen und Perfusionsparameter im Vergleich zu normaler Kochsalzlösung verbessern würde.
Wie bereits berichtet, haben wir immer wieder beobachtet, dass die Infusion hypertoner Flüssigkeiten eine ähnliche Reaktion hervorruft wie die Infusion des doppelten Volumens isotonischer Flüssigkeit16,17,18.
Genauer gesagt führte die Verwendung von Albumin plus hypertoner Kochsalzlösung zu einer größeren und längeren Volumenausdehnung als normale Kochsalzlösung oder hypertone Kochsalzlösung allein, mit signifikanten Unterschieden in HR, SVI und PPV und dem Fehlen eines progressiven Abfalls nach Volumenexpansion des Blutdrucks und GEDVI, wie in den anderen Gruppen beobachtet (Abbildung 1 und Abbildung 2). Darüber hinaus haben wir auch eine stärkere Verbesserung der Perfusionsparameter mit hypertonem Albumin beobachtet, was sich in einem stärkeren Anstieg von bTOI und CaBF und einer stärkeren Abnahme des Laktatspiegels als in den anderen Gruppen im Vergleich zum Beginn der Flüssigkeitsexpansion darstellt (Abbildung 3). Wir glauben, dass dieser Unterschied sekundär zu der Fähigkeit von Albumin sein könnte, das Blutvolumen zu erhöhen und für einen längeren Zeitraum im intravaskulären Kompartiment zu verbleiben als normale Kochsalzlösung. Interessanterweise haben wir gesehen, dass die Zugabe eines einzelnen Terlipressin-Bolus zu Beginn der Flüssigkeitsreanimation zu ähnlichen Ergebnissen führte wie in der hypertonen Albumingruppe, ohne zusätzliche Vorteile in Bezug auf hämodynamische oder Perfusionsparameter17,18.
Abbildung 1: Hämodynamische Parameter. (A) Entwicklung der Herzfrequenz, (B) mittlerer arterieller Druck, (C) Herzindex zu Studienbeginn (t0') und (D) systemischer Gefäßwiderstandsindex zu Studienbeginn (t0'). Im Verlauf des Experiments: Ende der kontrollierten Blutung (Shock30'); Beginn der Infusion, 30 Minuten nach Beendigung der kontrollierten Blutung (Res0'); Ende der Infusion (Res30'); Nachuntersuchung 30 Minuten nach Ende der Infusion (Obs30'); Nachuntersuchung 60 Minuten nach Ende der Infusion (Obs60'); Nachuntersuchung 90 Minuten nach Ende der Infusion (Obs90'). (*) Signifikanter Unterschied (p < 0,05) zum Ausgangswert, gleiche Gruppe. (‡) p < 0,05 von Blutungen, gleiche Gruppe. (#) p < 0,05 aus der Gruppe NS. Abkürzungen: NS = normale Kochsalzlösung; AHS = hypertones Kochsalzalbumin; TAHS = Terlipressin plus hypertones Kochsalzalbumin. Die Daten werden als Mittelwert und Standardabweichung dargestellt. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Urbano et al.17 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Blutvolumenparameter. (A) Entwicklung des Schlagvolumenindex, (B) Pulsdruckvariation und (C) globaler enddiastolischer Volumenindex zu Studienbeginn (t0'). Im Verlauf des Experiments: Ende der kontrollierten Blutung (Shock30'); Beginn der Infusion, 30 min nach Beendigung der kontrollierten Blutung (Res0'); Ende der Infusion (Res30'); Nachuntersuchung 30 Minuten nach Ende der Infusion (Obs30'); Nachuntersuchung 60 Minuten nach Ende der Infusion (Obs60'); Nachuntersuchung 90 Minuten nach Ende der Infusion (Obs90'). (*) Signifikanter Unterschied (p < 0,05) zum Ausgangswert, gleiche Gruppe. (‡) p < 0,05 von Blutungen, gleiche Gruppe. (#) p < 0,05 aus der Gruppe NS. Abkürzungen: NS = normale Kochsalzlösung; AHS = hypertones Kochsalzalbumin; TAHS = Terlipressin plus hypertones Kochsalzalbumin. Die Daten werden als Mittelwert und Standardabweichung dargestellt. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Urbano et al.17 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Systemische Perfusionsparameter. (A) Entwicklung des arteriellen Blutlaktats, (B) zentralvenöse Blutsauerstoffsättigung und (C) Oxygenierungsindex des Hirngewebes zu Studienbeginn (t0'). Im Verlauf des Experiments: Ende der kontrollierten Blutung (Shock30'); Beginn der Infusion, 30 min nach Beendigung der kontrollierten Blutung (Res0'); Ende der Infusion (Res30'); Nachuntersuchung 30 Minuten nach Ende der Infusion (Obs30'); Nachuntersuchung 60 Minuten nach Ende der Infusion (Obs60'); Nachuntersuchung 90 Minuten nach Ende der Infusion (Obs90'). (*) Signifikanter Unterschied (p < 0,05) zum Ausgangswert, gleiche Gruppe. (‡) p < 0,05 von Blutungen, gleiche Gruppe. (#) p < 0,05 aus der Gruppe NS. Die Daten werden als Mittelwert und Standardabweichung dargestellt. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Urbano et al.17 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Die Durchführung von Eingriffen an jungen Schweinen kann aufgrund bestimmter anatomischer und physiologischer Merkmale dieser Tiere komplex und potenziell lebensbedrohlich sein. Um konsistente Ergebnisse zu erzielen und den Verlust von Tieren zu reduzieren, gibt es einige kritische Schritte, die sorgfältig abgewogen werden sollten. Erstens ist es wichtig, ein angemessenes Maß an Sedierung zu erreichen, um die Stressreaktion der Tiere zu minimieren, die, wenn sie übermäßig ist, die Ergebnisse aufgrund der endogenen Katecholaminfreisetzung verändern kann. Es ist auch wichtig, Verzögerungen zwischen der intramuskulären Injektion und der Intubation zu vermeiden, da die Tiere eine schwere Stressreaktion mit Tachykardie und irreversibler metabolischer Azidose entwickeln können, die das Ende des Experiments beschleunigen kann. Obwohl andere Gruppen inhalative Anästhetika mit guten Ergebnissen verwenden20,21, bevorzugen wir intravenöse Medikamente, da inhalative Beruhigungsmittel die Messung des Atemgasaustauschs mit indirekter Kalorimetrie nicht ermöglichen. Unserer Erfahrung nach ist eine Kombination aus Propofol und Fentanyl wirksam und hat nur sehr wenige Nebenwirkungen. Ein sorgfältiges Temperaturmanagement während des gesamten Experiments ist ein weiterer wichtiger Aspekt des Protokolls, da schnelle Temperaturänderungen die hämodynamische Reaktion des Tieres auf einen Schock erheblich beeinflussen und die Ergebnisse verfälschen oder letztendlich zum Scheitern des Experiments führen können.
Ein weiterer wichtiger Teil der Instrumentierung ist die Intubation, da die Anatomie der Schweine und ihre Anfälligkeit für Laryngospasmus besonders. Daher sollte der Eingriff von mindestens einem Operateur mit Vorerfahrung durchgeführt werden, und die Verwendung eines Stiletts und Muskelentspannung ist ratsam10,22. Die Katheterisierung von Gefäßen kann aufgrund der geringen Größe der Tiere auch eine Herausforderung darstellen. Für den Femurzugang ist eine sonographiegeführte Punktion vorzuziehen, da die Gefäße tief liegen, in der Regel kleine Durchmesser haben und unterschiedliche Verläufe und Positionen aufweisen22. Für den zervikalen Zugang verwenden wir einen chirurgischen Zugang, um die Platzierung der Halsschlagadersonde zu ermöglichen, aber auch die Ultraschalltechnik ist durchführbar23,24. Die Kanülierung der Vena jugularis externa wird in der Regel aufgrund ihres größeren Durchmessers, ihrer oberflächlichen Lage und der geringeren Anzahl von umgebenden Strukturen bevorzugt22. Katheter sollten sofort nach dem Einführen mit Kochsalzlösungen gespült werden, um einen Verschluss zu verhindern. Wir verwenden kein Heparin, um Gerinnungsstörungen zu vermeiden. Außerdem haben wir anfangs die Verabreichung von Glukoseinfusionen vermieden, um eine mögliche Verzerrung der hämodynamischen Reaktion durch die Verabreichung zusätzlicher Flüssigkeiten zu verhindern, aber wir stellten fest, dass die Tiere eine schwere und frühe Hypoglykämie entwickelten. Schließlich erzeugt die Instrumentierung auch bei der Anästhesie und den weniger invasiven Techniken, die heutzutage verwendet werden, eine erhebliche Stressreaktion bei den Tieren, so dass es wünschenswert ist, genügend Zeit für die Genesung einzuplanen, bevor mit der Blutentnahme begonnen wird. Hinsichtlich der Induktion des hämorrhagischen Schocks empfehlen wir die Entfernung von 30 ml/kg, da dies eine signifikante pathophysiologische Reaktion mit hervorragenden Überlebensraten hervorruft. Unserer Erfahrung nach vertragen junge Schweine keinen größeren Blutverlust und die Sterblichkeit ist hoch. Eine allmähliche Entnahme des Blutes ist ebenfalls wichtig, da eine schnelle Entnahme zu einer schweren hämodynamischen Instabilität und einem frühen Tod des Tieres führen kann.
