Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

فحص بيولوجيا الدهون البيج والتمثيل الغذائي باستخدام نظام تنشيط CRISPR SunTag-p65-HSF1

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64849
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Obesity and Comorbidities Research Center, State University of Campinas, 2Department of Structural and Functional Biology, Institute of Biology, State University of Campinas
* These authors contributed equally

Summary

يقدم هذا البروتوكول استخدام CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) في الخلايا الشحمية (AdipoSPH) كاستراتيجية بديلة للفيروس المرتبط بالغدي (AAV) للتحقيق في بيولوجيا الدهون البيج. الحقن في الجسم الحي من sgRNA الحامل ل AAV الذي يستهدف جين Prdm16 الداخلي يكفي للحث على نمو الدهون البيج وتعزيز برنامج الجينات الحرارية.

Abstract

وقد أدت تقنية التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (كريسبر) إلى ثورة في علم الأحياء، وتم تطبيق الأدوات الحديثة إلى ما هو أبعد من التحرير الجيني الموصوف أصلا. يجمع نظام تنشيط كريسبر (CRISPRa) بين بروتين Cas9 (dCas9) غير النشط تحفيزيا مع وحدات نسخ مميزة للحث على التعبير الجيني الداخلي. SunTag-p65-HSF1 (SPH) هي تقنية CRISPRa تم تطويرها مؤخرا تجمع بين مكونات وسطاء التنشيط التآزري (SAMs) مع منشطات SunTag. يسمح هذا النظام بالإفراط في التعبير عن الجينات المفردة أو المتعددة من خلال تصميم RNA أحادي التوجيه مخصص (sgRNA). في هذه الدراسة ، تم استخدام فأر SPH تم تطويره مسبقا لتوليد فأر شرطي يعبر عن SPH في الخلايا الشحمية (سلالة adiponectin Cre) ، المسماة AdipoSPH. للحث على النمط الظاهري للدهون البيضاء إلى البيج (البني) ، تم حقن فيروس مرتبط بالغدي (AAV) يحمل sgRNA يستهدف جين Prdm16 الداخلي (عامل نسخ راسخ يتعلق بتطور الدهون البنية والبيج) في الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (iWAT). حفز نموذج الفأر هذا التعبير عن Prdm16 الداخلي المنشأ ونشط برنامج الجينات الحرارية. علاوة على ذلك ، أدى التعبير المفرط ل Prdm16 الناجم عن SPH في المختبر إلى تعزيز استهلاك الأكسجين للخلايا الشحمية البيج ، مما أدى إلى نسخ نتائج نموذج الفئران المعدلة وراثيا Prdm16 السابق. وبالتالي ، يصف هذا البروتوكول نموذج ماوس متعدد الاستخدامات وفعال من حيث التكلفة وفعال من حيث الوقت للتحقيق في بيولوجيا الأنسجة الدهنية.

Introduction

الخلايا الشحمية البيج (أو البريتي) هي خلايا دهنية تفصل عن البروتين 1 (UCP1) والخلايا الشحمية الغنية بالميتوكوندريا الموجودة داخل مستودعات الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT). تظهر الدهون البيج من مجموعة فرعية من أسلاف الخلايا الشحمية أو الخلايا الشحمية البيضاء الناضجة استجابة للتعرض للبرد والمحفزات الأخرى 1,2. يمكن للخلايا الشحمية البيج تحويل الطاقة إلى حرارة بطريقة تعتمد على UCP1 أو مستقلة3. بغض النظر عن وظيفتها الحرارية ، يمكن للدهون البيج أيضا تحسين صحة التمثيل الغذائي بوسائل أخرى ، مثل إفراز الأديبوكينات والأنشطة المضادة للالتهابات والمضادة للتليف. أظهرت الدراسات التي أجريت على الفئران والبشر أن تحريض الدهون البيج يحسن توازن الجلوكوز والدهون في الجسمبالكامل 3. ومع ذلك ، على الرغم من أن معرفتنا ببيولوجيا الدهون البيج قد تطورت بسرعة في السنوات الأخيرة ، إلا أن معظم فوائدها الأيضية والآليات ذات الصلة لا تزال غير مفهومة تماما.

تم وصف التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) لأول مرة في الخلايا حقيقية النواة كأداة قادرة على توليد فاصل مزدوج الخيوط (DSB) في موقع معين في الجينوم من خلال نشاط النيوكلياز لبروتين Cas9 4,5. يتم توجيه Cas9 بواسطة الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه الاصطناعي (sgRNA) لاستهداف منطقة جينومية معينة ، مما يؤدي إلى DSB الحمض النووي. بالإضافة إلى استخدام النيوكلياز Cas9 لأغراض التحرير ، تطورت تقنية CRISPR-Cas9 لاستخدامها كأداة لتنظيم الجينات الخاصة بالتسلسل6. أدى تطوير بروتين Cas9 غير نشط تحفيزيا (dCas9) وربط وحدات النسخ القادرة على تعزيز التعبير الجيني إلى ظهور أدوات تنشيط كريسبر (CRISPRa). ظهرت العديد من أنظمة CRISPRa ، مثل VP647,8 ، وسيط التنشيط التآزري (SAM) 9 ، SunTag10,11 ، VPR12,13 ، و SunTag-p65-HSF1 (SPH) 14 ، والتي تجمع بين مكونات منشطات SAM و SunTag. لقد ثبت مؤخرا أن التعبير المستحث للجينات العصبية في الخلايا العصبية N2a والخلايا النجمية الأولية أعلى باستخدام SPH مقارنة بأنظمة CRISPRa الأخرى14 ، مما يدل على SPH كأداة CRISPRa واعدة.

هنا ، استفدنا من ماوس SPH14 الذي تم تطويره مسبقا لإنشاء نموذج فأر شرطي يعبر عن SPH على وجه التحديد في الخلايا الشحمية باستخدام سلالة adiponectin Cre (AdipoSPH). باستخدام فيروس مرتبط بالغدي (AAV) يحمل gRNA يستهدف جين Prdm16 الداخلي ، تم تحفيز اللون البني (التحويل الأبيض إلى البيج) من WAT الإربي (iWAT) لزيادة التعبير عن برنامج الجينات الحرارية. علاوة على ذلك ، في المختبر Prdm16 التعبير المفرط عزز استهلاك الأكسجين. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول نموذج ماوس SPH متعدد الاستخدامات لاستكشاف آليات تطور الدهون البيج داخل الأنسجة الدهنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء الدراسات على الحيوانات وفقا لدليل جامعة كامبيناس لرعاية واستخدام المختبر (بروتوكول CEUA # 5810-1 / 2021).

1. الاستنساخ الجزيئي

  1. تصميم الحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNAs)
    1. صمم sgRNAs لتنشيط كريسبر باستخدام CHOP ، المتوفرة في https://chopchop.cbu.uib.no/ ، أو أي أداة أخرى مناسبة. استخدم المعلمات التالية لتصميم sgRNA الذي يستهدف جين Prdm16: الهدف: Prdm16; في: العضلات العضلية. باستخدام: كريسبر / كاس 9 ؛ من أجل: التنشيط.
      ملاحظة: صمم sgRNAs لكل منطقة ذات أهمية موزعة على منطقة موقع بدء النسخ المنبع (TSS) 200 نقطة أساس. على سبيل المثال ، فإن sgRNA الذي يستهدف Prdm16 المستخدم في هذه الدراسة يربط 154 نقطة أساس في المنبع من TSS.
    2. أضف الأجزاء المتدلية إلى sgRNA لمطابقة موقع تقييد SacI في العمود الفقري المتجه pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (انظر جدول المواد). تشمل: 5'- (N20) AGCT-3' (N = النيوكليوتيدات). على سبيل المثال ، التسلسل الذي يستهدف جين Prdm16 هو 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3 '، ومع النتوءات هو 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
    3. احصل على تسلسل المكمل العكسي sgRNA 3 'باستخدام الأداة المتاحة في https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. على سبيل المثال ، تسلسل sgRNA 3 'الذي يستهدف جين Prdm16 هو 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
  2. تلدين قليل النيوكليوتيدات التكميلية التي تقطعت بها السبل
    1. أضف 1 ميكرولتر من كل قليل النوكليوتيد أحادي الجديلة 5 'و 3' (تركيز المخزون: 100 ميكرومتر) ، 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت T4 ligase ، 0.5 ميكرولتر من T4 polynucleotide kinase (PNK) (1 × 104 وحدات / مل) ، و 6.5 ميكرولتر من H2O إلى حجم تفاعل نهائي يبلغ 10 ميكرولتر. قم بتلدين قليل النيوكليوتيدات التكميلية أحادية الشريط باستخدام جهاز تدوير حراري في ظل الظروف التالية: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، يليها معدل انحدار يبلغ 5 درجات مئوية / دقيقة.
      ملاحظة: يتم تزويد إنزيم PNK بمخزن PNK المؤقت ولا يحتوي على ما يكفي من ATP المطلوب لتفاعل الفسفرة (انظر جدول المواد). لتبسيط التفاعل ، استخدم المخزن المؤقت T4 ligase (بدلا من المخزن المؤقت PNK). يوفر المخزن المؤقت T4 ligase الكمية المناسبة (1 mM ATP) من الفوسفات لتفاعل الفسفرة. يوفر إنزيم PNK فسفرة نهاية 5 بوصات من قليل النيوكليوتيدات لتفاعل الربط اللاحق.
  3. ربط قليل النيوكليوتيدات sgRNA الملدن
    1. أضف 25 نانوغرام من البلازميد pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry إلى 2 ميكرولتر من قليل النيوكليوتيدات sgRNA الملدن ، 1 ميكرولتر من إنزيم SacI ، 2 ميكرولتر من 10x T4 DNA ligase buffer ، 1 μL من T4 DNA ligase (1-3 u / μL) (انظر جدول المواد) ، و H2O إلى حجم تفاعل نهائي يبلغ 10 ميكرولتر.
    2. قم بإجراء الربط عن طريق احتضان خليط التفاعل باستخدام جهاز تدوير حراري في ظل الظروف التالية: 15 دورة من 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، تليها الاحتفاظ عند 4 درجات مئوية.
  4. التحول متبوعا بتفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة (PCR)
    1. تحويل خلايا الإشريكية القولونية DH10B المختصة (انظر جدول المواد) مع 4 ميكرولتر من منتج الربط باستخدام صدمة حرارية (42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية) ونشرها على صفيحة أجار تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
    2. قم بتأكيد المستعمرات المحولة بواسطة مستعمرة PCR باستخدام مزيج PCR الرئيسي (انظر جدول المواد). اختر المستعمرة واخلطها مع 5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي ، و 0.1 ميكرولتر من التمهيدي العالمي (تركيز المخزون: 100 ميكرومتر) ، و 0.1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي sgRNA (تركيز المخزون: 100 ميكرومتر) (الجدول 1) ، و 5 ميكرولتر من H2O. قم بتشغيل PCR باستخدام جهاز تدوير حراري في ظل الظروف التالية: تمسخ أولي (94 درجة مئوية لمدة دقيقتين) ، تليها 35 دورة من التمسخ (94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية) ، والتلدين (60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) ، والتمديد (72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) ، وخطوة استطالة نهائية (72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق). حل الحمض النووي باستخدام الأغاروز (1.5٪) هلام الكهربائي في 0.5x TAE العازلة عند 90 فولت لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: تعطي الحيوانات المستنسخة الإيجابية نطاقا من ~ 280 نقطة أساس.
    3. إرسال عينات إيجابية لتسلسل سانجر باستخدام التمهيدي العالمي (الجدول 1 ، الملف التكميلي 1).
  5. تنقية البلازميد
    1. قم بتنقية البلازميد من استنساخ إيجابي باستخدام مجموعة تنقية البلازميد (انظر جدول المواد) ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: تنقية البلازميد باستخدام راتنج تبادل الأنيون أو مجموعة أخرى مناسبة للاستخدام في نقل الخلايا.
    2. احتضان المستنسخ الإيجابي (12 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 200 دورة في الدقيقة) باستخدام وسط نمو بكتيري قياسي يحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
    3. الطرد المركزي للخلايا البكتيرية عند 6000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اتبع الخطوات التالية وفقا لتعليمات مجموعة أدوات الشركة المصنعة.