Obwohl den Forschern eine Vielzahl von Spezies und experimentellen Modellen zur Verfügung steht, stellt das ideale Modell des hämorrhagischen Schocks bei Tieren - einfach, leicht reproduzierbar und genau die klinische Situation - immer noch eine Herausforderung dar. Kleintiermodelle - vor allem Mäuse und Ratten - werden verwendet, um die pathophysiologischen Mechanismen des Schocks zu untersuchen. Ihre geringe Größe erschwert jedoch die Durchführung von chirurgischen Eingriffen und Probenahmeverfahren erheblich. Größere Tiere wie Hunde und Schweine sind teurer und komplexer in der Handhabung, aber aufgrund ihrer Größe und physiologischen Ähnlichkeiten mit dem Menschen eignen sie sich besser für die präklinische Bewertung der Behandlungsstrategien. Der Einsatz von Hunden in der Vergangenheit und auch heute noch ist ethisch fragwürdig. Sie bieten keinen Vorteil gegenüber Schweinen als Versuchstiermodelle, und ihre Intelligenz und die besondere bilaterale Beziehung zwischen Mensch und Hund verorten sie auf einer höheren Position auf der phylogenetischen Skala 6,7,8.
In Anbetracht all dessen wurden erwachsene Schweine aufgrund ihrer Ähnlichkeiten mit der Physiologie, Größe und Anatomie des erwachsenen Menschen, die besser ist als die der meisten Arten, ausgiebig für die kardiovaskuläre Forschung verwendet. Wie in der Literatur gut etabliert ist, gibt es jedoch signifikante Unterschiede zwischen erwachsenen und pädiatrischen Patienten in Bezug auf das Herz-Kreislauf-System, das Blutvolumen, die Temperaturregulation und die Reaktion auf einen Schock 2,3,4. Gleichzeitig gibt es Hinweise darauf, dass diese Unterschiede auch für Schweine gelten, und es wurde festgestellt, dass Ferkel kardiovaskuläre, zerebrovaskuläre, hämatologische und Elektrolytprofile aufweisen, die denen von pädiatrischen menschlichen Patienten sehr ähnlich sind 9,25. Abgesehen von diesen anatomischen und physiologischen Unterschieden zwischen Erwachsenen und Säuglingen bei beiden Spezies bietet die Verwendung von Säuglingstiermodellen, insbesondere von Minischweinen, die Möglichkeit, die gleichen Geräte zu testen, die in der realen klinischen Umgebung zur Überwachung verwendet werden. In vielen Fällen hat sich die Zuverlässigkeit dieser Geräte aufgrund einer einfachen Anpassung der erwachsenen Algorithmen, Sensoren oder Waagen als gering erwiesen. All diese Aspekte unterstreichen die Bedeutung der Entwicklung spezifischer pädiatrischer Tiermodelle und ihre Relevanz in Bezug auf den translationalen Nutzen für das pädiatrische klinische Umfeld.