2. تغليف AAV

ملاحظة: تم تنفيذ تغليف AAV وفقا للمنشورات السابقة15,16 مع تعديلات طفيفة.

  1. لوحة 293T الخلايا (انظر جدول المواد) في قارورة 175 سم2 (بذر 5 × 106 خلايا لكل قارورة) باستخدام 25 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S). احتضان في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO2 ، و 95 ٪ الرطوبة حتى تصل الخلايا إلى التقاء 50 ٪ -70 ٪.
  2. امزج 14 ميكرولتر من البولي إيثيلين إنيمين (1 ميكروغرام / ميكرولتر) مع 1 مل من 150 مللي متر كلوريد الصوديوم. امزج البلازميدات الثلاثة المطلوبة لإنتاج AAV بنسبة مولية 1: 1: 1 (أي 17.7 ميكروغرام من pAdDeltaF6 ، 7.9 ميكروغرام من AAV2 / 8 (انظر جدول المواد) ، و 5.9 ميكروغرام من sgRNA المستنسخ من الخطوة 1 في 1 مل من 150 mM NaCl. نقل بولي إيثيلينيمين: خليط كلوريد الصوديوم قطرة قطرة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الحمض النووي (خليط من البلازميدات) واحتضانه لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: pAdDeltaF6 هو بلازميد مساعد و pCapsid pAAV2 / 8 عبارة عن بلازميد تغليف يعبر عن جينات النسخ المتماثل (Rep) و Capsid (cap). كل من البلازميدات ضرورية لإنتاج AAV.
  3. قبل النقل، استبدل وسط نمو الخلايا ب 18 مل من DMEM تحتوي على 1٪ FBS و L-alanyl-L-glutamine (0.5 جم / لتر). أضف 2 مل من بولي إيثيلينيمين: خليط الحمض النووي إلى كل دورق مزرعة واحتضان الخلايا في حاضنة CO 2 (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة).
  4. بعد 5 ساعات، أضف 5 مل من DMEM المكمل ب 10٪ FBS و L-alanyl-L-glutamine (0.5 جم / لتر).
  5. بعد 3 أيام من الحضانة ، افصل الخلايا عن قارورة الثقافة باستخدام مكشطة خلوية. اجمع الخلايا التائية 293 من 10 (175 سم2) قوارير زراعة الخلايا في أنابيب مخروطية سعة 50 مل وأضف DMEM (انظر جدول المواد) حتى 30 مل.
  6. أضف 3 مل من الكلوروفورم إلى كل أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على خلايا 293T واخلطه باستخدام خلاط دوامة بسرعة عالية لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا بإضافة 7.6 مل من 5 M NaCl والدوامة لفترة وجيزة. جهاز طرد مركزي عند 3000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. انقل الطور المائي إلى أنبوب مخروطي جديد وأضف 9.4 مل من 50٪ (v / v) من البولي إيثيلين جلايكول (PEG) 8000. تخلط مع خلاط دوامة بسرعة عالية لمدة 10 ثوان ووضع العينات على الجليد لمدة 1 ساعة.
  8. جهاز طرد مركزي عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية واترك الحبيبات تجف لمدة 10 دقائق.
  9. أضف 1.4 مل من HEPES (50 مللي مول ، درجة الحموضة 8) واخلطها لمدة 5 دقائق باستخدام خلاط دوامة بسرعة عالية. أضف 3.5 ميكرولتر من 1 M MgCl2 ، و 14 ميكرولتر من DNase I (20 وحدة / ميكرولتر) ، و 1.4 ميكرولتر من RNase A (10 ميكروغرام / ميكرولتر). احتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم نقل العينات إلى أنابيب جديدة 1.5 مل (700 ميكرولتر في كل أنبوب).
  10. أضف 700 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل أنبوب سعة 1.5 مل واخلطه باستخدام خلاط دوامة بسرعة عالية لمدة 10 ثوان. جهاز طرد مركزي عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد. كرر هذه الخطوة 3x.
  11. تبخر الكلوروفورم لمدة 30 دقيقة في خزانة السلامة الحيوية. بعد ذلك ، انقل 300 ميكرولتر من الطور المائي إلى أنبوب طرد مركزي فائق 0.5 مل (انظر جدول المواد). أدر الفلتر على حرارة 14000 × جم على حرارة 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة التدفق من خلال تدوير المرشح مرة أخرى حتى يمر مستوى الصوت بالكامل عبر الفلتر.
  12. اغسل الفلتر بإضافة 300 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) واخلط المحاليل عن طريق الماصة. جهاز طرد مركزي الفلتر لمدة 5 دقائق عند 14000 × جم عند 25 درجة مئوية. كرر خطوة الغسيل هذه 4x.
  13. جهاز طرد مركزي المرشح لمدة 8 دقائق عند 14000 × جم عند 25 درجة مئوية. ضع المرشح رأسا على عقب في أنبوب جديد ، وقم بتدويره لمدة دقيقتين عند 1000 × جم عند 25 درجة مئوية.

3. معايرة AAV بواسطة qPCR

  1. قم بإعداد منحنى قياسي لمعايرة AAV وحدد عيار AAV وفقا للدراسة الأصلية التي أجراها Fripont et al.15.

4. الحقن في الجسم الحي من AAV في الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (iWAT)

  1. افصل بين الأدوات والمستلزمات الجراحية اللازمة للجراحة وقم بتعقيمها على النحو الموصى به لكل مادة محددة.
  2. تخدير الفأر ب 100 مغ/كغ من الكيتامين و10 ملغ/كغ من الزيلازين عن طريق الحقن داخل الصفاق. تأكيد التخدير عن طريق الضغط القوي على المخلب والذيل والتحقق من وجود رد فعل. ضع مرهما على عيون الفأر لتجنب جفاف العين أثناء الجراحة.
  3. ضع الفأر المخدر في وضع الاستلقاء واحلق مساحة صغيرة على الأجنحة ، بالقرب من مفاصل الورك لحقن iWAT ، باستخدام ماكينة حلاقة. ضع كريم مزيل الشعر لمدة 5 دقائق. إزالة كريم المتبقية بالماء لتجنب حرق الجلد.
  4. تطهير الجلد باستخدام ثلاث جولات بالتناوب من تطبيق محلول مطهر (بوفيدون اليود) على الجلد بشاش نظيف وكحول 70٪. تخلص من الشاش بعد كل استخدام.
  5. أداء التطبيق النهائي لمحلول مطهر على الجلد. بعد ذلك ، قم بعمل شق 1-2 سم بمقص معقم في المنطقة القريبة من المفاصل ، وأمسك الجلد مفتوحا باستخدام ملقط لفضح مستودع الدهون. يمكن العثور على WAT متصلا بالجلد على كلا الجانبين ، ويمتد من البداية على الظهر ولأسفل باتجاه الخصية.
    ملاحظة: استخدم الستائر لتجنب التلوث أثناء الجراحة أو إجراءات الخياطة.
  6. باستخدام الملقط ، من خلال الشق ، اسحب مستودع الدهون برفق لأعلى للتأكد من أن الحقن في الموقع والعمق الصحيحين.
    ملاحظة: احرص على عدم إزالة الأنسجة من موقعها الأصلي.
  7. املأ حقنة الميكرولتر (المقياس: 33 ؛ نمط النقطة: 4 ؛ الزاوية: 12 ؛ الطول: 10) (انظر جدول المواد) ب 2.5 ميكرولتر (5.6 × 1010 جينومات فيروسية [VG] / μL) من AAV (تحتوي على sgRNA الذي يستهدف جين Prdm16 الداخلي). أدخل الإبرة بعناية بزاوية 30 درجة -45 درجة في iWAT. كرر الحقن 5x في مواقع مختلفة من الأنسجة لإصابة وسادة الدهون iWAT بأكملها بشكل متجانس. يوصى بحجم إجمالي قدره 15 ميكرولتر لإصابة iWAT.
    ملاحظة: يعتمد عمق إدخال المحقنة على سمك رواسب وسادة الدهون. استخدم تقنية عدم اللمس لسحب الحقن.
  8. أغلق شق الجلد المحلوق باستخدام خيوط 4/0 خيوط أحادية الشعيرات. ضع الماوس على وسادة حرارية حتى يتم استعادة الوعي. راقب الحيوان كل 10-15 دقيقة حتى يتعافى تماما. بعد أن يستعيد الحيوان وعيه ، لاحظ التنميط الحركي ، والذي يجب أن يكون خطيا وليس له أي علامات على الضيق أو الألم.
  9. يجب إجراء السيطرة على الألم بعد العملية الجراحية في غضون 48 ساعة بعد الجراحة عن طريق تطبيق ترامادول هيدروكلوريد (5 ملغ/كغ) داخل الصفاق لمدة 3 أيام (2x/يوم).
    ملاحظة: راقب علامات الضيق وعدم الراحة وراقب تناول الماء والطعام. إعطاء جرعة فعالة من المسكن بطريقة وقائية ، ويفضل قبل أو في بداية الجراحة.
  10. احتفظ بالماوس في قفص مع حرية الوصول إلى الطعام والماء خلال فترة الشفاء. بعد فترة الشفاء ، انتقل إلى القتل الرحيم للماوس. في هذه الدراسة ، تم إجراء القتل الرحيم بجرعة زائدة من التخدير عن طريق الحقن (داخل الصفاق) من 3 أضعاف الجرعة المحفزة (300-360 مجم / كجم هيدروكلوريد الكيتامين + 30-40 مجم / كجم زيلازين هيدروكلوريد) متبوعة بقطع الرأس.
    ملاحظة: يوصى بشدة بإبقاء الحيوانات في أقفاص فردية حتى تتعافى تماما من التخدير.