Neben der Art des Tieres gibt es drei grundlegende Modelle, die im Allgemeinen bei der Untersuchung des hämorrhagischen Schocks verwendet werden: kontrollierte Blutung - entweder durch Volumen oder Druck - und unkontrollierte Blutung. Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll beschreibt ein Blutungsmodell mit festem Volumen, bei dem ein festes Blutvolumen, das in der Regel durch den Prozentsatz des Körpergewichts berechnet wird, über einen vom Beobachter festgelegten Zeitraum entfernt wird. Im Gegensatz dazu werden die Tiere in Blutungsmodellen mit festem Druck auf einen vorgegebenen MAP-Wert ausgeblutet, der dann mit regelmäßigen Blutungen oder Flüssigkeitsinfusionen während eines bestimmten Zeitraums aufrechterhalten wird, abhängig von der Tierart und dem Grad oder dem Ergebnis des Schocks. Sowohl hämorrhagische Schockmodelle mit festem Volumen als auch mit festem Druck ermöglichen die Untersuchung schockinduzierter pathophysiologischer Veränderungen unter kontrollierten Bedingungen, was einen klaren Vorteil in Bezug auf Reproduzierbarkeit und Standardisierung bietet. Ihre Haupteinschränkung besteht jedoch darin, dass sie es nicht ermöglichen, die Auswirkungen verschiedener Wiederbelebungsstrategien auf aktive Blutungen zu untersuchen, bei denen bekannt ist, dass eine aggressive Flüssigkeitsreanimation vor der chirurgischen Kontrolle der Blutung aufgrund der Hemmung der Bildung des Thrombus und des Anstiegs des mittleren Blutdrucks die Blutung erhöht und das Überleben verringert. Unkontrollierte Blutungsmodelle, die durch ein standardisiertes vaskuläres Trauma - Quetschung/Riss von Leber und Milz, Arterienverletzung oder Amputation eines Anhängsels - induziert werden, wurden vorgeschlagen, um die klinische Situation besser widerzuspiegeln und so ein besseres Verständnis der Auswirkungen verschiedener Flüssigkeitswiederbelebungsstrategien und anderer Interventionen wie Hypothermie und hämostatischer Produkte zu ermöglichen. Obwohl diese unkontrollierten Blutungsmodelle klinisch am relevantesten sind, weisen sie einige klare Nachteile in Bezug auf Standardisierung und Reproduzierbarkeit auf. Angesichts all dessen scheint es, dass das ideale Modell nicht existiert, und daher muss die Forschung auf diesem Gebiet klinische Relevanz mit experimenteller Standardisierung und Zuverlässigkeit in Einklang bringen 6,7,8,9,26.
Das in dieser Studie beschriebene Modell könnte ein breites Anwendungspotenzial in der kardiovaskulären Forschung bieten, wie z.B. die Untersuchung von endothelialen Dysfunktionen und Mikrozirkulationsstörungen18 während des Schocks sowie die Validierung verschiedener hämodynamischer Überwachungssysteme. Darüber hinaus kann es auch in anderen Forschungsbereichen eingesetzt werden, um endokrine oder Immunantworten nach schweren Blutungen sowie die Bestimmung von Nebenwirkungen verschiedener Flüssigkeiten und Vasopressoren zu untersuchen. Im Hinblick auf die Erforschung verschiedener Reanimationsstrategien ist es jedoch ratsam, deren Auswirkungen in unkontrollierten Blutungsmodellen zu untersuchen, bevor Änderungen im klinischen Umfeld vorgenommen werden 7,26.
Neben der Schwierigkeit, die Ergebnisse auf das reale Leben zu übertragen, hat dieses Modell noch weitere Einschränkungen. Zunächst einmal gibt es einige Störvariablen im Zusammenhang mit dem Versuchsaufbau, wie z. B. die Verwendung von Anästhetika oder mechanischer Beatmung, die die physiologischen Reaktionen während des Schocks abschwächen und die Interpretation der Ergebnisse erschweren können. Darüber hinaus können die Stressreaktion der Instrumente auf die Tiere und die Temperaturkontrolle die Makro- und Mikrozirkulation durch verschiedene Mechanismen beeinflussen. Eine weitere wichtige Einschränkung dieses Modells, die mit den experimentellen Notwendigkeiten und der Verfügbarkeit von Ressourcen zusammenhängt, ist der begrenzte posttraumatische Beobachtungszeitraum, der die Untersuchung der Langzeitfolgen eines hämorrhagischen Schocks weiter einschränkt. Darüber hinaus gibt es trotz der physiologischen Ähnlichkeiten zwischen Menschen und Schweinen einige Unterschiede zwischen den Arten, die berücksichtigt werden sollten. Das Gerinnungssystem scheint beispielsweise bei Schweinen effektiver zu sein27,28. Außerdem unterscheiden sich die Laktat- und Succinat-Plasmaspiegel zwischen den Tierarten, und Schweine leiden an basaler Alkalose, was zu einer Unterschätzung der Auswirkungen von Blutungen auf den Säure-Basen-Haushalt führen kann29. Schließlich ist auch bekannt, dass die Entzündungs- und Immunreaktionen sowie einige Vasopressorrezeptoren bei Schweinen unterschiedlich sind9. Auch spezifische Unterschiede zwischen den Tieren müssen als Einflussfaktoren berücksichtigt werden. Mehrere Studien haben auf geschlechtsspezifische Unterschiede in Bezug auf die Schockanfälligkeit hingewiesen, wobei Frauen einen signifikanten Überlebensvorteil gegenüber Männern haben 6,9. Nichtsdestotrotz verwenden wir in den Experimenten, die in dieser Studie durchgeführt werden, Tiere aus der gleichen Altersgruppe und mit einem ähnlichen genetischen Hintergrund, um die potenzielle Variabilität der Arten zu minimieren.