5. في المختبر تمايز الخلايا الوعائية اللحمية (SVFs) إلى الخلايا الشحمية البيج

  1. إجراء عزل وطلاء SVFs الأولية من iWAT لفئران AdipoSPH وفقا ل Aune et al.17. بذور SVFs المشتقة من فئران AdipoSPH iWAT في صفيحة ذات 6 آبار تحتوي على وسط كامل (DMEM يحتوي على 3.1 جم / لتر جلوكوز ، 0.5 جم / لتر L-alanyl-L-glutamine ، 10٪ FBS ، و 2.5٪ P / S) لمدة 1-2 ساعة.
    ملاحظة: يحتوي جزء SVF على خليط من أنواع الخلايا المختلفة. في هذه الخطوة ، لا يمكن تحديد عدد الخلايا السلفية المصنفة التي تؤدي إلى ظهور الخلايا الشحمية.
  2. نضح الوسط ، واغسل البئر 2x باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) ، واستبدله بوسط كامل طازج. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -80٪.
  3. تحفيز التمايز (اليوم 0) عن طريق معالجة الخلايا بوسط الحث (الجدول 2).
    ملاحظة: كوكتيل الدواء من وسط الحث ضروري لتعزيز تمايز الخلايا الشحمية البيج وللتعبير عن برنامج الجينات الحرارية17.
  4. بعد يومين (اليوم الثاني) ، استبدل وسيط الحث بوسط الصيانة (الجدول 2).
  5. بعد يومين (اليوم 4) ، استبدل وسيط الصيانة بوسيط صيانة جديد (الجدول 2) لمدة يومين إلى 3 أيام.
  6. قم بتغيير وسط الصيانة كل 48 ساعة حتى يتم تمييز الخلايا السابقة تماما إلى خلايا دهنية (عادة بعد 6 أيام من إضافة وسط الحث). يمكن ملاحظة الخلايا الشحمية الناضجة باستخدام الفحص المجهري الضوئي ، حيث يبدو أن الخلايا المتمايزة محملة بقطرات الدهون.

6. في المختبر عدوى AAV من SVFs

ملاحظة: أصيبت SVFs المشتقة من فئران AdipoSPH iWAT ب sgRNA-Prdm16 الحامل ل AAV كما وصفه سابقا Wang et al.18 مع بعض التعديلات.

  1. قم بزراعة الخلايا على صفيحة استزراع مكونة من 6 آبار بوسط كامل حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -80٪ ، كما هو موضح سابقا في الخطوات 5.1-5.3.
  2. امزج 5.6 × 1010 VG / μL من sgRNA-Prdm16 الحامل ل AAV مع 2 مل من بروميد الوسيط الكامل وسداساديثرين (8 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد). قم بتحويل الخلايا عن طريق استبدال الوسط الكامل وإضافة الوسط الكامل الذي يحتوي على AAV. احتضان الخلايا المحولة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية ، رطوبة 95٪ ، و 5٪ CO2.
  3. قم بتقسيم الخلايا وزرعها كما هو موضح في الخطوة 5 لتكاثر الخلايا والتمايز إلى خلايا دهنية بيج.
    ملاحظة: بالنسبة لفحص استهلاك الأكسجين ، البذور 4.0 × 104 خلايا (من الخطوة 6.2) لكل بئر مع وسط الحث في لوحة زراعة الخلايا 24 بئرا. يتم تنفيذ الخطوات اللاحقة لتكاثر الخلايا والتمايز كما هو موضح في الخطوة 5. يتم إجراء فحص استهلاك الأكسجين عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ -100٪ وتكون متمايزة تماما ، كما ورد سابقا19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تطوير فئران AdipoSPH عن طريق تربية سلالات الفئران SPH و Adipoq-Cre. كانت كلتا سلالتي الماوس في خلفية C57BL6J-DBA / 2J هجينة (وفقا للمورد التجاري ؛ انظر جدول المواد). تم وصف سلالة فأر SPH في الأصل بواسطة Zhou et al.14.

في الجسم الحي تطور الخلايا الشحمية البيج من خلال التعبير المفرط بوساطة AdipoSPH Prdm16
لتقييم قدرة النموذج الموصوف في هذه الدراسة على تطوير الخلايا الشحمية البيج في الجسم الحي ، تم حقن AAV الذي يحمل جين sgRNA الذي يستهدف Prdm16 في iWAT لفئران AdipoSPH. Prdm16 هو عامل نسخ راسخ يحدد تطور الخلايا الشحمية البيج ووظيفتها20,21. من المهم الإشارة إلى أننا اخترنا هنا sgRNA الذي تم اختباره مسبقا والتحقق من صحته والذي يستهدف جين Prdm16 الداخلي14. تم استخدام AAV الذي يحمل sgRNA فارغا كعنصر تحكم. في 10 أيام بعد حقن AAV ، تم حصاد iWAT لتحليل التعبير النسيجي والجيني (الشكل 1 أ). كما هو متوقع ، أظهرت صور التألق المناعي ل iWAT من فئران AdipoSPH التعبير عن dCas9 في كل من المجموعة الضابطة و Prdm16 (الشكل 1B). بالإضافة إلى ذلك ، أكد تعبير mCherry نجاح عدوى AAV من iWAT في كل من المجموعة الضابطة و Prdm16 (الشكل 1 ب). من الواضح أن تعبير Prdm16 الناجم عن SPH قد تسبب في تراكم واسع النطاق للخلايا الشحمية البيج متعددة الخلايا في iWAT (الشكل 1B). علاوة على ذلك ، كشف تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) عن زيادة التعبير عن Prdm16 وبرنامج الجينات الحرارية (Ucp1 و Cox8b و Ppargc1a و Cidea) في مجموعة Prdm16 مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 1C).

تعزيز تطوير الخلايا الشحمية البيج وتعزيز استهلاك الأكسجين في المختبر عن طريق التعبير المفرط بوساطة AdipoSPH Prdm16
بعد ذلك ، تم التحقيق في مدى ملاءمة هذا النموذج لدراسة بيولوجيا الخلايا الشحمية البيج في المختبر . تحقيقا لهذه الغاية ، تم تحويل الخلايا preadipocytes المشتقة من iWAT من الفئران AdipoSPH مع AAV تحمل تسلسل sgRNA الذي يستهدف Prdm16. في سبعة أيام بعد التمايز ، تم استخدام الخلايا الشحمية البيج لتحليل التعبير الجيني واستهلاك الأكسجين (الشكل 2 أ). تم استخدام sgRNA الفارغ كعنصر تحكم. تجدر الإشارة إلى أن إزالة كودون STOP بواسطة CRE recombinase وتفعيل آلية SPH كانت تحت سيطرة مروج / محسن الأديبونيكتين ، مما أدى إلى تنشيط جين Prdm16 الداخلي في الخلايا الشحمية الناضجة. أكد تحليل التعبير الجيني زيادة التعبير عن جين Prdm16 الداخلي والجينات الحرارية في مجموعة التعبير المفرط Prdm16 مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 2B). للتأكد من أن الخلايا الشحمية البيج التي يسببها SPH كانت مولدة للحرارة وظيفيا ، تم إجراء اختبار قياس التنفس عالي الدقة على الخلايا الشحمية الأولية. تم إجراء تحليل بيانات قياس التنفس وتفسيرها كما هو موضح مؤخرا22. أدى تعبير Prdm16 الناجم عن SPH إلى استهلاك أكسجين قاعدي وأقصى من ذلك الموجود في الخلايا الضابطة (الشكل 2C). الأهم من ذلك ، أشارت البيانات إلى تعزيز التنفس غير المنفصل (قليل الحساسية للأوليغوميسين) في مجموعة Prdm16 مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 2C ، الجدول 3). مجتمعة ، كشفت هذه النتائج أن التعبير الناجم عن SPH ل Prdm16 الداخلي يلخص النمط الظاهري البني ويعزز معدلات استهلاك الأكسجين التي لوحظت في الفئران التقليدية Prdm16 Tg.

Figure 1
الشكل 1: تطور الدهون البيج عن طريق حقن الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) الذي يستهدف جين Prdm16 الداخلي في الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (iWAT) لفئران AdipoSPH. (أ) رسم تخطيطي للتصميم التجريبي للخلايا الشحمية باللون البيج في الجسم الحي (تم إنشاؤه باستخدام Biorender.com). (ب) الصور النسيجية (تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين [H&E]) ل iWAT. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ج) تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) ل Prdm16 والجينات الحرارية (Ucp1 و Cox8b و Ppargc1α و Cidea ؛ ن = 3). يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM. * p < 0.05 ؛ ** p < 0.01 ل Prdm16 مقابل التحكم (CTR) بواسطة اختبار t للطالب غير المقترن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تمايز الخلايا الشحمية البيج الناجم عن SPH بواسطة التعبير المفرط Prdm16. (أ) رسم تخطيطي للتصميم التجريبي للخلايا الشحمية باللون البيج في المختبر (تم إنشاؤه باستخدام Biorender.com). (ب) التعبير الجيني النسبي ل Prdm16 والجينات الحرارية (Ucp1 و Cox8b و Ppargc1α و Cidea ؛ ن = 3). (ج) معدل استهلاك الأكسجين (OCR) ، ن = 6. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM. * p < 0.05 ؛ ** ص < 0.01 ؛ p < 0.001 ل Prdm16 مقابل التحكم (CTR) بواسطة (B) اختبار t للطالب غير المزاوج و (C) المقاييس المتكررة ثنائية الاتجاه ANOVA ، متبوعا باختبار Tukey. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: تسلسل سانجر ل Prdm16 sgRNA. (أ) رسم تخطيطي يوضح محاذاة قليل النيوكليوتيدات Prdm16 التكميلية أحادية الشريط. (ب) تسلسل سانجر ل Prdm16 sgRNA باستخدام التمهيدي العام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجين جنس أمامي عكس
تعبير جيني بردم16 فأر CAGCACGGTGAAGCCATTC GCGTGCATCCGCTTGTG
يو سي بي 1 فأر TCTCAGCCGGCTTAATGACTG GGCTTGCATTCTGACCTTCAC
Ppargc1a فأر AGCCGTGACCACTGACAACGAG GCTGCATGGTTCTGAGTGCTAAG
كوكس 8 ب فأر GAACCATGAAGCCAACGACT GCGAAGTTCACAGTGGTTCC
سيديا فأر ATCACAACTGGCCTGGTTACG TACTACCCGGTGTCCATTTCT
36 ب 4 فأر TCCAGGCTTTGGGCATCA CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA
الاستنساخ الجزيئي تسلسل sgRNA Prdm16 فأر CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG CCCCTTTTCAGCGCAGCTCG
التمهيدي العالمي فأر GAGGGCCTATTTCCC
ATGATTCCTTCATAT

الجدول 1: تسلسل التمهيدي المستخدم في الدراسة.

متوسط تكوين
وسيط كامل وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع L-Glutamine
10٪ من مصل بقري الجنين (FBS)
2.5٪ من البنسلين / الستربتومايسين
الوسط التعريفي وسيط كامل
الإندوميتاسين ، التركيز النهائي 125 ميكرومتر (0.125 مليون مخزون في الإيثانول). ملاحظة: يجب تسخين الإندوميتاسين إلى 90 درجة مئوية لمدة 10 ثوان حتى يذوب.
الأنسولين ، التركيز النهائي 20 نانومتر (1 ملليمتر مخزون ، أضف 1 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك للذوبان (5.73 مجم / مل). يخزن المخزون في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
ديكساميثازون، التركيز النهائي 2 ميكروغرام/مل (2 ملغم/مل في الإيثانول)
3-إيزوبوتيل-1-ميثيل زانثين (IBMX) ، التركيز النهائي 500 ميكرومتر (0.25 م مخزون في 0.5 م KOH)
3،3 '، 5-Triiodo-L-thyronine (T3) ، التركيز النهائي 1 نانومتر (مخزون 10 ميكرومتر ، قم بإذابة T3 في 1 M HCl و EtOH 1: 4 إلى المخزون).
روزيجليتازون، التركيز النهائي 1 ميكروغرام/مل (مخزون 1 ملغم/مل في الإيثانول)
وسيط الصيانة وسيط كامل
الأنسولين ، التركيز النهائي 20 نانومتر (1 مليمتر الأسهم). أضف 1 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك للذوبان (5.73 مجم / مل).
روزيجليتازون، التركيز النهائي 1 ميكروغرام/مل (مخزون 1 ملغم/مل في الإيثانول)

الجدول 2: تكوين الوسائط المستخدمة في الدراسة.