Zusammenfassend bietet dieser Artikel eine praktische Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Einrichtung eines Schweinemodells für den pädiatrischen hämorrhagischen Schock. Im Vergleich zu anderen bestehenden Modellen handelt es sich um ein zuverlässiges und einfach zu befolgendes Protokoll mit breiter Anwendbarkeit in der biomedizinischen Forschung, entweder zur Untersuchung pathophysiologischer Reaktionen nach schweren Blutungen oder zur Bewertung verschiedener Wiederbelebungsstrategien.
Disclosures
Die Autoren dieser Arbeit befinden sich in keinem Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) im Rahmen des Projekts "PI20/01706" finanziert und von der Europäischen Union mitbegründet. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, bei der Datenerhebung und -analyse, bei der Entscheidung zur Veröffentlichung oder bei der Vorbereitung des Manuskripts. Wir möchten uns bei allen Kolleginnen und Kollegen der pädiatrischen Intensivstation Gregorio Marañón und des Versuchsinstituts Gregorio Marañón bedanken, denn ohne ihre Arbeit wäre dieses Projekt nicht möglich gewesen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADA swabs | Albino Dias de Andrade, S.A. | 300575750400 | Non-woven swabs |
| Alaris SE | Carefusion | N/A | Volumetric infusion pump |
| Atracurium | Aspen Pharma Trading Limited. Dublin, Ireland | N/A | Muscle relaxant |
| Atropine 1 mg/mL | B. Braun | 481377/1013 | |
| Barrier adhesive aperture drape | Mölnlycke | 63621 | |
| BD emerald syringe 5 mL, 10 mL, 20 mL | Becton Dickinson S.A | https://www.bd.com/en-eu/offerings/capabilities/syringes-and-needles/injection-syringes/bd-emerald-3-piece-syringe | various options available |
| BLF21A laser doppler monitor | Transonic Systems Inc. | BLF21A | Skin blood flow monitor |
| BlueSensor NF ECG electrodes | Ambu | NF-50-A/12 | |
| Check-Flo performer introducer set 5Fr | Cook Medical | G12018 | Vascular Sheath |
| Datex ohmeda S5 | GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland | M1162897 | Hemodynamic monitor |
| Fentanyl 0.05 mg/mL | Kern Pharma | N/A | Anesthesia |
| GE Vivid S5 | GE Healthcare | S series | Ultrasound machine |
| Introcan Safety 18 G, 22 G, 24 G | B. Braun | Introcan series | Safety intravenous catheter |
| INVOS cerebral/somatic oximetry adult sensors | Medtronic PLC, USA | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry/invos-cerebral-somatic-oximetry-adult-sensors.html | |
| INVOS OXIMETER cerebral/somatic | Somanetics | 08-10566 | Regional oxygenation monitor |
| Ketamin 50 mg/mL | Pfizer, S.L. | 47034 | Sedation |
| Leon plus | Heinen + Löwenstein | N/A | Ventilator |
| Life scope VS | Nihon Kohden | N/A | Bedside monitor |
| Miller laryngoscope blade 12″ | Jorgensen Labs, USA | J0449F | Laryngoscope |
| Multi-lumen central venous catheterization set 7 French, 3 lumen, 30 cm | Arrow | CS-14703 | Central venous catheter |
| Nellcor WarmTouch 5300A | Covidien | Thermal blancket | |
| Nitrile gloves | Medihands | KS-ST RT021 | Single use gloves |
| Pediatric SomaSensor INVOS cerebral/somatic | Covidien | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry.html | Disposable regional oxygen saturation sensor |
| PICCO monitoring kit | Pulsion Medical Systems | PV8215 | |
| PICCO thermodilution catheter 5F/20 cm | Pulsion Medical Systems | N/A | |
| Propofol Lipoven 10 mg/mL | Fresenius Kabi, Spain | N/A | Anesthesia |
| Pulse contour cardiac output (PiCCO2) | Pulsion Medical Systems | N/A | Hemodynamic monitor |
| Rüsch flexislip | Teleflex Medical | 503700 | Endotracheal tube stylet |
| Softa swabs | B. Braun | 19579 | Alcohol pads |
| Surgical silk sutures USP 0 | Aragó, Barcelona, Spain. | 6245 | |
| TruWave pressure monitoring set | Edwards | T001767A | Pressure monitoring set |
| Ultrasound transmission gel | Ultragel Hungary 2000 Kft. | UC260 |
References
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