البارامترات الخطر بي آر دي إم 16 القيمة الاحتمالية
لا استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا (pMoles / دقيقة / ميكروغرام البروتين) 8.19 ± 1.40 10.80 ± 1.83 0.01
التنفس القاعدي (بيئات/دقيقة/ميكروغرام) 28.82 ± 5.20 52.58 ± 13.73 0.001
التنفس الأقصى (بوتيل / دقيقة / ميكروغرام بروتين) 63.81 ± 9.80 122.94 ± 22.31 < 0.001
القدرة التنفسية الاحتياطية (بومولات / دقيقة / ميكروغرام بروتين) 34.98 ± 11.09 70.36 ± 26.06 0.006
قليل الحساسية (بوتيل / دقيقة / ميكروغرام بروتين) 8.27 ± 2.29 15.85 ± 5.48 0.005
Oligo الحساسة (pMoles / min / μg protein) 20.54 ± 5.68 36.72 ± 14.79 0.016
كفاءة اقتران 71.28 ± 1.51 69.84 ± 3.05 0.163
خلية RCR 7.70 ± 1.46 7.75 ± 2.43 0.485

الجدول 3: المعلمات التنفسية للخلايا الشحمية البيج التي يسببها SPH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أحد أكثر التطبيقات غير التحريرية المفيدة لتقنية كريسبر هو استجواب وظيفة الجينات من خلال تنشيط الجينات الداخلية باستخدام أنظمة كريسبر6. SPH هو كريسبرا قوي تم وصفه في الأصل للحث على تحويل الخلايا النجمية إلى خلايا عصبية نشطة من خلال استهداف العديد من الجينات العصبية14. في هذه الدراسة ، ثبت أن AdipoSPH أداة مناسبة للتحقيق في بيولوجيا الدهون البيج عن طريق تنشيط التعبير عن Prdm16 الداخلي في الخلايا الشحمية. يؤدي التعبير المفرط ل Prdm16 الناجم عن SPH في الخلايا الشحمية إلى تنشيط برنامج الجينات الحرارية ويحفز النمط الظاهري البني ، مما يؤدي إلى التكاثر الظاهري لنموذج الفئران المعدلة وراثيا (Tg) Prdm16 السابق23. تم اختيار Prdm16 في هذه الدراسة كهدف لتحفيز الخلايا الشحمية البيج بناء على الدور المركزي لعامل النسخ هذا في تنظيم تمايز الدهون البنية والبيج ، بالإضافة إلى تنظيم برنامج الجينات الحرارية (على سبيل المثال ، تعزيز تعبير Ucp1) في الخلايا الشحمية المتمايزة. ومع ذلك ، فإن النموذج الحالي يسمح بالإفراط في التعبير عن أي جين داخلي وفقا لتقدير الباحثين والهدف من الدراسة.

تعتمد النماذج المحورة وراثيا التقليدية التي تبحث في بيولوجيا الأنسجة الدهنية على تطوير القوارض المعدلة وراثيا التي تفرط في التعبير عن جين التحوير تحت سيطرة مروج / محسن يقتصر على الخلايا الشحمية (على سبيل المثال ، Fabp4 أو adiponectin)24. على الرغم من أن التكنولوجيا الحالية قد سرعت وتيرة تطوير هذه النماذج ، إلا أن التكاليف والوقت اللازم لتطويرها لا تزال مشكلة شائعة يعاني منها المجتمع العلمي. في المقابل ، يعد AdipoSPH نموذجا أرخص وأكثر تنوعا لنهج اكتساب الوظيفة من الفئران Tg التقليدية. علاوة على ذلك ، فإن AdipoSPH مناسب تماما لدراسة أشكال الحمض النووي الريبي الطويلة غير المشفرة والأشكال المتماثلة للنسخ ، والتي ليست مناسبة بشكل خاص لنماذج الفئران Tg.

يقدم AdipoSPH أيضا العديد من المزايا في التحقيق في بيولوجيا الأنسجة الدهنية مقارنة بالإدارة البسيطة ل AAV ، وهو نهج بديل حالي لتجارب كسب الوظيفة25. أولا ، يعزز AAV الذي يتم تسليمه إلى الأنسجة الدهنية الإفراط في التعبير عن طريق إدخال عدة نسخ من جين التحوير. في المقابل ، يمثل تنشيط SPH للجينات الداخلية آلية عمل أكثر طبيعية. ثانيا ، عادة ما تؤدي جينات التحوير التي يتم تسليمها بواسطة AAV (باستخدام المروجين التأسيسيين) إلى الإفراط في التعبير عنها في "أي نوع من الخلايا" داخل البيئة المكروية للأنسجة الدهنية. في المقابل ، يقتصر التعبير الناجم عن AdipoSPH للجينات الداخلية على الخلايا الشحمية. ثالثا ، حجم العبوة (~ 4.5 كيلو بايت) هو قيد نموذجي ل AAV لبعض الجيناتالمحورة 26. ومع ذلك ، يتطلب sgRNA الحامل ل AAV استراتيجية استنساخ بسيطة وسهلة ل 20 نيوكليوتيدات مخصصة. أخيرا ، تصل إدارة AAV عادة إلى الدورة الدموية الجهازية وتصيب الأنسجة والأعضاء الأخرى. على الرغم من أن بعض AAVs تحتوي على microRNAs للتخفيف من التعبير عن الجينات المحورة في أنسجة معينة ، مثل الكبد والقلب25 ، إلا أن هذه الاستراتيجية لا يمكن أن تمنع عدوى AAV في الأنسجة والأعضاء الأخرى. في المقابل ، يقتصر التعبير الناجم عن AdipoSPH للجينات الداخلية على الخلايا الشحمية ، حتى مع الأخذ في الاعتبار بعض تسرب AAV إلى الدورة الدموية الجهازية. وبالتالي ، فإن AdipoSPH هو أيضا نموذج مناسب للإدارة الجهازية ل sgRNA الحامل ل AAV والتحقيق في تنظيم الأنسجة الدهنية لتوازن طاقة الجسم بالكامل.

على الرغم من أن نموذج AdipoSPH يوفر بعض المزايا ، إلا أن له قيودا مهمة يجب مراعاتها. AAV هو حاليا النظام الأساسي الأكثر شيوعا لتسليم sgRNA في الجسم الحي. ومع ذلك ، لا تزال بعض التحديات في تصنيع AAV والقضايا المناعية دون حل26,27. علاوة على ذلك ، تؤدي الكميات والتوزيعات المختلفة لحقن AAV في جميع أنحاء الأنسجة الدهنية إلى تباين التعبير الجيني داخل الأنسجة وفيما بينها. نحن نعتبر أن استنساخ ناقلات sgRNA ، وإنتاج AAV ، والإدارة المتجانسة ل AAV في iWAT هي خطوات حاسمة لنجاح هذا البروتوكول. أخيرا ، تعمل sgRNAs المختلفة بشكل مميز على تنشيط التعبير عن الجينات الداخلية في نظام SPH14. التوصية الرئيسية هي تصميم واختبار ثلاثة إلى خمسة تسلسلات sgRNA في حدود 200 نقطة أساس في المنبع من موقع بدء النسخ (TSS) للجين محل الاهتمام. لذلك ، فإن تحديد أفضل تسلسل sgRNA للجين المستهدف يتطلب عادة فحوصات شاقة في المختبر قبل التجارب في الجسم الحي.

AdipoSPH هو أيضا نموذج جذاب للتحقيق في جوانب أخرى من بيولوجيا الأنسجة الدهنية. على سبيل المثال ، تعزز الخلايا الشحمية إفراز العديد من الأديبوكينات28,29 ؛ ومع ذلك ، فإن تأثيرات الجسم بالكامل لمعظم هذه الجزيئات لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. AdipoSPH هو نموذج مناسب لمعالجة هذه المشكلة عن طريق الإفراط في التعبير عن الجينات الداخلية الفردية أو المتعددة في الخلايا الشحمية الناضجة والتحقيق في آثارها المحلية أو الجهازية. وبالتالي ، فإن AdipoSPH هي أداة فريدة لدراسة بيولوجيا وفسيولوجيا الأنسجة الدهنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدعم الذي تلقوه من مركز متعدد التخصصات للبحوث البيولوجية في العلوم الطبية (Cemib) ، Unicamp ، لتوليد الفئران AdipoSPH ، ومختبر Inmmunometabolism وإشارات الخلية ، والمعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا على الضوئيات المطبقة على بيولوجيا الخلية (INFABIC) على كل الدعم التجريبي. نشكر الدعم المالي من مؤسسة أبحاث ساو باولو (FAPESP): 2019/15025-5 ؛ 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich T2877
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I5879
AAVpro 293T Cell Line Takarabio 632273
Amicon Ultra Centrifugal Filter Merckmillipore UFC510008 100 KDa
Dexamethasone Sigma-Aldrich D1756
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) Corning 10-017-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement Gibco 10565-018 high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8662
Excelta Self-Opening Micro Scissors Fisher Scientific 17-467-496
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) Fisher Scientific 08-100-241
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-940
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
HEPES Sigma-Aldrich H3375-25G
Hexadimethrine bromide (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378
Insulin Sigma-Aldrich I9278
LigaFast Rapid DNA Ligation System Promega M8225
Maxiprep purification kit  Qiagen 12162
Microliter syringe Hamilton 80308 Model 701
NEB 10-beta/Stable  New England Biolabs C3019H E. coli competent cells
pAAV2/8  Addgene  112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry Addgene  91947
pAdDeltaF6  Addgene  112867
PEG 8000 Sigma-Aldrich 89510
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Polyethylenimine Sigma-Aldrich 23966 Linear, MW 25000
Povidone-iodine Rioquímica 510101303 Antiseptic
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408
SacI enzyme New England Biolabs R0156
Surgical Design Premier Adson Forceps Fisher Scientific 22-079-741
Syringe Hamilton 475-40417
T4 DNA Ligase Promega M180B
T4 DNA ligase buffer  New England Biolabs B0202S
T4 PNK enzyme kit New England Biolabs M0201S
Tramadol Hydrochloride SEM 43930
Vidisic Gel  Bausch + Lomb  99620

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  3. Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
  7. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  8. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  9. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  10. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  13. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  14. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  15. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
  16. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
  17. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  18. Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
  19. Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
  20. Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
  21. Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
  22. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
  23. Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
  24. Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
  25. Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
  26. Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  27. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  28. Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
  29. Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 191 ، الأنسجة الدهنية ، توليد الحرارة ، التمثيل الغذائي ، كريسبر
فحص بيولوجيا الدهون البيج والتمثيل الغذائي باستخدام نظام تنشيط CRISPR SunTag-p65-HSF1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Valdivieso-Rivera, F. B., de… More

Valdivieso-Rivera, F. B., de Oliveira Furino, V., Sponton, C. H. Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System. J. Vis. Exp. (191), e64849, doi:10.3791/64849 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter